Bu makalede, izole ve sivrisinek midgut kültlenebilir mikropların belirlenmesi, sivrisinek bağırsak bakterilerin antibiyotik tükenmesi de dahil olmak üzere bireysel sivrisinek bağırsak bakterilerin etkisini araştırmak için bir protokol sunuyor ve belirli bir bakteri türleri yeniden tanıtmak.
Sivrisinek midgut konak metabolizmasını etkileyen son derece dinamik bir mikrobiyom barındırır, üreme, fitness, ve vektör yeterlilik. Bir bütün olarak bağırsak mikroplarının etkisini araştırmak için çalışmalar yapılmıştır; ancak, farklı mikroplar ana bilgisayara karşı farklı etkiler uygulayabilir. Bu makalede, her belirli sivrisinek bağırsak mikrobu ve potansiyel mekanizmanın etkisini incelemek için metodoloji sağlar.
Bu protokol iki bölümden oluşur. İlk bölümde sivrisinek midgut diseksiyon, kültleştirilebilir bakteri kolonileri izole ve bakteri türlerini tanımlamak nasıl tanıttı. İkinci bölüm antibiyotik tedavi sivrisinek oluşturmak ve belirli bir bakteri türlerini yeniden tanıtmak için prosedür sağlar.
Sivrisinekler zika virüsü, Dang virüsü ve Plazmodium parazitleri1 dahil olmak üzere yüzden fazla patojenilen insan patojenik hastalıkların en önemli vektörleri olarak kabul edilir. Sivrisinekler oviposition için besin elde etmek için bir kan yemek almak, yanlışlıkla sindirimsistemi2 yoluyla enfekte bir konak tan patojenleri yutabilir . Daha da önemlisi, sivrisinek midgut, hangi kan yemek sindirim ve patojen girişinde hem3de önemli bir rol oynar, son derece dinamik mikrobiyom 3 limanlar .
Çeşitli çalışmalar da bir kültüre bağlı yöntem ya da bir bakteri sıralama tsay4,5,,6kullanarak laboratuvar yetiştirilen ve alan toplanan sivrisinek mikrobiyota karakterize var. Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiave Enterococcus gibi türler genellikle çeşitli çalışmalarda sivrisinek izole5,7,8,9. İlginçtir, sivrisinek bağırsak mikrobiyota dinamik olarak hem toplum çeşitliliği ve bakteri türlerinin miktarı, geliştirme aşamasından etkilenen, türler, coğrafi kökeni ve beslenme davranışı4dalgalanmalar . Çalışmalar kan besleme önemli ölçüde Enterobacteriaceae türlerin hızlı genişleme ve genel çeşitlilik bir azalma ile toplam bakteri yükünü artırır göstermektedir10,11. Buna ek olarak, larva evresinin sivrisinek bağırsağı mikrobiyotası genellikle böcek pupasyon ve klozyon sırasında metamorfoz geçirdiğinde ortadan kalkar; böylece, yeni ortaya çıkan yetişkin sivrisinekmikrobiyotayenidengerekir 4 .
Gut mikrobiyota besin emilimi, bağışıklık, geliştirme, üreme ve vektör yeterlilik12dahil olmak üzere çeşitli yönleriyle, böcek fizyolojisi modüle. Bir bakteri oral kaynağı gelişimi kurtarır iken Axenic sivrisinek larvaları ilk instar ötesinde geliştirmek için başarısız, sivrisinek bağırsak mikrobu larva gelişimi için gerekli olduğunu belirten13,14. Ayrıca, bağırsak bakterilerin tükenmesi kan yemek sindirim ve besin emilimini geciktirir, yumurta olgunlaşmaetkiler, ve oviposition azalır15. Buna ek olarak, bağırsak mikroflorası ile sivrisinekler antibiyotik tedavi sivrisineklere göre daha yüksek bağışıklık yanıtları ortaya çıkarmak, diğer patojenlere karşı sürekli yüksek antimikrobiyal peptit ekspresyonu ile16. Antibiyotikler genellikle sözlü olarak bu çalışmalarda pan bağırsak bakterileri kaldırmak için uygulanır, ve daha sonra deneyler kommensal mikroplar ile axenic sivrisinek ve sivrisinek arasındaki farkı karşılaştırmak için yapılır. Ancak, sivrisinek midgut mikropların çeşitli bir topluluk limanlar, ve her bakteri türleri konak fizyolojisi doğru farklı bir etki uygulayabilir.
Sivrisinek mikrobiyota farklı etkileri ile vektör yetkinliğini düzenler. Dang humması endemik bölgelerin alan kaynaklı sivrisineklerden izole proteus tarafından kolonizasyon upregulated antimikrobiyal peptit ekspresyonu ve dang virüsü enfeksiyonuna karşı direnç verir16. Entomopatojenik mantar Beauveria bassiana arbovirüsenfeksiyonu17karşı Toll ve JAK-STAT bağışıklık yolu aktive . Buna karşılık, mantar Talaromyces Aedes aegypti midgut izole gut tripsin aktivitesimodüleederek dang virüsü enfeksiyonu kolaylaştırır 18 . Buna ek olarak, Serratia marcescens smEnhancein adlı bir salgı proteini ile arbovirüs iletimi teşvik, sivrisinek bağırsak epitel üzerinde müsin tabakası sindirir19.
Bu prosedür, sivrisinek midgut diseksiyon, kültleştirilebilir bakteri kolonilerinin izolasyon, bakteri türlerinin belirlenmesi ve oral beslenme yoluyla yeniden giriş için sistematik ve sezgisel bir yöntem sağlar. Bu bir kommensal bakteri ile kan besleme temsili sonuçlar sağlar, Chryseobacterium meningosepticum, sivrisinek yumurtalık gelişimi ve oviposition.
Konak-mikrop etkileşimleri üzerine yapılan araştırmalar, farklı bağırsak mikroplarının farklı mekanizmalar aracılığıyla konak fizyolojilerini etkilediğini ortaya koydu. Bu makalede sivrisinek bağırsak mikrobu ilgili rolünü araştırmak için yöntem tanıttı, sivrisinek midgut diseksiyon dahil, kültleştirilebilir bağırsak bakterileri kültüre, antibiyotik tedavisi, ve ilgi bakterilerin yeniden tanıtılması.
Başarılı antibiyotik tedavisi için, deney icrasında a?…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 81902094, 81600497) ve Hunan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (2019RS1036) tarafından desteklenmiştir.
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
Cotton balls | |||
Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g; Yeast Extract 5.0 g; NaCl 10.0 g; Agar 15.0 g. |
LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g; Yeast Extract 5.0 g; NaCl 10.0 g. |
Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
Paper cup | Place mosquito | ||
Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
Single Channal Pipettor | Gilson | ||
Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |