Summary
O manuscrito apresenta amostragem in loco de tumores cerebrais humanos com microextração de fase sólida seguida por seu perfil bioquímico para a descoberta de biomarcadores.
Abstract
Apesar da variedade de ferramentas disponíveis para diagnóstico e classificação do câncer, métodos que permitem a caracterização rápida e simples dos tumores ainda estão em necessidade. Nos últimos anos, a espectrometria de massa tornou-se um método de escolha para o perfil não-alvo de composto discriminatório como potenciais biomarcadores de uma doença. Os biofluidos são geralmente considerados como matrizes preferenciais, dada a sua acessibilidade e processamento mais fácil da amostra, enquanto o perfil tecidual direto fornece informações mais seletivas sobre um determinado câncer. A preparação de tecidos para a análise através de métodos tradicionais é muito mais complexa e demorada e, portanto, não é adequada para análise rápida no local. O trabalho atual apresenta um protocolo que combina preparação e extração de amostras de pequenas moléculas no local, imediatamente após a ressecção do tumor. O dispositivo de amostragem, do tamanho de uma agulha de acupuntura, pode ser inserido diretamente no tecido e depois transportado para o laboratório próximo para análise instrumental. Os resultados das análises metabolômicas e lipidômicas demonstram a capacidade da abordagem para o estabelecimento de fenótipos de tumores relacionados à origem histológica do tumor, malignidade e mutações genéticas, bem como para a seleção de compostos discriminatórios ou biomarcadores potenciais. A natureza não destrutiva da técnica permite o desempenho subsequente de testes rotineiramente utilizados, por exemplo, testes histológicos, nas mesmas amostras utilizadas para análise spme, permitindo assim a obtenção de informações mais abrangentes para suportar diagnósticos personalizados.
Introduction
Ressonância Magnética (RM) e Tomografia Computadorizada (TC) são os principais métodos utilizados para a análise em tempo real das lesões cerebrais. A diferenciação do tumor cerebral é geralmente baseada na histopatologia com coloração adicional e técnicas imunohistoquímicas avançadas. De acordo com as orientações atualizadas sobre tumores nervosos centrais emitidos pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2016, os testes genéticos são cruciais para a diferenciação e classificação desses tumores1. A diferenciação e classificação dos tumores permitem que os médicos escolham o tratamento mais eficaz para um determinado tipo de tumor, ampliando assim a expectativa de vida do paciente. Infelizmente, apesar da disponibilidade de tais métodos avançados para auxiliar os médicos na seleção de uma terapia ideal para seus pacientes, a expectativa de vida dos pacientes diagnosticados com glioblastoma (glioma de grau IV) é de apenas cerca de 15-16 meses2. Mesmo com a sofisticação e maior precisão dos referidos métodos de imagem e histológicos como ferramentas de diagnóstico, ainda há uma grande necessidade de novas técnicas capazes de oferecer informações complementares para auxiliar os médicos nas decisões relativas ao curso do tratamento. Ao longo dos últimos anos, várias novas abordagens baseadas na espectrometria de massa foram propostas para análise intraoperatória do câncer3,4. O potencial de microextração de fase sólida (SPME), método aqui apresentado, como ferramenta rápida de análise no local, já foi demonstrado em uma variedade de estudos5. O manuscrito atual mostra uma das aplicações clínicas do método, metabolômica não-alvo e lipidomics de tumores cerebrais humanos. Investigações não-alvo apresentam um importante ponto de partida na descoberta de potenciais biomarcadores. Uma vez estabelecidos, tais biomarcadores podem então ser usados como referências diagnósticas para diferenciar entre tumores usando a mesma tecnologia acoplada à instrumentação no local.
SPME é uma técnica de preparação de amostras baseada em equilíbrio que extrai pequenas moléculas de matrizes amostrais com o uso de pequenas quantidades de fase de extração. Na configuração mais tradicional do dispositivo (sonda) da SPME, uma fibra é revestida com uma fase de extração adequada e imobilizada em um suporte sólido, ou seja, um fio metálico5,6. Revestimentos e dispositivos biocompatíveis (sondas) permitem a extração diretamente de matrizes biológicas complexas sem pré-tratamento amostral, por exemplo, homogeneização e filtração. Através do processo de extração, os analitos são particionados entre a fase de extração e a matriz amostral em proporção às suas concentrações iniciais. Se a extração for realizada por tempo suficiente, então o equilíbrio é alcançado. Embora a extração em equilíbrio forneça a maior sensibilidade e reprodutibilidade possível, a extração pré-equilíbrio também é possível e até preferível em alguns casos, ou seja, amostragem in vivo, onde restrições de tempo associadas à amostragem no local (por exemplo, salas operacionais ou de emergência) necessitam de extrações rápidas. O perfil de tempo de extração de um determinado analito é geralmente influenciado pelas propriedades físico-químicas do analito, a matriz sendo amostrada, o tipo de sorbent utilizado e várias outras condições de extração. A infinidade de fatores que regem sua cinética extração torna praticamente impossível garantir a extração de equilíbrio de todos os compostos quando análises não-marcadas, como metabolômica ou lipidomics são realizadas. Pelas razões acima mencionadas, o tempo de extração do protocolo atual foi definido arbitrariamente para garantir sensibilidade satisfatória e cobertura de metabólitos, por um lado, e praticidade para uso no local, por outro.
Deve-se ressaltar que o tamanho muito pequeno das sondas utilizadas para a extração de amostras de tecidos só causa danos mínimos ao tecido, enquanto o procedimento amostral em si não consome nenhum tecido, mas quantidades muito pequenas de pequenas moléculas da área amostrada; portanto, a mesma amostra pode ser utilizada para testes de rotina, ou seja, histológico ou genético, possibilitando a obtenção de informações essenciais e complementares a partir da mesma amostra. Tais dados complementares e abrangentes permitiriam uma melhor compreensão da biologia tumoral, facilitando a descoberta de novos alvos de tratamento. A exploração desse método aumenta ainda mais a possibilidade de diagnósticos intraoperatórios no local ao determinar biomarcadores-alvo.
Abaixo apresentamos protocolos para amostragem de tumores cerebrais no local para análises metabolômicas e lipidómicas e processamento de dados.
Protocol
O estudo aqui apresentado foi aprovado pelo Comitê de Bioética do Colegiado Médico em Bydgoszcz na Universidade Nicolaus Copernicus em Toruń (KB 628/2015). Lembre-se de sempre usar um jaleco e qualquer outro equipamento de segurança pessoal necessário, como (mas não se limitando a) luvas de segurança e óculos. Não toque na fase de extração das sondas de microextração de fase sólida (SPME).
1. Preparação dos dispositivos SPME
- Use sondas (fibras) com revestimentos de modo misto e C18 para metabolômica e lipidódica, respectivamente. Colete dois conjuntos de amostras, uma para metabolômica e outra para lipidômica.
- Ajuste o revestimento da sonda a um comprimento ideal, aparando a sonda SPME. No presente estudo, o comprimento do revestimento selecionado foi de 7 mm. Selecione o comprimento da fibra de acordo com o tamanho do tumor em estudo, garantindo que todo o sorbent possa ser imerso no tumor(Figura 1).
- Condicionar os revestimentos das sondas, encharcando-as em metanol: água 50:50 v/v mistura por um período mínimo de 1h antes do procedimento de extração. Transportar fibras para o local da amostragem (por exemplo, hospital) em um frasco contendo a solução de condicionamento.
2. Procedimento de coleta de amostras
- Não lave ou pré-latre o tumor de forma alguma antes da extração do SPME.
- Inicie a amostragem o mais rápido possível após a remoção do tumor (2 min no estudo apresentado).
NOTA: Ajuste o tempo dependendo da configuração no local para uma determinada instalação (distância do local de trabalho do pesquisador a partir da mesa de operação) e mantenha-o constante durante todo o estudo. Minimizar o tempo decorrido entre a remoção do tumor e o início da extração é crucial para a captura de metabólitos instáveis que se degradam após a circulação sanguínea ser cortada do tecido estudado. - Realizar amostragem à temperatura ambiente. Alternativamente, coloque a amostra no gelo quando a extração for realizada. Em ambos os casos, mantenha as mesmas condições para todo o conjunto de amostras.
- Tire a sonda do frasco.
- Lave as fibras com espectrometria de massa cromatografia líquida (LC/MS) para 5 s, imergindo-as na água de grau LC/MS. Não deixe o sorbent secar antes da inserção da fibra para garantir uma boa reprodutibilidade dos dados.
- Insira as fibras no tecido tumoral cerebral o mais distante possível, garantindo que toda a fase de extração esteja localizada dentro do tumor.
NOTA: Recomenda-se que sejam realizadas extrações em replicação para determinar a natureza heterogênea do tumor (Figura 2). Recomenda-se três réplicas por amostra. - Deixe a sonda por 30 minutos no tecido (medido com um temporizador).
- Use controles em branco para eliminar fontes de erro relacionadas à presença de artefatos provenientes de fontes diferentes do tumor amostrado. Para obter controles em branco, submá-los fibras ao mesmo fluxo de trabalho analítico, conforme descrito acima, mas sem a etapa amostral (inserção no tecido ou qualquer outra amostra/matriz). Na etapa de processamento de dados, compile os analitos extraídos dessas fibras em uma "lista de exclusão" para excluir sinais derivados de contaminantes decorrentes de solventes ou fabricação de fibras. Recomenda-se que sejam utilizadas pelo menos 3 réplicas de em branco.
NOTA: Para verificar se há risco de contaminação, é necessário realizar amostragem de luvas, tabelas, aparelhos ou quaisquer outras superfícies que possam representar um risco de contaminação. Nesses casos, os protocolos de preparação de fibras, tempo de extração e dessorção são os mesmos das amostras. - Enquanto a extração estiver sendo realizada, rotule os frascos a serem usados para armazenamento das sondas após a extração.
- Após 30 min, remova as fibras do tumor cerebral.
- Lave as fibras com água por 3 s, imergindo-as na água de grau LC/MS para remover resíduos de sangue ou detritos celulares da sonda para que o extrato final contenha apenas pequenas moléculas. Um passo de lavagem mais longo não é recomendado, pois pode levar à perda de compostos polares.
- Imobilize as fibras no septo pré-fenda da tampa de frasco de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) perfurando a septa a partir da parte inferior com a extremidade não revestida da fibra.
- Coloque as fibras imobilizadas na tampa em frascos HPLC separados e coloque-as no recipiente de transporte selecionado.
- Execute as etapas 2.11-2.13 para fibras dedicadas a controles em branco.
3. Transporte e armazenamento
NOTA: Várias opções estão disponíveis para o transporte de amostras para o laboratório. Recomenda-se que uma caixa de nitrogênio líquido Dewar ou poliestireno cheia de gelo seco seja usada para transporte; alternativamente, as bolsas de gelo podem ser usadas para transporte imediato e rápido.
- Coloque os frascos com fibras no recipiente de transporte.
- Após a chegada do laboratório, coloque imediatamente frascos com fibras SPME em um congelador de -80 °C ou -30 °C. Não armazene fibras por mais de 3 anos a -30 °C ou 5 anos a -80 °C.
4. Preparação da amostra para análise metabolômica
NOTA: Esta etapa só deve ser realizada uma vez que todas as amostras para um experimento tenham sido coletadas.
- Antes da análise instrumental, prepare a mistura de solvente de desorção: acetonitrilo:água 80:20 v/v.
- Retire os frascos que contêm as fibras de modo misto do congelador. Use-os para análise metabolômica.
- Frascos de etiqueta a serem usados para desorção.
- Pipeta 300 μL da solução de desorção (preparada na etapa 4.1) em pastilhas de vidro colocadas em frascos de 2 mL.
- Realize a desorção de cada fibra colocada em uma inserção separada, imergindo totalmente o revestimento no solvente de desorção, agitando-o por 120 min a 1.200 rpm usando vórtice.
- Após 120 min (uma vez concluída a desorção) remova as tampas com sondas.
- Prepare a amostra QC misturando 10 μL alíquotas de cada amostra do conjunto amostral. O tamanho do conjunto amostral depende do design experimental. É importante analisar todas as amostras como um lote.
- Feche os frascos com novas tampas.
- Coloque os frascos no autosampler (4 °C) do espectrômetro de massa de alta resolução da cromatografia líquida (LC-HRMS) e mova-se para a etapa 5.
NOTA: A ordem de injeções aleatórias das amostras, incluindo os espaços em branco de controle. Injete amostra de QC após cada 8-10 amostras para monitorar a estabilidade do instrumento.
5. Análise metabolômica utilizando cromatografia líquida de fase invertida e espectrômetro de massa de alta resolução (análise RPLC-HRMS)
- Configure os parâmetros da análise LC-HRMS e do modo de ionização positiva.
NOTA: Os parâmetros utilizados no presente estudo no modo positivo foram os seguintes: intervalo de varredura: m/z 80-1000; resolução 70 000; aquisição realizada utilizando-se AGC (1.000.000 íons); tempo de injeção para armadilha C: auto; tensão de pulverização: 1,5 kV; Nível de RF da lente S: 55%; Tensão da lente S: 25 V; tensão de skimmer: 15 V; temperatura capilar: 300 °C; gás de baia: 40 a.u.; gás aux: 15 a.u.; temperatura do aquecedor aux gas: 300 °C. Este método cromatográfico foi adaptado de Vuckovic et al.7. Volume de injeção: 10 μL. - Configure os parâmetros da análise LC-HRMS e do modo de ionização negativa.
NOTA: Os parâmetros utilizados no presente estudo no modo negativo: intervalo de varredura: m/z 80-1000; resolução 70 000; aquisição realizada utilizando-se AGC (1.000.000 íons); tempo de injeção para armadilha C: auto; tensão de pulverização: 2,5 kV; Nível de RF da lente S: 55%; Tensão da lente S: -25 V; tensão de skimmer: -15 V; temperatura capilar: 256 °C gás da baia: 48 a.u; gás aux: 11 a.u.; temperatura do aquecedor aux gas: 413 °C. Este método cromatográfico foi adotado a partir de Vuckovic et al.7. Volume de injeção: 10 μL. - Calibrar o instrumento conforme recomendado pelo fabricante.
