Summary

In Vivo intrazelluläre Aufzeichnung von typidentifizierten Ratten-Spinal-Motoneuronen während der Trans-Spinal-Gleichstromstimulation

Published: May 11, 2020
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die intrazelluläre In-vivo-Aufzeichnung von Rattenlenden-Motoneuronen mit gleichzeitiger transspinaler Gleichstromstimulation. Die Methode ermöglicht es uns, Membraneigenschaften zu messen und rhythmisches Abfeuern von Motoneuronen vor, während und nach der anodalen oder kathhodalen Polarisation des Rückenmarks aufzuzeichnen.

Abstract

Die intrazelluläre Aufzeichnung von Spinal-Motoneuronen in vivo bietet einen “Goldstandard” zur Bestimmung der elektrophysiologischen Eigenschaften der Zellen im intakten Wirbelsäulennetz und bietet erhebliche Vorteile gegenüber klassischen in vitro oder extrazellulären Aufzeichnungstechniken. Ein Vorteil von intrazellulären In-vivo-Aufnahmen ist, dass diese Methode an erwachsenen Tieren mit einem vollausgereiften Nervensystem durchgeführt werden kann, und daher können viele beobachtete physiologische Mechanismen in praktische Anwendungen übersetzt werden. In diesem methodischen Papier beschreiben wir dieses Verfahren in Kombination mit extern angewendeter konstanter Strömungsstimulation, die Polarisationsprozesse in spinalen neuronalen Netzwerken imitiert. Die transspinale Gleichstromstimulation (tsDCS) ist eine innovative Methode, die zunehmend als neuromodulatorische Intervention in der Rehabilitation nach verschiedenen neurologischen Verletzungen sowie im Sport eingesetzt wird. Der Einfluss von tsDCS auf das Nervensystem bleibt schlecht verstanden und die physiologischen Mechanismen hinter seinen Handlungen sind weitgehend unbekannt. Die gleichzeitige Anwendung des tsDCS mit intrazellulären Aufnahmen ermöglicht es uns, Veränderungen der Motoneuronmembraneigenschaften und Eigenschaften des rhythmischen Abfeuerns als Reaktion auf die Polarisation des spinalen neuronalen Netzwerks, die für das Verständnis von tsDCS-Aktionen entscheidend ist, direkt zu beobachten. Darüber hinaus bietet das vorgestellte Protokoll, wenn es die Identifizierung des Motoneurons in Bezug auf einen innervierten Muskel und seine Funktion (Flexor versus Extensor) sowie den physiologischen Typ (schnell versus langsam) umfasst, die Möglichkeit, den Einfluss von tsDCS auf identifizierte Komponenten der Wirbelsäulenschaltung, die von der Polarisation unterschiedlich beeinflusst zu sein scheinen, selektiv zu untersuchen. Das vorgestellte Verfahren konzentriert sich auf die chirurgische Vorbereitung auf intrazelluläre Aufnahmen und Stimulation mit Einem Schwerpunkt auf den Schritten, die notwendig sind, um Präparationsstabilität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erreichen. Die Einzelheiten der Methodik der anodalen oder kathhodalen tsDCS-Anwendung werden unter Berücksichtigung praktischer und sicherheitsgewisser informationen erörtert.

Introduction

Transspinale Gleichstromstimulation (tsDCS) erhält Anerkennung als eine potente Methode zur Veränderung der Erregbarkeit des Spinalkreislaufs bei Gesundheit und Krankheit1,2,3. Bei dieser Technik wird ein konstanter Strom zwischen einer aktiven Elektrode über ausgewählten Wirbelsäulensegmenten übergeben, wobei eine Referenzelektrode entweder ventral oder rostral4befindet. Mehrere Studien haben bereits bestätigt, dass tsDCS bei der Verwaltung bestimmter pathologischer Erkrankungen wie neuropathische Schmerzen5, Spastik6, Rückenmarksverletzung7 oder zur Erleichterung der Rehabilitation8. Die Forscher vermuten, dass tsDCS Veränderungen in der Ionenverteilung zwischen dem intrazellulären und dem extrazellulären Raum über die Zellmembran hervorruft, und dies kann entweder die neuronale Aktivität je nach aktueller Ausrichtung9,10,11erleichtern oder hemmen. Bis vor kurzem fehlte jedoch eine direkte Bestätigung dieses Einflusses auf Motoneuronen.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur In-vivo-intrazellulären Aufzeichnung elektrischer Potentiale aus Lendenwirbelsäulen-Motoneuronen bei der anästhesierten Ratte bei gleichzeitiger Anwendung von tsDCS, um Veränderungen der Motoneuronmembran und feuerende Eigenschaften als Reaktion auf die anodale oder katahodale Polarisation des spinalen neuronalen Netzwerks zu beobachten. Intrazelluläre Aufnahmen öffnen mehrere Bereiche der Untersuchung von Neuroneneigenschaften, nicht verfügbar für zuvor verwendete extrazelluläre Techniken9,12. Beispielsweise ist es möglich, die Motoneuron-Membranspannung auf den durch tsDCS induzierten Gleichstromfluss präzise zu messen, die Spannungsschwelle für die Spitzenerzeugung anzugeben oder Aktionspotenzialparameter zu analysieren. Darüber hinaus ermöglicht uns diese Technik, passive Membraneigenschaften von Motoneuron zu bestimmen, wie z. B. Eingangswiderstand, und den Zusammenhang zwischen intrazellulärem Stimulationsstrom und Häufigkeit des rhythmischen Abfeuerns von Motoneuronen zu beobachten. Die antidromische Identifizierung von aufgezeichnetem Motoneuron, basierend auf der Stimulation funktionell identifizierter Nerven (d.h. Nerven, die Flexoren oder Extensoren efferents liefern) ermöglicht es uns, zusätzlich Typen von innervierten Motoreinheiten (schnell versus langsam) zu identifizieren, was die Möglichkeit gibt zu testen, ob polarisation steile debeeinflusst einzelne Elemente des reifen spinalen neuronalen Systems. Aufgrund umfangreicher Operationen vor der Aufnahme und hohen Anforderungen an die Stabilität und Zuverlässigkeit von Aufnahmen ist diese Technik sehr anspruchsvoll, ermöglicht aber eine direkte und langfristige Beurteilung der elektrophysiologischen Eigenschaften eines Motoneurons: vor, während und nach der Anwendung von tsDCS, was entscheidend ist, um sowohl seine akute Wirkung als auch die anhaltende Wirkung zu bestimmen13. Als Motoneuron aktiviert direkt extrafusale Muskelfasern14 und nimmt an der Rückkopplungssteuerung einer Muskelkontraktion und entwickelter Kraft15teil,16 jeder beobachtete Einfluss von tsDCS auf die Motoreinheit oder Muskelkontraktilen Eigenschaften kann mit Modulationen der Motoneuron Erregbarkeit oder Feuereigenschaften verbunden werden.

Protocol

Alle mit diesem Protokoll verbundenen Verfahren wurden von den zuständigen Behörden (z. B. der lokalen Ethikkommission) akzeptiert und folgen den nationalen und internationalen Vorschriften über Tierschutz und Tierschutz. HINWEIS: Jeder Teilnehmer, der an dem Eingriff beteiligt ist, muss in grundlegenden chirurgischen Eingriffen ordnungsgemäß geschult sein und über eine gültige Lizenz für die Durchführung von Tierversuchen verfügen. 1. Anästhesie und Präme…

Representative Results

Parameter von Aktionspotentialen und mehrere Membraneigenschaften können auf der Grundlage intrazellulärer Aufzeichnungen berechnet werden, wenn stabile Bedingungen der Zelldurchdringung gewährleistet sind. Abbildung 1A zeigt ein typisches orthodromisches Aktionspotential, das durch intrazelluläre Stimulation evoziert wird und alle Kriterien für die Dateneinschlusse erfüllt (das Ruhende Membranpotential von mindestens -50 mV und die Spikeamplitude über 50 mV mit einer positiven Übers…

