Summary
Il manoscritto presenta il campionamento in loco di tumori cerebrali umani con microesezione in fase solida seguita dalla loro profilazione biochimica verso la scoperta di biomarcatori.
Abstract
Nonostante la varietà di strumenti disponibili per la diagnosi e la classificazione del cancro, i metodi che consentono una caratterizzazione rapida e semplice dei tumori sono ancora necessari. Negli ultimi anni, la spettrometria di massa è diventata un metodo di scelta per la profilazione non mirata di composti discriminatori come potenziali biomarcatori di una malattia. I biofluidi sono generalmente considerati matrici preferibili data la loro accessibilità e una più facile elaborazione del campione, mentre la profilazione diretta dei tessuti fornisce informazioni più selettive su un dato cancro. La preparazione dei tessuti per l'analisi attraverso metodi tradizionali è molto più complessa e dispendiosa in termini di tempo e, pertanto, non è adatta per un'analisi rapida in loco. Il lavoro attuale presenta un protocollo che combina la preparazione del campione e l'estrazione di piccole molecole in loco, immediatamente dopo la resezione del tumore. Il dispositivo di campionamento, delle dimensioni di un agopuntura, può essere inserito direttamente nel tessuto e quindi trasportato al laboratorio vicino per l'analisi strumentale. I risultati delle analisi della metabolomica e della lipidomica dimostrano la capacità dell'approccio per la definizione di fenotipi di tumori legati all'origine istologica del tumore, malignità e mutazioni genetiche, nonché per la selezione di composti discriminanti o potenziali biomarcatori. Il carattere non distruttivo della tecnica consente di eseguire successivamente prove utilizzate di routine, ad esempio prove istologiche, sugli stessi campioni utilizzati per l'analisi SPME, consentendo così il raggiungimento di informazioni più complete a supporto della diagnostica personalizzata.
Introduction
La risonanza magnetica (MRI) e la tomografia computerizzata (TC) sono i principali metodi utilizzati per l'analisi in tempo reale delle lesioni cerebrali. La differenziazione del tumore al cervello si basa generalmente sull'istopatologia con colorazione aggiuntiva e tecniche immunoistochimiche avanzate. Secondo le linee guida aggiornate sui tumori cerebrali nervosi centrali emesse dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) nel 2016, i test genetici sono cruciali per la differenziazione e la classificazione di questi tumori1. La differenziazione e la classificazione dei tumori consentono ai medici di scegliere il trattamento più efficace per un determinato tipo di tumore, espandendo così l'aspettativa di vita del paziente. Sfortunatamente, nonostante la disponibilità di metodi così avanzati per assistere i medici nella selezione di una terapia ottimale per i loro pazienti, l'aspettativa di vita dei pazienti a cui è stato diagnosticato il glioblastoma (glioma di iv grado) è solo di circa 15-16 mesi2. Anche con la sofisticazione e la maggiore accuratezza di tali metodi di imaging e istologici come strumenti diagnostici, c'è ancora un grande bisogno di nuove tecniche in grado di offrire informazioni complementari per aiutare i medici nelle decisioni relative al corso del trattamento. Negli ultimi anni sono stati proposti diversi nuovi approcci basati sulla spettrometria di massa per l'analisi intraoperatoria del cancro3,4. Il potenziale della microesezione in fase solida (SPME), il metodo qui presentato, come strumento di analisi rapida in loco, è già stato dimostrato in una varietà di studi5. L'attuale manoscritto mostra una delle applicazioni cliniche del metodo, metabolomica non mirata e lipidomica dei tumori cerebrali umani. Le indagini non mirate presentano un importante punto di partenza per la scoperta di potenziali biomarcatori. Una volta stabiliti, tali biomarcatori possono quindi essere utilizzati come riferimenti diagnostici per differenziare tra i tumori utilizzando la stessa tecnologia accoppiata alla strumentazione in loco.
SPME è una tecnica di preparazione del campione basata sull'equilibrio che estrae piccole molecole da matrici campione con l'uso di piccole quantità di fase di estrazione. Nella configurazione più tradizionale di SPME del dispositivo (sonda), una fibra viene rivestita con un'appropriata fase di estrazione e immobilizzata su un supporto solido, cioè un filometallico 5,6. I rivestimenti e i dispositivi biocompatibili (sonde) consentono l'estrazione direttamente da matrici biologiche complesse senza pretrattamento del campione, ad esempio omogeneizzazione e filtrazione. Attraverso il processo di estrazione, gli aliti vengono partizionati tra la fase di estrazione e la matrice del campione in proporzione alle loro concentrazioni iniziali. Se l'estrazione viene effettuata abbastanza a lungo, si raggiunge l'equilibrio. Mentre l'estrazione all'equilibrio fornisce la massima sensibilità e riproducibilità possibile, l'estrazione pre-equilibrio è anche possibile e persino preferibile in alcuni casi, cioè il campionamento in vivo, dove le restrizioni di tempo associate al campionamento in loco (ad esempio, sale operatorie o di emergenza) richiedono estrazioni veloci. Il profilo del tempo di estrazione di un dato alyte è generalmente influenzato dalle proprietà fisicochimiche dell'alita, dalla matrice campiostata, dal tipo di assorbente utilizzato e da molte altre condizioni di estrazione. La pletora di fattori che regolano la loro cinetica di estrazione rende praticamente impossibile garantire l'estrazione di equilibrio di tutti i composti quando vengono eseguite analisi non mirate come la metabolomica o la lipidomica. Per i suddetti motivi, i tempi di estrazione dell'attuale protocollo sono stati fissati arbitrariamente per garantire una sensibilità e una copertura soddisfacenti dei metaboliti, da un lato, e la praticità per l'uso in loco, dall'altro.
Va sottolineato che le dimensioni molto ridotte delle sonde utilizzate per l'estrazione del campione dai tessuti causano solo danni minimi ai tessuti, mentre la procedura di campionamento stessa non consuma tessuto, ma quantità molto piccole di piccole molecole dall'area campionare; pertanto, lo stesso campione può essere ulteriormente utilizzato per test di routine, cioè istologici o genetici, consentendo il conseguimento di informazioni essenziali e complementari dallo stesso campione. Tali dati complementari e completi consentirebbero una migliore comprensione della biologia tumorale, facilitando si spera la scoperta di nuovi obiettivi di trattamento. Lo sfruttamento di questo metodo aumenta ulteriormente la possibilità di diagnostica intraoperatoria in loco quando si determinano i biomarcatori target.
Di seguito presentiamo protocolli per il campionamento di tumori cerebrali in loco per analisi metabolomiche e lipidomiche ed elaborazione dati.
Protocol
Lo studio presentato nel presente documento è stato approvato dal Comitato di Bioetica del Collegium Medicum di Bydgoszcz presso l'Università Nicolaus Copernicus di Toruń (KB 628/2015). Ricorda di indossare sempre un camice da laboratorio e qualsiasi altra attrezzatura di sicurezza personale richiesta, come (ma non limitatamente a) guanti e occhiali di sicurezza. Non toccare la fase di estrazione delle sonde di microestrazione in fase solida (SPME).
1. Preparazione dei dispositivi SPME
- Utilizzare sonde (fibre) con rivestimenti in modalità mista e C18 rispettivamente per metabolomica e lipidomica. Raccogliere due set di campioni, uno per la metabolomica e uno per la lipidomica.
- Regolare il rivestimento della sonda su una lunghezza ottimale tagliando la sonda SPME. Nello studio attuale, la lunghezza del rivestimento selezionata era di 7 mm. Selezionare la lunghezza della fibra in base alle dimensioni del tumore in esame, assicurando che l'intero assorbente possa essere immerso nel tumore (Figura 1).
- Condizionare i rivestimenti delle sonde immergendoli in metanolo: acqua miscela 50:50 v/v per un periodo minimo di 1 h prima della procedura di estrazione. Trasportare le fibre nel sito di campionamento (ad esempio, ospedale) in una fiala contenente la soluzione condizionante.
2. Procedura di raccolta dei campioni
- Non lavare o pretrattare il tumore in alcun modo prima dell'estrazione di SPME.
- Iniziare il campionamento il prima possibile dopo la rimozione del tumore (2 minuti nello studio presentato).
NOTA: Regolare il tempo a seconda dell'impianto in loco per una determinata struttura (distanza del sito di lavoro del ricercatore dal tavolo operatorio) e mantenerlo costante per l'intero studio. Ridurre al minimo il tempo trascorso tra la rimozione del tumore e l'inizio dell'estrazione è fondamentale per la cattura di metaboliti instabili che si degradano dopo che la circolazione sanguigna è stata tagliata fuori dal tessuto studiato. - Eseguire il campionamento a temperatura ambiente. In alternativa, posizionare il campione sul ghiaccio quando viene eseguita l'estrazione. In entrambi i casi, mantenere le stesse condizioni per l'intero set di campioni.
- Eserti la sonda dal flaconcino.
- Lavare le fibre con acqua liquida di grado cromatografia-spettrometria di massa (LC/MS) per 5 s immergendole in acqua di grado LC/MS. Non lasciare asciugare il assorbente prima dell'inserimento della fibra per garantire una buona riproducibilità dei dati.
- Inserire le fibre nel tessuto tumorale cerebrale il più distante possibile, assicurando che l'intera fase di estrazione si trovi all'interno del tumore.
NOTA: Si raccomanda di effettuare estrazioni in replica per determinare la natura eterogenea del tumore (Figura 2). Sono consigliate tre repliche per esempio. - Lasciare la sonda per 30 minuti nel tessuto (misurata con un timer).
- Utilizzare controlli vuoti per eliminare le fonti di errore legate alla presenza di manufatti derivanti da fonti diverse dal tumore campionato. Per ottenere controlli vuoti, sottoposere fibre allo stesso flusso di lavoro analitico, come descritto sopra, ma senza la fase di campionamento (inserimento nel tessuto o in qualsiasi altro campione/matrice). Nella fase di elaborazione dei dati, compilare gli aliti estratti da queste fibre in un "elenco di esclusione" per escludere i segnali derivati da contaminanti derivanti da solventi o produzione di fibre. Si consiglia di utilizzare almeno 3 repliche di spazi vuoti.
