Summary
El manuscrito presenta muestras in situ de tumores cerebrales humanos con microextracción de fase sólida seguida de su perfil bioquímico hacia el descubrimiento de biomarcadores.
Abstract
A pesar de la variedad de herramientas disponibles para el diagnóstico y clasificación del cáncer, todavía se necesitan métodos que permiten una caracterización rápida y sencilla de los tumores. En los últimos años, la espectrometría de masas se ha convertido en un método de elección para el perfilado no dirigido de compuesto discriminatorio como biomarcadores potenciales de una enfermedad. Los biofluidos generalmente se consideran matrices preferibles dada su accesibilidad y un procesamiento de muestras más fácil, mientras que el perfilado directo de tejidos proporciona información más selectiva sobre un cáncer determinado. La preparación de tejidos para el análisis a través de métodos tradicionales es mucho más compleja y requiere mucho tiempo y, por lo tanto, no es adecuada para un análisis rápido in situ. El trabajo actual presenta un protocolo que combina la preparación de muestras y la extracción de moléculas pequeñas in situ, inmediatamente después de la resección del tumor. El dispositivo de muestreo, que es del tamaño de una aguja de acupuntura, se puede insertar directamente en el tejido y luego transportarse al laboratorio cercano para el análisis instrumental. Los resultados de los análisis metabolómicos y lipidómicos demuestran la capacidad del enfoque para el establecimiento de fenotipos de tumores relacionados con el origen histológico del tumor, la neoplasia maligna y las mutaciones genéticas, así como para la selección de compuestos o biomarcadores potenciales. La naturaleza no destructiva de la técnica permite la realización posterior de pruebas utilizadas rutinariamente, por ejemplo, pruebas histológicas, en las mismas muestras utilizadas para el análisis SPME, lo que permite obtener información más completa para apoyar diagnósticos personalizados.
Introduction
Las imágenes por resonancia magnética (RM) y la tomografía computarizada (TC) son los principales métodos utilizados para el análisis en tiempo real de lesiones cerebrales. La diferenciación del tumor cerebral se basa generalmente en histopatología con tinción adicional y técnicas avanzadas de inmunohistoquímicas. Según la guía actualizada sobre tumores cerebrales nerviosos centrales emitida por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 2016, las pruebas genéticas son cruciales para la diferenciación y clasificación de estos tumores1. La diferenciación y clasificación de tumores permite a los médicos elegir el tratamiento más eficaz para un tipo determinado de tumor, ampliando así la esperanza de vida del paciente. Desafortunadamente, a pesar de la disponibilidad de estos métodos avanzados para ayudar a los médicos en la selección de una terapia óptima para sus pacientes, la esperanza de vida de los pacientes diagnosticados con glioblastoma (glioma de grado IV) es sólo de 15-16meses 2. Incluso con la sofisticación y la mayor precisión de dichas imágenes y métodos histológicos como herramientas de diagnóstico, todavía existe una gran necesidad de nuevas técnicas capaces de ofrecer información complementaria para ayudar a los médicos en las decisiones relativas al curso del tratamiento. En los últimos años, se han propuesto varios enfoques nuevos basados en la espectrometría de masas para el análisis intraoperatorio del cáncer3,4. El potencial de la microextracción de fase sólida (SPME), el método presentado en el presente documento, como una herramienta de análisis rápido in situ, ya se ha demostrado en una variedad de estudios5. El manuscrito actual muestra una de las aplicaciones clínicas del método, la metabolómica no objetivo y la lipidómica de los tumores cerebrales humanos. Las investigaciones no objetivo presentan un punto de partida importante en el descubrimiento de biomarcadores potenciales. Una vez establecidos, estos biomarcadores pueden utilizarse como referencias diagnósticas para diferenciar entre tumores utilizando la misma tecnología acoplada a la instrumentación in situ.
SPME es una técnica de preparación de muestras basada en equilibrio que extrae moléculas pequeñas de matrices de muestras con el uso de pequeñas cantidades de fase de extracción. En la configuración más tradicional de SPME del dispositivo (sonda), una fibra se recubre con una fase de extracción adecuada e inmovilizada en un soporte sólido, es decir, un alambre metálico5,6. Los recubrimientos y dispositivos biocompatibles (sondas) permiten la extracción directamente de matrices biológicas complejas sin pretratamiento de muestras, por ejemplo, homogeneización y filtración. A través del proceso de extracción, los analitos se dividen entre la fase de extracción y la matriz de muestras en proporción a sus concentraciones iniciales. Si la extracción se lleva a cabo el tiempo suficiente, entonces se logra el equilibrio. Mientras que la extracción en equilibrio proporciona la mayor sensibilidad y reproducibilidad posible, la extracción de preeficción también es posible e incluso preferible en algunos casos, es decir, el muestreo in vivo, donde las restricciones de tiempo asociadas con el muestreo in situ (por ejemplo, salas de operación o de emergencia) requieren extracciones rápidas. El perfil de tiempo de extracción de un analito dado generalmente está influenciado por las propiedades fisicoquímicas del analito, la matriz que se muestrea, el tipo de sorbente utilizado y varias otras condiciones de extracción. La plétora de factores que rigen su cinética de extracción hace prácticamente imposible asegurar la extracción de equilibrio de todos los compuestos cuando se realizan análisis no dirigidos como metabolómica o lipidómica. Por las razones antes mencionadas, el tiempo de extracción del protocolo actual se fijó arbitrariamente para garantizar una sensibilidad y cobertura satisfactorias de los metabolitos, por un lado, y la practicidad para el uso in situ por el otro.
Cabe destacar que el tamaño muy pequeño de las sondas utilizadas para la extracción de muestra de los tejidos sólo causa un daño tisular mínimo, mientras que el procedimiento de muestreo en sí no consume ningún tejido, sino cantidades muy pequeñas de moléculas pequeñas de la zona muestreada; por lo tanto, la misma muestra puede utilizarse más adelante para pruebas rutinarias, es decir, histológicas o genéticas, lo que permite el logro de información esencial y complementaria de la misma muestra. Estos datos complementarios y completos permitirían una mejor comprensión de la biología tumoral, con suerte facilitando el descubrimiento de nuevas dianas de tratamiento. La explotación de este método aumenta aún más la posibilidad de diagnósticos intraoperatorios in situ al determinar los biomarcadores objetivo.
A continuación presentamos protocolos para el muestreo de tumores cerebrales in situ para análisis metabolómicos y lipidómicos y procesamiento de datos.
Protocol
El estudio presentado aquí fue aprobado por el Comité de Bioética de Collegium Medicum en Bydgoszcz en la Universidad Nicolaus Copernicus en Toruá (KB 628/2015). Recuerde usar siempre una bata de laboratorio y cualquier otro equipo de seguridad personal requerido, como (pero no limitado a) guantes de seguridad y gafas. No toque la fase de extracción de las sondas de microextracción de fase sólida (SPME).
1. Preparación de los dispositivos SPME
- Utilice sondas (fibras) con recubrimientos de modo mixto y C18 para metabolómica y lipidómica, respectivamente. Recoger dos conjuntos de muestras, una para metabolómica y otra para lipidómica.
- Ajuste el recubrimiento de la sonda a una longitud óptima recortando la sonda SPME. En el estudio actual, la longitud de recubrimiento seleccionada fue de 7 mm. Seleccione la longitud de la fibra según el tamaño del tumor en estudio, asegurándose de que todo el sorbente pueda sumergirse en el tumor (Figura 1).
- Acondicionar los recubrimientos de las sondas remojando en metanol: agua 50:50 v/v mezcla durante un período mínimo de 1 h antes del procedimiento de extracción. Transporte las fibras al lugar del muestreo (por ejemplo, hospital) en un vial que contenga la solución de acondicionamiento.
2. Procedimiento de recogida de muestras
- No lave ni pretrata el tumor de ninguna manera antes de la extracción de SPME.
- Comience el muestreo tan pronto como sea posible después de la extirpación del tumor (2 min en el estudio presentado).
NOTA: Ajuste el tiempo dependiendo de la configuración in situ de una instalación determinada (distancia del sitio de trabajo del investigador desde la mesa de operaciones) y manténgalo constante durante todo el estudio. Minimizar el tiempo transcurrido entre la extirpación del tumor y el inicio de la extracción es crucial para la captura de metabolitos inestables que se degradan después de la circulación sanguínea se corta del tejido estudiado. - Realice el muestreo a temperatura ambiente. Alternativamente, coloque la muestra sobre hielo cuando se lleve a cabo la extracción. En cualquier caso, mantenga las mismas condiciones para todo el conjunto de muestras.
- Saque la sonda del vial.
- Lave las fibras con agua de grado cromatografía-espectrometría de masas líquidas (LC/MS) durante 5 s sumergiéndolas en agua de grado LC/MS. No deje que el sorbente se seque antes de la inserción de la fibra para garantizar una buena reproducibilidad de los datos.
- Inserte las fibras en el tejido tumoral cerebral lo más separado posible, asegurando que toda la fase de extracción se encuentre dentro del tumor.
NOTA: Se recomienda que las extracciones se realicen en réplica para determinar la naturaleza heterogénea del tumor (Figura 2). Se recomiendan tres réplicas por muestra. - Deje la sonda durante 30 minutos en el tejido (medida con un temporizador).
- Utilice controles en blanco para eliminar las fuentes de error relacionadas con la presencia de artefactos derivados de fuentes distintas del tumor muestreado. Para obtener controles en blanco, somete las fibras al mismo flujo de trabajo analítico, como se ha descrito anteriormente, pero sin el paso de muestreo (inserción en el tejido o cualquier otra muestra/matriz). En la etapa de procesamiento de datos, compile los analitos extraídos de estas fibras en una "lista de exclusión" para excluir las señales derivadas de contaminantes derivados de disolventes o fabricación de fibra. Se recomienda utilizar al menos 3 réplicas de espacio en blanco.
NOTA: Para comprobar el riesgo de contaminación, es necesario realizar muestreos a partir de guantes, mesas, aparatos o cualquier otra superficie que pueda suponer un riesgo de contaminación. En tales casos, la preparación de fibra, el tiempo de extracción y los protocolos de desorción son los mismos que para las muestras. - Durante la extracción se está llevando a cabo, etiquetar los viales que se utilizarán para el almacenamiento de las sondas después de la extracción.
- Después de 30 min, extraiga la(s) fibra(s) del tumor cerebral.
- Lave las fibras con agua durante 3 s sumergiéndolas en agua de grado LC/MS para eliminar los residuos de sangre o restos celulares de la sonda para que el extracto final contenga solo moléculas pequeñas. No se recomienda un paso de lavado más largo, ya que puede conducir a la pérdida de compuestos polares.
- Inmovilizar las fibras en el septo pre-slit de la tapa del vial de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) perforando el septo desde la parte inferior con el extremo no recubierto de la fibra.
- Coloque las fibras inmovilizadas en la tapa en viales HPLC separados y colóquelas en el contenedor de transporte seleccionado.
- Realice los pasos 2.11-2.13 para las fibras dedicadas a los controles en blanco.
3. Transporte y almacenamiento
NOTA: Hay varias opciones disponibles para transportar muestras al laboratorio. Se recomienda utilizar para el transporte una caja de nitrógeno líquido Dewar o poliestireno llena de hielo seco; alternativamente, los paquetes de hielo se pueden utilizar para el transporte inmediato y rápido.
- Coloque los viales con fibras en el contenedor de transporte.
- A su llegada al laboratorio, coloque inmediatamente los viales con fibras SPME en un congelador de -80 oC o -30 oC. No almacene las fibras de más de 3 años a -30 oC o 5 años a -80 oC.
4. Preparación de muestras para el análisis metabolómico
NOTA: Este paso solo debe realizarse una vez que se hayan recopilado todas las muestras de un experimento.
- Antes del análisis instrumental, prepare la mezcla de disolvente de desorción: acetonitrilo:agua 80:20 v/v.
- Saque los viales que contienen las fibras de modo mixto del congelador. Utilícelos para el análisis metabolómico.
- Viales de etiqueta que se utilizarán para la desorción.
- Pipetear 300 l de la solución de desorción (preparada en el paso 4.1) en plaquitas de vidrio colocadas en viales de 2 ml.
- Realice la desorción de cada fibra colocada en una plaquita separada sumergiendo completamente el recubrimiento en el disolvente de desorción, luego agitando durante 120 minutos a 1.200 rpm usando vórtice.
- Después de 120 minutos (una vez completada la desorción) retire las tapas con sondas.
- Prepare la muestra de control de calidad mezclando alícuotas de 10 ml de cada muestra del conjunto de muestras. El tamaño del conjunto de muestras depende del diseño experimental. Es importante analizar todas las muestras como un lote.
- Cierre los viales con tapas nuevas.
- Coloque los viales en el muestreador automático (4 oC) del espectrómetro de masas de alta resolución (LC-HRMS) de la cromatografía líquida y pase al paso 5.
NOTA: Aleatorizar el orden de las inyecciones de las muestras, incluidos los espacios en blanco de control. Inyecte la muestra de control de calidad después de cada 8-10 muestras para supervisar la estabilidad del instrumento.
5. Análisis metabolómico utilizando cromatografía líquida de fase inversa y espectrómetro de masas de alta resolución (análisis RPLC-HRMS)
- Configure los parámetros del análisis LC-HRMS y el modo de ionización positiva.
NOTA: Los parámetros utilizados en el estudio actual en modo positivo fueron los siguientes: rango de escaneo: m/z 80-1000; resolución 70 000; adquisición realizada con AGC (1.000.000 de iones); tiempo de inyección a C-trap: auto; voltaje de pulverización: 1.5 kV; Nivel de RF de lente S: 55%; Voltaje de la lente S: 25 V; voltaje del skimmer: 15 V; temperatura capilar: 300 oC; gas de vaina: 40 a.u.; gas auxiliar: 15 a.u.; temperatura del calentador de gas auxiliar: 300 oC. Este método cromatográfico fue adaptado de Vuckovic et al.7. Volumen de inyección: 10 l. - Configure los parámetros del análisis LC-HRMS y el modo de ionización negativa.
NOTA: Los parámetros utilizados en el estudio actual en modo negativo: rango de escaneo: m/z 80-1000; resolución 70 000; adquisición realizada con AGC (1.000.000 de iones); tiempo de inyección a C-trap: auto; voltaje de pulverización: 2.5 kV; Nivel de RF de lente S: 55%; Voltaje de la lente S: -25 V; voltaje skimmer: -15 V; temperatura capilar: gas de vaina de 256oC: 48 a.u; gas auxiliar: 11 a.u.; temperatura del calentador de gas auxiliar: 413 oC. Este método cromatográfico fue adoptado de Vuckovic et al.7. Volumen de inyección: 10 l. - Calibre el instrumento según lo recomendado por el fabricante.
NOTA: En el estudio actual, el instrumento se calibraba utilizando calibración externa cada 48 h, lo que resulta en una precisión de masa <2 ppm. - Inicie el análisis haciendo clic en el botón Inicio del software que opera el instrumento.
- Cuando el análisis esté completo, reemplace la columna RPLC con la columna HILIC, cambie las fases móviles y vaya al paso 6.
6. Análisis metabolómico utilizando cromatografía líquida de interacción hidrófila y espectrómetro de masas de alta resolución (análisis HILIC-HRMS)
- Configure los parámetros del análisis LC-HRMS y el modo de ionización positiva.
NOTA: Los parámetros utilizados en el estudio actual en modo positivo fueron los siguientes: rango de escaneo: m/z 80-1000; resolución 70 000; adquisición realizada con AGC (1.000.000 de iones); tiempo de inyección a C-trap: auto; voltaje de pulverización: 1.5 kV; Nivel de RF de lente S: 55%; Voltaje de la lente S: 25 V; voltaje del skimmer: 15 V; gas de vaina: 60 a.u.; gas auxiliar: 40 a.u.; temperatura del calentador de gas auxiliar: 425 oC; temperatura capilar: 325oC. El método cromatográfico fue adaptado de Vuckovic et al.7. Volumen de inyección: 10 l. - Configure los parámetros del análisis LC-HRMS y el modo de ionización negativa.
NOTA: Los parámetros utilizados en el estudio actual en modo negativo fueron los siguientes: rango de escaneo: m/z 80-1000; resolución 70 000; adquisición realizada con AGC (1.000.000 de iones); tiempo de inyección a C-trap: auto; voltaje de pulverización: 1.3 kV; Nivel de RF de lente S: 55%.; Voltaje de la lente S: -25 V; voltaje skimmer: -15 V; temperatura capilar: 263 oC; gas de vaina: 60 a.u.; gas auxiliar: 30 a.u.; temperatura del calentador de gas auxiliar: 425 oC. El método cromatográfico fue adaptado de Vuckovic et al.7. Volumen de inyección: 10 l. - Calibre el instrumento según lo recomendado por el fabricante.
NOTA: En el estudio actual, el instrumento se calibraba utilizando calibración externa cada 48 h, lo que resulta en una precisión de masa <2 ppm. - Inicie el análisis haciendo clic en el botón Inicio del software que opera el instrumento.
7. Preparación de muestras para el análisis lipidómico
NOTA: Este paso solo debe realizarse una vez que se hayan recopilado todas las muestras del experimento.
- Antes de iniciar el análisis, preparar la mezcla de disolvente de desorción: isopropanol:metanol 50:50 v/v.
- Saque del congelador los viales que contienen las fibras C18 dedicadas al análisis lipidémico.
- Viales de etiqueta que se utilizarán para la desorción.
- Pipetear 200 l de la solución de desorción (preparada en el paso 7.1) para silanizar las plaquitas de vidrio colocadas en viales de 2 ml.
NOTA: También se pueden utilizar plaquitas no silanizadas, pero su uso puede resultar en una reproducibilidad deficiente de compuestos con alto logP, ya que tales compuestos pueden adherirse de forma no específica a las paredes de vidrio. - Realice la desorción de cada fibra en una plaquita separada sumergiendo completamente el recubrimiento en el disolvente de desorción, luego agitando durante 60 minutos a 1.200 rpm usando vórtice.
- Después de 60 minutos cuando se completa la desorción, retire las tapas con sondas.
- Prepare la muestra de control de calidad mezclando alícuotas de 10 ml de cada muestra del conjunto de muestras. El tamaño del conjunto de muestras depende del diseño experimental. Es importante analizar todas las muestras como un lote.
- Cierre los viales con tapas nuevas.
- Coloque los viales en el muestreador automático (4 oC) del espectrómetro de masas de alta resolución (LC-HRMS) de la cromatografía líquida y pase al paso 8.
8. Análisis lipidómico mediante cromatografía líquida de fase inversa y espectrometría de masas de alta resolución (análisis RPLC-HRMS)
- Configure los parámetros del análisis LC-HRMS y el modo de ionización positiva.
NOTA: Los parámetros utilizados en el estudio actual en modo iónico positivo fueron los siguientes: rango de escaneo: m/z 100-1000; adquisición realizada con AGC (1.000.000 de iones); tiempo de inyección a C-trap: auto; voltaje de pulverización: 3.5 kV, nivel de RF de lente S: 55%; Voltaje de la lente S: 25 V; voltaje del skimmer: 15 V; temperatura capilar 275 oC; gas de vaina: 30 a.u.; gas auxiliar: 10 a.u.; gas de repuesto: 2 a.u.; temperatura del calentador de la sonda 300 oC. Los parámetros LC utilizados fueron: fase A: metanol: agua, 40:60 con 10 mM de acetato de amonio y ácido acético de 1 mM; fase B: isopropanol:metanol, 90:10 con 10mM de acetato de amonio y ácido acético de 1 mM.; el gradiente: 0 min – 20% B; 1.0 min – 20% B; 1.5 min – 50% B; 7.5 min – 70% B; 13.0 min – 95% B; 17.0 min – 95% B; 17.1 min – 95.5 % B; 23.0 min – STOP; C18 Columna, 3,5 m, 2,1 mm x 75 mm; flujo: 0,2 ml/min; temperatura del horno: 55 oC; volumen de inyección: 10 l. - Configure los parámetros del análisis LC-HRMS y el modo de ionización negativa.
