Summary
Рукопись представляет на месте выборки опухолей головного мозга человека с твердой фазы микроэкстракции следуют их биохимического профилирования к открытию биомаркеров.
Abstract
Несмотря на разнообразие инструментов, доступных для диагностики и классификации рака, методы, которые позволяют быстро и простой характеристики опухолей по-прежнему нуждаются. В последние годы масс-спектрометрия стала можно сделать выбор для нецелевого профилирования дискриминационного соединения в качестве потенциальных биомаркеров заболевания. Биофлюиды, как правило, рассматриваются как предпочтительные матрицы, учитывая их доступность и более легкую обработку образцов, в то время как прямое профилирование тканей обеспечивает более избирательную информацию о данном раке. Подготовка тканей к анализу традиционными методами гораздо сложнее и трудоемка, а значит, не подходит для быстрого анализа на месте. Текущая работа представляет собой протокол, сочетающий подготовку образца и экстракцию небольших молекул на месте, сразу после ресекции опухоли. Устройство для отбора проб размером с иглоукалывание может быть вставлено непосредственно в ткань, а затем доставлено в ближайшую лабораторию для инструментального анализа. Результаты метаболомических и липидомических анализов демонстрируют способность подхода к установлению фенотипов опухолей, связанных с гистологическим происхождением опухоли, злокачественных новообразований и генетических мутаций, а также для отбора распознавания соединений или потенциальных биомаркеров. Неразрушательный характер метода позволяет последующее выполнение регулярно используемых тестов, например, гистологических тестов, на тех же образцах, используемых для анализа SPME, что позволяет получить более полную информацию для поддержки персонализированной диагностики.
Introduction
Магнитно-резонансная томография (МРТ) и компьютерная томография (КТ) являются основными методами, используемыми для анализа поражений головного мозга в режиме реального времени. Дифференциация опухоли головного мозга, как правило, основана на гистопатологии с дополнительными окрашивания и передовых иммуногистохимических методов. Согласно обновленному руководству по центральным опухолям нервного мозга, изданного Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в 2016 году, генетические тесты имеют решающее значение для дифференциации и классификацииэтих опухолей 1. Дифференциация и классификация опухолей позволяют врачам выбирать наиболее эффективное лечение данного типа опухоли, тем самым увеличивая продолжительность жизни пациента. К сожалению, несмотря на наличие таких передовых методов, чтобы помочь врачам в выборе оптимальной терапии для своих пациентов, продолжительность жизни пациентов с диагнозом глиобластома (глиома IV класса) составляет всего около 15-16 месяцев2. Даже с изощренностью и повышенной точностью сказал изображений и гистологических методов в качестве диагностических инструментов, по-прежнему существует большая потребность в новых методах, способных предложить дополнительную информацию для оказания помощи врачам в принятии решений, касающихся курса лечения. За последние годы было предложено несколько новых подходов, основанных на масс-спектрометрии для внутриоперационногоанализа рака 3,4. Потенциал микроэкстракции твердой фазы (SPME), метод, представленный в настоящем месте, как инструмент быстрого анализа на месте, уже был продемонстрирован в различных исследованиях5. Текущая рукопись показывает одно из клинических применений метода, нецелевые метаболомики и липидомики опухолей головного мозга человека. Нецелесоприимные исследования являются важной отправной точкой в открытии потенциальных биомаркеров. После создания, такие биомаркеры могут быть использованы в качестве диагностических ссылок для дифференциации между опухолями, используя ту же технологию в сочетании с приборами на месте.
SPME - это метод подготовки образцов на основе равновесия, который извлекает небольшие молекулы из матриц образца с использованием небольших количеств фазы экстракции. В самой традиционной конфигурации spME устройства (зонда) волокно покрыто соответствующей фазой извлечения и обездвижено на твердой опоре, т.е. металлическойпроволоке 5,6. Биосовместимые покрытия и приборы (зонды) позволяют извлечения непосредственно из сложных биологических матриц без предварительной обработки образца, например, гомогенизации и фильтрации. В процессе извлечения анализы разделены между фазой и матрицей образца пропорционально их первоначальным концентрациям. Если добыча осуществляется достаточно долго, то равновесие достигается. Хотя добыча на равновесии обеспечивает максимально возможную чувствительность и воспроизводимость, возможна и даже предпочтительнее в некоторых случаях, т.е. отбор проб in vivo, где ограничения по времени, связанные с выборкой на месте (например, операционные или аварийные отделения), требуют быстрой добычи. Профиль времени извлечения данного анализа, как правило, зависит от физико-химических свойств аналита, пробы матрицы, типа используемого сорбента и ряда других условий экстракции. Множество факторов, регулирующих их экстракции кинетики делает практически невозможным обеспечить равновесное извлечение всех соединений, когда нецелесохотные анализы, такие как метаболомика или липидомика выполняются. По вышеупомянутым причинам время извлечения текущего протокола было установлено произвольно для обеспечения удовлетворительной чувствительности и охвата метаболитов, с одной стороны, и практичности использования на месте - с другой.
Следует подчеркнуть, что очень небольшой размер зондов, используемых для извлечения образца из тканей, вызывает лишь минимальные повреждения тканей, в то время как сама процедура отбора проб не потребляет никаких тканей, а очень небольшое количество мелких молекул из отобранной области; таким образом, этот же образец может быть дополнительно использован для обычных тестов, т.е. гистологических или генетических, что позволяет получить необходимую и дополняемую информацию из одного и того же образца. Такие дополнительные, всеобъемлющие данные позволили бы лучше понять биологию опухолей, что, как мы надеемся, способствовало бы открытию новых целей лечения. Использование этого метода еще больше увеличивает возможность внутриоперационной диагностики на месте при определении целевых биомаркеров.
Ниже мы представляем протоколы отбора проб опухолей головного мозга на месте для метаболомики и липидомики анализов и обработки данных.
Protocol
Исследование, представленное в настоящем исследовании, было одобрено Комитетом по биоэтике коллегиального медика в Быдгоще при Университете Николауса Коперника в Торуне (KB 628/2015). Не забудьте всегда носить лабораторное пальто и любое другое необходимое оборудование личной безопасности, такое как (но не ограничиваясь) защитные перчатки и очки. Не прикасайтесь к фазе извлечения зондов микроэкстракции твердой фазы (SPME).
1. Подготовка устройств SPME
- Используйте зонды (волокна) со смешанным режимом и C18 покрытия для метаболомики и липидомики, соответственно. Соберите два набора образцов, один для метаболомики и один для липидомики.
- Отрегулируйте покрытие зонда до оптимальной длины, обрезая зонд SPME. В текущем исследовании выбранная длина покрытия составила 7 мм. Выберите длину волокна в зависимости от размера изучаемой опухоли, гарантируя, что весь сорбент может быть погружен в опухоль(рисунок 1).
- Состояние покрытий зондов путем замачивания их в метанол: вода 50:50 v/v смеси в течение минимального периода 1 ч до процедуры извлечения. Транспортировка волокон к месту отбора проб (например, в больницу) во флаконе, содержащем раствор кондиционирования.
2. Процедура сбора образцов
- Не мыть или предварительно лечить опухоль в любом случае до извлечения SPME.
- Начать отбор проб как можно скорее после удаления опухоли (2 мин в представленном исследовании).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время в зависимости от настройки на месте для данного объекта (расстояние от рабочего места исследователя от операционного стола) и держите его постоянным в течение всего исследования. Минимизация прошедшего времени между удалением опухоли и началом экстракции имеет решающее значение для захвата нестабильных метаболитов, которые деградируют после того, как кровообращение отрезано от изученной ткани. - Выполняем выборку при комнатной температуре. Кроме того, поместите образец на лед, когда добыча осуществляется. В любом случае, поддерживать те же условия для всего набора образцов.
- Вывихи зонд из флакона.
- Вымойте волокна с жидкой хроматографией-масс-спектрометрией (LC/MS) класса воды в течение 5 с, погружая их в воду класса LC/MS. Не позволяйте сорбенту высохнуть до вставки волокна, чтобы обеспечить хорошую воспроизводимость данных.
- Вставьте волокна в ткани опухоли головного мозга как можно больше друг от друга, гарантируя, что вся фаза экстракции находится внутри опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проводить экстракции в репликации для того, чтобы определить неоднородный характер опухоли(рисунок 2). Рекомендуется три репликации на один образец. - Оставьте зонд на 30 минут в ткани (измеряется таймером).
- Используйте пустые элементы управления для устранения источников ошибок, связанных с наличием артефактов, вытекающих из других источников, кроме пробной опухоли. Чтобы получить пустой элемент управления, подставить волокна к тому же аналитическому рабочему процессу, как описано выше, но без шага отбора проб (вставка в ткани или любой другой образец/матрица). На этапе обработки данных составите анализаты, извлеченные из этих волокон, в «список исключений», чтобы исключить сигналы, полученные от загрязняющих веществ, вытекающих из растворителей или производства волокон. Рекомендуется использовать не менее 3 репликаций пробела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить риск заражения, необходимо выполнить отбор проб из перчаток, столов, аппарата или любых других поверхностей, которые могут представлять опасность загрязнения. В таких случаях, волокна подготовки, время извлечения, и desorption протоколы такие же, как для образцов. - Пока идет добыча, обозначите флаконы, которые будут использоваться для хранения зондов после извлечения.
- После 30 минут, удалить волокна (ы) из опухоли головного мозга.
- Вымойте волокна водой на 3 с, погружая их в воду класса LC/MS, чтобы удалить остатки крови или клеточного мусора из зонда, так что окончательный экстракт содержит только небольшие молекулы. Более длинный шаг стирки не рекомендуется, так как это может привести к потере полярных соединений.
- Обездвижить волокна в предварительно щели септы высокой производительности жидкой хроматографии (HPLC) флакон крышка путем пирсинга септы снизу с не покрытием конца волокна.
- Положите волокна обездвижены в крышку в отдельные флаконы HPLC и поместите их в выбранный транспортный контейнер.
- Выполните шаги 2.11-2.13 для волокон, предназначенных для пустого управления.
3. Транспорт и хранение
ПРИМЕЧАНИЕ: Имеется несколько вариантов транспортировки образцов в лабораторию. Рекомендуется использовать для транспортировки жидкий азот Dewar или полистирол, наполненный сухим льдом; в качестве альтернативы, пакеты со льдом могут быть использованы для немедленной и быстрой транспортировки.
- Поместите флаконы с волокнами в транспортный контейнер.
- По прибытии в лабораторию немедленно поместите флаконы с волокнами SPME в морозильную камеру -80 градусов по Цельсию или -30 градусов по Цельсию. Не храните волокна дольше, чем 3 года при -30 градусов по Цельсию или 5 лет при -80 градусов по Цельсию.
4. Пример подготовки к анализу метаболомики
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен только после того, как все образцы для эксперимента были собраны.
- Перед инструментальным анализом приготовьте смесь растворителя desorption: acetonitrile:water 80:20 v/v.
- Вынюхив флаконы со смешанными волокнами из морозильной камеры. Используйте их для анализа метаболомики.
- Этикетка флаконы, которые будут использоваться для desorption.
- Pipette 300 йл раствора desorption (подготовлен в шаге 4.1) в стеклянные вставки, помещенные в 2 мл флаконов.
- Выполните desorption от каждого волокна помещены в отдельную вставку, полностью погружая покрытие в растворитель desorption, а затем агитирует его в течение 120 мин при 1200 об/мин с помощью вихря.
- После 120 минут (как только desorption завершена) удалить шапки с зондами.
- Подготовь образец КК, смешивая 10 алицитов каждого образца из набора образцов. Размер набора образцов зависит от экспериментальной конструкции. Важно проанализировать все образцы как одну партию.
- Закройте флаконы новыми колпачками.
- Поместите флаконы в автоамплеер (4 градуса по Цельсию) жидкого хроматографии высокого разрешения масс-спектрометра (LC-HRMS) и перейти к шагу 5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рандомизировать порядок инъекций образцов, включая контрольные пробелы. Инъекция образца КК после каждых 8-10 образцов для мониторинга стабильности инструмента.
5. Метаболомический анализ с использованием обратной фазовой жидкой хроматографии и масс-спектрометра высокого разрешения (анализ RPLC-HRMS)
- Настройка параметров анализа LC-HRMS и положительного режима ионизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые в текущем исследовании в позитивном режиме, были следующими: диапазон сканирования: m/z 80-1000; разрешение 70 000; приобретение с использованием AGC (1 000 000 ионов); вводить время в C-ловушку: авто; напряжение распыления: 1,5 кВ; Уровень S-lens RF: 55%; Напряжение S-объектива: 25 V; напряжение скиммера: 15 В; температура капилляров: 300 градусов по Цельсию; оболочка газа: 40 a.u.; газ aux: 15 a.u.; Температура газового обогревателя: 300 градусов по Цельсию. Этот хроматографический метод был адаптирован из Vuckovic et al.7. Объем инъекций: 10 МКЛ. - Настройка параметров анализа LC-HRMS и режима отрицательной ионизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые в текущем исследовании в негативном режиме: диапазон сканирования: m/z 80-1000; разрешение 70 000; приобретение с использованием AGC (1 000 000 ионов); вводить время в C-ловушку: авто; напряжение распыления: 2,5 кВ; Уровень S-lens RF: 55%; Напряжение S-объектива: -25 V; напряжение скиммера: -15 В; температура капилляра: 256 градусов по Цельсию: 48 a.u; газ aux: 11 a.u.; Температура газового обогревателя: 413 градусов по Цельсию. Этот хроматографический метод был принят от Vuckovic et al.7. Объем инъекций: 10 МКЛ. - Калибруйте прибор в том, что рекомендовано производителем.
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании, инструмент был откалиброван с использованием внешней калибровки каждые 48 ч, в результате чего точность массы lt;2 ppm. - Начните анализ, нажав кнопку «Пуск» в программном обеспечении, работающем с инструментом.
- По мере завершения анализа замените столбец RPLC на столбец HILIC, измените мобильные фазы и перейдите на шаг 6.
6. Метаболомический анализ с использованием гидрофильной взаимодействия жидкой хроматографии и масс-спектрометра высокого разрешения (анализ HILIC-HRMS)
- Настройка параметров анализа LC-HRMS и положительного режима ионизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые в текущем исследовании в позитивном режиме, были следующими: диапазон сканирования: m/z 80-1000; разрешение 70 000; приобретение с использованием AGC (1 000 000 ионов); вводить время в C-ловушку: авто; напряжение распыления: 1,5 кВ; Уровень S-lens RF: 55%; Напряжение S-объектива: 25 V; напряжение скиммера: 15 В; оболочка газа: 60 a.u.; газ aux: 40 a.u.; температура газового обогревателя: 425 градусов по Цельсию; температура капилляра: 325 градусов по Цельсию. Хроматографический метод был адаптирован из Vuckovic et al.7. Объем инъекций: 10 МКЛ. - Настройка параметров анализа LC-HRMS и режима отрицательной ионизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые в текущем исследовании в негативном режиме, были следующими: диапазон сканирования: m/z 80-1000; разрешение 70 000; приобретение с использованием AGC (1 000 000 ионов); вводить время в C-ловушку: авто; напряжение распыления: 1,3 кВ; Уровень S-lens RF: 55%.; Напряжение S-объектива: -25 V; напряжение скиммера: -15 В; температура капилляров: 263 градуса по Цельсию; оболочка газа: 60 a.u.; газ aux: 30 a.u.; Температура газового обогревателя: 425 градусов по Цельсию. Хроматографический метод был адаптирован из Vuckovic et al.7. Объем инъекций: 10 МКЛ. - Калибруйте прибор в том, что рекомендовано производителем.
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании, инструмент был откалиброван с использованием внешней калибровки каждые 48 ч, в результате чего точность массы lt;2 ppm. - Начните анализ, нажав кнопку «Пуск» в программном обеспечении, работающем с инструментом.
7. Пример подготовки к липидомике анализа
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен только после того, как все образцы для эксперимента были собраны.
- Перед началом анализа приготовьте смесь растворителя desorption: изопропанол:метанол 50:50 v/v.
- Вынюхив из морозильной камеры флаконы, содержащие волокна C18, предназначенные для липидомического анализа.
- Этикетка флаконы, которые будут использоваться для desorption.
- Pipette 200 йл раствора desorption (подготовлен в шаге 7.1) для силанизированных стеклянных вставок, помещенных в 2 мл флаконов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неиланизированные вставки также могут быть использованы, но их использование может привести к плохой воспроизводимости соединений с высоким logP, так как такие соединения могут не специально прикрепляться к стеклянным стенам. - Выполните desorption от каждого волокна в отдельной вставке, полностью погружая покрытие в растворитель desorption, а затем агитирует его в течение 60 минут при 1200 об/мин с помощью вихря.
- После 60 минут, когда desorption завершена удалить шапки с зондами.
- Подготовь образец КК, смешивая 10 алицитов каждого образца из набора образцов. Размер набора образцов зависит от экспериментальной конструкции. Важно проанализировать все образцы как одну партию.
- Закройте флаконы новыми колпачками.
- Поместите флаконы в автоамплеер (4 кк) жидкого хроматографии высокого разрешения масс-спектрометра (LC-HRMS) и переместим на шаг 8.
8. Липидомический анализ с использованием обратной фазовой жидкой хроматографии и масс-спектрометрии высокого разрешения (анализ RPLC-HRMS)
- Настройка параметров анализа LC-HRMS и положительного режима ионизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые в текущем исследовании в положительном ионом режиме, были следующими: диапазон сканирования: m/z 100-1000; приобретение с использованием AGC (1 000 000 ионов); вводить время в C-ловушку: авто; напряжение брызг: 3,5 кВ, Уровень S-линзы RF: 55%; Напряжение S-объектива: 25 V; напряжение скиммера: 15 В; температура капилляра 275 градусов по Цельсию; оболочка газа: 30 a.u.; газ aux: 10 a.u.; запасной газ: 2 a.u.; температура зонда нагревателя 300 градусов по Цельсию. Lc параметры, используемые были: фаза А: метанол: вода, 40:60 с 10 мМ ацетат аммония и 1 мМ уксусной кислоты; фаза B: изопропанол:метанол, 90:10 с ацетатом аммония 1мм и уксусной кислотой 1 мМ.; градиент: 0 мин - 20% B; 1,0 мин - 20% Б; 1,5 мин - 50% Б; 7,5 мин - 70% Б; 13,0 мин - 95% Б; 17,0 мин - 95% Б; 17,1 мин - 95,5% Б; 23.0 мин. - СТОП; Колонна C18, 3,5 мкм, 2,1 мм x 75 мм; поток: 0,2 мл/мин; температура духовки: 55 градусов по Цельсию; объем инъекций: 10 йл. - Настройка параметров анализа LC-HRMS и режима отрицательной ионизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые в текущем исследовании, были следующими: параметры HRMS для отрицательного ионового режима: диапазон сканирования: m/z 100-1000; приобретение с использованием AGC (1 000 000 ионов); вводить время в C-ловушку: авто; напряжение брызг: 3,5 кВ, Уровень S-линзы RF: 55%; Напряжение S-объектива: -25 V; напряжение скиммера: -15 В; температура капилляра 275 градусов по Цельсию; оболочка газа: 30 a.u; газ aux: 10 a.u.; запасной газ: 2 a.u; температура зонда нагревателя 300 градусов по Цельсию. Хроматографический метод: такой же, как и в 8.1. - Калибруйте прибор в том, что рекомендовано производителем.
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании, инструмент был откалиброван с использованием внешней калибровки каждые 48 ч, в результате чего точность массы lt;2 ppm. - Начните анализ, нажав кнопку «Пуск» в программном обеспечении, работающем с вашим инструментом.
- По мере завершения анализа замените столбец RPLC на столбец HILIC, измените мобильные фазы и перейдите к шагу 9.
9. Липидомический анализ с использованием гидрофильной взаимодействия жидкой хроматографии и масс-спектрометра высокого разрешения (анализ HILIC-HRMS)
- Настройка параметров анализа LC-HRMS и положительного режима ионизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые в текущем исследовании в положительном ионом режиме, были следующими: диапазон сканирования: m/z 100-1000; приобретение с использованием AGC (1 000 000 ионов); напряжение распыления: 1,5 кВ; Уровень S-lens RF: 55%; Напряжение S-объектива: 25 V; напряжение скиммера: 15 В; температура капилляра 325 градусов по Цельсию; оболочка газа: 60 a.u.; газ aux: 30 a.u.; запасной газ: 2 a.u.; температура нагревателя зонда 320 C. Используемые параметры LC были: фаза A: 5 mM ацетат аммония в воде; фаза B: ацетонитрил; градиент: 0 - 2мин - 4% B; 15.0 - 20% B; 15.1 - 4% B, 21.0 мин - STOP; 3 мкм 100 мм x 2,1 мм колонны; поток: 0,4 мл/мин; температура духовки: 40 градусов по Цельсию; объем инъекций: 10 йл. - Настройка параметров анализа LC-HRMS и режима отрицательной ионизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые в текущем исследовании в режиме отрицательного иона, были следующими: диапазон сканирования: m/z 80-1000; приобретение с использованием AGC (1 000 000 ионов); напряжение распыления: 1,5 кВ, Уровень S-линзы RF: 55%; Напряжение S-объектива: -25 V; напряжение скиммера: -15 В; температура капилляра 320 градусов по Цельсию; оболочка газа: 50 a.u.; газ aux: 21 a.u.; запасной газ: 3 a.u.; температура зонда нагревателя 320 градусов по Цельсию. Хроматографический метод был таким же, как описано в 9.1. - Калибруйте прибор в том, что рекомендовано производителем.
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании, инструмент был откалиброван с использованием внешней калибровки каждые 48 ч, в результате чего точность массы lt;2 ppm. - Начните анализ, нажав кнопку «Пуск» в программном обеспечении, работающем с инструментом.
10. Обработка данных и статистический анализ
- Обработайте данные с помощью программного обеспечения, совместимого с форматом необработанных файлов данных.
- Выполняйте статистический анализ с использованием обработанных данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тип теста зависит от научной гипотезы и дизайна исследования. В текущем исследовании были использованы основной анализ компонентов, частично-наименее квадратный-дисциплинарный анализ и одноуговая ANOVA.
Representative Results
Использование твердой фазовой микроэкстракции в качестве метода подготовки образцов в сочетании с жидкой хроматографией в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения и передовым программным обеспечением для обработки данных позволило нам успешно охарактеризовать метаболому и липидом опухолей головного мозга человека. Таким образом, зонд, размер которого был эквивалентен игле иглоукалывания, нанес минимальный ущерб изученной ткани и отсутствие потребления тканей, что позволило продолжить использование образцов для гистологических или генетических исследований. Удовлетворительное разделение выбранных групп было получено как для обратных фазовых, так и для столбцов HILIC, а также для обоих режимов ионизации в анализах метаболомики и липидомики. Использование обоих методов разделения не только в метаболомике, но и в липидомном анализе предоставило ценные дополнительные данные. Обратный столбец фазы отделяет липиды по отношению к длине углеродных цепей и наличию ненасыщенных связей, в то время как столбец HILIC полезен для профилирования липидных групп, особенно фосфолипидов8.
Воспроизводимость инструментального анализа была признана очень хорошей на основе плотной кластеризации образцов КК на основной участок анализа компонентов(рисунок 3A, три образца КК вводили каждые восемь образцов пациентов вдоль перекрытия последовательности). Кроме того, были обнаружены пробелы для извлечения, используемые для отрицательного контрольного анализа, которые хорошо отделялись от реальных образцов. Широкий спектр анализов, извлеченных зондами, способствовал открытию репрезентативных видов, что позволило успешно провести дифференциацию опухолей головного мозга человека на основе их гистологического происхождения, злокачественности и других факторов (например, генетических). На рисунке 3B показаны данные липидомики для образцов, взятых у пациентов с глиомами и менингиомами. Включение дифференциации между этими опухолями, которые характеризовались различным гистологическим происхождением и злокачественностью, было важной целью исследования, так как менингиомы обычно рассматриваются как доброкачественные опухоли, в то время как глиомы являются одними из самых злокачественных. Кроме того, на рисунке 4, представляя данные метаболомики, глиомы были разделены на основе степени злокачественности на высокие и низкие. Эти подгруппы сравнивались с молекулярным фенотипом менингиом. В обоих случаях наблюдалось заметное разделение кластеров. В настоящее время диагностика глиомы в первую очередь основывается на определении специфических генетических мутаций в образцах опухолей. Таким образом, полученные результаты были сопоставлены с генотипированием данных. На рисунке 5A представлено разделение образцов с обнаруженным совместное удаление 1p19q и образцы, где мутации не наблюдалось.
Статистический анализ также позволяет отвечать соединения в изученных группах. Эти соединения могут рассматриваться в качестве потенциальных биомаркеров в тех случаях, когда отдается выборка достаточно большой когорты. Однако для того, чтобы сделать окончательные выводы биологического характера, необходим более углубленный анализ, включая окончательное подтверждение обнаруженных соединений путем фрагментации и сопоставления обнаруженных видов с аналитическими стандартами. Примеры таких дискриминантных метаболитов представлены на рисунке 3C и рисунке 5B. Идентичность этих соединений, т.е. сфингомиелина: SM d36:1 и пролина, была подтверждена путем сравнения моделей фрагментации метаболитов из выборки и подлинных стандартов.
Рисунок 1: Волокна SPME, подготовленные для процесса экстракции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Извлечение менингиомы с помощью зондов SPME. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: PCA и коробки участков для глиомы и менингиомы. Основной участок анализа компонентов,содержащий ( A) все проанализированные образцы, включая пробелы, экстракции КК, пробелы, менингиомы, глиомы; (B)содержащие только изученные группы (после исключения пробелов и КК); (C) коробка усы участок для сфингомиелин: SM d36:1 дифференциации пациента с глиомой и менингиомой. Липидомные данные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: PCA для HGG, LGG и менингиомы. Основной участок анализа компонентов,показывающий дифференциациюмежду ( A ) глиомами высокого класса (HGG) и менингиомами (MEN)9 и (B) низкосортными глиомами (LGG) и менингиомами. Метаболомики данные перепечатаны из Via Medica ref9 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: PCA и коробки участков для глиомы с и без удаления. (A)Основной участок анализа компонентов показал различия у пациентов с и без совместного удаления 1p19q; (B) коробка усы участки для proline дифференцированных пациентов с и без совместного удаления 1p19q; n-без удаления, y-с удалением. Данные метаболомики Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Нецелевые метаболомики и липидомики обычно используются в исследованиях, ориентированных на выявление биомаркеров опухоли. Однако в большинстве случаев исследователи ищут соединения, которые могут быть использованы для скрининга заболевания. Следовательно, предпочтительными биологическими образцами являются кровь или моча из-за их относительно легкого доступа. Анализ опухолевых тканей в основном проводится для понимания механизмов, стоящих за болезнью, характеризует различные типы опухолей и т.д. На месте анализ биомаркеров опухоли проводится редко, так как такие приложения требуют обширной подготовки образца. Кроме того, стратегии, основанные на анализе в режиме реального времени профилей тканей без предварительного отбора конкретных биомаркеров,привлекают внимание медицинского сообщества 3,4. Решение, представленное в настоящем подробнее, дает еще один взгляд на обработку тканей на месте, раскрывая тип информации, которую можно получить с помощью таких методов.
Сочетание выборки, подготовки образцов и экстракции делает SPME очень полезным инструментом для анализа на месте. Кроме того, отсутствие потребления тканей во время отбора проб позволяет в дальнейшем использовать те же образцы для анализа биомаркеров и рутинных испытаний (генотипирование, гистологический анализ), поэтому добавляет новую информацию к результатам стандартного тестирования. Устройство для отбора проб имеет очень простую конструкцию, его эксплуатация очень проста, и никакой специальной подготовки для выполнения самой добычи не требуется. Однако достижение надежных результатов требует гораздо большего, чем просто правильное обращение с устройствами. Чтобы правильно выполнить эксперимент, необходимо понять процесс извлечения, характер образца, и быть в курсе потенциальных ошибок, которые могут повлиять на данные.