NOTA: Per verificare il rischio di contaminazione, è necessario eseguire il campionamento da guanti, tavoli, apparecchi o qualsiasi altra superficie che possa rappresentare un rischio di contaminazione. In questi casi, la preparazione delle fibre, il tempo di estrazione e i protocolli di desorbimento sono gli stessi di quello per i campioni. - Durante l'estrazione, etichettare le fiale da utilizzare per lo stoccaggio delle sonde dopo l'estrazione.
- Dopo 30 minuti, rimuovere le fibre dal tumore al cervello.
- Lavare le fibre con acqua per 3 s immergendole in acqua di grado LC/MS per rimuovere residui di sangue o detriti cellulari dalla sonda in modo che l'estratto finale contenga solo piccole molecole. Una fase di lavaggio più lunga non è raccomandata in quanto può portare alla perdita di composti polari.
- Immobilizzare le fibre nel setto pre-fessurato del cappuccio del flaconcino a liquido ad alte prestazioni (HPLC) perforando il setto dal basso con l'estremità non rivestita della fibra.
- Mettere le fibre immobilizzate nel cappuccio in flaconcini HPLC separati e posizionarle nel contenitore di trasporto selezionato.
- Eseguire i passaggi da 2.11 a 2.13 per le fibre dedicate ai controlli vuoti.
3. Trasporto e magazzinaggio
NOTA: Sono disponibili diverse opzioni per il trasporto di campioni in laboratorio. Si raccomanda di utilizzare per il trasporto una scatola di azoto liquido Dewar o polistirolo riempita di ghiaccio secco; in alternativa, le confezioni di ghiaccio possono essere utilizzate per il trasporto immediato e rapido.
- Posizionare le fiale con fibre nel contenitore di trasporto.
- All'arrivo in laboratorio, posizionare immediatamente le fiale con fibre SPME in un congelatore a -80 °C o -30 °C. Non conservare fibre più lunghe di 3 anni a -30 °C o 5 anni a -80 °C.
4. Preparazione del campione per l'analisi della metabolomica
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito solo una volta raccolti tutti i campioni per un esperimento.
- Prima dell'analisi strumentale, preparare la miscela di solventi di desorbimento: acetonitrile:acqua 80:20 v/v.
- Eseni le fiale contenenti le fibre in modalità mista dal congelatore. Usali per l'analisi metabolomica.
- Flaconcini per etichette da utilizzare per il desorbimento.
- Pipetta 300 μL della soluzione di desorbimento (preparata nella fase 4.1) in inserti in vetro posti in flaconcini da 2 mL.
- Eseguire il desorbimento da ogni fibra posta in un inserto separato immergendo completamente il rivestimento nel solvente di desorbimento, quindi agitarlo per 120 min a 1.200 giri/min utilizzando il vortice.
- Dopo 120 min (una volta completato il desorbimento) rimuovere i tappi con sonde.
- Preparare il campione QC mescolando 10 μL di aliquote di ciascun campione dal set di campioni. La dimensione del set di campioni dipende dal progetto sperimentale. È importante analizzare tutti i campioni come un unico lotto.
- Chiudere le fiale con nuovi tappi.
- Posizionare i flaconcini nell'autocampionatore (4 °C) dello spettrometro di massa ad alta risoluzione della cromatografia liquida (LC-HRMS) e passare al passaggio 5.
NOTA: Randomizzare l'ordine delle iniezioni dei campioni, inclusi gli spazi vuoti di controllo. Iniettare il campione QC dopo ogni 8-10 campioni per monitorare la stabilità dello strumento.
5. Analisi metabolomica utilizzando cromatografia liquida in fase inversa e spettrometro di massa ad alta risoluzione (analisi RPLC-HRMS)
- Impostare i parametri dell'analisi LC-HRMS e della modalità di ionizzazione positiva.
NOTA: I parametri utilizzati nello studio attuale in modalità positiva erano i seguenti: intervallo di scansione: m/z 80-1000; risoluzione 70 000; acquisizione effettuata utilizzando AGC (1.000.000 ioni); iniettare tempo a C-trap: auto; tensione di spruzzatura: 1,5 kV; Livello RF dell'obiettivo S: 55%; Tensione dell'obiettivo S: 25 V; tensione skimmer: 15 V; temperatura capillare: 300 °C; gas di sheath: 40 a.u.; gas aux: 15 a.u.; temperatura del riscaldatore aux gas: 300 °C. Questo metodo cromatografico è stato adattato da Vuckovic etal. Volume di iniezione: 10 μL. - Impostare i parametri dell'analisi LC-HRMS e della modalità di ionizzazione negativa.
NOTA: I parametri utilizzati nello studio attuale in modalità negativa: intervallo di scansione: m/z 80-1000; risoluzione 70 000; acquisizione effettuata utilizzando AGC (1.000.000 ioni); iniettare tempo a C-trap: auto; tensione di spruzzatura: 2,5 kV; Livello RF dell'obiettivo S: 55%; Tensione dell'obiettivo S: -25 V; tensione skimmer: -15 V; temperatura capillare: gas di sheath a 256 °C: 48 a.u;; gas aux: 11 a.u.; temperatura del riscaldatore aux gas: 413 °C. Questo metodo cromatografico è stato adottato da Vuckovic etal. Volume di iniezione: 10 μL. - Calibrare lo strumento come raccomandato dal produttore.