NOTA: Los parámetros utilizados en el estudio actual fueron los siguientes: parámetros HRMS para el modo iónico negativo: rango de escaneo: m/z 100-1000; adquisición realizada con AGC (1.000.000 de iones); tiempo de inyección a C-trap: auto; voltaje de pulverización: 3.5 kV, nivel de RF de lente S: 55%; Voltaje de la lente S: -25 V; voltaje skimmer: -15 V; temperatura capilar 275 oC; gas de vaina: 30 a.u; gas auxiliar: 10 a.u.; gas de repuesto: 2 a.u; temperatura del calentador de la sonda 300 oC. Método cromatográfico: igual que en 8.1. - Calibre el instrumento según lo recomendado por el fabricante.
NOTA: En el estudio actual, el instrumento se calibraba utilizando calibración externa cada 48 h, lo que resulta en una precisión de masa <2 ppm. - Inicie el análisis haciendo clic en el botón Inicio del software que opera su instrumento.
- Cuando se complete el análisis, reemplace la columna RPLC por la columna HILIC, cambie las fases móviles y vaya al paso 9.
9. Análisis lipidómico utilizando cromatografía líquida de interacción hidrófila y espectrómetro de masas de alta resolución (análisis HILIC-HRMS)
- Configure los parámetros del análisis LC-HRMS y el modo de ionización positiva.
NOTA: Los parámetros utilizados en el estudio actual en modo iónico positivo fueron los siguientes: rango de escaneo: m/z 100-1000; adquisición realizada con AGC (1.000.000 de iones); voltaje de pulverización: 1.5 kV; Nivel de RF de lente S: 55%; Voltaje de la lente S: 25 V; voltaje del skimmer: 15 V; temperatura capilar 325 oC; gas de vaina: 60 a.u.; gas auxiliar: 30 a.u.; gas de repuesto: 2 a.u.; temperatura del calentador de la sonda 320 oC. Los parámetros LC utilizados fueron: fase A: acetato de amonio de 5 mM en agua; fase B: acetonitrilo; el gradiente: 0 – 2min – 4% B; 15,0 – 20% B; 15.1 – 4% B, 21.0 min – STOP; Columna de 3 mm 100 mm x 2,1 mm; flujo: 0,4 ml/min; temperatura del horno: 40 oC; volumen de inyección: 10 l. - Configure los parámetros del análisis LC-HRMS y el modo de ionización negativa.
NOTA: Los parámetros utilizados en el estudio actual en modo iónico negativo fueron los siguientes: rango de escaneo: m/z 80-1000; adquisición realizada con AGC (1.000.000 de iones); voltaje de pulverización: 1.5 kV, nivel de RF de lente S: 55%; Voltaje de la lente S: -25 V; voltaje skimmer: -15 V; temperatura capilar 320 oC; gas de vaina: 50 a.u.; gas auxiliar: 21 a.u.; gas de repuesto: 3 a.u.; temperatura del calentador de la sonda 320 oC. El método cromatográfico fue el mismo que se describe en 9.1. - Calibre el instrumento según lo recomendado por el fabricante.
NOTA: En el estudio actual, el instrumento se calibraba utilizando calibración externa cada 48 h, lo que resulta en una precisión de masa <2 ppm. - Inicie el análisis haciendo clic en el botón Inicio del software que opera el instrumento.
10. Procesamiento de datos y análisis estadístico
- Procesar datos utilizando software compatible con el formato de los archivos de datos sin procesar.
- Realice análisis estadísticos utilizando los datos procesados.
NOTA: El tipo de prueba depende de la hipótesis científica y el diseño del estudio. En el estudio actual, se utilizaron Análisis de componentes principales, Análisis de discriminación cuadrada parcial-menos cuadrada y ANOVA unidireccional.
Representative Results
La explotación de la microextracción de fase sólida como método de preparación de muestras en combinación con la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución y un avanzado software de procesamiento de datos nos permitió caracterizar con éxito el metaboloma y el lipidome de los tumores cerebrales humanos. La sonda, cuyo tamaño era equivalente a una aguja de acupuntura, causó un daño mínimo al tejido estudiado y ningún consumo de tejido, por lo tanto, permitiendo el uso posterior de muestras para estudios histológicos o genéticos. Se obtuvo una separación satisfactoria de los grupos seleccionados tanto para las columnas de fase invertida como para las columnas HILIC, y para ambos modos de ionización en análisis metabolómicos y lipidómicos. El uso de ambos métodos de separación no sólo en metabolómica, sino también en el análisis lipidómico proporcionó valiosos datos complementarios. La columna de fase invertida separa los lípidos con respecto a la longitud de sus cadenas de carbono y la presencia de enlaces insaturados, mientras que la columna HILIC es útil para perfilar grupos de lípidos, especialmente fosfolípidos8.
Se encontró que la reproducibilidad del análisis instrumental era muy buena sobre la base de la agrupación apretada de muestras de control de calidad en la gráfica de análisis de componentes principales(Figura 3A, las tres muestras de control de calidad inyectadas cada muestra de ocho pacientes a lo largo de la superposición de secuencias). Además, se encontró que los espacios en blanco de extracción utilizados para el análisis de control negativo separaban bien de las muestras reales. La amplia gama de analitos extraídos por las sondas facilitó el descubrimiento de especies representativas, permitiendo así con éxito la diferenciación entre tumores cerebrales humanos basados en su origen histológico, neoplasia maligna y otros factores (por ejemplo, genéticos). La Figura 3B muestra datos lipidómicos de muestras recogidas de pacientes con gliomas y meningiomas. La habilitación de la diferenciación entre estos tumores, que se caracterizaron por un origen histológico y neoplasia maligna diferentes, fue un objetivo importante del estudio, ya que los meningiomas se consideran generalmente como tumores benignos, mientras que los gliomas son uno de los más malignos. Además, en la Figura 4 que presenta datos metabolómicos, los gliomas se dividieron en función de su grado de neoplasia maligna en alto y bajo. Estos subgrupos se compararon con el fenotipo molecular de los meningiomas. En ambos casos, se observó una separación prominente de los racimos. Hoy en día, el diagnóstico de glioma se basa principalmente en determinar mutaciones genéticas específicas en muestras tumorales. Por lo tanto, los resultados obtenidos se compararon con los datos de genotipado. La Figura 5A presenta la separación de las muestras con la co-eliminación 1p19q detectada y muestras donde no se observó la mutación.
El análisis estadístico también permite la selección de compuestos en los grupos estudiados. Estos compuestos pueden considerarse como biomarcadores potenciales en los casos en que se muestrea una cohorte adecuadamente grande. Sin embargo, se requiere un análisis más detallado, incluida la confirmación concluyente de los compuestos detectados por fragmentación y comparación de especies detectadas con normas analíticas, para extraer conclusiones definitivas de carácter biológico. Ejemplos de estos metabolitos discriminantes se presentan en la Figura 3C y la Figura 5B. Las identidades de estos compuestos, es decir, sphingomielyn: SM d36:1 y proline se confirmaron comparando los patrones de fragmentación de los metabolitos de la muestra y las normas auténticas.
Figura 1: Fibras SPME preparadas para el proceso de extracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Extracción de meningioma mediante sondas SPME. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: PCA y cajas para glioma y meningioma. Gráfica de análisis de componentes principales que contiene (A) todas las muestras analizadas, incluidos espacios en blanco, control de calidad de extracción, espacios en blanco, meningiomas, gliomas; (B) que contiene únicamente grupos estudiados (después de la exclusión de espacios en blanco y QCs); (C) caja bigote parcela para sphingomielyn: SM d36:1 paciente diferenciador con glioma y meningioma. Datos lipidómicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: PCA para HGG, LGG y meningioma. Gráfica de análisis de componentes principales que muestra la diferenciación entre (A) gliomas de alto grado (HGG) y meningiomas (MEN)9 y (B) gliomas de bajo grado (LGG) y meningiomas. Datos metabolómicos reimpresos desde Via Medica ref9 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: PCA y cajas gráficas para glioma con y sin eliminación. (A) La gráfica de análisis de componentes principales mostró diferencias en pacientes con y sin co-eliminación 1p19q; (B) gráficas de bigote de caja para pacientes diferenciados prolina con y sin supresión conjunta 1p19q; n-sin eliminación, y-con eliminación. Datos de metabolómica Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Metabolómica no focalizada y lipidómica se utilizan comúnmente en estudios centrados en la identificación de biomarcadores tumorales. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los investigadores buscan compuestos que se pueden utilizar para la detección de la enfermedad. En consecuencia, las muestras biológicas preferidas son la sangre u orina debido a su acceso relativamente fácil. El análisis del tejido tumoral se realiza principalmente para entender los mecanismos detrás de la enfermedad, caracterizar diferentes tipos de tumores, etc. El análisis in situ de los biomarcadores tumorales rara vez se realiza, ya que tales aplicaciones requieren una amplia preparación de la muestra. Alternativamente, las estrategias basadas en el análisis en tiempo real de perfiles de tejidos sin preselección de biomarcadores específicos están ganando la atención de la comunidad médica3,4. La solución presentada aquí proporciona otra perspectiva sobre el procesamiento de tejidos in situ al revelar el tipo de información que se puede obtener a través de estos métodos.
La combinación de muestreo, preparación de muestras y extracción hace que SPME sea una herramienta muy útil para el análisis in situ. Además, la falta de consumo de tejido durante el muestreo permite un mayor uso de las mismas muestras para el análisis de biomarcadores y pruebas rutinarias (genotipado, análisis histológico), por lo tanto, añadiendo nueva información a los resultados de las pruebas estándar. El dispositivo de muestreo tiene un diseño muy simple, su funcionamiento es muy fácil, y no se requiere ningún entrenamiento especial para realizar la extracción en sí. Sin embargo, lograr resultados fiables requiere mucho más que un manejo adecuado de los dispositivos. Para realizar correctamente el experimento, es necesario comprender el proceso de extracción, la naturaleza de la muestra y ser consciente de posibles errores que pueden influir en los datos.
Es importante considerar la heterogeneidad del tejido canceroso10; Los tumores muestreados pueden contener partes sometidas a necrosis, calcificación e hipoxia, y cada uno de estos procesos se reflejará en el metaboloma y el lipidome alcanzados, influyendo así en los resultados. Por lo tanto, se recomienda que el muestreo de resolución espacial se lleve a cabo mediante la inserción de varias fibras en diferentes partes del tejido canceroso, o alternativamente, que se utilice un recubrimiento más largo para penetrar en todo el tumor con el fin de obtener información promediada sobre el tumor. Si se lleva a cabo el método de muestreo de resolución espacial, todas las fibras pueden desorberse en un disolvente de desorción; esto no sólo permitiría el logro de información general sobre el tumor, sino que también aumentaría la sensibilidad del análisis. Alternativamente, la desorción de fibras individuales en viales separados permitiría a las investigaciones averiguar la diversidad interna del tumor cerebral, que consiste en el núcleo construido de células cancerosas, y la zona externa, que es el borde del tejido sano. Las partes más profundas del tumor suelen estar más dañadas por los procesos relacionados con el cáncer11. Sin embargo, los investigadores deben tener en cuenta que esta opción compromete la sensibilidad del método y el número total de compuestos detectables. En el trabajo actual, se utilizó un recubrimiento de 7 mm; esta longitud se consideró óptima para varios tamaños de tumores incluidos en el estudio. Los recubrimientos penetraron en los tumores, y por lo tanto proporcionaron una resolución no especial, pero promediaron datos a lo largo de la muestra. Independientemente del protocolo seleccionado, es importante que se siga el mismo protocolo durante todo el estudio, incluyendo el número de fibras utilizadas para el muestreo individual, la longitud del recubrimiento, el tiempo de extracción y todos los demás factores delineados en este trabajo.
Es importante controlar la calidad del análisis. El QC agrupado (véanse los pasos 4.7 y 7.7 en el protocolo) debe prepararse y utilizarse para supervisar la estabilidad del instrumento durante la ejecución de todo el lote de muestras. Los controles en blanco (véase el paso 2.8) se pueden utilizar más adelante para preparar una "lista de exclusión" para eliminar las señales de contaminantes procedentes de disolventes o la fabricación de fibra. En ocasiones especiales, como el riesgo de contaminación, es necesario realizar muestreos a partir de guantes, mesas, aparatos o cualquier otra superficie que pueda suponer un riesgo de contaminación. En tales casos, la preparación de fibra, el tiempo de extracción y los protocolos de desorción son los mismos que para las muestras.
Los análisis metabolómicos y lipidómicos se centran enteramente en moléculas pequeñas (menos de 1.500 Da) que aparecen en un organismo o componentes específicos del organismo, como órganos específicos, tejidos, fluidos, células, etc. Metabolómica y lipidómica ofrecen una instantánea de los cambios bioquímicos que ocurren en el cuerpo, y en el caso del cáncer, integran información relacionada con el genoma, la histología y la neoplasia maligna del tumor. Estas ciencias omics crean una conexión entre la fisiología y el fenotipo, ya que los metabolitos son más altos en la escala bioquímica que las proteínas o genes12. Al entender el metabolomo y el lipidomo de los tumores cancerosos, nos acercamos a descubrir el fenotipo entre todas las ciencias -omics ya que estas ramas de estudio ofrecen un conocimiento más profundo de los cambios dinámicos de las moléculas como respuesta de los organismos vivos a diversos estímulos. Como se presenta en este trabajo, los datos obtenidos en un muestreo corresponden a la histología del cáncer, su grado de neoplasia maligna, y refleja los cambios que se producen a nivel del genoma. En los gliomas, como el tipo de cáncer de interés en este estudio, la información oculta en el genoma es particularmente importante, ya que se desarrolla un tratamiento personalizado basado en los resultados de las pruebas genéticas. Las mutaciones particulares son marcadores de pronóstico de los resultados de la quimioterapia o radioterapia. Como se demuestra aquí, la selección de biomarcadores que reflejan una mutación dada es posible con la estrategia propuesta. Los marcadores de mutación, así como los tipos de descriptores adicionales, como los que indican el grado de neoplasia maligna del tumor, también se pueden utilizar para apoyar los métodos de diagnóstico de rutina.