Discussion

Bei korrekter Durchgeführtkeit sollte der chirurgische Teil des beschriebenen Protokolls innerhalb von etwa drei Stunden abgeschlossen sein. Besonders vorsichtig ist es, während der Operation stabile physiologische Bedingungen eines Tieres, insbesondere körperintheischer Temperatur und Tiefe der Anästhesie, aufrechtzuerhalten. Abgesehen von offensichtlichen ethischen Erwägungen kann ein Mangel an richtiger Anästhesie zu übermäßigen Gliedmaßenbewegungen während der Nervensektion oder Laminektomie führen und zu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch das Stipendium des National Science Center Nr. 2017/25/B/NZ7/00373 unterstützt. Die Autoren möchten die Arbeit von Hanna Drzymaa-Celichowska und W.zimierz Mr. wczyéski würdigen, die beide zur Datenerhebung und Analyse der in diesem Beitrag vorgestellten Ergebnisse beigetragen haben.

Materials

Durgs and solutions
Atropinum sulfuricum Polfa Warszawa
Glucose Merck 346351
NaHCO3 Merck 106329
Pancuronium Jelfa PharmaSwiss/Valeant Neuromuscular blocker
Pentobarbital sodium Biowet Puławy Sp. z o.o Main anesthetic agent
Pottasium citrate Chempur 6100-05-06
Tetraspan Braun HES solution
Surgical equipment
21 Blade FST 10021-00 Scalpel blade
Cauterizer FST 18010-00
Chest Tubes Mila CT1215
Dumont #4 Forceps FST 11241-30 Muscle forceps
Dumont #5 Forceps FST 11254-20 Dura forceps
Dumont #5F Forceps FST 11255-20 Nerve forceps
Dumont #5SF Forceps FST 11252-00 Pia forceps
Forceps FST 11008-13 Blunt forceps
Forceps FST 11053-10 Skin forceps
Hemostat FST 13013-14
Rongeur FST 16021-14 For laminectomy
Scissors FST 15000-08 Vein scissors
Scissors FST 15002-08 Dura scissors
Scissors FST 14184-09 For trachea cut
Scissors FST 104075-11 Muscle scissors
Scissors FST 14002-13 Skin scissors
Tracheal tube Custom made
Vein catheter Vygon 1261.201
Vessel cannulation forceps FST 18403-11
Vessel clamp FST 18320-11 For vein clamping
Vessel Dilating Probe FST 10160-13 For vein dissection
Sugrgical materials
Gel foam Pfizer GTIN 00300090315085 Hemostatic agent
Silk suture 4.0 FST 18020-40
Silk suture 6.0 FST 18020-60
Equipment
Axoclamp 2B Molecular devices discontinued Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor CWE 11-10000 Gas analyzer
Grass S-88 A-M Systems discontinued Constant current stimulator
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe Harvard Apparatus 507222F Heating system
ISO-DAM8A WPI 74020 Extracellular amplifier
Microdrive Custom made/replacement IVM/Scientifica
P-1000 Microelectrode puller Sutter Instruments P-1000 Microelectrode puller
SAR-830/AP Small Animal Ventilator CWE 12-02100 Respirator
Support frame Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting
Spinal clamps Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting
TP-1 DC stimulator WiNUE tsDCS stimulator
Miscellaneous
1B150-4 glass capillaries WPI 1B150-4 For microelectrodes production
Cotton wool
flexible tubing For respirator and CO2 analyzer connection
MicroFil WPI MF28G67-5 For filling micropipettes
Silver wire For nerve electrodes

References

  1. Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
  2. Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
  3. Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
  4. Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
  5. Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
  6. Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
  7. de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
  8. de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
  9. Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
  10. Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
  11. Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
  12. Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
  13. Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
  14. Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system’s final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
  15. Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
  16. Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
  17. Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
  18. Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
  19. Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
  20. Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
  21. Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
  22. Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).
  23. Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
  24. Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
  25. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  26. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).
  27. Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
  28. Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).

Play Video

Cite This Article
Bączyk, M., Krutki, P. In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation. J. Vis. Exp. (159), e61439, doi:10.3791/61439 (2020).

View Video