Важно учитывать неоднородность раковых тканей10; пробы опухолей могут содержать части, проходящие некроз, кальцификации и гипоксии, и каждый из этих процессов будет отражен в метаболоме и липидоме, достигнутых, тем самым влияя на результаты. Поэтому рекомендуется проводить выборку пространственного разрешения путем вставки нескольких волокон в различные части раковой ткани, или же, чтобы более длинное покрытие было использовано для проникновения всей опухоли, чтобы получить усредненную информацию о опухоли. Если метод отбора проб пространственного разрешения осуществляется, волокна могут быть все desorbed в один растворитель desorption; это не только позволит получить общую информацию об опухоли, но и повысит чувствительность анализа. Кроме того, desorption отдельных волокон в отдельные флаконы позволит исследования, чтобы выяснить внутреннее разнообразие опухоли головного мозга, которая состоит из ядра построен из раковых клеток, и внешняя зона, которая является границей здоровых тканей. Более глубокие части опухоли, как правило, более повреждены процессами, связанными сраком 11. Тем не менее, исследователи должны иметь в виду, что этот вариант ставит под угрозу чувствительность метода и общее количество обнаруживаемых соединений. В текущих работах использовалось 7-мм покрытие; эта длина считалась оптимальной для различных размеров опухолей, включенных в исследование. Покрытия проникали в опухоли, и, таким образом, при условии, не специальное разрешение, но усредненые данные по образцу. Независимо от выбранного протокола, важно, чтобы в течение всего исследования соблюдался один и тот же протокол, включая количество волокон, используемых для индивидуальной выборки, продолжительность покрытия, время извлечения и все другие факторы, очерченные в этой работе.
Важно контролировать качество анализа. Объединение КК (см. шаги 4.7 и 7.7 в протоколе) должно быть подготовлено и использовано для мониторинга стабильности приборов во время времени времени ирования всей партии выборки. Пустые элементы управления (см. шаг 2.8) могут быть позже использованы для подготовки "списка исключений" для устранения сигналов загрязняющих веществ, происходящих из растворителей или производства волокон. В особых случаях, таких, как риск заражения, необходимо проводить отбор проб из перчаток, столов, аппаратов или любых других поверхностей, которые могут представлять опасность загрязнения. В таких случаях, волокна подготовки, время извлечения и desorption протоколы такие же, как для образцов.
Метаболомические и липидомные анализы полностью сосредоточены на небольших молекулах (менее 1500 да), появляющихся в организме или конкретных компонентах организма, таких как специфические органы, ткани, жидкости, клетки и т.д. Метаболомические и липидомные препараты предлагают снимок биохимических изменений, происходящих в организме, а в случае рака, они интегрируют информацию, связанную с геномом, гистологией и злокачественностью опухоли. Эти науки омичи создают связь между физиологией и фенотипом, поскольку метаболиты выше в биохимической лестнице, чем белки или гены12. Понимая метаболом и липидом раковых опухолей, мы приблизимся к открытию фенотипа среди всех наук-омиков, поскольку эти отрасли исследования предлагают более глубокие знания динамических изменений молекул как реакции живых организмов на различные раздражители. Как представлено в этой работе, данные, полученные в одной выборке, соответствуют гистологии рака, степени злокачественности, и отражают изменения, происходящие на уровне генома. В глиомах, как тип рака, представляющий интерес в этом исследовании, информация, скрытая в геноме, особенно важна, так как персонализированное лечение разрабатывается на основе результатов генетических тестов. Особые мутации являются прогностические маркеры исходов химиотерапии или лучевой терапии. Как попродемонстрировано здесь, выбор биомаркеров, отражающих данный мутации, возможен с предлагаемой стратегией. Мутациотельные маркеры, а также дополнительные типы дескрипторов, такие как те, которые указывают на степень злокачественности опухоли, также могут быть использованы для поддержки обычных диагностических методов.
Химическая биопсия Ex vivo с использованием твердых фазовых микроэкстракционных волокон является первым шагом в применении метода к интраоперационной диагностике. Метод может быть легко принят для отбора проб in vivo до получения разрешения от соответствующих этических советов. В таких случаях стерилизация устройств SPME должна проводиться в соответствии с принятыми процедурами стерилизации в больнице, где проводится отбор проб, т.е. автоклавированием или стерилизацией оксида этилена. Предварительно кондиционированные и стерилизованные волокна должны храниться в запечатанных упаковках, помеченных сроком годности стерилизации. Важно отметить, что волокна не должны быть очищены с использованием сурфактантов. Такая процедура может вызвать неспецифические изменения в составе сорбента, тем самым влияя на экстракции аналитов. В исследованиях, описанных в настоящем, 30-минутный период извлечения был использован, но другие доклады подтверждают, что более короткие сроки могут дать удовлетворительные результаты в исследованиях vivo 13. Huq et al. показали, что равновесное время аналитии достигается быстрее в тканях, как сложная матрица, чем в простыхматрицах 14. Однако воспроизводимость полученных результатов может быть скомпрометирована в более короткие периоды извлечения, поскольку больше анлитов будет добываться в до равновесных условиях; поэтому необходимо осуществлять точный контроль за временем.
Обе науки омичи, эксплуатируемые в рамках этой работы, имеют отличный потенциал в качестве инструментов обнаружения биомаркеров. После выбора биомаркеров или создания хемометрической модели медицинская диагностика, основанная на определении целевых метаболитов с помощью методов, применимых для проведения исследований на месте, таких как подход SPME, описанный в этой работе, может быть разработана и реализована в рамках обычной диагностики.
В протоколе, предложенном в настоящей рукописи, описывается, как проводить нецелевых метаболимических и липидомных анализов раковых тканей с использованием твердой фазовой микроэкстракции для скрининга потенциальных биомаркеров. Он предназначен для обеспечения экстракции репрезентативных соединений, дифференциации опухолей и выявления дискриминационных соединений, характеризующих данный рак, т.е. потенциальных биомаркеров. Нецелесочных анализов с SPME описаны в этой статье представляют собой отправную точку в развитии быстрой интраоперационной диагностики, где выбранная группа соединений может быть определена без необходимости скрининга всех соединений, присутствующих в образце. В интересах быстрых диагностических результатов, зонды SPME, используемые для извлечения на месте, могут быть непосредственно соединены с аналитическими приборами, расположенными в больничном учреждении. Простые экстракции, выполняемые с минимальным препаратом образца с последующим анализом без хроматографии, значительно сократят общее время с нескольких часов до нескольких минут, как уже описано для мониторингалекарств 15.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследование было поддержано грантом Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 от Национального научного центра. Авторы хотели бы отметить MilliporeSigma, бизнес Merck KGaA, Дармштадт, Германия, за предоставление устройств SPME, используемых в этой работе. Бизнес Merck в области науки о жизни работает как MilliporeSigma в США и Канаде. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Thermo Fisher Scientific за доступ к масс-спектрометру "К-Точный фокус".
Вклад авторов: JB: оптимизация подготовки выборки и параметров LC-MS, производительность экспериментов SPME-LC-MS, анализ данных, статистический анализ и интерпретация данных и подготовка рукописи, связанные с липидомной частью; ПЗГ: координация и выполнение большинства проб в больнице, оптимизация параметров отбора проб и подготовки образцов, выполнение экспериментов SPME-LC-MS, анализ данных, статистический анализ и интерпретация данных, подготовка рукописей, связанных с метаболомической частью; MG – помощь в оптимизации подготовки образца, метода LC-MS и анализа данных, связанных с липидомной частью; КГ: совместное выполнение проб SPME и оптимизация отбора проб и подготовки образцов, анализ SPME-LC-MS, связанный с метаболомической частью; KC: выполнение нескольких проб SPME в больнице, помощь в оптимизации выборки, подготовке выборки и анализе данных, связанных с метаболомической частью; KJ: производительность нескольких проб SPME в больнице, помощь в липидном анализе; ДП: выполнение хирургических процедур, набор пациентов; JF: выполнение хирургических процедур, набор пациентов; MH: выполнение хирургических процедур, координация клинической части исследования; BB: концепция, координационный надзор за проектом и подготовкой рукописей, выполнение нескольких проб
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9x5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Bi, W. L., Beroukhim, R. Beating the odds: extreme long-term survival with glioblastoma. Neuro Oncology. 16 (9), 1159-1160 (2014).
- Ifa, D. R., Eberlin, L. S. Ambient Ionization Mass Spectrometry for Cancer Diagnosis and Surgical Margin Evaluation. Clinical Chemistry. 62, 111-123 (2016).
- Alexander, J., et al. A novel methodology for in vivo endoscopic phenotyping of colorectal cancer based on real-time analysis of the mucosal lipidome: a prospective observational study of the iKnife. Surgical Endoscopy. 31 (3), 1361-1370 (2017).
- Reyes-Garcés, N., et al. Advances in Solid Phase Microextraction and Perspective on Future Directions. Analytical Chemistry. 90, 302-360 (2018).
- Pawliszyn, J. Handbook of Solid Phase Microextraction. , Chemical Industry Press. Beijing. (2009).
- Vuckovic, D., Pawliszyn, J. Systematic Evaluation of Solid-Phase Microextraction Coatings for Untargeted Metabolomic Profiling of Biological Fluids by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 83, 1944-1954 (2011).
- Cajka, T., Fiehn, O. Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 61, 192-206 (2014).
- Goryńska, P. Z., et al. A new strategy for brain tumour metabolomic analysis. Medical Research Journal. 3 (1), 15-22 (2018).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Fernandes, M., Rosel, D., Brábek, J. Translation in solid cancer: are size-based response criteria an anachronism. Clinical Translational Oncology. 17 (1), 1-10 (2015).
- Lämmerhofer, M., Weckwerth, W. Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data. , Wiley-VCH. (2013).
- Lendor, S., et al. Solid Phase Microextraction- Based Miniaturized Probe and Protocol for Extraction of Neurotransmitters from Brains in Vivo. Analytical Chemistry. 91 (7), 4896-4905 (2019).
- Huq, M., Tascon, M., Nazdrajic, E., Roszkowska, A., Pawliszyn, J. Measurement of Free Drug Concentration from Biological Tissue by Solid-Phase Microextraction: In Silico and Experimental Study. Analytical Chemistry. 91 (12), 7719-7728 (2019).
- Looby, N., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
