Un test d’alimentation orale bactérienne avec des moustiques traités aux antibiotiques
Summary
Cet article présente un protocole pour étudier l’effet des bactéries intestinales des moustiques individuelles, y compris l’isolement et l’identification des microbes cultivables midgut moustique, l’épuisement antibiotique des bactéries intestinales des moustiques, et réintroduire une espèce spécifique de bactéries.
Abstract
Le moustique midgut abrite un microbiome très dynamique qui affecte le métabolisme de l’hôte, la reproduction, la forme physique et la compétence vectorielle. Des études ont été menées pour étudier l’effet des microbes intestinaux dans leur ensemble; cependant, différents microbes pourraient exercer des effets distincts vers l’hôte. Cet article fournit la méthodologie pour étudier l’effet de chaque microbe spécifique d’intestin de moustique et le mécanisme potentiel.
Ce protocole contient deux parties. La première partie introduit la façon de disséquer le moustique midgut, d’isoler les colonies de bactéries cultivables et d’identifier les espèces de bactéries. La deuxième partie fournit la procédure pour générer des moustiques traités aux antibiotiques et réintroduire une espèce bactérienne spécifique.
Introduction
Les moustiques sont considérés comme les vecteurs les plus importants des maladies pathogènes humaines, transmettant plus d’une centaine d’agents pathogènes, y compris le virus Zika, le virus de la dengue et les parasites Plasmodium 1. Lorsque les moustiques prennent un repas sanguin pour acquérir des nutriments pour l’oviposition, ils peuvent accidentellement ingérer des agents pathogènes d’un hôte infecté via le tube digestif2. Fait important, le midgut de moustique, qui joue un rôle central dans la digestion de farine de sang et l’entrée de pathogène, abrite un microbiome très dynamique3.
Plusieurs études ont caractérisé le microbiote des moustiques élevés en laboratoire et sur le terrain à l’aide d’une méthode dépendante de la culture ou d’un test de séquençage des bactéries4,,5,6. Espèces, y compris Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, et Enterococcus sont généralement isolés des moustiques dans diverses études5,7,8,9. Fait intéressant, le microbiote intestinal des moustiques fluctue dynamiquement dans la diversité de la communauté et la quantité d’espèces bactériennes, affectées par le stade de développement, les espèces, l’origine géographique et le comportement alimentaire4. Des études montrent que l’alimentation sanguine augmente considérablement la charge bactérienne totale avec l’expansion rapide des espèces d’Enterobacteriaceae et une réduction de la diversité globale10,11. En outre, le microbiote intestinal des moustiques du stade larvaire est généralement éradiqué lorsque l’insecte subit une métamorphose pendant la pupation et l’éclosion; ainsi, les moustiques adultes nouvellement émergés ont besoin de repeupler leur microbiote4.
Le microbiote intestinal module la physiologie des insectes sous divers aspects, y compris l’absorption des nutriments, l’immunité, le développement, la reproduction et la compétence vectorielle12. Les larves de moustiques axeniques ne se développent pas au-delà de la première étoile tandis qu’un approvisionnement oral de bactéries sauve le développement, indiquant que le microbe d’intestin de moustique est essentiel pour le développement de larval13,14. En outre, l’épuisement des bactéries intestinales retarde la digestion des farines sanguines et l’absorption des nutriments, affecte la maturation des ovocytes, et diminue l’oviposition15. En outre, les moustiques atteints de microflore intestinale provoquent des réponses immunitaires plus élevées que les moustiques traités aux antibiotiques, avec une expression peptide antimicrobiene constamment élevée contre d’autres agents pathogènes pour infecter16. Les antibiotiques sont généralement administrés par voie orale pour éliminer les bactéries intestinales dans ces études, puis des expériences sont menées pour comparer la différence entre les moustiques axeniques et les moustiques avec les microbes commensaux. Cependant, le moustique midgut abrite une communauté diversifiée de microbes, et chaque espèce de bactéries pourrait exercer un effet distinct vers la physiologie de l’hôte.
Le microbiote des moustiques régule la compétence vectorielle avec des effets divergents. La colonisation par Proteus isolé des moustiques dérivés du champ des zones dengue-endémiques confère l’expression et la résistance des peptides antimicrobiens upregulés contre l’infection par le virus de la dengue16. Le champignon entomopathogène Beauveria bassiana active la voie immunitaire Toll et JAK-STAT contre l’infection par l’arbovirus17. En revanche, le champignon Talaromyces isolé d’Aedes aegypti midgut facilite l’infection par le virus de la dengue en modulant l’activité de trypsineintestinale 18. En outre, Serratia marcescens favorise la transmission d’arbovirus par une protéine sécrétoire appelée SmEnhancin, qui digère la couche de mucine sur l’épithélium intestinal des moustiques19.
Cette procédure fournit une méthode systématique et intuitive pour la dissection du midgut de moustique, l’isolement des colonies de bactéries cultivables, l’identification des espèces de bactéries, et la réintroduction par l’alimentation orale. Il fournit des résultats représentatifs de l’alimentation du sang avec une bactérie commensal, Chryseobacterium meningosepticum, sur le développement des ovaires de moustiques et l’oviposition.
Protocol
Representative Results
Discussion
La recherche sur les interactions hôte-microbe ont constaté que différents microbes intestinaux affectent leur physiologie hôte par des mécanismes divergents. Cet article présente la méthode pour étudier le rôle respectif du microbe intestinal de moustique, y compris la dissection de midgut de moustique, la culture des bactéries intestinales cultivables, le traitement antibiotique, et la réintroduction des bactéries d’intérêt.
Pour réussir un traitement antibiotique, les déta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497) et le Projet de plan scientifique et technologique de la province du Hunan (2019RS1036).
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g； Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
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