NOTA: Nello studio attuale, lo strumento è stato calibrato utilizzando la calibrazione esterna ogni 48 ore, con conseguente precisione di massa <2 ppm. - Avviare l'analisi facendo clic sul pulsante Start nel software che gestisce lo strumento.
- Al termine dell'analisi, sostituire la colonna RPLC con la colonna HILIC, modificare le fasi mobili e passare al passaggio 6.
6. Analisi metabolomica utilizzando cromatografia liquida ad interazione idrofila e spettrometro di massa ad alta risoluzione (analisi HILIC-HRMS)
- Impostare i parametri dell'analisi LC-HRMS e della modalità di ionizzazione positiva.
NOTA: I parametri utilizzati nello studio attuale in modalità positiva erano i seguenti: intervallo di scansione: m/z 80-1000; risoluzione 70 000; acquisizione effettuata utilizzando AGC (1.000.000 ioni); iniettare tempo a C-trap: auto; tensione di spruzzatura: 1,5 kV; Livello RF dell'obiettivo S: 55%; Tensione dell'obiettivo S: 25 V; tensione skimmer: 15 V; gas di sheath: 60 a.u.; gas aux: 40 a.u.; temperatura del riscaldatore aux gas: 425 °C; temperatura capillare: 325 °C. Il metodo cromatografico è stato adattato da Vuckovic etal. Volume di iniezione: 10 μL. - Impostare i parametri dell'analisi LC-HRMS e della modalità di ionizzazione negativa.
NOTA: I parametri utilizzati nello studio attuale in modalità negativa erano i seguenti: intervallo di scansione: m/z 80-1000; risoluzione 70 000; acquisizione effettuata utilizzando AGC (1.000.000 ioni); iniettare tempo a C-trap: auto; tensione di spruzzatura: 1,3 kV; Livello RF dell'obiettivo S: 55%; Tensione dell'obiettivo S: -25 V; tensione skimmer: -15 V; temperatura capillare: 263 °C; gas di sheath: 60 a.u.; gas aux: 30 a.u.; temperatura del riscaldatore aux gas: 425 °C. Il metodo cromatografico è stato adattato da Vuckovic etal. Volume di iniezione: 10 μL. - Calibrare lo strumento come raccomandato dal produttore.
NOTA: Nello studio attuale, lo strumento è stato calibrato utilizzando la calibrazione esterna ogni 48 ore, con conseguente precisione di massa <2 ppm. - Avviare l'analisi facendo clic sul pulsante Start nel software che gestisce lo strumento.
7. Preparazione del campione per l'analisi lipidomica
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito solo dopo aver raccolto tutti i campioni per l'esperimento.
- Prima di iniziare l'analisi, preparare la miscela di solvente da desorbimento: isopropanolo:metanolo 50:50 v/v.
- Eseni dal congelatore le fiale contenenti le fibre C18 dedicate all'analisi lipidomica.
- Flaconcini per etichette da utilizzare per il desorbimento.
- Pipetta 200 μL della soluzione di desorbimento (preparata nella fase 7.1) a inserti in vetro silanizzato posti in flaconcini da 2 mL.
NOTA: È possibile utilizzare anche inserti non silanizzati, ma il loro uso può comportare una scarsa riproducibilità di composti con logP elevato, in quanto tali composti possono non essere specificamente attaccati alle pareti di vetro. - Eseguire il desorbimento da ogni fibra in un inserto separato immergendo completamente il rivestimento nel solvente di desorbimento, quindi agitarlo per 60 min a 1.200 giri/min utilizzando il vortice.
- Dopo 60 minuti al termine del desorbimento rimuovere i tappi con sonde.
- Preparare il campione QC mescolando 10 μL di aliquote di ciascun campione dal set di campioni. La dimensione del set di campioni dipende dal progetto sperimentale. È importante analizzare tutti i campioni come un unico lotto.
- Chiudere le fiale con nuovi tappi.
- Posizionare i flaconcini nell'autocampionatore (4 °C) dello spettrometro di massa ad alta risoluzione della cromatografia liquida (LC-HRMS) e passare al passaggio 8.
8. Analisi lipidomica utilizzando cromatografia liquida in fase inversa e spettrometria di massa ad alta risoluzione (analisi RPLC-HRMS)
- Impostare i parametri dell'analisi LC-HRMS e della modalità di ionizzazione positiva.
NOTA: I parametri utilizzati nello studio attuale in modalità ioni positivi erano i seguenti: intervallo di scansione: m/z 100-1000; acquisizione effettuata utilizzando AGC (1.000.000 ioni); iniettare tempo a C-trap: auto; tensione di spruzzatura: 3,5 kV, livello RF dell'obiettivo S: 55%; Tensione dell'obiettivo S: 25 V; tensione skimmer: 15 V; temperatura capillare 275 °C; gas di sheath: 30 a.u.; aux gas: 10 a.u.; gas di ricambio: 2 a.u.; temperatura del riscaldatore sonda 300 °C. I parametri LC utilizzati erano: fase A: metanolo:acqua, 40:60 con acetato di ammonio da 10 mM e acido acetico da 1 mM; fase B: isopropanolo:metanolo, 90:10 con acetato di ammonio da 10 mM e acido acetico da 1 mM.; la pendenza: 0 min – 20% B; 1,0 min – 20% B; 1,5 min – 50% B; 7,5 min – 70% B; 13,0 min – 95% B; 17,0 min – 95% B; 17,1 min – 95,5 % B; 23,0 min – STOP; Colonna C18, 3,5 μm, 2,1 mm x 75 mm; flusso: 0,2 mL/min; temperatura del forno: 55 °C; volume di iniezione: 10 μL. - Impostare i parametri dell'analisi LC-HRMS e della modalità di ionizzazione negativa.
NOTA: I parametri utilizzati nello studio attuale erano i seguenti: parametri HRMS per la modalità ionica negativa: intervallo di scansione: m/z 100-1000; acquisizione effettuata utilizzando AGC (1.000.000 ioni); iniettare tempo a C-trap: auto; tensione di spruzzatura: 3,5 kV, livello RF dell'obiettivo S: 55%; Tensione dell'obiettivo S: -25 V; tensione skimmer: -15 V; temperatura capillare 275 °C; gas di sheath: 30 a.u; aux gas: 10 a.u.; gas di scorta: 2 a.u; temperatura del riscaldatore sonda 300 °C. Metodo cromatografico: lo stesso di cui al punto 8.1. - Calibrare lo strumento come raccomandato dal produttore.
NOTA: Nello studio attuale, lo strumento è stato calibrato utilizzando la calibrazione esterna ogni 48 ore, con conseguente precisione di massa <2 ppm. - Avviare l'analisi facendo clic sul pulsante Start nel software che gestisce lo strumento.
- Al termine dell'analisi, sostituire la colonna RPLC con la colonna HILIC, modificare le fasi mobili e passare al passaggio 9.
9. Analisi lipidomica utilizzando cromatografia liquida ad interazione idrofila e spettrometro di massa ad alta risoluzione (analisi HILIC-HRMS)
- Impostare i parametri dell'analisi LC-HRMS e della modalità di ionizzazione positiva.
NOTA: I parametri utilizzati nello studio attuale in modalità ioni positivi erano i seguenti: intervallo di scansione: m/z 100-1000; acquisizione effettuata utilizzando AGC (1.000.000 ioni); tensione di spruzzatura: 1,5 kV; Livello RF dell'obiettivo S: 55%; Tensione dell'obiettivo S: 25 V; tensione skimmer: 15 V; temperatura capillare 325 °C; gas di sheath: 60 a.u.; gas aux: 30 a.u.; gas di ricambio: 2 a.u.; temperatura del riscaldatore sonda 320 °C. I parametri LC utilizzati erano: fase A: acetato di ammonio di 5 mM in acqua; fase B: acetonitrile; la pendenza: 0 – 2 min – 4% B; 15,0 – 20% B; 15,1 – 4% B, 21,0 min – STOP; Colonna 3 μm 100 mm x 2,1 mm; flusso: 0,4 mL/min; temperatura del forno: 40 °C; volume di iniezione: 10 μL. - Impostare i parametri dell'analisi LC-HRMS e della modalità di ionizzazione negativa.
NOTA: I parametri utilizzati nello studio attuale in modalità ioni negativi erano i seguenti: intervallo di scansione: m/z 80-1000; acquisizione effettuata utilizzando AGC (1.000.000 ioni); tensione di spruzzatura: 1,5 kV, livello RF dell'obiettivo S: 55%; Tensione dell'obiettivo S: -25 V; tensione skimmer: -15 V; temperatura capillare 320 °C; gas di sheath: 50 a.u.; gas aux: 21 a.u.; gas di ricambio: 3 a.u.; temperatura del riscaldatore sonda 320 °C. Il metodo cromatografico era lo stesso descritto nella 9.1. - Calibrare lo strumento come raccomandato dal produttore.
NOTA: Nello studio attuale, lo strumento è stato calibrato utilizzando la calibrazione esterna ogni 48 ore, con conseguente precisione di massa <2 ppm. - Avviare l'analisi facendo clic sul pulsante Start nel software che gestisce lo strumento.
10. Informatica e analisi statistica
- Elaborare i dati utilizzando software compatibile con il formato dei file di dati non elaborati.
- Eseguire analisi statistiche utilizzando i dati elaborati.
NOTA: Il tipo di test dipende dall'ipotesi scientifica e dalla progettazione dello studio. Nello studio corrente sono state utilizzate l'analisi dei componenti principali, l'analisi discriminante quadrata a minimo parziale e l'ANOVA uni-way.
Representative Results
Sfruttare la microesezione in fase solida come metodo di preparazione del campione in combinazione con la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione e un software avanzato di elaborazione dei dati ci ha permesso di caratterizzare con successo il metaboloma e il lipidome dei tumori cerebrali umani. La sonda, la cui dimensione era equivalente a un agopuntura, ha causato un danno minimo al tessuto studiato e nessun consumo di tessuti, consentendo quindi l'ulteriore utilizzo di campioni per studi istologici o genetici. La separazione soddisfacente dei gruppi selezionati è stata ottenuta sia per le colonne in fase invertita che per le colonne HILIC, sia per entrambi i modi di ionizzazione nelle analisi metabolomiche e lipidomiche. L'uso di entrambi i metodi di separazione non solo nella metabolomica, ma anche nell'analisi lipidomica ha fornito preziosi dati complementari. La colonna di fase invertita separa i lipidi rispetto alla loro lunghezza delle catene di carbonio e alla presenza di legami insaturi, mentre la colonna HILIC è utile per profilare i gruppi lipidici, in particolare i fosfolipidi8.
