Summary
Het manuscript presenteert on-site bemonstering van menselijke hersentumoren met vaste fase microextractie, gevolgd door hun biochemische profilering naar de ontdekking van biomarkers.
Abstract
Ondanks de verscheidenheid van tools beschikbaar voor kanker diagnose en classificatie, methoden die het mogelijk maken snelle en eenvoudige karakterisering van tumoren zijn nog steeds in nood. In de afgelopen jaren is massaspectrometrie een methode geworden voor ongerichte profilering van discriminerende verbinding als potentiële biomarkers van een ziekte. Biofluïden worden over het algemeen beschouwd als voorkeur matrices gezien hun toegankelijkheid en gemakkelijkere monsterverwerking, terwijl directe weefselprofilering meer selectieve informatie over een bepaalde kanker biedt. De bereiding van weefsels voor de analyse via traditionele methoden is veel complexer en tijdrovender en daarom niet geschikt voor snelle analyse ter plaatse. Het huidige werk presenteert een protocol dat monstervoorbereiding en extractie van kleine moleculen ter plaatse combineert, onmiddellijk na tumorresectie. Het bemonsteringsapparaat, dat zo groot is als een acupunctuurnaald, kan direct in het weefsel worden ingebracht en vervolgens naar het nabijgelegen laboratorium worden vervoerd voor instrumentele analyse. De resultaten van metabolomics en lipidomics analyses tonen het vermogen van de aanpak voor de oprichting van fenotypes van tumoren in verband met de histologische oorsprong van de tumor, maligniteit, en genetische mutaties, evenals voor de selectie van discriminerende verbindingen of potentiële biomarkers. De niet-destructieve aard van de techniek maakt latere uitvoering van routinematig gebruikte tests mogelijk, bijvoorbeeld histologische tests, op dezelfde monsters die worden gebruikt voor SPME-analyse, waardoor uitgebreidere informatie kan worden verkregen ter ondersteuning van gepersonaliseerde diagnostiek.
Introduction
Magnetic Resonance Imaging (MRI) en Computertomografie (CT) zijn de belangrijkste methoden die worden gebruikt voor de real-time analyse van hersenletsels. Hersentumor differentiatie is over het algemeen gebaseerd op histopathologie met extra vlekken en geavanceerde immunohistochemische technieken. Volgens de bijgewerkte richtlijnen voor centrale nerveuze hersentumoren uitgegeven door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) in 2016, genetische tests zijn cruciaal voor de differentiatie en classificatie van deze tumoren1. Differentiatie en classificatie van tumoren stellen artsen in staat om de meest effectieve behandeling voor een bepaald type tumor te kiezen, waardoor de levensverwachting van de patiënt wordt uitgebreid. Helaas, ondanks de beschikbaarheid van dergelijke geavanceerde methoden om artsen te helpen bij het selecteren van een optimale therapie voor hun patiënten, de levensverwachting van patiënten gediagnosticeerd met glioblastoom (IV rang glioom) is slechts ongeveer 15-16 maanden2. Zelfs met de verfijning en verhoogde nauwkeurigheid van de genoemde beeldvorming en histologische methoden als diagnostische instrumenten, is er nog steeds een grote behoefte aan nieuwe technieken die in staat zijn om aanvullende informatie aan te bieden om artsen te helpen bij beslissingen over het verloop van de behandeling. In de afgelopen jaren zijn verschillende nieuwe benaderingen op basis van massaspectrometrie voorgesteld voor intraoperatieve analyse van kanker3,4. Het potentieel van vaste fase microextractie (SPME), de methode die hierin wordt gepresenteerd, als een snel on-site analyseinstrument, is reeds aangetoond in verschillende studies5. Het huidige manuscript toont een van de klinische toepassingen van de methode, ongerichte metabolomics en lipidomics van menselijke hersentumoren. Ongerichte onderzoeken vormen een belangrijk uitgangspunt bij de ontdekking van potentiële biomarkers. Eenmaal vastgesteld, kunnen dergelijke biomarkers vervolgens worden gebruikt als diagnostische verwijzingen om onderscheid te maken tussen tumoren met behulp van dezelfde technologie gekoppeld aan on-site instrumentatie.
SPME is een op evenwicht gebaseerde monsterpreparaattechniek die kleine moleculen uit monstermatrices haalt met behulp van kleine hoeveelheden extractiefase. In spme's meest traditionele configuratie van het apparaat (sonde), wordt een vezel bedekt met een geschikte extractiefase en geïmmobiliseerd op een solide ondersteuning d.w.z. een metalen draad5,6. Biocompatibele coatings en apparaten (sondes) maken extractie rechtstreeks uit complexe biologische matrices mogelijk zonder monstervoorbehandeling, bijvoorbeeld homogenisatie en filtratie. Door het extractieproces worden analyten verdeeld tussen de extractiefase en de monstermatrix in verhouding tot hun initiële concentraties. Als de extractie lang genoeg wordt uitgevoerd, wordt evenwicht bereikt. Hoewel extractie bij evenwicht de hoogst mogelijke gevoeligheid en reproduceerbaarheid biedt, is pre-evenwichtsextractie ook mogelijk en in sommige gevallen zelfs de voorkeur, d.w.z. in vivo bemonstering, waarbij tijdsbeperkingen in verband met de bemonstering ter plaatse (bijvoorbeeld operatie- of noodruimten) snelle extracties vereisen. Het extractietijdprofiel van een bepaalde analyt wordt over het algemeen beïnvloed door de fysisch-chemische eigenschappen van de analyt, de bemonsterde matrix, het gebruikte type sorbent en verschillende andere extractieomstandigheden. De overvloed aan factoren die hun extractiekinetiek bepalen, maakt het praktisch onmogelijk om evenwichtsextractie van alle verbindingen te garanderen wanneer ongerichte analyses zoals metabolomics of lipidomics worden uitgevoerd. Om bovengenoemde redenen werd de extractietijd van het huidige protocol willekeurig vastgesteld om een bevredigende gevoeligheid en dekking van metabolieten enerzijds en bruikbaarheid voor gebruik ter plaatse anderzijds te waarborgen.
