Summary
Bu protokol, eşzamanlı trans-spinal doğru akım stimülasyonu ile sıçan lomber motoneurons in vivo hücre içi kayıt açıklar. Bu yöntem, omuriliğin anodal veya kahodal polarizasyonuöncesinde, sırasında ve sonrasında motononların ritmik ateşlemesini kaydetmemizi sağlar.
Abstract
In vivo spinal motoneurons hücre içi kayıt bozulmamış spinal ağ hücrelerin elektrofizyolojik özelliklerini belirlemek için bir "altın standart" sağlar ve klasik in vitro veya hücre dışı kayıt teknikleri göre önemli avantajlar alametleri vardır. In vivo hücre içi kayıtların bir avantajı, bu yöntemin tamamen olgun bir sinir sistemine sahip yetişkin hayvanlar üzerinde yapIlebilmektedir ve bu nedenle gözlenen birçok fizyolojik mekanizma pratik uygulamalara çevrilebilir. Bu metodolojik yazıda, spinal nöronal ağlarda meydana gelen polarizasyon süreçlerini taklit eden dışa uygulanan sürekli akım stimülasyonu ile birlikte bu prosedürü açıklıyoruz. Trans-spinal doğru akım stimülasyonu (tsDCS) giderek çeşitli nörolojik yaralanmalar dan sonra rehabilitasyon da nöromodülatör bir müdahale olarak kullanılan yenilikçi bir yöntemdir yanı sıra spor. TSDCS'nin sinir sistemi üzerindeki etkisi tam olarak anlaşılamamıştır ve eylemlerinin arkasındaki fizyolojik mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. TSDCS'nin hücre içi kayıtlarla eş zamanlı olarak uygulanması, tsDCS eylemlerinin anlaşılması için çok önemli olan spinal nöronal ağın polarizasyonuna yanıt olarak motonöron membran özelliklerinin ve ritmik ateşleme özelliklerinin değişimini doğrudan gözlemlememizi sağlar. Ayrıca, sunulan protokol bir innerve kas ve fonksiyonu (fleksör karşı ekstansör) yanı sıra fizyolojik türü (hızlı karşı yavaş) açısından motoneuron belirlenmesi ni içerdiğinde seçici olarak spinal devre, farklı kutuplaşma etkilenmiş gibi görünüyor spinal devre nin tanımlanmış bileşenleri üzerinde tsDCS etkisini araştırmak için bir fırsat sağlar. Sunulan prosedür, hazırlık stabilitesi ve sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için gerekli olan adımlarüzerinde durularak hücre içi kayıtlar ve stimülasyon için cerrahi hazırlık üzerine odaklanmaktadır. Pratik ve güvenlik konularına dikkat edilirken anodal veya katodal tsDCS uygulamasının metodolojisinin ayrıntıları tartışılır.
Introduction
Trans-spinal doğru akım stimülasyonu (tsDCS) sağlık ve hastalık1spinal devre uyarılabilirlik değiştirmek için güçlü bir yöntem olarak tanıma kazanıyor1,2,3. Bu teknikte, seçilen spinal segmentlerin üzerinde bulunan aktif bir elektrot arasında sabit bir akım geçirilir, ventrally veya daharostrally4 bulunan bir referans elektrot ile. Çeşitli çalışmalar zaten tsDCS bazı patolojik koşulların yönetiminde kullanılabilir doğruladı, nöropatik ağrı gibi5, spastisite6, omurilik yaralanması7 veya rehabilitasyon kolaylaştırmak için8. Araştırmacılar tsDCS hücre içi ve hücre zarı boyunca hücre içi ve hücre dışı uzay arasındaki iyon dağılımıdeğişiklikleri çağrıştırıyor öneririz, ve9bu ya kolaylaştırmak veya mevcut oryantasyon abağlı olarak nöronal aktiviteyi inhibe 9,10,11. Ancak, yakın zamana kadar, motoneurons üzerinde bu etkiyi doğrudan bir onay eksikti.
Burada, tsDCS eşzamanlı uygulama ile anestezili sıçan lomber spinal motoneurons elektrik selülozlarının in vivo hücre içi kayıt yapmak için ayrıntılı bir protokol açıklar, spinal nöronal ağın anodal veya kahodal polarizasyon yanıt olarak motonöron membran değişiklikleri gözlemlemek ve ateşleme özellikleri. Hücre içi kayıtlar nöron özellikleri nin araştırılması çeşitli alanlarda açık, daha önce kullanılan hücre dışı teknikler için kullanılamaz9,12. Örneğin, tsDCS tarafından indüklenen doğru akım akışına motoneuron membran gerilim tepkisini tam olarak ölçmek, ani üretim için gerilim eşiğini belirtmek veya eylem potansiyeli parametrelerini analiz etmek mümkündür. Ayrıca, bu teknik bize girdap direnci gibi motoneuron pasif membran özelliklerini belirlemek için izin verir, ve intrahücresel stimülasyon akımı ve motoneurons ritmik ateş sıklığı arasındaki ilişkiyi gözlemlemek için. Kayıtlı motoneuron antidromik tanımlama, fonksiyonel olarak tanımlanmış sinirlerin uyarılmasıdayalı (yani, fleksörveya ekstansörler efferents sağlayan sinirler) bize ekselvaya motor birimlerinin türlerini belirlemenize olanak sağlar (hızlı karşı yavaş), polarizasyon farklı olgun spinal nöronal sistemin bireysel unsurları etkiler olup olmadığını test etmek için bir fırsat verir. Kayıt tan önce kapsamlı bir ameliyat ve kayıtların stabilite ve güvenilirlik yüksek gereksinimleri nedeniyle, bu teknik son derece zor ama bir motoneuron elektrofizyolojik özellikleridoğrudan ve uzun vadeli değerlendirilmesi sağlar: önce, sırasında ve tsDCS uygulamadan sonra, hangi akut eylemleri ve kalıcı etkileri belirlemek için çok önemlidir13. Bir motoneuron doğrudan ekstrafusal kas lifleri aktive olarak14 ve bir kas kasılması geribildirim kontrolünde yer alır ve geliştirilen kuvvet15,16 motor ünitesi veya kas kontraktil özellikleri üzerinde tsDCS herhangi bir gözlenen etkisi motoneuron uyarılabilirlik veya ateş özellikleri modülasyonları ile bağlantılı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokole bağlı tüm prosedürler ilgili makamlar (örneğin, Yerel Etik Komitesi) tarafından kabul edilmiş ve hayvan refahı ve yönetimi ile ilgili ulusal ve uluslararası kurallara uyulması.
NOT: Prosedüre katılan her katılımcının temel cerrahi işlemler konusunda doğru şekilde eğitilmesi ve hayvan deneyleri yapmak için geçerli bir lisansa sahip olması gerekir.
1. Anestezi ve premedication
- Sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonları ile bir sıçan anestezik (6 aylık erkek Wistar sıçanlar için başlangıç dozu 60 mg·kg-1 400\u2012550g).
NOT: Bu protokol belirtilen suşu, cinsiyeti veya sıçan yaşı ile sınırlı değildir. Ayrıca, ketamin-ksilazin karışımı, alfa-kloralose veya fentanil+midazolam+medetomidin gibi alternatif anestezi, farklı araştırma hedefleri için daha uygun sayılsa veya etik kurul tarafından gerekli olduğunda kullanılabilir. - Yaklaşık 5 dakika sonra, künt forceps ile sıçan arka ekstremite parmak çimdikleme tarafından anestezi derinliğini kontrol edin. Yalnızca refleks eylemi gözlenmediğinde protokolün sonraki adımlarını uygulayın.
- Entübasyon sonrası mukus üretimini azaltmak için 0.05 mL atropin ienjekte edin.
- %4 glukoz çözeltisi içeren 5 mL fosfat tamponu enjekte etmek, NaHCO3 (%1) ve jelatin (%14). Bu tampon bir deney boyunca kutanöz damarlar tarafından emilir ve sıvı dengesini korumaya yardımcı olacaktır.
- Ameliyat boyunca, periyodik olarak refleks eylemleri için hayvan kontrol edin ve gerekirse anestezi takviyesi (10 mg·kg-1·h-1sodyum pentobarbital).
2. Cerrahi
- Sol arka ekstremitenin sırt kısmı üzerinde kürk tıraş ederek cerrahi tedavi için hayvan hazırlayın, kalça ayak bileği, arka, kuyruk yüksek torasik segmentleri için, göğüs sol tarafında, ve sternum üzerinde boyun bölgesinin ventral tarafı
- İntravenöz hattın yerleştirilmesi
- Fareyi kapalı halkalı bir ısıtma yastığına sırtına yerleştirin (ve ekstremite fiksasyonlarıyla sabitle).
- 21 bıçak kullanarak, göğüs kafesinden çeneye kadar deriyi boylamsal bir şekilde kesin.
- Pratisyen hekimler ile deri tutun ve altta yatan doku dan ayırın.
- Künt diseksiyon teknikleri kullanarak sağ juguler ven ortaya çıkarmak. Dikkatlice çevre dokulardan damar incelemek.
- Dallanma noktaları olmadan ven parçası bulmak, altında iki 4-0 ligatures kayma.
- Ven daha önce tanımlanmış olmayan dallanma segmentinin proksimal ucunda bir gevşek düğüm ve ven bu segmentin distal ucunda bir gevşek düğüm olun. Kalbe damar proksimal kelepçe, ve sonra ven distal kısmını ligate.
- Iris makas kullanarak, kelepçe ve uzak ligature arasında bir kesi yapmak. Ven bir flep tutun ve kelepçe tarafından bloke noktaya önceden doldurulmuş bir kateter tanıtmak.
- Ven ve kateteri forceps ile birlikte tutarken, kelepçeyi çıkarın ve kateteri birkaç milimetre lik bir damara doğru itin. Kateterin her iki ucunu da damara sabitle ve cilde ek bir sabitleme noktası ekleyin.
- Trakeal tüpün tanıtımı
- Künt forceps kullanarak sternohyoid kasları kapsayan iki mandibular bezleri ayırın. Trakeayı ortaya çıkarmak için orta hattasternohioid kasları ayırın.
- Nefes borusu altında üç 4-0 ligatürler slip, sonra trakeal tüp ekleme noktası altında iki düğüm yapmak ve yukarıda bir düğüm.
- Gırtlak krikoid kıkırdak bulmak ve üçüncü trakeal kıkırdak altında bir kesi yapmak.
- Trakeaaşağı bir trakeal tüp yerleştirin ve önceden hazırlanmış ligatürler ile yerine tüp güvenli, sonra cilde ek bir ligatür ekleyin.
- Ayrılmış kasların üzerine küçük bir pamuk parçası yerleştirin ve cildi işletilen alanın üzerine dikin.
- Arka ekstremite sinirlerinin diseksiyonu
- 21 bıçak kullanarak, sol arka ekstremitenin arka tarafında uzunlamasına bir kesik yapın, Aşil tendonundan kalçaya kadar.
- Forseps ile deri kapmak, ve künt diseksiyon teknikleri kullanarak kesi her iki tarafında altta yatan kaslardan cildi ayırmak.
- Diz ekleminin arkasında popliteal fossa bulun, hangi pazı femoris kas ile kaplıdır, ve makas kullanarak bu kas ın ön ve arka kısmı arasında bir kesim yapmak.
- Yukarı doğru hareket siyatik sinir ortaya çıkarmak için kalça ya da iki baş pazı femoris tüm yol kesti. Kanamayı önlemek için gerektiği gibi cauterize.
- Siyatik sinirin sural, tibial ve yaygın peroneal dalları tanımlayın.
- Makas kullanarak, tibial sinir ve dalları ortaya çıkarmak için gastroknemius kas Medial başkanı lateral ayırın.
- 55 forceps kullanarak sural sinirdistal ucunu kapmak, distal kesip ve mümkün olduğunca incelemek.
- Ortak peroneal sinir ile prosedürü tekrarlayın.
- Künt bir cam çubuk kullanarak kaval siniri çevre dokulardan ayırın, kan damarlarına zarar vermemeye özen, ve distal kesti.
- Medial gastroknemius (MG) ve lateral gastroknemius ve soleus (LGS) sinirleri tanımlayın.
- 55 forceps kullanarak, dikkatle MG ve LGS sinirleri incelemek, çevre dokulardan onları keserek, ama ilgili kaslarla bağlantılarını korumak.
- Maruz kalan sinirlerin altına tuzlu batırılmış bir pamuk parçası yerleştirin.
- Cildi işletilen alanın üzerinde kapatın.
- Laminektomi
- 21 bıçak kullanarak sakrum dan torasik vertebra kadar uzunlamasına bir kesi yapmak.
- Altta yatan kaslardan cildi ayırın.
- Torasik ve lomber spinous süreçlerin her iki tarafında longissimus kas kesin.
- Künt kenarlı neşter kullanarak her vertebra enine süreçleri ortaya çıkarmak için omurilik kasları geri çekmek.
- Künt uç makası kullanarak maruz spinal kolon boyunca enine süreçlere bağlı kasların tendonu kesti. Gerekirse hemostatik ajanlar uygulayın.
- Kaburga takılması ile en düşük torasik segment olarak Th13 vertebra tanımlayın ve ince rongeurs kullanarak spinous süreçleri kaldırmak ve Omuriliğin lomber segmentleri ortaya çıkarmak için Th13 L2 vertebra. Omurga stabilizasyonu için bir fiksasyon noktası olarak kullanılacak L3 spinous süreci zarar vermemeyi unutmayın.
- Th12 spinous işlemini çıkarın ve vertebra sırt yüzeyini mümkün olduğunca pürüzsüz leştirin.
- Künt diseksiyon teknikleri kullanarak tutucu ekleme noktaları oluşturmak için Th11 vertebra kasları ayırın.
- Maruz kalan omurilik segmentleri üzerinde ince tuzlu batırılmış pamuk yerleştirin.
- Fareyi, omurgayı desteklemek ve stabilize etmek için iki paralel çubuk ve kelepçeli iki ayarlanabilir kolla özel yapılmış metal çerçeveye taşıyın.
3. Kayıt ve uyarılma için hazırlık
- Vertebral kolon fiksasyonu ve sinir düzeni
- 37 ± 1 ° C hayvan vücut sıcaklığını korumak için kapalı döngü ısıtma sistemine bağlı bir ısıtma yastığı üzerinde özel yapım çerçeve içinde sıçan yerleştirin.
- EKG elektrotlarını derinin altına yerleştirin ve kalp atış hızı takibi için bir amplifikatöre bağlanın.
- Deri flepleri kullanarak, maruz kalan omurilik üzerinde derin bir havuz oluşturur.
- Metal kelepçeler kullanarak, Th12 enine proseslerin altına ve L3 spinous prosese kelepçeler koyarak vertebral kolon düzeltmek.
- Vertebral kolon güvenli ve yatay olarak düzenlenmiş olduğundan emin olun, ve sonra kasları geri çekmek için sütunun her iki tarafına dorso-ventral basınç uygulayın.
- Havuzu Sıcak (37 °C) mineral yağ ile doldurun ve bu sıcaklıkta muhafaza edin.
- İplik aşil tendonu ile 4-0 ligature, asansör ve ayak bileği kalça ile tesviye böylece işletilen sol arka ekstremite germek.
- Deri kapakları kullanarak maruz kaval üzerinde derin bir havuz yapmak, MG ve LGS sinirler.
- Havuzu sıcak (37 °C) mineral yağ ile doldurun.
- MG ve LGS sinirlerini bipolar gümüş telli uyarıcı elektrotlara yerleştirin ve kare darbe uyarıcısına bağlayın. Her sinir için ayrı stimülasyon kanalları kullanın.
- Yüzey elektrot yerleşimi
- Arka kaslara yerleştirilen referans elektrotla açık omuriliğin sol kaudal tarafına gümüş bir top elektrot yerleştirin ve her iki elektrotu da diferansiyel DC amplifikatöre bağlayın. Yüzey topu elektrot sinirlerden afferent vole kaydetmek için kullanılacaktır.
- Sabit akım uyarıcı kullanarak, 0.1 ms süresi kare darbeler ile MG ve LGS sinirleri uyarmak, 3 Hz bir frekansta tekrarlanan, ve afferent volegözlem.
- Sinir aktivasyonu için eşiğin (T) belirlenmesi, her siniri yaklaşık 3· T yoğunluğu ve her sinir için afferent vole rekor genliği.
- Yüzey elektrot rostral taşıyın ve vole genlikleri her sinir için en yüksek olduğu spinal segmentleri belirlemek için prosedürü tekrarlayın. Maksimum vole yerini belirledikten sonra, yüzey elektrodu omurilikten güvenli bir mesafeye taşıyın.
- Kas felci ve solunum hareketlerini azaltmak için bir pnömotoraks oluşturan
- Bir nöromüsküler bloker ile intravenöz sıçan felç ve bir kemirgen uyumlu kapnometre doğrultusunda bir dış ventilatör trakeal tüp bağlayın (Pankuronyum bromür, bir başlangıç dozu 0.4 mg·kg-1, 0.2 mg·kg dozlarda her 30 dakika takviye-1)
- Son gelgit CO2 konsantrasyonu izlemek ve havalandırma parametreleri (frekans, hava basıncı ve akış hacimleri) ayarlayarak yaklaşık 3\u20124% olarak korumak.
- Kaydın bir tarafında 5 ve 6 kaburga arasında deride uzunlamasına bir kesi yapın.
- Künt uç makası kullanarak kaburgalar arasında interkostal boşluk görselleştirmek için örten kasları kesti.
- Küçük keskin makas kullanarak, interkostal kaslarda ve plevra küçük bir kesi yapmak, sonra açılış içine künt bir kenar forceps bir ucu eklemek, akciğerlere basın dikkat.
- Pnömotoraks'ı deney boyunca açık tutmak için forceps'lerin küçük bir tüpü genişletmesine veya takmasına izin verin.
- Nöromüsküler blok sonra, EKG sıklığını kontrol ederek anestezi derinliğini izlemek, ve kalp hızı aşarsa anestezik ajan tamam 400 bpm. Kas felci ve solunum hareketlerini azaltmak için bir pnömotoraks oluşturan, hangi kayıt istikrarı nı artıracak
- Dura ve pia mater açılması
- #55 forseps kullanarak, yavaşça dura mater kaldırın ve L5 segmentinden caudally kesilmiş, L4 segmentine kadar rostrally.
- Ultra ince 5SF forceps bir çift kullanarak dorsal sütun kapsayan pia küçük bir yama yapmak, kan damarları arasında, MG veya LGS sinir maksimum afferent vole düzeyinde tam olarak.
- Gerekirse kanamayı engellemek için tuzlu ve kurutulmuş jel köpük küçük parçalar kullanın.
- tsDCS elektrot yerleştirme
- L4-L5 spinal segmentlerin konumuna karşılık gelen rostro-kaudal düzeyde bir sıçan karın ventral tarafında deride küçük bir kesi olun.
- Bir referans elektrot olarak hizmet verecek bir metal klip ile maruz cilt kapağı kapmak.
- Th12 omurunun sırt tarafına tuzlu bir sünger yerleştirin. Sünger boyutunun aktif bir tsDCS elektroduna (5 mm çapında daire şeklinde paslanmaz çelik plaka) eşit olduğundan emin olun.
- İnce bir manipülatör kullanarak, süngeri aktif bir tsDCS elektrotla kemiğe bastırın ve elektrotun tüm yüzeyine eşit şekilde basıldığından emin olun.
- Hem referans ı hem de aktif tsDCS elektrotlarını sürekli doğru akım akışı sağlayabilen sabit akımlı bir uyarıcı ünitesine bağlayın.
- Mikropipetlerin hazırlanması
- Bir mikroelektrot çekmecekullanarak, bir mikroelektrot hazırlayın.
NOT: Hem filament hem de filament olmayan elektrotlar kullanılabilir, ancak, elektrot un sapı iniş sırasında omurilik sıkıştırmak için yeterince ince iken ventral boynuz ulaşmak için yeterince uzun olması gerektiğini unutmayın.- Çekmece ayarını, omuriliğe giren sapın yaklaşık 3 mm uzunluğunda, elektrotun ucu çapı 1\u20122 μm'den fazla olmayacak, mikroelektrot direnci ise 10 ile 20 MΩ arasında olacak şekilde ayarlayın.
- Mikroelektrotları 2M potasyum sitrat elektroliti ile doldurun.
- Hazırlanan mikroelektrotı mikromanipülatöre monte edin ve 1\u20122 μm adımlama hareketi ve stereotaksik kalibrasyon sağlar.
- Mikro elektromu arka kaslara yerleştirilen referans elektrotla hücre içi amplifikatöre bağlayın.
- Bir mikroelektrot çekmecekullanarak, bir mikroelektrot hazırlayın.
- Nöromüsküler blok sonra, EKG sıklığını kontrol ederek anestezi derinliğini izlemek, ve sıçan kalp hızı aşmaması için anestezik ajan tamamlamak 400 bpm.
4. Motoneuron izleme ve penetrasyon
- Afferent vole kayıt elektrodu geri omurilik sırt yüzeyine yerleştirin, caudally kayıt alanının konumuna, L6 segmenti düzeyinde.
- Seçilen bir sinir içinde alfa-motoneurons tüm aksonları etkinleştirmek için, 3 Hz ve 3T yoğunluğu bir frekansta elektrik 0.1 ms darbeleri ile MG ve LGS sinirleri teşvik.
- Mikropipeti pia'da 15\u201220° medio-lateral açıyla (yanal olarak yönlendirilmiş bir uçla) seçili bir yama halinde sürükleyin.
- Yüzeyin altına indikten sonra, mikroelektrot kalibre ve kapasitans ve voltaj ofset telafi, ve tüm parametreler kararlı olduğunda omurilik penetrasyon devam. Motonöron havuzunun antidromik alan potansiyeli, ilgili sinirin uyarılması sırasında özel bir motor çekirdeğine yaklaşırken mikroelektrot gerilim izlerine görünür olacaktır.
- 1\u20122 μm adımda mikroelektrot ile delinmeye devam edin ve elektrot ucunu herhangi bir kalıntıdan temizlemek için hücre içi amplifikatörün vızıltı fonksiyonunu periyodik olarak kullanın.
- Kaydedilen voltaj iz ve bir antidromik başak potansiyeli görünümünü ani hiperpolarizasyon ile karakterize olacak motoneuron penetrasyon gözlemleyin.
5. Motonöron membranının ve ateşleme özelliklerinin kaydedilmesi
- Hücre içi amplifikatör bir köprü modunda, ilgili sinir dalları uyararak antidromik eylem potansiyelinin "all-or-nothing" görünümünü temelinde motoneuron tanımlayın. Daha sonraki ortalamalar için sonraki 20 izlemeyi kaydedin.
- Yüksek kaliteli veri sağlamak için katı bir dahil etme kriteri uygulayın: genlikte en az -50 mV'lik dinlenme membranı potansiyeli; pozitif bir overshoot ile, 50 mV'den büyük eylem potansiyeli genlikleri; kayıttan önce en az 5 dk membran potansiyel stabildir.
- Hücre içi amplifikatörün kesintisiz akım kelepçe modunda (akım anahtar hızı modu 4-8 kHz), 0,5 ms hücre içi depolarize akım darbeleri kullanarak bir motoneuron bir orthodromic eylem potansiyeli uyandırmak. Çevrimdışı ortalama için en az 20 kez tekrarlayın.
- Hücre giriş direncini hesaplamak için 40 kısa darbe (100 ms) hiperpolarize akım (1 nA) ile bir motoneuron teşvik.
- Tek bir başak ortaya çıkarmak için gerekli depolarize akımın minimum genliği olarak reobase değerini belirlemek için artan genlikleri 50 ms kare dalga darbeleri ile bir motoneuron teşvik.
- Motoneuronların ritmik deşarjlarını uyandırmak için 0,1-2 nA'lık basamaklarda genlikleri artırarak depolarize akımın 500 ms kare dalga darbelerini enjekte edin.
6. Trans-spinal doğru akım stimülasyonu (tsDCS)
- Motoneuron kararlı bir penetrasyon korurken, doğru akım trans-spinal uygulama ile polarizasyon prosedürü başlatmak. Geçerli yoğunluğu nu ve uygulama süresini deney tasarımına ayarlayın (örn. 15 dakika için 0,1 mA).
- DC'yi geçtikten hemen sonra motonöron membran potansiyelini gözlemleyin. Anodal polarizasyon (anodu olarak aktif elektrot) membran potansiyelinin depolarizasyonuna neden olurken, katot polarizasyonu (katot olarak aktif elektrot) ters etki uyandırmalıdır. DC stimülasyonuna yanıt olarak istirahat membranı potansiyelindeki bir değişikliğin sabit olup olmadığını gözlemleyin, bu da elektriksel alan yoğunluğunun etkilenmemesini sağlar.
- Sürekli akım uygulaması sırasında 5 dk aralıklarla 5.3\u20125.6 adımlarını tekrarlayın.
- DC'yi kapatın ve kayıtlar kararsız hale gelene veya ekleme ölçütleri tehlikeye atAna kadar 5.3\u20125.6 adımlarını 5 dakika aralıklarla tekraretmeye devam edin.
- Deneyi sonlandırın ve öldürücü dozda pentobarbital sodyum (180 mg·kg-1)intravenöz uygulama kullanarak hayvanı ötenaziye edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etki potansiyellerinin parametreleri ve çeşitli membran özellikleri, hücre penetrasyonunun istikrarlı koşulları sağlandığında hücre içi kayıtlar temelinde hesaplanabilir. Şekil 1A, hücre içi stimülasyonun uyardığı tipik bir ortopedik etki potansiyeli sunar ve bu da veri dahil etme için tüm kriterleri karşılar (en az -50 mV'lik istirahat membran potansiyeli ve 50 mV'den yüksek olan ani genlik, pozitif bir overshoot ile). Ani genlik, hiperpolarizasyon genliği veya hiperpolarizasyon sonrası yarı bozunma süresi (AHP-HDT) gibi etki potansiyel parametreleri ölçülebilir. Sıçan motoneurons ikinci parametre değeri hızlı ve yavaş motoneurons (AHP-HDT > 20 ms yavaş için, AHP-HDT <20 ms hızlı motoneurons için)17arasında ayrım için güvenilir bir kriter olarak hizmet vermektedir. Şekil 1B, bir motoneuronun hem tepe hem de plato giriş direncinin (IR) voltaj sapmasıyla belirlenebildiği 1nA'nın 100 ms'lik hiperpolarize akım darbesine bir hücre yanıtı gösterir. Şekil 1C, ani gerilim eşiğini açıkça işaretlenmiş bir gerilim eşiğine sahip bir reobaz başak takiben genişletilmiş bir gerilim izi gösterir ve bu da gerilim kapılı sodyum kanallarının etki potansiyelini başlatmak için aktive edildiği membran depolarizasyon seviyesini gösterir. Tüm bu kayıtlar tsDCS uygulaması sırasında ve sonrasında birkaç kez tekrarlanabilir, bu da istirahat membran potansiyeli sabit olduğu ve diğer uyarım ve kayıt protokolü kriterleri yerine getirildiği sürece ilgili parametreleri karşılaştırmamızı sağlar.
Çeşitli çalışmalar dolaylı olarak tsDCS motoneuron uyarılabilirlik ve ateş desen9,,18değiştirir göstermiştir. Şekil 2, tsDCS uygulamasından önce, sırasında ve sonrasında 500 ms kare akım darbeleriyle hücre içi uyarılmış iki motoneurondan gelen hücre içi voltaj izlerinin örneklerini göstermektedir. Kararlı koşullar altında, kayıtlar birbiri ardına birkaç dakika tekrarlanabilir ve motoneuron ateşleme desenleri güvenilir bir şekilde karşılaştırılabilir. Anodal (+) tsDCS'nin artmış motonöron uyarılabilirliği ve ritmik ateşleme sıklığının artması(Şekil 2A),katodal (-) tsDCS ise ateş inhibisyonu yönünde hareket ettiği saptanmıştır (Şekil 2B). Ayrıca, tsDCS her iki tip etkileri polarizasyon dönemi dayandı. Ayrıca, uyarılabilirlik ve ateşleme paternindeki gözlenen değişikliklerin sadece anodal veya katodal tsDCS tarafından hücre zarının depolarizasyonu veya hiperpolarizasyonunun bir sonucu olmadığını, ancak bu parametrenin kutuplaşmanın sona ermesinden sonra bir taban çizgisine geri dönmesine rağmen devam ettikleri için, bir membran potansiyelinin değişimiyle ilgili olmayan derin değişiklikler gösterdiğini de belirtmekte yarar vardır.
Son olarak, sunulan protokolden herhangi bir sapmanın, hazırlıkların bozulması ve/veya veri güvenilirliğinde derin bir düşüş nedeniyle başarısız bir deneyle sonuçlanacağı vurgulanmalıdır. Şekil 3, mikroelektrot direncini ve kapasitansını dengelemek için ihmal (Şekil3B) veya omurilik instabilitesi nedeniyle veri ekleme kriterlerinin tehlikeye girdiği kayıt örneklerini göstermektedir ( Şekil3C). Araştırmacıların bu tür optimal olmayan kayıtları belirlemeleri ve uygun düzeltici eylemleri uygulamaları veya veri kümesinden elde edilen sonuçları göz ardı etmeleri önemlidir.
Şekil 1: Etki potansiyellerinin parametreleri ve membran özellikleri.
(A) Hücre içi stimülasyonla ortaya çıkan ve bu kayıttan hesaplanabilen belirtilen temel parametrelere sahip bir ortokromik etki potansiyeli. AP genl = eylem potansiyeli genliği; AHP ampl = afterhyperpolarization genliği; AHP-HDT = hiperpolarizasyon sonrası yarı bozunma süresi. (B) Bir membran tepkisinin 1nA şiddetindeki kısa (100 ms) depolarize akım darbesine verdiği gerilim izi, giriş direncini (IR) hesaplamamızı sağlar. Potansiyel sapmanın (IR Peak) zirvesine dikkat edin ve ardından küçük bir düşüş ve membran potansiyelinin sonraki plato evresi (IR platosu). (C) Ani gerilim eşiğini gösteren noktalı yatay çizgili bir reobasic başak genişletilmiş gerilim izi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Polarizasyonun motonöron ateşlemesi üzerine etkileri.
(A) Bir motoneuron hücre içi kayıtları hücre içi olarak uyarılmış 7.5 nA için 500 ms, önce yapılan (solda), anodal tsDCS sırasında (0.1 mA, orta), ve 10 kutuplaşma sonundan sonra (sağ). Aynı uyarıcı yoğunluğunda motoneuron uyarılabilirlik kademeli artış unutmayın. (B) Başka bir motoneuron hücre içi kayıtları hücre içi olarak uyarılmış 6 nA için 500 ms, önce yapılan (solda), katot tsDCS sırasında (0.1 mA, orta), ve 10 kutuplaşma sonundan sonra (sağ). Aynı uyarıcı yoğunluğunda motoneuron ateşleme sıklığı kademeli bir inhibisyonu dikkat edin. Kayıtların altında hücre içi stimülasyon akımının izleri verilmiştir. Sağ alttaki kalibrasyon çubukları sunulan tüm hücre içi kayıtlar için geçerlidir. Dinlenme membranı potansiyelinin değerleri her kaydın solunda sağlanır. Son üç interspike aralığının araçlarından hesaplanan sabit durum ateşleme frekansları, kayıtların üzerinde verilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Deneysel protokolden sapmalar sonucu suboptimal kayıt örnekleri.
(A) Bir motonöron dan kaydedilen antidromik başak yetersiz nüfuz. Dinlenme zarı potansiyeli yetersizdir (-45 mV) ve depolarizasyon, repolarizasyon ve hiperpolarizasyon tüm ardışık aşamaları ile başak uygun bir şekil rağmen, genliği çok düşük (41 mV) ve bir overshoot olmadan. (B) Gerçekçi olmayan bir gerilim eşiğinde oluşan bir reobazik başak (membran +68 mV'ye depolarize). Bu tür hatalar genellikle bloke edilmiş bir mikroelektrottan kaynaklanır, telafi edilmemiş direnç ve kapasitans ile. Bu kaydın 50 Hz elektrik gürültüsüyle kirlendiğini de görebilirsiniz. (C) 500 ms depolarize akıma yanıt olarak bir motonöron ritmik ateş, bir membran potansiyeli büyük dalgalanmalar ile, ağırlıklı olarak kararsız mikroelektrot penetrasyonu neden, muhtemelen aşırı solunum hareketleri nedeniyle. Tüm sunulan durumlarda hesaplanan membran veya ateşleme özellikleri güvenilmez olacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doğru yapılırsa, tanımlanan protokolün cerrahi kısmı yaklaşık üç saat içinde tamamlanmalıdır. Ameliyat sırasında bir hayvanın stabil fizyolojik durumunun korunmasına özellikle vücut ısısı ve anestezi derinliği ne kadar özen li olmak gerekir. Bariz etik hususlarDışında, uygun anestezi eksikliği sinir diseksiyonu veya laminektomi sırasında aşırı ekstremite hareketlerine neden olabilir ve hazırlık veya erken deney sonlandırma hasara yol açabilir. Bir hayvanı mikroelektrotla omuriliğe girmeden önce felç ettikten sonra, anestezi ve kalp hızının derinliğini izlemek ve hayvan ağırlığı ve akciğer kapasitesine göre uygun havalandırma parametrelerini uygulamak çok önemlidir. Prosedürün başarısını sağlamak için istenilen fizyolojik parametrelerden herhangi bir sapma nın derhal değiştirilmesi gerekir. Ameliyattan sonra, istikrarlı kayıt koşulları en az dört saat boyunca korumak mümkün olmalıdır.
Bir motoneuron penetrasyonu sonra, kayıt kararlılığı yüksek önem taşımaktadır. Herhangi bir dalgalanmalar önemli ölçüde reobase akım ve ritmik ateş bir eşik etkileyecek gibi bir membran potansiyeli kontrol kayıtları sırasında sabit kalır zorunludur. Vertebral kolon uygun fiksasyon temel istikrar sağlamalıdır, bir pnömotoraks amacı solunum tarafından uyarılmış omurilik hareketlerini azaltmak için ise. Ayrıca, bir kas kasılmaları penetrasyon denemeden önce tamamen kaldırılmış olduğundan emin olmak ve nöromüsküler bloker düzenli aralıklarla uygulanır emin olmak gerekir.
Kaydedilen motoneuron başarılı bir penetrasyon antidromik tanımlama sonra ilgili bir sinir dalı uyarılması ile yapılabilir. Bu in vivo hazırlık gerçek bir avantajdır, hangi motoneuron aksonlar spinal dilimler üzerinde yapılan in vitro hücre içi kayıtları referans innerve kasları ile süreklilik tutulur, hangi sadece son zamanlarda yetişkin hayvanlarda mümkün oldu16, ama kayıtlı motoneuron belirlenmesine izin vermez. Ancak, araştırmacılar ın verilerin yanlış yorumlanmasını önlemek için motoneuron19 antidromik ve orthodromik aktivasyonu arasındaki farkı net bir anlayışa sahip olması önemlidir. Bu mevcut yayılması nedeniyle ek sinirlerin aktivasyonunu önlemek için mümkün olduğunca düşük (az 0.5 V) periferik sinir stimülasyonu tutmak ve antidromik başak sabit ve kısa gecikme dikkat etmekönemlidir 19.
Sunulan tekniğin bir diğer avantajı da motoneurons ayrıca eylem potansiyel parametreleri, yani AHP-HDT süresi17temelinde hızlı veya yavaş türleri olarak sınıflandırılabilir olmasıdır. Hızlı ve yavaş tip kas lifleri innervating motoneurons arasındaki farklılaşma hareketleri sırasında kas performansına farklı katkıları açısından çok önemlidir. Ayrıca, hızlı ve yavaş motoneurons farklıpolarizasyon9 tepki verebilir.
Polarizasyon güvenilir sonuçlar sağlamak için bir tsDCS uygun parametreleri ayarı dikkat etmelidir. Mevcut yoğunluğu, bir yandan, nöronal ağlar üzerinde etkileri uyandırmak için seçilen alanda istenilen alan yoğunluğu sağlamak gerekir, diğer taraftan doku hasarı için güvenlik sınırları içinde olmalıdır20. Aktif ve referans elektrotların boyutu ve kayıt bir site ile ilgili yerleşimi de dikkate alınması gereken önemliunsurlardır 4, ve tsDCS süresi uygulama süresi istenilen etkileri uyandırmak için yeterli olmalıdır16,17,22. Bu yöntem de 15 dk için 100 μA kahodal veya anodal polarizasyon uygulaması ile temsili sonuçlar elde edilmiştir. Elektrot şekli ve çapı dikkate alınarak, doğrudan elektrot altında ilgili elektrik alan yoğunluğu 39,25 μA·mm2idi. Ancak, bir kaydedilen motoneuron sitede elektrik alanının kesin değeri polarizasyon elektrot açısından motonöron konumu olarak önceden belirlemek mümkün değildir anlamak gerekir değişir, ve e-alan yoğunluğu önemli ölçüde artan derinlik ve azalmış elektrot boyutu ile düşer4,24. Ayrıca, motoneuron bölmelerinin uygulanan elektrik alanına göre yönlendirmesi etki potansiyellerinin üretimi için önemlidir22,25,26, ve bu bireysel hücreler için tahmin edilemez. Buna ek olarak, tsDCS etkileri kutuplaşma bir süre ile sınırlı değildir anlamak için son derece önemlidir, ve kalıcı, uzun ömürlü etkileri iyi belgelenmiştir22,27. Bu nedenle, tek, kısa bir polarizasyon seansı bile takip edilse, aynı hazırlıktaki tüm ardışık kayıtlar post-polarizasyon koşullarında yapılacaktır, bu da olası akut polarizasyon kayıtlarının hayvan başına bir e göre sınırlandırılmasıdır.
Sunulan yordamın ek değişiklikler belirli araştırma sorularını yanıtlamak için yapılabilir. Minimum modifikasyonlara sahip bu protokol, çeşitli deneysel tasarımlar için standart olarak kullanılabilir, örneğin, uygulanan tsDCS'nin çeşitli süreleri ve/veya genlikleri test ederken veya çeşitli havuzlarda tsDCS'nin kısa veya uzun vadeli etkilerini karşılaştırırken motoneurons. Çeşitli genetik hastalık modellerinin (örneğin amotrofik lateral sklerozSOD1 G93A sıçan modeli) veya antidromik sinir aktivasyonu için farklı sinirlerin (peroneal, tibial, safenöz, vb.) kullanımı kabul edilebilir. Ancak, bir de yordam sınırlamaları farkında olmalıdır. Örneğin, anestezi için barbitürat kullanımı kalıcı içe akımların aktivitesini inhibe28, belirli blokerlerin sistemik giriş genellikle in vitro preparatlar kullanılan iken (örneğin, nikotinik reseptörleri engellemek için strychnine) hayvan için ölümcül kanıtlayabilir. Araştırmacıların uygun deneysel protokolü seçmeden önce bu sınırlamaları göz önünde bulundurmaları tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma 2017/25/B/NZ7/00373 sayılı Ulusal Bilim Merkezi hibesi ile desteklenmiştir. Yazarlar Hanna Drzymała-Celichowska ve Włodzimierz Mrówczyński, her ikisi de veri toplama ve bu makalede sunulan sonuçların analizi katkıda çalışmalarını tanımak istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), Bethesda, Md. 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, Pt 1 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, Pt 3 663-677 (2006).