NOTA: No presente estudo, o instrumento foi calibrado utilizando calibração externa a cada 48 h, resultando em uma precisão de massa <2 ppm. - Inicie a análise clicando no botão Iniciar no software que opera o instrumento.
- Quando a análise estiver concluída, substitua a coluna RPLC pela coluna HILIC, altere as fases móveis e vá para a etapa 6.
6. Análise metabolômica utilizando cromatografia líquida de interação hidrofílica e espectrômetro de massa de alta resolução (análise HILIC-HRMS)
- Configure os parâmetros da análise LC-HRMS e do modo de ionização positiva.
NOTA: Os parâmetros utilizados no presente estudo no modo positivo foram os seguintes: intervalo de varredura: m/z 80-1000; resolução 70 000; aquisição realizada utilizando-se AGC (1.000.000 íons); tempo de injeção para armadilha C: auto; tensão de pulverização: 1,5 kV; Nível de RF da lente S: 55%; Tensão da lente S: 25 V; tensão de skimmer: 15 V; gás de baia: 60 a.u.; gás aux: 40 a.u.; temperatura do aquecedor aux a gás: 425 °C; temperatura capilar: 325 °C. O método cromatográfico foi adaptado de Vuckovic et al.7. Volume de injeção: 10 μL. - Configure os parâmetros da análise LC-HRMS e do modo de ionização negativa.
NOTA: Os parâmetros utilizados no presente estudo no modo negativo foram os seguintes: intervalo de varredura: m/z 80-1000; resolução 70 000; aquisição realizada utilizando-se AGC (1.000.000 íons); tempo de injeção para armadilha C: auto; tensão de pulverização: 1,3 kV; Nível de RF da lente S: 55%.; Tensão da lente S: -25 V; tensão de skimmer: -15 V; temperatura capilar: 263 °C; gás de baia: 60 a.u.; gás aux: 30 a.u.; temperatura do aquecedor aux gas: 425 °C. O método cromatográfico foi adaptado de Vuckovic et al.7. Volume de injeção: 10 μL. - Calibrar o instrumento conforme recomendado pelo fabricante.
NOTA: No presente estudo, o instrumento foi calibrado utilizando calibração externa a cada 48 h, resultando em uma precisão de massa <2 ppm. - Inicie a análise clicando no botão Iniciar no software que opera o instrumento.
7. Preparação da amostra para análise lipidódica
NOTA: Esta etapa só deve ser realizada uma vez que todas as amostras para o experimento tenham sido coletadas.
- Antes de iniciar a análise, prepare a mistura de solvente de desorpção: isopropanol:metanol 50:50 v/v.
- Retire os frascos contendo as fibras C18 dedicadas à análise lipidômica do congelador.
- Frascos de etiqueta a serem usados para desorção.
- Pipeta 200 μL da solução de desorção (preparada na etapa 7.1) para pastilhas de vidro silanizadas colocadas em frascos de 2 mL.
NOTA: As pastilhas não silanizadas também podem ser usadas, mas seu uso pode resultar em baixa reprodutibilidade de compostos com alto logP, uma vez que tais compostos podem não especificamente anexar a paredes de vidro. - Realize a desorção de cada fibra em uma inserção separada, imergindo totalmente o revestimento no solvente de desorção, agitando-o por 60 min a 1.200 rpm usando vórtice.
- Após 60 min quando a desorção for concluída, remova as tampas com sondas.
- Prepare a amostra QC misturando 10 μL alíquotas de cada amostra do conjunto amostral. O tamanho do conjunto amostral depende do design experimental. É importante analisar todas as amostras como um lote.
- Feche os frascos com novas tampas.
- Coloque os frascos no autosampler (4 °C) do espectrômetro de massa de alta resolução da cromatografia líquida (LC-HRMS) e mova-se para a etapa 8.
8. Análise lipidômica utilizando cromatografia líquida de fase invertida e espectrometria de massa de alta resolução (análise RPLC-HRMS)
- Configure os parâmetros da análise LC-HRMS e do modo de ionização positiva.
NOTA: Os parâmetros utilizados no presente estudo no modo íon positivo foram os seguintes: intervalo de varredura: m/z 100-1000; aquisição realizada utilizando-se AGC (1.000.000 íons); tempo de injeção para armadilha C: auto; tensão de pulverização: 3,5 kV, nível RF de lente S: 55%; Tensão da lente S: 25 V; tensão de skimmer: 15 V; temperatura capilar 275 °C; gás de baia: 30 a.u.; gás aux: 10 a.u.; gás de reposição: 2 a.u.; temperatura do aquecedor da sonda 300 °C. Os parâmetros de LC utilizados foram: fase A: metanol:água, 40:60 com acetato de amônio de 10 mM e ácido acético de 1 mM; fase B: isopropanol:metanol, 90:10 com acetato de amônio 10mM e ácido acético de 1 mM.; o gradiente: 0 min – 20% B; 1,0 min – 20% B; 1,5 min – 50% B; 7,5 min – 70% B; 13,0 min – 95% B; 17,0 min – 95% B; 17,1 min – 95,5 % B; 23,0 min – PARADA; Coluna C18, 3,5 μm, 2,1 mm x 75 mm; fluxo: 0,2 mL/min; temperatura do forno: 55 °C; volume de injeção: 10 μL. - Configure os parâmetros da análise LC-HRMS e do modo de ionização negativa.
NOTA: Os parâmetros utilizados no presente estudo foram os seguintes: parâmetros hrms para modo de íon negativo: intervalo de varredura: m/z 100-1000; aquisição realizada utilizando-se AGC (1.000.000 íons); tempo de injeção para armadilha C: auto; tensão de pulverização: 3,5 kV, nível RF de lente S: 55%; Tensão da lente S: -25 V; tensão de skimmer: -15 V; temperatura capilar 275 °C; gás de baia: 30 a.u; gás aux: 10 a.u.; gás de reposição: 2 a.u; temperatura do aquecedor da sonda 300 °C. Método cromatográfico: o mesmo que em 8.1. - Calibrar o instrumento conforme recomendado pelo fabricante.
NOTA: No presente estudo, o instrumento foi calibrado utilizando calibração externa a cada 48 h, resultando em uma precisão de massa <2 ppm. - Inicie a análise clicando no botão Iniciar no software que opera seu instrumento.
- Quando a análise estiver concluída, substitua a coluna RPLC pela coluna HILIC, altere as fases móveis e vá para a etapa 9.
9. Análise lipidômica utilizando cromatografia líquida de interação hidrofílica e espectrômetro de massa de alta resolução (análise HILIC-HRMS)
- Configure os parâmetros da análise LC-HRMS e do modo de ionização positiva.
NOTA: Os parâmetros utilizados no presente estudo no modo íon positivo foram os seguintes: intervalo de varredura: m/z 100-1000; aquisição realizada utilizando-se AGC (1.000.000 íons); tensão de pulverização: 1,5 kV; Nível de RF da lente S: 55%; Tensão da lente S: 25 V; tensão de skimmer: 15 V; temperatura capilar 325 °C; gás de baia: 60 a.u.; gás aux: 30 a.u.; gás de reposição: 2 a.u.; temperatura do aquecedor da sonda 320 °C. Os parâmetros de LC utilizados foram: fase A: acetato de amônio de 5 mM na água; fase B: acetonitrilo; o gradiente: 0 – 2min – 4% B; 15,0 – 20% B; 15,1 – 4% B, 21,0 min – STOP; Coluna de 3 μm 100 mm x 2,1 mm; fluxo: 0,4 mL/min; temperatura do forno: 40 °C; volume de injeção: 10 μL. - Configure os parâmetros da análise LC-HRMS e do modo de ionização negativa.
NOTA: Os parâmetros utilizados no presente estudo no modo íon negativo foram os seguintes: intervalo de varredura: m/z 80-1000; aquisição realizada utilizando-se AGC (1.000.000 íons); tensão de pulverização: 1,5 kV, nível RF da lente S: 55%; Tensão da lente S: -25 V; tensão de skimmer: -15 V; temperatura capilar 320 °C; gás de baia: 50 a.u.; gás aux: 21 a.u.; gás de reposição: 3 a.u.; temperatura do aquecedor da sonda 320 °C. O método cromatográfico foi o mesmo descrito em 9.1. - Calibrar o instrumento conforme recomendado pelo fabricante.
NOTA: No presente estudo, o instrumento foi calibrado utilizando calibração externa a cada 48 h, resultando em uma precisão de massa <2 ppm. - Inicie a análise clicando no botão Iniciar no software que opera o instrumento.
10. Processamento de dados e análise estatística
- Processar dados usando software compatível com o formato dos arquivos de dados brutos.
- Realizar análises estatísticas utilizando os dados processados.
NOTA: O tipo de teste depende da hipótese científica e do desenho do estudo. No presente estudo, foram utilizadas análises componentes principais, análise parcial-menos quadrada-discriminante e ANOVA unidirecional.
Representative Results
Explorar a microextração de fase sólida como um método de preparação de amostras em combinação com a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução e um software avançado de processamento de dados nos permitiu caracterizar com sucesso o metabolome e lipidome dos tumores cerebrais humanos. A sonda, do tamanho equivalente a uma agulha de acupuntura, causou danos mínimos ao tecido estudado e sem consumo de tecido, permitindo, portanto, o uso posterior de amostras para estudos histológicos ou genéticos. A separação satisfatória dos grupos selecionados foi obtida tanto para as colunas de fase invertida quanto para HILIC, e para ambos os modos de ionização em análises metabolômicas e lipidómicas. O uso de ambos os métodos de separação não apenas na metabolômica, mas também na análise lipidóica forneceu dados complementares valiosos. A coluna de fase invertida separa lipídios em relação ao comprimento de suas cadeias de carbono e à presença de ligações insaturadas, enquanto a coluna HILIC é útil para traçar perfis lipídicos, especialmente fosfolipídios8.
A reprodutibilidade da análise instrumental foi considerada muito boa com base no agrupamento apertado de amostras de QC no enredo principal de análise de componentes (Figura 3A, as três amostras de QC injetaram amostras de cada oito pacientes ao longo da sobreposição sequência). Além disso, foram encontrados espaços de extração utilizados para análise de controle negativo para separar bem das amostras reais. A ampla gama de analitos extraídos pelas sondas facilitou a descoberta de espécies representativas, permitindo assim diferenciação entre tumores cerebrais humanos com base em sua origem histológica, malignidade e outros fatores (por exemplo, genéticos). A Figura 3B mostra dados lipidomicos para amostras coletadas de pacientes com gliomas e meningiomas. Possibilitar a diferenciação entre esses tumores, caracterizados por diferentes origens histológicas e malignidade, foi um importante objetivo do estudo, pois os meningiomas são geralmente considerados tumores benignos, enquanto os gliomas são um dos mais malignos. Além disso, na Figura 4 apresentando dados metabolômicos, os gliomas foram divididos com base em seu grau de malignidade em alto e baixo. Estes subgrupos foram comparados com o fenótipo molecular de meningiomas. Em ambos os casos, observou-se separação proeminente de aglomerados. Atualmente, o diagnóstico de glioma depende principalmente da determinação de mutações genéticas específicas em amostras de tumores. Portanto, os resultados obtidos foram comparados aos dados de genotipagem. A Figura 5A apresenta separação das amostras com co-exclusão detectada 1p19q e amostras em que a mutação não foi observada.
A análise estatística também permite a seleção de compostos nos grupos estudados. Esses compostos podem ser considerados como biomarcadores potenciais nos casos em que uma coorte adequadamente grande é amostrada. No entanto, uma análise mais aprofundada, incluindo a confirmação conclusiva dos compostos detectados por fragmentação e comparação de espécies detectadas com padrões analíticos, é necessária para tirar conclusões definitivas de natureza biológica. Exemplos de metabólitos discriminantes são apresentados na Figura 3C e Figura 5B. As identidades desses compostos, ou seja, sphingomielyn: SM d36:1 e proline foram confirmadas comparando padrões de fragmentação dos metabólitos da amostra e padrões autênticos.
Figura 1: Fibras SPME preparadas para o processo de extração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Extração de meningioma usando sondas SPME. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: PCA e caixas para glioma e meningioma. Enredo principal de análise de componentes contendo (A) todas as amostras analisadas, incluindo em branco, QC de extração, espaços em branco, meningiomas, gliomas; (B) contendo apenas grupos estudados (após exclusão de espaços em branco e QCs); (C) gráfico de bigode de caixa para sphingomielyn: SM d36:1 diferenciando paciente com glioma e meningioma. Dados lipidódmicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: PCA para HGG, LGG e meningioma. Enredo principal de análise decomponentes mostrando diferenciação entre gliomas de alto grau (HGG) e meningiomas (MEN)9 e(B) gliomas de baixo grau (LGG) e meningiomas. Dados metabolômicos reimpressos da Via Medica ref9 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: PCA e parcelas de caixa para glioma com e sem exclusão. (A) O gráfico principal de análise de componentes mostrou diferenças em pacientes com e sem co-exclusão 1p19q; (B) gráficos de bigode de caixa para pacientes diferenciados proline com e sem co-exclusão 1p19q; n-sem exclusão, y-com exclusão. Dados metabolômicos Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Metabolômica não-alvo e lipidomia são comumente utilizadas em estudos focados na identificação de biomarcadores tumorais. No entanto, na maioria dos casos, os pesquisadores procuram compostos que possam ser usados para a triagem da doença. Consequentemente, as amostras biológicas preferidas são sangue ou urina devido ao seu acesso relativamente fácil. A análise do tecido tumoral é realizada principalmente para entender os mecanismos por trás da doença, caracterizar diferentes tipos de tumores, etc. A análise no local dos biomarcadores tumorais raramente é realizada, pois tais aplicações requerem uma extensa preparação amostral. Alternativamente, estratégias baseadas na análise em tempo real de perfis teciduais sem pré-seleção de biomarcadores específicos estão ganhando a atenção da comunidade médica3,4. A solução aqui apresentada fornece outra perspectiva sobre o processamento de tecidos no local, revelando o tipo de informação que pode ser obtida através desses métodos.
A combinação de amostragem, preparação de amostras e extração torna o SPME uma ferramenta muito útil para análise no local. Além disso, a falta de consumo de tecidos durante a amostragem permite o uso adicional das mesmas amostras para análise biomarcadora e testes de rotina (genotipagem, análise histológica), adicionando novas informações aos resultados dos testes padrão. O dispositivo de amostragem tem um design muito simples, seu funcionamento é muito fácil, e nenhum treinamento especial é necessário para realizar a extração em si. No entanto, alcançar resultados confiáveis requer muito mais do que apenas o manuseio adequado dos dispositivos. Para realizar adequadamente o experimento, é preciso entender o processo de extração, a natureza da amostra e estar ciente de possíveis erros que podem influenciar os dados.
É importante considerar a heterogeneidade do tecido cancerígeno10; os tumores amostrados podem conter partes submetidas a necrose, calcificação e hipóxia, e cada um desses processos será refletido no metabolome e lipidome atingidos, influenciando assim os resultados. Portanto, recomenda-se que a amostragem de resolução espacial seja realizada por inserção de várias fibras em diferentes partes do tecido cancerígeno, ou alternativamente, que um revestimento mais longo seja usado para penetrar em todo o tumor de modo a obter informações médias sobre o tumor. Se o método de amostragem de resolução espacial for realizado, as fibras podem ser todas desordenadas em um solvente de desorção; isso não só permitiria a obtenção de informações gerais sobre o tumor, mas também aumentaria a sensibilidade da análise. Alternativamente, a desorção de fibras individuais em frascos separados permitiria que as investigações descobrissem a diversidade interna do tumor cerebral, que consiste no núcleo construído de células cancerosas, e na zona externa, que é a borda do tecido saudável. Partes mais profundas do tumor geralmente são mais danificadas pelos processos relacionados ao câncer11. No entanto, os pesquisadores devem ter em mente que essa opção compromete a sensibilidade do método e o número total de compostos detectáveis. No trabalho atual, foi utilizado um revestimento de 7 mm; esse comprimento foi considerado ideal para vários tamanhos de tumores incluídos no estudo. Os revestimentos penetraram os tumores e, portanto, forneceram resolução não especial, mas dados médios em toda a amostra. Independentemente do protocolo selecionado, é importante que o mesmo protocolo seja seguido durante todo o estudo, incluindo o número de fibras utilizadas para amostragem individual, o comprimento do revestimento, o tempo de extração e todos os outros fatores delineados neste trabalho.
É importante controlar a qualidade da análise. O QC agrupado (ver etapas 4.7 e 7.7 no protocolo) deve ser preparado e usado para monitorar a estabilidade do instrumento durante o execução de todo o lote amostral. Os controles em branco (ver passo 2.8) podem ser usados posteriormente para preparar uma "lista de exclusão" para eliminar sinais de contaminantes originários de solventes ou fabricação de fibras. Em ocasiões especiais, como o risco de contaminação, é necessário realizar amostragem de luvas, mesas, aparelhos ou quaisquer outras superfícies que possam representar um risco de contaminação. Nesses casos, a preparação de fibras, o tempo de extração e os protocolos de desorção são os mesmos das amostras.
As análises metabolômicas e lipidômicas são focadas inteiramente em pequenas moléculas (menos de 1.500 Da) que aparecem em um organismo ou componentes específicos do organismo, como órgãos específicos, tecidos, fluidos, células, etc. Metabolômicas e lipidômicas oferecem um instantâneo de alterações bioquímicas ocorridas no corpo, e no caso do câncer, integram informações relacionadas ao genoma, histologia e malignidade do tumor. Essas ciências omicesiárias criam uma conexão entre fisiologia e fenótipo, pois os metabólitos são mais elevados na escada bioquímica do que proteínas ou genes12. Ao compreender o metabolo e lipidome dos tumores cancerígenos, estamos mais perto de descobrir o fenótipo entre todas as ciências -omics à medida que esses ramos de estudo oferecem um conhecimento mais profundo das mudanças dinâmicas das moléculas como resposta dos organismos vivos a vários estímulos. Conforme apresentado neste trabalho, os dados obtidos em uma amostragem correspondem à histologia do câncer, seu grau de malignidade, e reflete mudanças ocorridas no nível do genoma. Nos gliomas, como o tipo de câncer de interesse neste estudo, as informações escondidas no genoma são particularmente importantes, pois um tratamento personalizado é desenvolvido com base nos resultados dos testes genéticos. Mutações particulares são marcadores prognósticos dos resultados da quimioterapia ou radioterapia. Como demonstrado aqui, a seleção de biomarcadores refletindo uma determinada mutação é possível com a estratégia proposta. Marcadores de mutação, bem como tipos adicionais de descritores como aqueles que indicam o grau de malignidade do tumor também podem ser usados para apoiar métodos de diagnóstico de rotina.
A biópsia química ex vivo com o uso de fibras de microextração de fase sólida é o primeiro passo na aplicação do método para diagnósticos intraoperatórios. O método pode ser facilmente adotado para amostragem in vivo pendente de permissão de Conselhos éticos apropriados. Nesses casos, a esterilização dos dispositivos SPME deve ser realizada de acordo com os procedimentos de esterilização aceitos do hospital onde a amostragem deve ser realizada, ou seja, esterilização automática ou óxido de etileno. As fibras pré-condicionadas e esterilizadas devem ser mantidas em embalagens lacradas rotuladas com data de validade da esterilização. É importante notar que as fibras não devem ser limpas com o uso de surfactantes. Tal procedimento pode causar alterações inespecíficas na composição sorbent, impactando assim a extração de analitos. Nos estudos aqui descritos, foi utilizado um período de extração de 30 minutos, mas outros relatos validam que tempos mais curtos podem produzir resultados satisfatórios nos estudos in vivo 13. Huq et al. mostraram que o tempo de equilíbrio de analito é alcançado mais rapidamente no tecido, como uma matriz complexa, do que nas matrizes simples14. No entanto, a reprodutibilidade dos resultados obtidos pode ser comprometida em períodos de extração mais curtos, uma vez que mais analitos serão extraídos em condições pré-equilíbrio; portanto, deve ser implementado um controle de tempo preciso.
Ambas as ciências omics exploradas como parte deste trabalho têm excelente potencial como ferramentas de descoberta de biomarcadores. Uma vez que os biomarcadores são selecionados ou um modelo quimiométrico é estabelecido, diagnósticos médicos baseados na determinação de metabólitos através de métodos aplicáveis para investigações no local, como a abordagem SPME descrita neste trabalho, podem ser desenvolvidos e implementados como parte de diagnósticos de rotina.
O protocolo proposto no presente manuscrito descreve como realizar análises metabolômicas e lipidômicas não-diretas do tecido cancerígeno utilizando microextração de fase sólida para triagem de potenciais biomarcadores. Destina-se a permitir a extração de compostos representativos, diferenciação de tumores e identificação de compostos discriminatórios caracterizando um determinado câncer, ou seja, potenciais biomarcadores. As análises não-ágeis com o SPME descritas neste artigo representam um ponto de partida no desenvolvimento de diagnósticos intraoperatórios rápidos, onde um painel selecionado de compostos pode ser determinado sem a necessidade de triagem de todos os compostos presentes na amostra. No interesse de resultados diagnósticos rápidos, as sondas SPME utilizadas para extração no local poderiam ser diretamente acopladas à instrumentação analítica localizada na unidade hospitalar. Extrações simples realizadas com preparação mínima da amostra seguida de análise livre de cromatografia reduziriam significativamente o tempo total de horas para poucos minutos, como já descrito para o monitoramento de medicamentos15.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O estudo foi apoiado pela bolsa Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 do Centro Nacional de Ciências. Os autores gostariam de reconhecer a MilliporeSigma, um negócio da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha, por fornecer os dispositivos SPME usados neste trabalho. O negócio de ciências da vida da Merck opera como MilliporeSigma nos EUA e Canadá. Além disso, os autores gostariam de agradecer à Thermo Fisher Scientific pelo acesso ao espectrômetro de massa Q-Exactive Focus orbitrap.
Contribuições dos autores: JB: otimização da preparação da amostra e parâmetros de LC-MS, desempenho de experimentos SPME-LC-MS, análise de dados, análise estatística e interpretação de dados e elaboração de manuscritos relacionados à parte lipidômica; PZG: coordenação e desempenho da maioria das amostrades hospitalares, otimização dos parâmetros de amostragem e preparação da amostra, desempenho de experimentos SPME-LC-MS, análise de dados, análise estatística e interpretação de dados, elaboração de manuscritos relacionados à parte metabolômica; MG – auxílio na otimização da preparação da amostra, método LC-MS e análise de dados relacionados à parte lipidóica; KG: co-desempenho das amostras de SPME e otimização da amostragem e preparação da amostra, análise SPME-LC-MS relacionada à parte metabolômica; KC: desempenho de diversas amostras de SPME no hospital, assistência na otimização da amostragem, preparação da amostragem e análise de dados relacionados à parte metabolômica; KJ: desempenho de diversas amostras de SPME no hospital, assistência na análise lipidóica; DP: realização de procedimentos cirúrgicos, recrutamento dos pacientes; JF: realização de procedimentos cirúrgicos, recrutamento dos pacientes; MH: realização de procedimentos cirúrgicos, coordenação da parte clínica da pesquisa; BB: conceito, supervisão de coordenação do projeto e elaboração de manuscritos, realização de diversas amostragems
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9x5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
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