Er zij op gewezen dat de zeer kleine omvang van de sondes die worden gebruikt voor de extractie van monsters uit weefsels slechts minimale weefselschade veroorzaakt, terwijl de bemonsteringsprocedure zelf geen weefsel verbruikt, maar zeer kleine hoeveelheden kleine moleculen uit het bemonsterde gebied; Daarom kan hetzelfde monster verder worden gebruikt voor routinetests, d.w.z. histologisch of genetisch, zodat essentiële en aanvullende informatie uit hetzelfde monster kan worden vervulling gegaan. Dergelijke aanvullende, uitgebreide gegevens zouden een beter begrip van tumorbiologie mogelijk maken, hopelijk de ontdekking van nieuwe behandelingsdoelen vergemakkelijken. Het gebruik van deze methode verhoogt de mogelijkheid van intraoperatieve diagnostiek ter plaatse bij het bepalen van doelbiomarkers.
Hieronder presenteren we protocollen voor de bemonstering van hersentumoren ter plaatse voor metabolomics en lipidomics analyses en gegevensverwerking.
Protocol
De hierin gepresenteerde studie werd goedgekeurd door het Comité bio-ethiek van Collegium Medicum in Bydgoszcz van de Nicolaus Copernicus-universiteit in Toruń (KB 628/2015). Vergeet niet om altijd een labjas en andere vereiste persoonlijke veiligheidsuitrusting te dragen, zoals (maar niet beperkt tot) veiligheidshandschoenen en -brillen. Raak de extractiefase van de spme-sondes (solid phase microextraction) niet aan.
1. Bereiding van de SPME-apparaten
- Gebruik sondes (vezels) met mixed-mode en C18 coatings voor metabolomics en lipidomics, respectievelijk. Verzamel twee sets monsters, een voor metabolomics en een voor lipidomics.
- Pas de coating van de sonde aan op een optimale lengte door de SPME-sonde te trimmen. In de huidige studie was de geselecteerde coatinglengte 7 mm. Selecteer de lengte van de vezel op basis van de grootte van de onderzochte tumor, zodat de gehele sorbent kan worden ondergedompeld in de tumor(figuur 1).
- Conditioneren de coatings van de sondes door ze te weken in methanol: water 50:50 v/v mengsel voor een minimum periode van 1 uur vóór de extractieprocedure. Transportvezels naar de plaats van bemonstering (bijvoorbeeld ziekenhuis) in een flacon met de conditioneringsoplossing.
2. Procedure voor het verzamelen van monsters
- Was of voorbehandeling de tumor op geen enkele manier voorafgaand aan SPME extractie.
- Start de bemonstering zo snel mogelijk na de tumorverwijdering (2 min in de gepresenteerde studie).
OPMERKING: Pas de tijd aan, afhankelijk van de on-site set-up voor een bepaalde faciliteit (afstand van de werklocatie van de onderzoeker van de operatietafel) en houd deze constant voor de hele studie. Het minimaliseren van de verstreken tijd tussen tumorverwijdering en het begin van de extractie is cruciaal voor het vangen van onstabiele metabolieten die afbreken nadat de bloedcirculatie is afgesneden van het bestudeerde weefsel. - Voer bemonstering uit bij kamertemperatuur. U het monster ook op ijs leggen wanneer de extractie wordt uitgevoerd. In beide gevallen, handhaven dezelfde voorwaarden voor de hele set monsters.
- Haal de sonde uit het flesje.
- Was vezels met vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (LC/MS) kwaliteit water voor 5 s door ze onder te dompelen in LC / MS grade water. Laat de sorbent niet drogen voorafgaand aan het inbrengen van vezels om een goede reproduceerbaarheid van gegevens te garanderen.
- Steek de vezels in de hersenen tumor weefsel zo ver mogelijk uit elkaar, ervoor te zorgen dat de gehele extractie fase is gelegen in de tumor.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen extracties in repliceren uit te voeren om de heterogene aard van de tumor te bepalen (figuur 2). Drie replica's per monster worden aanbevolen. - Laat de sonde 30 minuten in het weefsel (gemeten met een timer).
- Gebruik lege besturingselementen om bronnen van fouten in verband met de aanwezigheid van artefacten die afkomstig zijn van andere bronnen dan de bemonsterde tumor te elimineren. Om blanco besturingselementen te verkrijgen, onderwerpen vezels aan dezelfde analytische workflow, zoals hierboven beschreven, maar zonder de bemonsteringsstap (inbrengen in het weefsel of een ander monster / matrix). Compileer in de stap gegevensverwerking de analyten die uit deze vezels worden geëxtraheerd in een "uitsluitingslijst" om signalen uit te sluiten die afkomstig zijn van verontreinigingen die afkomstig zijn van oplosmiddelen of vezelproductie. Het wordt aanbevolen dat ten minste 3 replica's van blanco worden gebruikt.
OPMERKING: Om te controleren op het risico van besmetting, is het noodzakelijk om bemonstering uit te voeren van handschoenen, tafels, apparaten of andere oppervlakken die een besmettingsrisico kunnen opleveren. In dergelijke gevallen zijn vezelvoorbereiding, tijd van extractie en desorptieprotocollen hetzelfde als die voor de monsters. - Terwijl de extractie wordt uitgevoerd, etiket de flesjes worden gebruikt voor de opslag van de sondes na extractie.
