Summary
Этот протокол описывает внутриклеточную запись внутриклеточной записи крысиных поясничных мотонейронов с одновременным транс-спинномозговой стимуляцией прямого тока. Метод позволяет измерять мембранные свойства и записывать ритмическую стрельбу мотонейронов до, во время и после анодальной или катодальной поляризации спинного мозга.
Abstract
Внутриклеточная запись спинномозговых мотонейронов in vivo обеспечивает «золотой стандарт» для определения электрофизиологических характеристик клеток в нетронутой спинальной сети и имеет значительные преимущества по сравнению с классическими методами экстракорпоральной или внеклеточной записи. Преимущество внутриклеточных записей in vivo заключается в том, что этот метод может быть выполнен на взрослых животных с полностью зрелой нервной системой, и поэтому многие наблюдаемые физиологические механизмы могут быть переведены на практическое применение. В этой методологической работе мы описываем эту процедуру в сочетании с внешне применяемой постоянной текущей стимуляцией, которая имитирует процессы поляризации, происходящие в спинномозговых нейронных сетях. Транс-спинальной стимуляции прямого тока (tsDCS) является инновационным методом все чаще используется в качестве нейромодуляторного вмешательства в реабилитации после различных неврологических травм, а также в спорте. Влияние tsDCS на нервную систему остается плохо понятым и физиологические механизмы, стоящие за его действиями, в значительной степени неизвестны. Применение tsDCS одновременно с внутриклеточными записями позволяет нам непосредственно наблюдать изменения свойств мотонейронной мембраны и характеристик ритмической стрельбы в ответ на поляризацию сети спинного нейрона, что имеет решающее значение для понимания действий цДЦ. Кроме того, когда представленный протокол включает в себя идентификацию мотонейрона в отношении иннерватной мышцы и ее функции (сгибатель против экстенсора), а также физиологический тип (быстрый и медленный), он дает возможность выборочно исследовать влияние tsDCS на выявленные компоненты спинномозговой цепи, которые, как представляется, по-разному зависит от поляризации. Представленная процедура посвящена хирургической подготовке к внутриклеточным записям и стимуляции с акцентом на шаги, необходимые для достижения стабильности подготовки и воспроизводимости результатов. Детали методологии анодального или катодального применения tsDCS обсуждаются, обращая внимание на практические вопросы и вопросы безопасности.
Introduction
Транс-спинальной стимуляции прямого тока (tsDCS) получает признание в качестве мощного метода для изменения возбудимости спинномозговой цепив здоровье и болезни 1,2,3. В этом методе, постоянный ток передается между активным электродом, расположенным над выбранными сегментами позвоночника, со эталонным электродом, расположенным либо вентрально, либо болеерострально 4. Несколько исследований уже подтвердили, что tsDCS может быть использован в управлении определенными патологическими состояниями, такими какневропатическая боль 5,спастичность 6,повреждениеспинного мозга 7 или для облегченияреабилитации 8. Исследователи предполагают, что tsDCS вызывает изменения в распределении ионов между внутриклеточным и внеклеточным пространством через клеточную мембрану, и это может либо облегчить или ингибировать нейронной активности в зависимости оттекущей ориентации 9,10,11. Однако до недавнего времени прямого подтверждения этого влияния на мотонейроны не было.
Здесь мы описываем подробный протокол для проведения внутриклеточной записи внутриклеточной записи электрических потенциалов поясничных позвоночных мотонейронов в анестезированной крысе с одновременным применением цДКС, для того, чтобы наблюдать изменения в мотонейронной мембране и огневых свойствах в ответ на анодальную или катодную поляризацию спинальной нейрональной сети. Внутриклеточные записи открывают несколько областей исследования свойств нейронов, недоступных для ранее использованных внеклеточныхметодов 9,,12. Например, можно точно измерить реакцию напряжения мотонейроновой мембраны на прямой поток тока, индуцированный tsDCS, указать порог напряжения для генерации шипов или проанализировать потенциальные параметры действия. Кроме того, этот метод позволяет определить мотонейронные пассивные мембранные свойства, такие как входное сопротивление, и наблюдать связь между внутриклеточным тоном стимуляции и частотой ритмичной стрельбы мотонейронов. Антидромная идентификация записанного мотонейрона, основанная на стимуляции функционально идентифицированных нервов (т.е. нервов, обеспечивающих эфференты сгибателям или разгибателям), позволяет дополнительно определить типы иннерватных моторных агрегатов (быстрых и медленных), что дает возможность проверить, влияет ли поляризация по-разному на отдельные элементы зрелой спинномозговой нейронной системы. В связи с обширной хирургией, предшествующей записи, и высокими требованиями к стабильности и надежности записей, этот метод является весьма сложным, но позволяет проводить прямую и долгосрочную оценку электрофизиологических характеристик одного мотонейрона: до, во время и после применения tsDCS, что имеет решающее значение для определения как его острых действий, так истойких эффектов 13. Как motoneuron непосредственно активирует внефусальные мышечныеволокна 14 и принимает участие в контроле обратной связи сокращения мышц и развитойсилы 15,16 любое наблюдаемое влияние tsDCS на двигательный блок или мышечные контрактильные свойства могут быть связаны с модуляциями мотонейрона возбудимость или огневые характеристики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с этим протоколом, были приняты соответствующими органами (например, местным комитетом по этике) и следуют национальным и международным правилам в области защиты животных и управления ими.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый участник, участвующий в процедуре, должен быть должным образом обучен основным хирургическим процедурам и иметь действительную лицензию на выполнение экспериментов на животных.