La biopsia química ex vivo con el uso de fibras de microextracción de fase sólida es el primer paso en la aplicación del método al diagnóstico intraoperatorio. El método se puede adoptar fácilmente para el muestreo in vivo en espera de permiso de las juntas éticas apropiadas. En tales casos, la esterilización de dispositivos SPME debe realizarse de acuerdo con los procedimientos de esterilización aceptados del hospital donde se va a llevar el muestreo, es decir, autoclaves o esterilización con óxido de etileno. Las fibras pre-acondicionadas y esterilizadas deben mantenerse en envases sellados etiquetados con una fecha de caducidad de esterilización. Es importante tener en cuenta que las fibras no deben limpiarse con el uso de tensioactivos. Tal procedimiento puede causar cambios inespecíficos en la composición del sorbente, afectando así la extracción de analitos. En los estudios descritos en este documento, se utilizó un período de extracción de 30 minutos, pero otros informes validan que tiempos más cortos pueden producir resultados satisfactorios en los estudios in vivo 13. Huq y otros mostraron que el tiempo de equilibrio de los analitos se logra más rápido en el tejido, como una matriz compleja, que en matrices simples14. Sin embargo, la reproducibilidad de los resultados obtenidos puede verse comprometida en períodos de extracción más cortos, ya que se extraerán más analitos en condiciones de presecise; por lo tanto, debe implementarse un control preciso del tiempo.
Ambas ciencias omics explotadas como parte de este trabajo tienen un excelente potencial como herramientas de descubrimiento de biomarcadores. Una vez que se seleccionan biomarcadores o se establece un modelo quimiométrico, se pueden desarrollar e implementar diagnósticos médicos basados en la determinación de metabolitos diana a través de métodos aplicables a las investigaciones in situ, como el enfoque SPME descrito en este trabajo, como parte de los diagnósticos de rutina.
El protocolo propuesto en el presente manuscrito describe cómo realizar análisis metabolómicos y lipidómicos no dirigidos del tejido canceroso utilizando microextracción de fase sólida para el cribado de posibles biomarcadores. Está diseñado para permitir la extracción de compuestos representativos, la diferenciación de tumores y la identificación de compuestos discriminatorios que caracterizan un determinado cáncer, es decir, biomarcadores potenciales. Los análisis no dirigidos con SPME descritos en este artículo representan un punto de partida en el desarrollo de diagnósticos intraoperatorios rápidos, donde se puede determinar un panel seleccionado de compuestos sin necesidad de cribado de todos los compuestos presentes en la muestra. En aras de resultados de diagnóstico rápidos, las sondas SPME utilizadas para la extracción in situ podrían acoplarse directamente a la instrumentación analítica ubicada en las instalaciones del hospital. Las extracciones simples realizadas con una preparación mínima de la muestra seguidas de análisis sin cromatografía reducirían significativamente el tiempo total de horas a unos pocos minutos, como ya se ha descrito para el monitoreo de fármacos15.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El estudio fue apoyado por la beca Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 del Centro Nacional de Ciencias. Los autores desean reconocer a MilliporeSigma, una empresa de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania, por proporcionar los dispositivos SPME utilizados en esta obra. El negocio de ciencias de la vida de Merck opera como MilliporeSigma en los Estados Unidos y Canadá. Además, los autores quieren agradecer a Thermo Fisher Scientific el acceso al espectrómetro de masas orbitrap Q-Exactive Focus.
Contribuciones de los autores: JB: optimización de la preparación de muestras y parámetros LC-MS, rendimiento de experimentos SPME-LC-MS, análisis de datos, análisis estadístico e interpretación de datos y preparación de manuscritos relacionados con la parte lipidómica; PZG: coordinación y rendimiento de la mayoría de los muestreos en hospitales, optimización de los parámetros de muestreo y preparación de muestras, rendimiento de experimentos SPME-LC-MS, análisis de datos, análisis estadístico e interpretación de datos, preparación de manuscritos relacionados con la parte metabolómica; MG – asistencia en la optimización de la preparación de muestras, el método LC-MS y el análisis de datos relacionados con la parte lipidémica; KG: co-rendimiento de los muestreos SPME y optimización del muestreo y la preparación de muestras, análisis SPME-LC-MS relacionados con la parte metabolómica; KC: rendimiento de varios muestreos SPME en el hospital, asistencia en la optimización del muestreo, preparación de muestras y análisis de datos relacionados con la parte metabolómica; KJ: rendimiento de varios muestreos de SPME en el hospital, asistencia en el análisis lipidómico; DP: realización de procedimientos quirúrgicos, reclutamiento de los pacientes; JF: realización de procedimientos quirúrgicos, reclutamiento de los pacientes; MH: rendimiento de los procedimientos quirúrgicos, coordinación de la parte clínica de la investigación; BB: concepto, supervisión de coordinación del proyecto y preparación del manuscrito, realización de varios muestreos
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9x5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
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