- Na 30 min, verwijder vezel(en) uit de hersentumor.
- Was vezels met water voor 3 s door ze onder te dompelen in LC / MS rang water om resten van bloed of cel puin te verwijderen uit de sonde, zodat het uiteindelijke extract bevat alleen kleine moleculen. Een langere wasstap wordt niet aanbevolen omdat dit kan leiden tot het verlies van polaire verbindingen.
- Immobiliseer de vezels in de voorgesneden septa van de high-performance vloeibare chromatografie (HPLC) flacon door piercing de septa van de bodem met de niet-gecoate einde van de vezel.
- Zet de vezels geïmmobiliseerd in de dop in aparte HPLC flacons en plaats ze in de geselecteerde transportcontainer.
- Voer stappen 2.11-2.13 uit voor vezels die zijn gewijd aan blanco besturingselementen.
3. Vervoer en opslag
LET OP: Er zijn verschillende opties beschikbaar voor het vervoer van monsters naar het laboratorium. Aanbevolen wordt een vloeibare stikstofDewar of polystyreendoos gevuld met droogijs te gebruiken voor transport; als alternatief kunnen ijsverpakkingen worden gebruikt voor onmiddellijk en snel transport.
- Plaats de flacons met vezels in de transportcontainer.
- Bij aankomst in het laboratorium plaatst u onmiddellijk flesjes met SPME-vezels in een vriezer van -80 °C of -30 °C. Bewaar vezels niet langer dan 3 jaar bij -30 °C of 5 jaar bij -80 °C.
4. Voorbereiding van de steekproef voor metabolomics-analyse
OPMERKING: Deze stap mag alleen worden uitgevoerd nadat alle monsters voor een experiment zijn verzameld.
- Bereid vóór instrumentele analyse het oplosmiddelmengsel voor: acetonitrile:water 80:20 v/v.
- Haal de flesjes met de gemengde vezels uit de vriezer. Gebruik deze voor metabolomics analyse.
- Label flesjes worden gebruikt voor desorptie.
- Pipette 300 μL van de desorptieoplossing (bereid in stap 4.1) in glazen inzetstukken die in 2 mL-flacons zijn geplaatst.
- Voer desorptie uit van elke vezel die in een aparte wisselplaat wordt geplaatst door de coating volledig onder te dompelen in het desorptieoplosmiddel en deze vervolgens 120 minuten bij 1.200 tpm te roeren met vortex.
- Na 120 min (zodra desorptie is voltooid) verwijder caps met sondes.
- Bereid het QC-monster voor door 10 μL-aliquoten van elk monster uit de sampleset te mengen. De grootte van de sampleset is afhankelijk van het experimentele ontwerp. Het is belangrijk om alle monsters te analyseren als een partij.
- Sluit de flesjes met nieuwe doppen.
- Plaats de flacons in de autosampler (4 °C) van de vloeibare chromatografie hoge resolutie massaspectrometer (LC-HRMS) en ga naar stap 5.
OPMERKING: Randomize injecties volgorde van de monsters met inbegrip van controle blanks. Injecteer QC-monster na elke 8-10 monsters om de stabiliteit van het instrument te controleren.
5. Metabolomics analyse met behulp van omgekeerde fase vloeibare chromatografie en hoge resolutie massaspectrometer (RPLC-HRMS analyse)
- Stel de parameters van de LC-HRMS-analyse en positieve ionisatiemodus in.
OPMERKING: De parameters die in de huidige studie in positieve modus werden gebruikt, waren als volgt: scanbereik: m/z 80-1000; resolutie 70 000; acquisitie uitgevoerd met AGC (1.000.000 ionen); injecteer tijd naar C-trap: automatisch; sproeispanning: 1,5 kV; S-lens RF-niveau: 55%; S-lens spanning: 25 V; skimmerspanning: 15 V; capillaire temperatuur: 300 °C; schedegas: 40 a.u.; aux gas: 15 a.u.; aux gaskacheltemperatuur: 300 °C. Deze chromatografische methode werd aangepast van Vuckovic et al.7. Injectievolume: 10 μL. - Stel de parameters in van de LC-HRMS-analyse en de negatieve ionisatiemodus.
OPMERKING: De parameters die in het huidige onderzoek in negatieve modus worden gebruikt: scanbereik: m/z 80-1000; resolutie 70 000; acquisitie uitgevoerd met AGC (1.000.000 ionen); injecteer tijd naar C-trap: automatisch; sproeispanning: 2,5 kV; S-lens RF-niveau: 55%; S-lens spanning: -25 V; skimmerspanning: -15 V; capillaire temperatuur: 256 °C schedegas: 48 a.u; aux gas: 11 a.u.; aux gaskacheltemperatuur: 413 °C. Deze chromatografische methode werd overgenomen van Vuckovic et al.7. Injectievolume: 10 μL. - Kalibreer het instrument zoals aanbevolen door de fabrikant.
OPMERKING: In de huidige studie werd het instrument om de 48 uur gekalibreerd met behulp van externe kalibratie, wat resulteerde in een massanauwkeurigheid <2 ppm. - Start de analyse door op de knop Start te klikken in de software die het instrument operating.
- Wanneer de analyse is voltooid, vervangt u de RPLC-kolom door de HILIC-kolom, wijzigt u de mobiele fasen en gaat u naar stap 6.
6. Metabolomics analyse met behulp van hydrofiele interactie vloeibare chromatografie en hoge resolutie massaspectrometer (HILIC-HRMS analyse)
- Stel de parameters van de LC-HRMS-analyse en positieve ionisatiemodus in.
OPMERKING: De parameters die in de huidige studie in positieve modus werden gebruikt, waren als volgt: scanbereik: m/z 80-1000; resolutie 70 000; acquisitie uitgevoerd met AGC (1.000.000 ionen); injecteer tijd naar C-trap: automatisch; sproeispanning: 1,5 kV; S-lens RF-niveau: 55%; S-lens spanning: 25 V; skimmerspanning: 15 V; schedegas: 60 a.u.; aux gas: 40 a.u.; aux gaskacheltemperatuur: 425 °C; capillaire temperatuur: 325 °C. Chromatografische methode werd aangepast van Vuckovic et al.7. Injectievolume: 10 μL. - Stel de parameters in van de LC-HRMS-analyse en de negatieve ionisatiemodus.
OPMERKING: De parameters die in het huidige onderzoek in negatieve modus werden gebruikt, waren als volgt: scanbereik: m/z 80-1000; resolutie 70 000; acquisitie uitgevoerd met AGC (1.000.000 ionen); injecteer tijd naar C-trap: automatisch; sproeispanning: 1,3 kV; S-lens RF-niveau: 55%.; S-lens spanning: -25 V; skimmerspanning: -15 V; capillaire temperatuur: 263 °C; schedegas: 60 a.u.; aux gas: 30 a.u.; aux gaskacheltemperatuur: 425 °C. Chromatografische methode werd aangepast van Vuckovic et al.7. Injectievolume: 10 μL. - Kalibreer het instrument zoals aanbevolen door de fabrikant.
OPMERKING: In de huidige studie werd het instrument om de 48 uur gekalibreerd met behulp van externe kalibratie, wat resulteerde in een massanauwkeurigheid <2 ppm. - Start de analyse door op de knop Start te klikken in de software die het instrument operating.
7. Voorbereiding van de steekproef voor lipidomics-analyse
OPMERKING: Deze stap mag alleen worden uitgevoerd nadat alle monsters voor het experiment zijn verzameld.
- Bereid voor aanvang van de analyse het desorptieoplosmiddelmengsel voor: isopropanol:methanol 50:50 v/v.
- Haal de flesjes met de C18 vezels gewijd voor lipidomics analyse uit de vriezer.
- Label flesjes worden gebruikt voor desorptie.
- Pipette 200 μL van de desorptieoplossing (bereid in stap 7.1) op geslibineerde glazen inzetstukken geplaatst in 2 mL flacons.
OPMERKING: Niet-gesilualiseerde wisselplaten kunnen ook worden gebruikt, maar het gebruik ervan kan leiden tot een slechte reproduceerbaarheid van verbindingen met een hoge logP, omdat dergelijke verbindingen niet specifiek aan glazen wanden kunnen worden bevestigd. - Voer desorptie uit van elke vezel in een aparte wisselplaat door de coating volledig onder te dompelen in het desorptieoplosmiddel en deze vervolgens 60 minuten bij 1.200 tpm te roeren met vortex.
- Na 60 min wanneer desorptie is voltooid verwijder caps met sondes.
- Bereid het QC-monster voor door 10 μL-aliquoten van elk monster uit de sampleset te mengen. De grootte van de sampleset is afhankelijk van het experimentele ontwerp. Het is belangrijk om alle monsters te analyseren als een partij.
- Sluit de flesjes met nieuwe doppen.
- Plaats de flacons in de autosampler (4 °C) van de vloeibare chromatografie hoge resolutie massaspectrometer (LC-HRMS) en ga naar stap 8.
8. Lipidomics analyse met behulp van omgekeerde fase vloeibare chromatografie en hoge resolutie massaspectrometrie (RPLC-HRMS analyse)
- Stel de parameters van de LC-HRMS-analyse en positieve ionisatiemodus in.
OPMERKING: De parameters die in de huidige studie in de positieve ionenmodus werden gebruikt, waren als volgt: scanbereik: m/z 100-1000; acquisitie uitgevoerd met AGC (1.000.000 ionen); injecteer tijd naar C-trap: automatisch; spray voltage: 3,5 kV, S-lens RF-niveau: 55%; S-lens spanning: 25 V; skimmerspanning: 15 V; capillaire temperatuur 275 °C; schedegas: 30 a.u.; aux gas: 10 a.u.; reservegas: 2 a.u.; sondeverwarmingstemperatuur 300 °C. Gebruikte LC-parameters waren: fase A: methanol:water, 40:60 met ammoniumacetaat van 10 mM en 1 mM azijnzuur ; fase B: isopropanol:methanol, 90:10 met 10mM ammoniumacetaat en 1 mM azijnzuur.; het verloop: 0 min – 20% B; 1,0 min – 20% B; 1,5 min – 50% B; 7,5 min – 70% B; 13,0 min – 95% B; 17.0 min – 95% B; 17,1 min – 95,5 % B; 23.0 min – STOP; C18 Kolom, 3,5 μm, 2,1 mm x 75 mm; stroom: 0,2 mL/min; oventemperatuur: 55 °C; injectievolume: 10 μL. - Stel de parameters in van de LC-HRMS-analyse en de negatieve ionisatiemodus.
OPMERKING: De parameters die in de huidige studie werden gebruikt, waren als volgt: HRMS-parameters voor de negatieve ionenmodus: scanbereik: m/z 100-1000; acquisitie uitgevoerd met AGC (1.000.000 ionen); injecteer tijd naar C-trap: automatisch; spray voltage: 3,5 kV, S-lens RF-niveau: 55%; S-lens spanning: -25 V; skimmerspanning: -15 V; capillaire temperatuur 275 °C; schedegas: 30 a.u; aux gas: 10 a.u.; reservegas: 2 a.u; sondeverwarmingstemperatuur 300 °C. Chromatografische methode: hetzelfde als in 8.1. - Kalibreer het instrument zoals aanbevolen door de fabrikant.
OPMERKING: In de huidige studie werd het instrument om de 48 uur gekalibreerd met behulp van externe kalibratie, wat resulteerde in een massanauwkeurigheid <2 ppm. - Start de analyse door op de startknop te klikken in de software die uw instrument operating.
- Wanneer de analyse is voltooid, vervangt u de RPLC-kolom door de HILIC-kolom, wijzigt u de mobiele fasen en gaat u naar stap 9.
9. Lipidomics analyse met behulp van hydrofiele interactie vloeibare chromatografie en hoge resolutie massaspectrometer (HILIC-HRMS analyse)
- Stel de parameters van de LC-HRMS-analyse en positieve ionisatiemodus in.
OPMERKING: De parameters die in de huidige studie in de positieve ionenmodus werden gebruikt, waren als volgt: scanbereik: m/z 100-1000; acquisitie uitgevoerd met AGC (1.000.000 ionen); sproeispanning: 1,5 kV; S-lens RF-niveau: 55%; S-lens spanning: 25 V; skimmerspanning: 15 V; capillaire temperatuur 325 °C; schedegas: 60 a.u.; aux gas: 30 a.u.; reservegas: 2 a.u.; sonde kacheltemperatuur 320 °C. GEBRUIKTE LC-parameters waren: fase A: 5 mM ammoniumacetaat in water; fase B: acetonitril; het verloop: 0 – 2min – 4% B; 15,0 – 20% B; 15,1 – 4% B, 21,0 min – STOP; 3 μm 100 mm x 2,1 mm kolom; stroom: 0,4 mL/min; oventemperatuur: 40 °C; injectievolume: 10 μL. - Stel de parameters in van de LC-HRMS-analyse en de negatieve ionisatiemodus.
OPMERKING: De parameters die in de huidige studie in de negatieve ionenmodus werden gebruikt, waren als volgt: scanbereik: m/z 80-1000; acquisitie uitgevoerd met AGC (1.000.000 ionen); spray voltage: 1,5 kV, S-lens RF-niveau: 55%; S-lens spanning: -25 V; skimmerspanning: -15 V; capillaire temperatuur 320 °C; schedegas: 50 a.u.; aux gas: 21 a.u.; reservegas: 3 a.u.; sondeverwarmingstemperatuur 320 °C. De chromatografische methode was dezelfde als beschreven in 9.1. - Kalibreer het instrument zoals aanbevolen door de fabrikant.
OPMERKING: In de huidige studie werd het instrument om de 48 uur gekalibreerd met behulp van externe kalibratie, wat resulteerde in een massanauwkeurigheid <2 ppm. - Start de analyse door op de knop Start te klikken in de software die het instrument operating.
10. Gegevensverwerking en statistische analyse
- Gegevens verwerken met behulp van software die compatibel is met het formaat van de ruwe gegevensbestanden.
- Statistische analyse uitvoeren met behulp van de verwerkte gegevens.
OPMERKING: Het type test is afhankelijk van de wetenschappelijke hypothese en het ontwerp van de studie. In de huidige studie werden Principal Component Analysis, Partial-Least Square-Discriminant Analysis en one-way ANOVA gebruikt.
Representative Results
Door gebruik te maken van vaste fasemicroextractie als monstervoorbereidingsmethode in combinatie met vloeibare chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie met hoge resolutie en een geavanceerde software voor gegevensverwerking konden we met succes de metabolome en lipidome van menselijke hersentumoren karakteriseren. De sonde, waarvan de grootte gelijk was aan een acupunctuurnaald, veroorzaakte minimale schade aan het bestudeerde weefsel en geen weefselconsumptie, waardoor het verdere gebruik van monsters voor histologische of genetische studies mogelijk werd. Een bevredigende scheiding van de geselecteerde groepen werd verkregen voor zowel omgekeerde fase- als HILIC-kolommen, en voor zowel ionisatiemodi in metabolomics als lipidomics-analyses. Het gebruik van beide scheidingsmethoden, niet alleen bij metabolomics, maar ook in lipidomics analyse leverde waardevolle aanvullende gegevens. De omgekeerde fasekolom scheidt lipiden met betrekking tot hun lengte van de koolstofketens en de aanwezigheid van onverzadigde bindingen, terwijl de HILIC-kolom nuttig is voor het profileren van lipidegroepen, met name fosfolipiden8.
De reproduceerbaarheid van de instrumentele analyse bleek zeer goed te zijn op basis van de strakke clustering van QC-monsters op de belangrijkste componentanalyseplot (Figuur 3A, de drie QC-monsters injecteerden om de acht patiënten monsters langs de sequentie overlapping). Bovendien bleken extractie-blanco's die voor een negatieve controleanalyse werden gebruikt, goed te scheiden van echte monsters. Het brede scala van analyten gewonnen door de sondes vergemakkelijkt de ontdekking van representatieve soorten, waardoor met succes waardoor differentiatie tussen menselijke hersentumoren op basis van hun histologische oorsprong, maligniteit, en andere factoren (bijvoorbeeld genetische). Figuur 3B toont lipidomics gegevens voor monsters verzameld van patiënten met gliomen en meningiomen. Het mogelijk maken van differentiatie tussen deze tumoren, die werden gekenmerkt door verschillende histologische oorsprong en maligniteit, was een belangrijk doel van de studie, omdat meningiomen over het algemeen worden beschouwd als goedaardige tumoren, terwijl gliomen een van de meest kwaadaardige zijn. Bovendien werden in figuur 4 metabolomics-gegevens gliomen verdeeld op basis van hun mate van maligniteit in hoog en laag. Deze subgroepen werden vergeleken met het moleculaire fenotype van meningiomen. In beide gevallen werd een prominente scheiding van clusters waargenomen. Tegenwoordig is diagnostiek van glioom voornamelijk afhankelijk van het bepalen van specifieke genetische mutaties in tumormonsters. Daarom werden de verkregen resultaten vergeleken met genotypergegevens. Figuur 5A presenteert de scheiding van de monsters met gedetecteerde co-verwijdering 1p19q en monsters waar de mutatie niet werd waargenomen.
Statistische analyse maakt het ook mogelijk om verbindingen in de bestudeerde groepen te selecteren. Deze verbindingen kunnen worden beschouwd als potentiële biomarkers in gevallen waarin een op de juiste plaats genomen groot cohort wordt bemonsterd. Er is echter een meer diepgaande analyse nodig, met inbegrip van een afdoende bevestiging van gedetecteerde verbindingen door fragmentatie en vergelijking van gedetecteerde soorten met analytische normen, om definitieve conclusies van biologische aard te trekken. Voorbeelden van dergelijke discriminante metabolieten worden gepresenteerd in figuur 3C en figuur 5B. De identiteit van deze verbindingen, d.w.z., sfingomielyn: SM d36:1 en proline werden bevestigd door fragmentatiepatronen van de metabolieten van de steekproef en authentieke normen te vergelijken.
Figuur 1: SPME-vezels die zijn voorbereid op het winningsproces. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Extractie van meningioma met SPME-sondes. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: PCA- en boxpercelen voor glioom en meningioma. Belangrijkste componentanalyseplot met (A) alle geanalyseerde monsters, met inbegrip van blanco's, extractie QC, blanks, meningiomen, gliomen; b) die alleen bestudeerde groepen bevatten (na uitsluiting van blanco's en QC's); (C) doos snorharen plot voor sphingomielyn: SM d36:1 differentiërende patiënt met glioom en meningioma. Lipidomics gegevens. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: PCA voor HGG, LGG en meningioma. Belangrijkste componentanalyseplot die differentiatie tussen (A) hoogwaardige glinomen (HGG) en meningiomen (MEN)9 en (B)laagwaardige gliomen (LGG) en meningiomen toont. Metabolomics gegevens herdrukt van Via Medica ref9 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: PCA- en boxpercelen voor glioom met en zonder verwijdering. (A) De belangrijkste componentanalyseplot toonde verschillen bij patiënten met en zonder co-schrapping 1p19q; b) box snorharenpercelen voor proline gedifferentieerde patiënten met en zonder co-schrapping 1p19q; n-zonder verwijdering, y-met verwijdering. Metabolomics gegevens Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Ongerichte metabolomics en lipidomics worden vaak gebruikt in studies gericht op het identificeren van tumorbiomarkers. Echter, in de meeste gevallen, onderzoekers op zoek naar verbindingen die kunnen worden gebruikt voor screening van de ziekte. Bijgevolg, de voorkeur biologische monsters zijn bloed of urine als gevolg van hun relatief gemakkelijke toegang. Analyse van tumorweefsel wordt voornamelijk uitgevoerd om de mechanismen achter de ziekte te begrijpen, verschillende tumortypen te karakteriseren, enz. On-site analyse van tumor biomarkers wordt zelden uitgevoerd, omdat dergelijke toepassingen uitgebreide monstervoorbereiding vereisen. Als alternatief verdienen strategieën op basis van real-time analyse van weefselprofielen zonder voorselectie van specifieke biomarkers de aandacht van de medische gemeenschap3,4. De hierin gepresenteerde oplossing biedt een ander perspectief op weefselverwerking ter plaatse door het type informatie te onthullen dat via dergelijke methoden kan worden verkregen.
De combinatie van bemonstering, monsterbereiding en extractie maakt SPME een zeer nuttig hulpmiddel voor analyse ter plaatse. Bovendien maakt het gebrek aan weefselverbruik tijdens de bemonstering het verdere gebruik van dezelfde monsters voor biomarkeranalyse en routinetests (genotypering, histologische analyse) mogelijk, waardoor nieuwe informatie wordt toegevoegd aan de resultaten van standaardtests. Het bemonsteringsapparaat heeft een zeer eenvoudig ontwerp, de werking ervan is zeer eenvoudig en er is geen speciale training nodig om de extractie zelf uit te voeren. Het bereiken van betrouwbare resultaten vereist echter veel meer dan alleen een goede behandeling van apparaten. Om het experiment goed uit te voeren, moet men het extractieproces, de aard van het monster begrijpen en zich bewust zijn van mogelijke fouten die de gegevens kunnen beïnvloeden.
Het is belangrijk om rekening te houden met de heterogeniteit van kankerweefsel10; bemonsterde tumoren kunnen delen bevatten die necrose, verkalking en hypoxie ondergaan, en elk van deze processen zal worden weerspiegeld in de metabolome en lipidome bereikt, waardoor de resultaten worden beïnvloed. Daarom wordt aanbevolen om bemonstering met ruimtelijke resolutie uit te voeren door het inbrengen van verschillende vezels in verschillende delen van het kankerweefsel, of als alternatief, dat een langere coating wordt gebruikt om het geheel van de tumor binnen te dringen om gemiddelde informatie over de tumor te verkrijgen. Als de bemonsteringsmethode voor ruimtelijke resolutie wordt uitgevoerd, kunnen vezels allemaal in één desorptieoplosmiddel worden gedesorbeerd; dit zou niet alleen het verkrijgen van algemene informatie over de tumor mogelijk maken, maar ook de gevoeligheid van de analyse verhogen. Als alternatief zou desorptie van individuele vezels in afzonderlijke flesjes onderzoeken mogelijk maken om de interne diversiteit van de hersentumor te achterhalen, die bestaat uit de kern die is opgebouwd uit kankercellen, en de buitenste zone, die de grens van gezond weefsel is. Diepere delen van de tumor zijn meestal meer beschadigd door de processen in verband met kanker11. Onderzoekers moeten echter in gedachten houden dat deze optie de gevoeligheid van de methode en het totale aantal detecteerbare verbindingen compromitteert. In het huidige werk werd een 7 mm coating gebruikt; deze lengte werd beschouwd als optimaal voor verschillende maten tumoren opgenomen in de studie. De coatings doordrongen de tumoren, en dus niet-speciale resolutie, maar gemiddeld gegevens over het monster. Ongeacht het gekozen protocol is het belangrijk dat hetzelfde protocol tijdens de hele studie wordt gevolgd, inclusief het aantal vezels dat wordt gebruikt voor individuele bemonstering, de lengte van de coating, extractietijd en alle andere factoren die in dit werk zijn afgebakend.
Het is belangrijk om de kwaliteit van de analyse te controleren. De gepoolde QC (zie de stappen 4.7 en 7.7 in het protocol) moet worden voorbereid en gebruikt voor het bewaken van de stabiliteit van het instrument tijdens de werking van de gehele monsterpartij. De blanco besturingselementen (zie stap 2.8) kunnen later worden gebruikt om een "uitsluitingslijst" op te stellen om signalen van verontreinigingen afkomstig van oplosmiddelen of vezelproductie te elimineren. Bij speciale gelegenheden, zoals een besmettingsrisico, is het noodzakelijk om monsters te nemen van handschoenen, tafels, apparaten of andere oppervlakken die een besmettingsrisico kunnen opleveren. In dergelijke gevallen zijn vezelpreparaat, extractietijd en desorptieprotocollen hetzelfde als voor de monsters.
Metabolomic en lipidomic analyses zijn volledig gericht op kleine moleculen (minder dan 1.500 Da) die in een organisme of specifieke componenten van het organisme, zoals specifieke organen, weefsel, vloeistoffen, cellen, enz. Metabolomic en lipidomics bieden een momentopname van biochemische veranderingen die zich in het lichaam voordoen, en in het geval van kanker, integreren ze informatie met betrekking tot het genoom, histologie en maligniteit van de tumor. Deze omics wetenschappen creëren een verband tussen fysiologie en fenotype als metabolieten hoger in de biochemische ladder staan dan eiwitten of genen12. Door het begrijpen van de metabokoom en lipidome van kankertumoren, komen we dichter bij het ontdekken van het fenotype onder alle -omics wetenschappen als deze takken van de studie bieden meer diepgaande kennis van dynamische veranderingen van moleculen als een reactie van levende organismen op verschillende stimuli. Zoals in dit werk wordt voorgesteld, komen de gegevens die in één bemonstering zijn verkregen overeen met de histologie van de kanker, de mate van maligniteit ervan, en weerspiegelen veranderingen die zich op genoomniveau voordoen. In gliooms, als het type kanker van belang in deze studie, de informatie verborgen in het genoom is bijzonder belangrijk, als een gepersonaliseerde behandeling wordt ontwikkeld op basis van de resultaten van genetische tests. Bijzondere mutaties zijn prognostische markers van de uitkomsten van de chemo- of radiotherapie. Zoals hier is aangetoond, is de selectie van biomarkers die een bepaalde mutatie weerspiegelen mogelijk met de voorgestelde strategie. Mutatie markers, evenals extra descriptoren types zoals die aangeven de mate van maligniteit van de tumor kan ook worden gebruikt ter ondersteuning van routine diagnostische methoden.
Ex vivo chemische biopsie met het gebruik van vaste fase microextractievezels is de eerste stap in de toepassing van de methode op intraoperatieve diagnostiek. De methode kan gemakkelijk worden aangenomen voor in vivo bemonstering in afwachting van toestemming van de juiste Ethische Boards. In dergelijke gevallen moet sterilisatie van SPME-apparaten worden uitgevoerd volgens de aanvaarde sterilisatieprocedures van het ziekenhuis waar bemonstering moet worden uitgevoerd, d.w.z. autoclaving of ethyleenoxidesterilisatie. De voorgeconditioneerde en gesteriliseerde vezels moeten worden bewaard in verzegelde verpakkingen met een sterilisatie vervaldatum. Het is belangrijk op te merken dat vezels niet moeten worden gereinigd met het gebruik van oppervlakteactieve stoffen. Een dergelijke procedure kan leiden tot niet-specifieke veranderingen in de sorbent samenstelling, waardoor de extractie van analyten. In de hierin beschreven studies werd een extractieperiode van 30 minuten gebruikt, maar andere rapporten valideren dat kortere tijden bevredigende resultaten kunnen opleveren in in vivo studies13. Huq et al. toonden aan dat analyt evenwichtstijd sneller wordt bereikt in weefsel, als een complexe matrix, dan in eenvoudige matrices14. De reproduceerbaarheid van de verkregen resultaten kan echter in het gedrang komen onder kortere extractieperioden, aangezien meer analyten onder pre-evenwichtsomstandigheden zullen worden gewonnen; Daarom moet nauwkeurige tijdscontrole worden uitgevoerd.
Beide omics wetenschappen uitgebuit als onderdeel van dit werk hebben een uitstekend potentieel als biomarker discovery tools. Zodra biomarkers zijn geselecteerd of een chemometrisch model is vastgesteld, kunnen medische diagnostiek op basis van de bepaling van doelmetabolieten via methoden die van toepassing zijn op on-site onderzoeken, zoals de SPME-benadering die in dit werk wordt beschreven, worden ontwikkeld en geïmplementeerd als onderdeel van routinediagnostiek.
