Este artículo presenta un protocolo para investigar el efecto de las bacterias intestinales de mosquitos individuales, incluyendo el aislamiento y la identificación de microbios cultivables de mosquitos en la mitad del intestino, agotamiento de antibióticos de bacterias intestinales de mosquitos, y reintroducir una especie específica de bacterias.
El mosquito midgut alberga un microbioma altamente dinámico que afecta el metabolismo del huésped, la reproducción, la aptitud física y la competencia vectorial. Se han realizado estudios para investigar el efecto de los microbios intestinales en su conjunto; sin embargo, diferentes microbios podrían ejercer efectos distintos hacia el huésped. Este artículo proporciona la metodología para estudiar el efecto de cada microbio intestinal específico del mosquito y el mecanismo potencial.
Este protocolo contiene dos partes. La primera parte introduce cómo diseccionar el mosquito en la parte media del intestino, aislar colonias de bacterias cultivables e identificar especies de bacterias. La segunda parte proporciona el procedimiento para generar mosquitos tratados con antibióticos y reintroducir una especie específica de bacterias.
Los mosquitos se consideran los vectores más importantes de las enfermedades patógenas humanas, transmitiendo más de un centenar de patógenos, incluyendo el virus del Zika, el virus del Dengue y los parásitos Plasmodium 1. Cuando los mosquitos toman una comida de sangre para adquirir nutrientes para la oviposición, pueden ingerir accidentalmente patógenos de un huésped infectado a través del tracto digestivo2. Es importante destacar que el medio mosquito, que desempeña un papel fundamental tanto en la digestión de las comidas en sangre como en la entrada de patógenos, alberga un microbioma altamente dinámico3.
Varios estudios han caracterizado la microbiota de mosquitos criada en laboratorio y recogida en el campo utilizando un método dependiente del cultivo o un ensayo de secuenciación de bacterias4,,5,,6. Especies como Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiay Enterococcus se suelen aislar de los mosquitos en diversos estudios5,7,8,9. Curiosamente, la microbiota intestinal de los mosquitos fluctúa dinámicamente tanto en la diversidad comunitaria como en la cantidad de especies bacterianas, afectadas por la etapa de desarrollo, las especies, el origen geográfico y el comportamiento de alimentación4. Los estudios muestran que la alimentación sanguínea aumenta dramáticamente la carga bacteriana total con una rápida expansión de las especies de Enterobacteriaceae y una reducción de la diversidad general10,11. Además, la microbiota intestinal del mosquito de la etapa larval generalmente se erradica cuando el insecto sufre metamorfosis durante la pupación y eclosión; por lo tanto, los mosquitos adultos recién surgidos necesitan repoblar su microbiota4.
La microbiota intestinal modula la fisiología de los insectos en diversos aspectos, como la absorción de nutrientes, la inmunidad, el desarrollo, la reproducción y la competencia vectorial12. Las larvas de mosquitos estribicos no se desarrollan más allá de la primera estrella, mientras que un suministro oral de bacterias rescata el desarrollo, lo que indica que el microbio intestinal del mosquito es esencial para el desarrollo larvario13,14. Además, el agotamiento de las bacterias intestinales retrasa la digestión de las comidas en la sangre y la absorción de nutrientes, afecta la maduración de los ovocitos y disminuye la oviposición15. Además, los mosquitos con microflora intestinal provocan respuestas inmunitarias más altas en comparación con los mosquitos tratados con antibióticos, con una expresión de péptido antimicrobiano constantemente elevada contra otros patógenos para infectar a16. Por lo general, los antibióticos se administran por vía oral para eliminar las bacterias del intestino de la sartén en estos estudios, y luego se llevan a cabo experimentos para comparar la diferencia entre los mosquitos oxenicos y los mosquitos con microbios commensales. Sin embargo, el mosquito midgut alberga una comunidad diversa de microbios, y cada especie de bacteria podría ejercer un efecto distintivo hacia la fisiología anfitriona.
La microbiota de mosquitos regula la competencia vectorial con efectos divergentes. La colonización por Proteus aislada de mosquitos derivados del campo de las zonas endémicas de dengue confiere la expresión de péptidos antimicrobianos reguladas y la resistencia contra la infección por el virus del dengue16. El hongo entomopatógeno Beauveria bassiana activa la vía inmune Toll y JAK-STAT contra la infección por arbovirus17. Por el contrario, el hongo Talaromyces aislado de Aedes aegypti midgut facilita la infección por el virus del dengue mediante la modulación de la actividad de tripsina intestinal18. Además, Serratia marcescens promueve la transmisión del arbovirus a través de una proteína secretora llamada SmEnhancin, que digiere la capa de mucina en el epitelio intestinal de los mosquitos19.
Este procedimiento proporciona un método sistemático e intuitivo para la disección del pasto del mosquito, el aislamiento de colonias de bacterias cultivables, la identificación de las especies de bacterias y la reintroducción a través de la alimentación oral. Proporciona resultados representativos de la alimentación de la sangre con una bacteria commensal, Chryseobacterium meningosepticum,sobre el desarrollo del ovario de mosquitos y la oviposición.
Las investigaciones sobre las interacciones huésped-microbio han encontrado que diferentes microbios intestinales afectan su fisiología huésped a través de mecanismos divergentes. Este artículo presenta el método para investigar el papel respectivo del microbio intestinal del mosquito, incluyendo la disección de la mitad del mosquito en la bles, el cultivo de bacterias intestinales cultivables, el tratamiento antibiótico y la reintroducción de las bacterias de interés.
Para un tratam…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81902094, 81600497), y el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Hunan (2019RS1036).
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
Cotton balls | |||
Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g; Yeast Extract 5.0 g; NaCl 10.0 g; Agar 15.0 g. |
LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g; Yeast Extract 5.0 g; NaCl 10.0 g. |
Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
Paper cup | Place mosquito | ||
Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
Single Channal Pipettor | Gilson | ||
Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |