Summary
该协议描述了大鼠腰椎瘤的体内细胞内记录，同时具有跨脊柱直电流刺激。该方法使我们能够测量膜特性，并记录脊髓的腺体或阴极化之前、期间和之后有节奏的分子发射。
Abstract
体内脊髓腺细胞内记录为确定完整脊柱网络中的细胞电生理特征提供了"黄金标准"，与传统的体外或细胞外记录技术相比具有显著优势。体内细胞内记录的优点是，这种方法可以在神经系统完全成熟的成年动物身上进行，因此许多观察到的生理机制可以转化为实际应用。在本文中，我们描述了这个程序与外部应用的恒定电流刺激相结合，它模仿脊柱神经元网络内发生的极化过程。跨脊柱直流刺激（tsDCS）是一种创新的方法，越来越多地用作各种神经损伤后康复和运动的神经调节干预。tsDCS对神经系统的影响仍然不为人所知，其行动背后的生理机制在很大程度上未知。tsDCS 与细胞内记录同时应用使我们能够直接观察莫托龙膜特性的变化和节律激发的特征，以应对脊柱神经元网络的极化，这对理解 tsDCS 操作至关重要。此外，当提出的协议包括识别内侧肌肉及其功能（柔性与拉伸器）以及生理类型（快速与缓慢）的motoneuron时，它提供了一个机会，有选择地研究tsDCS对已识别的脊柱回路成分的影响，这些成分似乎受到极化的影响不同。所介绍的程序侧重于细胞内记录和刺激的手术准备，重点是实现制备稳定性和结果可重复性所必需的步骤。讨论了阴极或阴极 tsDCS 应用方法的细节，同时关注实际和安全问题。
Introduction
跨脊柱直流刺激（tsDCS）作为一种有效的方法，在健康和疾病1，2，3中改变2脊柱回路兴奋性， 正在得到认可。1在这项技术中，一个恒定电流在位于选定脊髓段上方的有源电极之间传递，参考电极位于呼吸口或更红润的 4。几项研究已经证实，tsDCS可用于管理某些病理状况，如神经病变疼痛5，痉挛6，脊髓损伤7或促进康复8。研究人员认为，tsDCS会唤起细胞内和细胞膜外空间之间离子分布的改变，根据当前方向,9、10、11，,10这可促进或抑制神经元活动。然而，直到最近，还缺乏对莫托龙这种影响的直接证实。
在这里，我们描述了一个详细的方案，用于在体内进行麻醉大鼠腰椎莫酮的电位记录，同时应用 tsDCS，以观察莫托内隆膜的变化和燃烧特性，以应对脊髓神经网络的腺癌或阴极化。细胞内记录打开神经元属性的几个区域调查，不适用于以前使用的细胞外技术9,9，12。例如，可以精确测量由 tsDCS 诱导的莫托龙膜膜电压响应，以指示尖峰生成电压阈值，或分析作用电位参数。此外，该技术还使我们能够确定莫托龙无源膜特性，如输入电阻，并观察细胞内刺激电流与分子节律发射频率之间的关系。基于功能识别神经（即向屈曲器或挤出器提供发源的神经）的抗浪漫性识别，使我们能够进一步识别内向运动单元的类型（快与慢），从而有机会测试极化是否以不同的方式影响成熟的脊柱神经元系统的单个元素。由于在录音前进行了广泛的手术，并且对录音的稳定性和可靠性要求很高，这项技术极具挑战性，但允许对一个motoneuron的电生理特性进行直接和长期的评估：在tsDCS应用之前、期间和之后，这对于确定其急性作用和持续效应至关重要。由于motoneuron直接激活外混肌纤维14，并参与肌肉收缩的反馈控制，并发展力量15，16任何观察到15,的tsDCS对运动单元或肌肉收缩特性的影响可能与motoneuron兴奋性或燃烧特性的调制有关。
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Protocol
与本议定书有关的所有程序都已被有关当局（例如地方道德委员会）接受，并遵守关于动物福利和管理的国家和国际规则。
注：参与手术的每个参与者必须接受基本外科手术方面的训练，并且必须拥有进行动物实验的有效许可证。
1. 麻醉和预谋
- 麻醉大鼠与内丙酮注射五巴比妥钠（初始剂量60毫克+千克-1 为6个月大的雄性威斯塔大鼠体重400\u2012550g）。
注：此协议不限于大鼠的分株、性别或年龄。此外，如果更适合不同的研究目标或伦理委员会的要求，可以使用替代麻醉，如氯胺酮-锡拉辛混合物、α-氯糖或芬太尼-米达佐兰®梅多米丁。 - 大约 5 分钟后，通过用钝钳捏大鼠的后肢脚趾来检查麻醉深度。只有在未观察到反射操作时，才继续执行协议的下一步。
- 注射0.05 mL的阿托平皮，以减少插管后粘液的产生。
- 注射含有4%葡萄糖溶液的5 mL磷酸盐缓冲液，NaHCO3 （1%）和明胶（14%）。这种缓冲液将被皮肤血管吸收，有助于保持流体平衡。
- 在整个手术过程中，定期检查动物的反射动作，如果需要，补充麻醉（10mg=kg-1+h-1五巴比妥钠）。
2. 手术
- 通过剃毛在左后肢的背部，从脚踝到臀部，背面，从尾巴到高胸段，胸部左侧，以及胸骨上方颈部区域的腹侧，为动物进行手术治疗做好准备
- 静脉注射线的放置
- 将大鼠放在其背部的闭环加热垫上（用肢体固定固定固定它）。
- 使用 21 刀片，将从胸骨到下巴的纵向切口穿过。
- 用钳子握住皮肤，把它从底层组织分离。
- 使用钝解剖技术暴露右血管。小心地从周围组织解剖静脉。
- 找到没有分支点的静脉部分，在静脉下方滑动两个 4-0 连字。
- 在先前识别的静脉非分支段的近端打一个松动结，在静脉的这一段的端端打一个松动结。将静脉紧拉至心脏，然后将静脉的端点夹住。
- 使用虹膜剪刀，在夹子和远处连结之间进行切口。握住静脉的活门，将预填充的导管引入被夹子阻挡的点。
- 将静脉和导管与钳子一起握住时，拆下夹子，将导管推入静脉几毫米。将导管的两端固定到静脉，并在皮肤上添加额外的固定点。
- 气管的介绍
- 使用钝钳分离覆盖胸腺的两个腺体。分离中线的胸腺肌肉，露出气管。
- 在气管下方滑动三个 4-0 连结，然后在气管插入点下方打两节，在上面打一个结。
- 找到喉部软骨，并在第三气管软骨下方做一个切口。
- 将气管管插入气管下气管，然后用预先准备的连字固定管，然后向皮肤添加额外的连结。
- 将一小块棉布放在分离的肌肉上方，将皮肤缝合在手术区域上方。
- 后肢神经的解剖
- 使用21刀片，在左后肢的后侧，从跟腱到臀部进行纵向切割。
- 用钳子抓取皮肤，并使用钝解剖技术将皮肤与切口两侧底层肌肉分开。
- 找到膝盖关节后部的罂粟花，这是覆盖的二头肌股骨肌肉，并使用剪刀在这个肌肉的前部和后部之间做一个切口。
- 向上移动切切两个头的二头肌股骨一路到臀部暴露坐骨神经。根据需要进行烧灼，以防止出血。
- 确定坐骨神经的骨、三分和常见的性各分枝。
- 使用剪刀将横向与胃神经肌肉的中脑头部分离，以暴露骨神经及其分支。
- 使用55钳子抓住神经的远端，切它，并尽可能解剖。
- 用常见的佩罗内神经重复手术。
- 使用钝玻璃棒将三维神经与周围组织分离，注意不要损伤血管，并切开。
- 确定中胃神经 （MG） 和横向胃和鞋底 （LGS） 神经。
- 使用55个钳子，仔细解剖MG和LGS神经，断开它们与周围组织，但保持它们与各自的肌肉的连接。
- 将一块盐水浸泡的棉布放在暴露的神经下。
- 关闭手术区域的皮肤。
- 拉明切除术
- 使用21刀片做一个纵向切口从囊到胸椎。
- 将皮肤与底层肌肉分开。
- 切开胸椎和腰椎旋转过程的两侧的长肌。
- 使用钝刃手术刀从脊柱中缩回肌肉，以暴露每个椎骨的横向过程。
- 使用钝尖剪刀切割肌肉的肌腱，沿着暴露的脊柱与横向过程相连。如有必要，应用止血剂。
- 将 Th13 椎骨识别为带肋骨插入的最低胸段，并使用细的长颈去除从 Th13 到 L2 椎骨的旋转过程和层压，以暴露脊髓的腰部部分。请记住，不要损坏 L3 旋转过程，该过程将用作脊柱稳定固定点。
- 拆下 Th12 旋转过程，并尽可能平滑椎体后体表面。
- 使用钝解剖技术将肌肉与 Th11 椎骨分离，以创建支架插入点。
- 将细盐湿棉布放在裸露的脊髓部分上。
- 将大鼠移动到定制的金属框架，带两个平行杆和两个可调节臂，带夹子，以支持和稳定脊柱。
3. 记录和刺激的准备
- 椎柱固定和神经排列
- 将大鼠放在加热垫上的定制框架中，连接到闭环加热系统，使动物体温保持 37 ± 1°C。
- 在皮肤下插入心电图电极，并连接到放大器进行心率监测。
- 使用皮肤皮瓣，在裸露的脊髓上形成一个深池。
- 使用金属夹，通过将夹放在 Th12 横向工艺下方和 L3 旋转工艺中固定椎柱。
- 确保椎柱固定并水平排列，然后在椎柱两侧施加多索-心室压力以收回肌肉。
- 向池中加注热 （37 °C） 矿物油，并在此温度下保持。
- 通过跟腱螺纹 4-0 连结，抬起并伸展操作的左后肢，使脚踝与臀部平起平平。
- 使用皮肤皮瓣使一个深池在暴露的三口， Mg 和 LGS 神经.
- 向池中加注热 （37 °C） 矿物油。
- 将MG和LGS神经放在双极银线刺激电极上，并将它们连接到方形脉冲刺激器。对每个神经使用单独的刺激通道。
- 表面电极放置
- 将银球电极放在外露脊髓的左侧，将参考电极插入背部肌肉，将两个电极连接到差分直流放大器。表面球电极将用于记录来自神经的发量球。
- 使用常流刺激器，以 0.1 ms 持续时间的平方脉冲刺激 MG 和 LGS 神经，以 3 Hz 的频率重复，并观察发泡的排球。
- 确定神经活化的阈值 （T），在大约 3° 时刺激每个神经T 强度，并记录每个神经的发量振幅。
- 移动表面电极rostral并重复该过程，以确定脊柱段，其中排球的振幅是每个神经的最高。确定最大排球位置后，将表面电极移动到与脊髓的安全距离。
- 肌肉麻痹，形成肺气管，以减少呼吸运动
- 用神经肌肉阻滞剂静脉麻痹大鼠，将气管连接到外部呼吸机，符合啮齿动物兼容的上限计（溴化铀的初始剂量为0.4mg=kg-1，每30分钟补充-10.2mg=kg-1）-1
- 通过调整通风参数（频率、气压和 流量），监控端潮 CO 2 浓度并保持在 3+u20124% 左右。
- 在录音一侧的第 5 条肋骨和第 6 根肋骨之间的皮肤上进行纵向切口。
- 使用钝尖剪刀切割覆盖的肌肉，以可视化肋骨之间的成本间空间。
- 使用小锋利的剪刀，在间关节肌肉和胸膜中做一个小切口，然后插入钝边尖插入开口，注意不要按肺。
- 允许钳子展开或插入小管，以保持气管在整个实验中打开。
- 神经肌肉块后，通过检查心电图频率监测麻醉深度，如果心率超过400 bpm，补充麻醉剂。肌肉麻痹和形成肺气管，以减少呼吸运动，这将提高记录稳定性
- 打开杜拉和皮娅母校
- 使用#55钳子，轻轻抬起 dura 母体，然后从 L5 段（玫瑰色）到 L4 段，将其切割。
- 使用一对超薄的5SF钳子在覆盖支骨柱的皮娅中，在血管之间，正好在MG或LGS神经的最大发泡水平。
- 如有必要，使用小块盐水浸泡和干燥的凝胶泡沫来止血。
- tsDCS 电极放置
- 在大鼠腹部的腹侧皮肤上，在与L4-L5脊髓段位置相对应的腹侧进行小切口。
- 用金属夹抓住外露的皮肤皮瓣，作为参考电极。
- 将盐水浸泡的海绵放在 Th12 椎骨的后侧。确保海绵尺寸等于有源 tsDCS 电极（直径为 5 mm 的圆形不锈钢板）。
- 使用精细操纵器，用有源 tsDCS 电极将海绵按到骨骼上，并确保电极的整个表面均等地按下。
- 将参考和有源 tsDCS 电极连接到常电流刺激器单元，能够提供直流电流的连续流量。
- 微管的制备
- 使用微电子拉拔器，准备微电子。
注：可以使用灯丝和非灯丝电极，但是，请记住，电极的刀柄必须足够长，可以到达腹角，而薄到足以在下降时不压缩脊髓。- 调整拉拔器设置，使进入脊髓的刀柄长约 3 mm，而电极尖端直径不超过 1μ u20122 μm，微电极电阻介于 10 至 20 MΩ 之间。
- 用2M钾柠檬酸电解质填充微电极。
- 将准备好的微电子支架安装在微操纵器上，允许 1μ u20122 μm 步进运动和立体轴校准。
- 将微电极连接到细胞内放大器，将参考电极放置在背部肌肉中。
- 使用微电子拉拔器，准备微电子。
- 神经肌肉块后，通过检查心电图频率监测麻醉深度，并补充麻醉剂，使大鼠心率不超过400bpm。
4. 莫托纳龙跟踪和渗透
- 将发声排球记录电极放回脊髓的背面，在 L6 段的水平上，将排答器记录电极固定到记录场的位置。
- 以 3 Hz 的频率和 3T 强度的电 0.1 ms 脉冲刺激 MG 和 LGS 神经，激活选定神经内所有 α-motoneurons 的轴星。
- 将微管驱动到 pia 中选定的贴片中，其平度角度为 15°u201220°（带横向倾斜的尖端）。
- 降到地表以下后，校准微电位并补偿其电容和电压偏移，并在所有参数稳定时继续穿透脊髓。在刺激各神经时接近专用电机核时，微电极电压微量线将可见莫托龙池的抗浪漫场电位。
- 以 1\u20122 μm 步数进行微电极穿透，并定期使用细胞内放大器的嗡嗡声功能清除电极尖端的任何残留物。
- 观察莫托尼龙渗透，其特点是记录的电压痕迹突然超极化，并出现抗浪漫尖峰电位。
5. 记录莫托龙膜和燃烧特性
- 在细胞内放大器的桥接模式下，通过刺激各自的神经分支，根据抗变色作用潜力的"全无"外观识别莫托龙。记录 20 个后续跟踪，以便以后平均。
- 实施严格的包含标准，确保高质量数据：静膜电位幅度至少为-50 mV;动作电位振幅大于50 mV，正过冲;膜电位稳定至少5分钟，在记录前。
- 在细胞内放大器的不连续电流夹紧模式（电流开关速率模式 4–8 kHz）中，使用 0.5 ms 细胞内去极化电流脉冲，在磁体中激发正交作用电位。重复至少 20 次脱机平均。
- 刺激具有 40 个脉冲 （100 ms） 超极化电流 （1 nA） 的莫托尼龙，以计算细胞输入电阻。
- 在增加振幅时刺激具有 50 ms 方波脉冲的 motoneuron，以确定 rheobase 值为引出单个峰值所需的极极化电流最小振幅。
- 注入500ms平方波脉冲的去极化电流，在0.1~2 nA的步调中增加振幅，以唤起莫托龙的有节奏放电。
6. 跨脊柱直流刺激（tsDCS）
- 在保持莫托龙稳定穿透的同时，通过直流反脊柱应用启动极化过程。根据实验设计调整当前强度和应用时间（例如，0.1 mA 为 15 分钟）。
- 打开直流后，立即观察莫托龙膜电位。阳极化（有源电极作为阳极）应导致膜电位去极化，而阴极极化（有源电极作为阴极）应引起相反的效果。观察静膜电位对直流刺激的反应变化是否恒定，从而确保电场强度不受影响。
- 在连续电流应用期间，每隔 5 分钟重复步骤 5.3+u20125.6。
- 关闭 DC 并继续以 5 分钟间隔重复步骤 5.3+u20125.6，直到录制变得不稳定或包含条件受损。
- 终止实验，使用静脉注射给药的致命剂量五巴比妥钠（180mg=kg-1）对动物实施安乐死。
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Representative Results
当确保细胞穿透条件稳定时，可以在细胞内记录的基础上计算作用电位参数和若干膜特性。 图1A 提供了细胞内刺激引起的典型正交作用潜力，它符合数据包含的所有标准（至少为-50 mV的静膜电位，峰值振幅高于50 mV，具有正过冲）。可测量动作电位参数，如尖峰振幅、后白化幅度或后白化半衰减时间（AHP-HDT）。大鼠莫托龙中后一个参数的值是区分快速和慢莫托龙（AHP-HDT > 20 ms 表示慢速，而 AHP-HDT <20 ms 表示快速莫托龙）的可靠标准）17。 图 1B 显示了 100 ms 超极化电流脉冲 1nA 的细胞响应，从该脉冲中可以确定莫托龙的峰值和高原输入电阻 （IR）。 图 1C 显示了风湿尖峰的扩展电压轨迹，其峰值的电压阈值明显标记，指示激活电压门控钠通道以启动作用电位的膜去极化水平。所有这些录音可以在 tsDCS 应用期间和之后重复多次，这使我们能够比较各自的参数，只要静膜电位稳定，并满足其他刺激和记录协议标准。
几项研究间接表明，tsDCS改变莫托龙的兴奋性和发射模式9,9，18。图 2显示了在 tsDCS 应用之前、期间和之后用 500 ms 平方脉冲刺激细胞内电图的细胞内电压痕迹示例。在稳定的条件下，可以一次次重复录制几分钟，可以可靠地比较莫托龙发射模式。发现阿诺达尔 （+） tsDCS 对增加的莫托龙兴奋性和更高的节奏发射频率（图2A）有作用，而阴极 （-） tsDCS 则对燃烧抑制作用 （图 2B）。此外，这两种类型的 tsDCS 的影响超过了极化时期。还值得注意的是，观察到的兴奋性和燃烧模式的变化不仅仅是由极性或阴极性 tsDCS 引起的细胞膜去极化或超极化的结果，而且表现出与膜电位变化无关的深刻变化，尽管该参数在极化结束后返回基线，但这些变化仍然存在。
最后，必须强调，由于准备的恶化和/或数据可靠性的大幅下降，任何偏离提出的协议都可能导致实验失败。 图3 显示了由于细胞穿透不完善而导致数据包含标准受损的录音示例（图3A），忽视补偿微电位电阻和电容（图3B）或脊髓不稳定性（图3C）。重要的是，研究人员要识别此类非最佳记录，并实施适当的纠正措施，或忽略数据集的此类结果。
图1：作用电位和膜特性的参数。
（A） 细胞内刺激引出的矫形作用潜力，其指示的基本参数可根据该记录计算。AP 安培 = 动作电位振幅;AHP 安培 = 后极化振幅;AHP-HDT = 超极化后半衰减时间。（B） 膜响应到1nA强度的短（100ms）去极化电流脉冲的电压轨迹，使我们能够计算输入电阻（IR）。请注意电位偏转的峰值（IR 峰值），然后是小减小和膜电位（IR 高原）的下一个高原相。（C） 流变尖峰的扩展电压轨迹，有一条虚线指示尖峰电压阈值。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：极化对莫托龙发射的影响。
（ A ）一个莫托龙的细胞内记录在细胞内受到刺激，7.5 nA为500 ms，在阿诺达尔 tsDCS之前（左），在极化结束后（右）10分钟。请注意，在相同的刺激强度下，motoneuron的兴奋性逐渐增加。（B） 来自另一个莫托龙的细胞内记录以 6 nA 刺激 500 ms，在阴极 tsDCS（0.1 mA，中间）和极化结束后 10 分钟（右）。请注意，在相同的刺激强度下逐渐抑制莫托尼龙发射频率。在录音下面，提供了细胞内刺激电流的痕迹。右下角的校准条适用于所有显示的细胞内记录。每次记录左侧提供静膜电位的值。根据最后三个间隔的平均值计算，稳态发射频率由上述记录给出。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 3：由于偏离实验协议而导致的次优记录示例。
（A） 从莫托龙记录的反浪漫尖峰渗透不足。静膜电位不足（-45 mV），尽管尖峰的形状适当，具有极化、极化和超极化的所有连续阶段，但其振幅过低（41 mV），且无过冲。（B） 在不切实际的电压阈值（膜去极化到+68 mV）下产生的风湿尖峰。这种错误通常是由于一个阻塞的微选择，具有无补偿的电阻和电容。人们还可以看到，此记录受到 50 Hz 电气噪声的强污染。（C） 一种莫托龙有节奏的发射，响应500ms的去极化电流，膜电位波动较大，主要是由不稳定的微电位渗透引起的，可能是由于呼吸运动过度。对于所有呈现的案例，计算的膜或点火特性将不可靠。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
如果执行正确，所述方案的手术部分应在大约三小时内完成。在手术过程中，应特别注意保持动物的生理状况，特别是体温和麻醉深度。除了明显的伦理考虑外，缺乏适当的麻醉可能导致神经解剖或拉明切除术期间肢体过度运动，并导致制剂损伤或实验终止。在用微电子穿透脊髓之前使动物瘫痪后，监测麻醉深度和心率以及应用基于动物体重和肺活量的适当通气参数至关重要。任何偏离所需生理参数的偏差必须立即修正，以确保手术成功。手术后，稳定的记录条件应能维持至少四个小时。
渗透一个莫托龙后，记录稳定性是高度重要的。在控制记录期间，膜电位必须保持不变，因为任何波动都会显著影响流变量位电流和有节奏的发射阈值。正确固定椎柱应提供基本稳定性，而肺气管的目标是减少呼吸引起的脊髓运动。此外，在尝试渗透和神经肌肉阻滞剂定期施用之前，必须确保肌肉收缩被完全废除。
成功穿透记录的莫托龙后，可以通过刺激各自的神经分支进行。这是体内准备的真正优势，其中莫托龙轴子与内侧肌肉保持连续性，参照在体外细胞内记录进行脊柱切片，这是最近才有可能在成年动物16，但不允许识别记录的莫托内龙。然而，重要的是，研究人员要清楚地了解19 号磁体和矫形活化的区别，以避免对数据产生误解。重要的是要保持周围神经刺激尽可能低（小于0.5V），以防止激活额外的神经由于电流传播，并注意抗浪漫尖峰19的恒定和短延迟。
提出技术的另一个优点是，根据其作用潜力参数，即AHP-HDT持续时间17，可额外分类为快速或慢速类型。在运动过程中，对运动期间肌肉性能的不同贡献，区分内向快型和慢型肌肉纤维之间是至关重要的。此外，快速和缓慢的莫托龙可以对极化9有不同的反应。
为了确保极化的可靠结果，人们应注意设置 tsDCS 的正确参数。一方面，当前强度应提供所选区域所需的场密度，以唤起对神经元网络的影响，另一方面，应处于组织损伤的安全限度内。有源电极的大小和参考电极的大小及其在记录站点上的放置也是需要考虑的重要元素 4，tsDCS 持续时间应用时间应足以唤起所需的效果16、17、22。,17,224在本文论文中，通过应用100μA阴极或阴极性15分钟，获得了代表性的结果。考虑到电极的形状和直径，电极直接下各自的电场强度为39.25μAμ mm2。然而，人们应该明白，在记录的motoneuron站点的电场的精确值是不可能预先确定，因为与极化电极的motoneuron位置不同，电子场密度显著下降，随着深度的增加和电极尺寸的减少4，24。4,此外，莫托龙隔间相对于应用电场的方向对于产生作用电位22、25、2622,25,26非常重要，而且对于单个细胞来说，这是无法预测的。此外，重要的是要明白，tsDCS的影响不限于一个极化时期，持久，持久的影响是有据可查的22，27。,27因此，即使在一次短暂的极化会话之后，在极化后条件下将执行相同准备中的所有连续记录，从而将可能的急性极化记录数限制在每个动物一次。
可以对介绍的程序进行其他修改，以回答特定的研究问题。此协议具有最小的修改，可用于多个实验设计的标准，例如，在测试应用 tsDCS 的各种持续时间和/或振幅时，或在比较各种池中 tsDCS 的短期或长期影响时。使用几种遗传疾病模型（例如 SOD1 G93A 肌萎缩性侧索硬化症的大鼠模型）或不同的神经进行抗浪漫神经活化（双体、三叶虫等）是可以接受的。但是，人们也应该了解程序限制。例如，使用巴比妥酸盐麻醉会抑制持续内流28的活性，而全身引入体外制剂中常用的特定阻滞剂（例如，用于阻断尼古丁受体的strychnine）对动物来说可能是致命的。建议研究人员在选择适当的实验方案之前考虑这些限制。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了国家科学中心第2017/25/B/NZ7/00373号赠款的支持。作者们要表彰汉娜·德日马尼亚-塞利乔夫斯卡和沃齐米尔兹·姆罗奇斯基的作品，他们都为收集和分析本文件介绍的结果做出了贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), Bethesda, Md. 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, Pt 1 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, Pt 3 663-677 (2006).