Het protocol dat in dit manuscript wordt voorgesteld beschrijft hoe ongerichte metabolomic en lipidomic analyses van kankerweefsel uit te voeren met behulp van vaste fasemicroextractie voor screening van potentiële biomarkers. Het is ontworpen om extractie van representatieve verbindingen mogelijk te maken, differentiatie van tumoren en identificatie van discriminerende verbindingen die een bepaalde vorm van kanker kenmerken, d.w.z. potentiële biomarkers. De ongerichte analyses met SPME beschreven in dit artikel vormen een uitgangspunt in de ontwikkeling van snelle intraoperatieve diagnostiek, waarbij een geselecteerd paneel van verbindingen kan worden bepaald zonder de noodzaak voor screening van alle verbindingen die in het monster aanwezig zijn. In het belang van snelle diagnostische resultaten kunnen SPME-sondes die worden gebruikt voor on-site extractie direct worden gekoppeld aan analytische instrumenten in de ziekenhuisfaciliteit. Eenvoudige extracties uitgevoerd met minimale monstervoorbereiding gevolgd door chromatografievrije analyse zouden de totale tijd aanzienlijk verkorten van uren tot enkele minuten, zoals reeds is beschreven voor het toezicht op geneesmiddelen15.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De studie werd ondersteund door subsidie Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 van het National Science Centre. De auteurs willen MilliporeSigma, een bedrijf van Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland, erkennen voor het leveren van de SPME-apparaten die in dit werk worden gebruikt. De life science business van Merck opereert als MilliporeSigma in de VS en Canada. Ook willen de auteurs Thermo Fisher Scientific bedanken voor de toegang tot de Q-Exactive Focus orbitrap massaspectrometer.
Bijdragen van auteurs: JB: optimalisatie van de parameters voor monstervoorbereiding en LC-MS, prestaties van SPME-LC-MS experimenten, gegevensanalyse, statistische analyse en gegevensinterpretatie en manuscriptvoorbereiding met betrekking tot lipidomics deel; PZG: coördinatie en prestaties van de meeste bemonsteringen in het ziekenhuis, optimalisatie van bemonsterings- en monstervoorbereidingsparameters, prestaties van SPME-LC-MS-experimenten, gegevensanalyse, statistische analyse en gegevensinterpretatie, manuscriptvoorbereiding met betrekking tot metabolomics- deel; MG – hulp bij de optimalisatie van de voorbereiding van monsters, LC-MS methode en data-analyse met betrekking tot lipidomics deel; KG: co-performance van SPME-bemonsteringen en optimalisatie van bemonstering en monstervoorbereiding, SPME-LC-MS-analyse met betrekking tot metabolomics-onderdeel; KC: prestaties van verschillende SPME-bemonsteringen in het ziekenhuis, hulp bij het optimaliseren van bemonstering, monstervoorbereiding en gegevensanalyse met betrekking tot metabolomics-onderdeel; KJ: prestaties van verschillende SPME-bemonsteringen in het ziekenhuis, hulp bij lipidomics-analyse; DP: prestaties van chirurgische ingrepen, werving van de patiënten; JF: prestaties van chirurgische ingrepen, werving van de patiënten; MH: uitvoering van chirurgische ingrepen, coördinatie van het klinische deel van het onderzoek; BB: concept, coördinatie toezicht op het project en manuscriptvoorbereiding, uitvoering van verschillende bemonsteringen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9x5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Bi, W. L., Beroukhim, R. Beating the odds: extreme long-term survival with glioblastoma. Neuro Oncology. 16 (9), 1159-1160 (2014).
- Ifa, D. R., Eberlin, L. S. Ambient Ionization Mass Spectrometry for Cancer Diagnosis and Surgical Margin Evaluation. Clinical Chemistry. 62, 111-123 (2016).
- Alexander, J., et al. A novel methodology for in vivo endoscopic phenotyping of colorectal cancer based on real-time analysis of the mucosal lipidome: a prospective observational study of the iKnife. Surgical Endoscopy. 31 (3), 1361-1370 (2017).
- Reyes-Garcés, N., et al. Advances in Solid Phase Microextraction and Perspective on Future Directions. Analytical Chemistry. 90, 302-360 (2018).
- Pawliszyn, J. Handbook of Solid Phase Microextraction. , Chemical Industry Press. Beijing. (2009).
- Vuckovic, D., Pawliszyn, J. Systematic Evaluation of Solid-Phase Microextraction Coatings for Untargeted Metabolomic Profiling of Biological Fluids by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 83, 1944-1954 (2011).
- Cajka, T., Fiehn, O. Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 61, 192-206 (2014).
- Goryńska, P. Z., et al. A new strategy for brain tumour metabolomic analysis. Medical Research Journal. 3 (1), 15-22 (2018).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Fernandes, M., Rosel, D., Brábek, J. Translation in solid cancer: are size-based response criteria an anachronism. Clinical Translational Oncology. 17 (1), 1-10 (2015).
- Lämmerhofer, M., Weckwerth, W. Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data. , Wiley-VCH. (2013).
- Lendor, S., et al. Solid Phase Microextraction- Based Miniaturized Probe and Protocol for Extraction of Neurotransmitters from Brains in Vivo. Analytical Chemistry. 91 (7), 4896-4905 (2019).
- Huq, M., Tascon, M., Nazdrajic, E., Roszkowska, A., Pawliszyn, J. Measurement of Free Drug Concentration from Biological Tissue by Solid-Phase Microextraction: In Silico and Experimental Study. Analytical Chemistry. 91 (12), 7719-7728 (2019).
- Looby, N., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