La riproducibilità dell'analisi strumentale è stata trovata molto buona sulla base dello stretto raggruppamento di campioni qc sul grafico di analisi dei componenti principali(Figura 3A,i tre campioni qc iniettati ogni otto campioni di pazienti lungo la sovrapposizione della sequenza). Inoltre, sono stati trovati spazi vuoti di estrazione utilizzati per l'analisi di controllo negativo che si separano bene dai campioni reali. L'ampia gamma di aliti estratti dalle sonde ha facilitato la scoperta di specie rappresentative, consentendo così con successo la differenziazione tra i tumori cerebrali umani in base alla loro origine istologica, malignità e altri fattori (ad esempio, genetici). La figura 3B mostra i dati lipidomici per campioni raccolti da pazienti con gliomi e meningiomi. Consentire la differenziazione tra questi tumori, che erano caratterizzati da diversa origine istologica e malignità, era un obiettivo importante dello studio, poiché i meningiomi sono generalmente considerati tumori benigni, mentre i gliomi sono uno dei più maligni. Inoltre, nella figura 4 che presenta i dati della metabolomica, i gliomi sono stati divisi in base al loro grado di malignità in alto e basso. Questi sottogruppi sono stati confrontati con il fenotipo molecolare dei meningiomi. In entrambi i casi, è stata osservata un'importante separazione degli ammassi. Al giorno d'oggi, la diagnostica del glioma si basa principalmente sulla determinazione di specifiche mutazioni genetiche nei campioni tumorali. Pertanto, i risultati ottenuti sono stati confrontati con i dati di genotipizzazione. La figura 5A presenta la separazione dei campioni con co-eliminazione rilevata 1p19q e campioni in cui la mutazione non è stata osservata.
L'analisi statistica consente anche la selezione dei composti nei gruppi studiati. Questi composti possono essere considerati potenziali biomarcatori nei casi in cui viene campiottata una coorte di dimensioni adeguatamente grandi. Tuttavia, per trarre conclusioni definitive di natura biologica è necessaria un'analisi più approfondita, compresa la conferma conclusiva dei composti rilevati mediante frammentazione e confronto tra specie rilevate e norme analitiche. Esempi di tali metaboliti discriminanti sono presentati nella figura 3C e nella figura 5B. L'identità di questi composti, vale a dire la sfingomielina: SM d36:1 e la prolina sono state confermate confrontando i modelli di frammentazione dei metaboliti del campione e gli standard autentici.
Figura 1: Fibre SPME preparate per il processo di estrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Estrazione del meningioma mediante sonde SPME. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: PCA e box plot per glioma e meningioma. Grafico di analisi dei componenti principali contenente (A) tutti i campioni analizzati tra cui spazi vuoti, QC di estrazione, spazi vuoti, meningiomi, gliomi; (B) contenenti solo gruppi studiati (previa esclusione di spazi vuoti e QC); (C) box whisker plot per sfingomielyn: PAZIENTE che differenzia SM d36:1 con glioma e meningioma. Dati lipidomici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: PCA per HGG, LGG e meningioma. Grafico di analisi dei componenti principali che mostra la differenziazione tra (A) gliomi di alta qualità (HGG) e meningiomi (MEN)9 e(B)gliomi di basso grado (LGG) e meningiomi. Dati metabolomici ristampati da Via Medica ref9 con autorizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: PCA e box plot per glioma con e senza cancellazione. (A) Il grafico principale di analisi dei componenti ha mostrato differenze nei pazienti con e senza co-deelezione 1p19q; (B) box whisker plots per pazienti differenziati prolina con e senza co-deelezione 1p19q; n-senza eliminazione, y-with eliminazione. Dati metabolomici Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Metabolomica non mirata e lipidomica sono comunemente usati in studi focalizzati sull'identificazione dei biomarcatori tumorali. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, i ricercatori cercano composti che possono essere utilizzati per lo screening della malattia. Di conseguenza, i campioni biologici preferiti sono sangue o urina a causa del loro accesso relativamente facile. L'analisi del tessuto tumorale viene eseguita principalmente per comprendere i meccanismi alla base della malattia, caratterizzare diversi tipi di tumore, ecc. L'analisi in loco dei biomarcatori tumorali viene eseguita raramente, in quanto tali applicazioni richiedono un'ampia preparazione del campione. In alternativa, le strategie basate sull'analisi in tempo reale dei profili tissutali senza preselezione di biomarcatori specifici stanno guadagnando l'attenzione della comunitàmedica 3,4. La soluzione qui presentata fornisce un'altra prospettiva sulla lavorazione dei tessuti in loco svelando il tipo di informazioni che possono essere ottenute tramite tali metodi.
La combinazione di campionamento, preparazione del campione ed estrazione rende SPME uno strumento molto utile per l'analisi in loco. Inoltre, la mancanza di consumo di tessuti durante il campionamento consente un ulteriore utilizzo degli stessi campioni per l'analisi del biomarcatore e le prove di routine (genotipizzazione, analisi istologiche), aggiungendo quindi nuove informazioni ai risultati delle prove standard. Il dispositivo di campionamento ha un design molto semplice, il suo funzionamento è molto semplice e non è richiesto alcun allenamento speciale per eseguire l'estrazione stessa. Tuttavia, il raggiungimento di risultati affidabili richiede molto di più della semplice corretta gestione dei dispositivi. Per eseguire correttamente l'esperimento, è necessario comprendere il processo di estrazione, la natura del campione ed essere consapevoli di potenziali errori che possono influenzare i dati.
È importante considerare l'eterogeneità del tessuto canceroso10; i tumori campionati possono contenere parti sottoposte a necrosi, calcificazione e ipossia, e ciascuno di questi processi si rifletterà nel metaboloma e nel lipidoma raggiunti, influenzando così i risultati. Pertanto, si raccomanda che il campionamento a risoluzione spaziale sia effettuato mediante l'inserimento di diverse fibre in diverse parti del tessuto canceroso o, in alternativa, che venga utilizzato un rivestimento più lungo per penetrare l'intero tumore in modo da ottenere informazioni medie sul tumore. Se viene eseguito il metodo di campionamento della risoluzione spaziale, le fibre possono essere tutte desorbita in un unico solvente di desorbimento; ciò consentirebbe non solo il raggiungimento di informazioni generali sul tumore, ma aumenterebbe anche la sensibilità dell'analisi. In alternativa, il desorbimento delle singole fibre in fiale separate consentirebbe alle indagini di capire la diversità interna del tumore al cervello, che consiste nel nucleo costruito di cellule cancerose, e la zona esterna, che è il bordo del tessuto sano. Parti più profonde del tumore sono solitamente più danneggiate dai processi legati al cancro11. Tuttavia, gli investigatori devono tenere presente che questa opzione compromette la sensibilità del metodo e il numero complessivo di composti rilevabili. Nel lavoro attuale è stato utilizzato un rivestimento da 7 mm; questa lunghezza è stata considerata ottimale per varie dimensioni di tumori inclusi nello studio. I rivestimenti penetrarono nei tumori, e quindi fornirono una risoluzione non speciale, ma mediarono i dati in tutto il campione. Indipendentemente dal protocollo selezionato, è importante che lo stesso protocollo venga seguito durante l'intero studio, incluso il numero di fibre utilizzate per il campionamento individuale, la lunghezza del rivestimento, il tempo di estrazione e tutti gli altri fattori delineati in questo lavoro.
È importante controllare la qualità dell'analisi. Il QC in pool (vedere i passaggi 4.7 e 7.7 nel protocollo) deve essere preparato e utilizzato per monitorare la stabilità dello strumento durante l'esecuzione dell'intero lotto campione. I controlli in bianco (vedere fase 2.8) possono essere successivamente utilizzati per preparare una "lista di esclusione" per eliminare i segnali di contaminanti provenienti da solventi o dalla produzione di fibre. In occasioni speciali, come il rischio di contaminazione, è necessario eseguire il campionamento da guanti, tavoli, apparecchi o qualsiasi altra superficie che possa rappresentare un rischio di contaminazione. In questi casi, la preparazione delle fibre, il tempo di estrazione e i protocolli di desorbimento sono gli stessi dei campioni.
Le analisi metabolomiche e lipidomiche sono focalizzate interamente su piccole molecole (meno di 1.500 Da) che compaiono in un organismo o in componenti specifici dell'organismo, come organi specifici, tessuti, fluidi, cellule, ecc. La metabolomica e la lipidomica offrono un'istantanea dei cambiamenti biochimici che si verificano nel corpo e, nel caso del cancro, integrano informazioni relative al genoma, all'istologia e alla malignità del tumore. Queste scienze omiche creano una connessione tra fisiologia e fenotipo in quanto i metaboliti sono più alti nella scala biochimica rispetto alle proteine o aigeni 12. Comprendendo il metaboloma e il lipidoma dei tumori cancerosi, ci avviciniamo alla scoperta del fenotipo tra tutte le scienze dell'omica in quanto questi rami di studio offrono una conoscenza più approfondita dei cambiamenti dinamici delle molecole come risposta degli organismi viventi a vari stimoli. Come presentato in questo lavoro, i dati ottenuti in un campione corrispondono all'istologia del cancro, al suo grado di malignità e riflettono i cambiamenti che si verificano a livello genomico. Nei gliomi, come il tipo di cancro di interesse in questo studio, le informazioni nascoste nel genoma sono particolarmente importanti, poiché viene sviluppato un trattamento personalizzato basato sui risultati dei test genetici. Particolari mutazioni sono marcatori prognostici degli esiti della chemioterapia o della radioterapia. Come dimostrato in questa sede, la selezione di biomarcatori che riflettono una data mutazione è possibile con la strategia proposta. Marcatori di mutazione, così come ulteriori tipi di descrittori come quelli che indicano il grado di malignità del tumore possono anche essere utilizzati per supportare metodi diagnostici di routine.
La biopsia chimica ex vivo con l'uso di fibre di microesezione in fase solida è il primo passo nell'applicazione del metodo alla diagnostica intraoperatoria. Il metodo può essere facilmente adottato per il campionamento in vivo in attesa dell'autorizzazione da parte di commissioni etiche appropriate. In tali casi, la sterilizzazione dei dispositivi SPME deve essere eseguita secondo le procedure di sterilizzazione accettate dell'ospedale in cui deve essere effettuato il campionamento, vale a dire l'autoclave o la sterilizzazione con ossido di etilene. Le fibre preconditti e sterilizzate devono essere conservate in confezioni sigillate etichettate con una data di scadenza di sterilizzazione. È importante notare che le fibre non devono essere pulite con l'uso di tensioattivi. Tale procedura può causare cambiamenti non specifici nella composizione assorbente, influenzando così l'estrazione degli aliti. Negli studi qui descritti è stato utilizzato un periodo di estrazione di 30 minuti, ma altre relazioni confermano che tempi più brevi possono produrre risultati soddisfacenti negli studi in vivo 13. ha dimostrato che il tempo di equilibrio degli aaliti si ottiene più velocemente nei tessuti, come matrice complessa, che nelle matrici semplici14. Tuttavia, la riproducibilità dei risultati ottenuti può essere compromessa in periodi di estrazione più brevi, poiché più aliti saranno estratti in condizioni di pre-equilibrio; pertanto, è necessario attuare un controllo preciso del tempo.
Entrambe le scienze omiche sfruttate nell'ambito di questo lavoro hanno un eccellente potenziale come strumenti di scoperta dei biomarcatori. Una volta selezionati i biomarcatori o stabilito un modello chemiometrico, la diagnostica medica basata sulla determinazione dei metaboliti bersaglio attraverso metodi applicabili per le indagini in loco, come l'approccio SPME descritto in questo lavoro, può essere sviluppata e implementata come parte della diagnostica di routine.
Il protocollo proposto nel presente manoscritto descrive come eseguire analisi metabolomiche e lipidomiche non mirate del tessuto tumorale utilizzando la microesportazione in fase solida per lo screening di potenziali biomarcatori. È progettato per consentire l'estrazione di composti rappresentativi, la differenziazione dei tumori e l'identificazione di composti discriminatori che caratterizzano un dato cancro, cioè potenziali biomarcatori. Le analisi non mirate con SPME descritte in questo articolo rappresentano un punto di partenza nello sviluppo di una diagnostica intraoperatoria rapida, in cui un pannello selezionato di composti può essere determinato senza la necessità di vagliare tutti i composti presenti nel campione. Nell'interesse di risultati diagnostici rapidi, le sonde SPME utilizzate per l'estrazione in loco potrebbero essere accoppiate direttamente alla strumentazione analitica situata nella struttura ospedaliera. Semplici estrazioni eseguite con una preparazione minima del campione seguita da un'analisi priva di cromatografia ridurrebbero significativamente il tempo complessivo da ore a pochi minuti, come già descritto per il monitoraggio deifarmaci 15.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato supportato dalla sovvenzione Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 del Centro Nazionale di Scienze. Gli autori vorrebbero riconoscere MilliporeSigma, un'azienda di Merck KGaA, Darmstadt, Germania, per aver fornito i dispositivi SPME utilizzati in questo lavoro. Il business delle scienze della vita di Merck opera come MilliporeSigma negli Stati Uniti e in Canada. Inoltre, gli autori ringraziano Thermo Fisher Scientific per l'accesso allo spettrometro di massa Q-Exactive Focus orbitrap.
Contributi degli autori: JB: ottimizzazione della preparazione del campione e dei parametri LC-MS, esecuzione di esperimenti SPME-LC-MS, analisi dei dati, analisi statistica e interpretazione dei dati e preparazione manoscritta relativa alla parte lipidomica; PZG: coordinamento e rendimento della maggior parte dei campionamenti in ospedale, ottimizzazione dei parametri di campionamento e preparazione del campione, esecuzione di esperimenti SPME-LC-MS, analisi dei dati, analisi statistica e interpretazione dei dati, preparazione manoscritta relativa alla parte metabolomica; MG – assistenza nell'ottimizzazione della preparazione del campione, metodo LC-MS e analisi dei dati relativi alla parte lipidomica; KG: co-esecuzione di campionamenti SPME e ottimizzazione del campionamento e preparazione del campione, analisi SPME-LC-MS relativa alla parte metabolomica; KC: esecuzione di diversi campionamenti SPME in ospedale, assistenza nell'ottimizzazione del campionamento, preparazione del campione e analisi dei dati relativi alla parte metabolomica; KJ: esecuzione di diversi campionamenti SPME in ospedale, assistenza nell'analisi lipidomica; DP: esecuzione di procedure chirurgiche, reclutamento dei pazienti; JF: esecuzione di procedure chirurgiche, reclutamento dei pazienti; MH: esecuzione di procedure chirurgiche, coordinamento della parte clinica della ricerca; BB: concept, supervisione del coordinamento del progetto e preparazione manoscritta, esecuzione di diversi campionamenti
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9x5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
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