1. Анестезия и предустановка
- Анестезировать крысу с внутриперитонеальными инъекциями пентобарбитала натрия (начальная доза 60мг/кг -1 для 6-месячного самца крыс Wistar весом 400-u2012550g).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не ограничивается указанным штаммом, полом или возрастом крыс. Кроме того, альтернативные анестезии, такие как кетамин-ксилазин смесь, альфа-хлоралоза или фентанил-мидазолам-медетомидин могут быть использованы, если больше подходит для различных целей исследования или при необходимости комитета по этике. - Примерно через 5 минут проверьте глубину анестезии, ущипнув крысиный задний конечность тупыми щипсями. Продолжить следующие шаги протокола только тогда, когда никаких рефлекторных действий не наблюдается.
- Вводить 0,05 мл атропина подкожно, чтобы уменьшить выработку слизи после интубации.
- Вводить подкожно 5 мл фосфатного буфера, содержащего 4% раствор глюкозы, NaHCO3 (1 %) и желатин (14%). Этот буфер будет поглощаться каными сосудами на протяжении всего эксперимента и поможет поддерживать баланс жидкости.
- На протяжении всей операции периодически проверяйте животное на наличие рефлекторных действий и при необходимости дополняйте анестезию(10 мг/кг -1ч -1пентобарбитала натрия).
2. Хирургия
- Подготовка животного к хирургическому лечению путем бритья меха над спинной частью левой задней части, от лодыжки до бедра, задней, от хвоста до высоких грудных сегментов, левая сторона груди, и брюшной стороне области шеи над грудиной
- Размещение внутривенной линии
- Поместите крысу на спину на закрытую грелку (и закрените ее фиксациями конечностей).
- Используя 21 лезвие, сделайте продольный разрез через кожу от грудины до подбородка.
- Держите кожу с тисью и отделить его от основной ткани.
- Используя тупые методы вскрытия, выставляют правую яремную вену. Тщательно вскрыть вену из окружающих тканей.
- Найдите часть вены без точек ветвления, проскользнете под ней две лигатуры 4-0.
- Сделайте один свободный узел на проксимальной конце ранее выявленного не ветвясь сегмента вены и один свободный узел на дистальной конце этого сегмента вены. Зажим вены проксимальной для сердца, а затем ligate дистальной части вены.
- Используя ножницы радужной оболочки глаза, сделайте разрез между зажимом и далекой лигатурой. Держите лоскут вены, и ввести предварительно заполненный катетер до точки, где он заблокирован зажимом.
- Удерживая вену и катетер вместе с типсами, снимите зажим и надавлите катетер на несколько миллиметров в вену. Защитите оба конца катетера к вене, и добавьте дополнительную точку фиксации к коже.
- Введение трахеальной трубки
- Использование тупых типсов отделяет две миндибулярные железы, покрывающие стернохиоидные мышцы. Отдельные стернохиоидные мышцы в средней линии, чтобы разоблачить трахею.
- Скольжение три 4-0 лигатуры под трахеей, а затем сделать два узла ниже точки вставки трахеи трубки и один узел выше.
- Найдите крикоидный хрящ гортани и сделайте разрез ниже третьего трахеального хряща.
- Вставьте трахею трубки вниз трахеи и обеспечить трубку на месте с заранее подготовленными лигатурами, а затем добавить дополнительную лигатуру на кожу.
- Поместите небольшой кусочек ваты над разделенными мышцами, и шов кожи над оперой области.
- Рассечение нервов задних конечностей
- Используя 21 лезвие, сделайте продольный разрез на задней стороне левой задней конечности, от ахиллова сухожилия до бедра.
- Захватите кожу тисью и с помощью тупых методов вскрытия отделить кожу от основных мышц по обе стороны разреза.
- Найдите popliteal fossa в задней части коленного сустава, который покрыт мышцей бицепса бедренной кости, и с помощью ножниц сделать разрез между передней и задней части этой мышцы.
- Двигаясь вверх вырезать две головы бицепса femoris вся дорогу до бедра подвергать седалищного нерва. Прижигать по мере необходимости, чтобы предотвратить кровотечение.
- Определите sural, tibial и общие перонеальные ветви седалищного нерва.
- Используя ножницы, отделить боковой от медиальной головки мышцы гастрокнейма подвергать трибиального нерва и его ветвей.
- Используя 55 типсов захватить дистальный конец слухового нерва, сократить его дистально и вскрыть, насколько это возможно.
- Повторите процедуру с общим перонеальным нервом.
- Использование тупого стеклянного стержня отделяет тибиальный нерв от окружающих тканей, заботясь о том, чтобы не повредить кровеносные сосуды, и разрезает его в конце.
- Определите медиальный гастрокнеймиус (MG) и боковой гастрокнеймиус и soleus (LGS) нервы.
- Используя 55 типсов, тщательно рассекает нервы MG и LGS, отключая их от окружающих тканей, но поддерживая их связь с соответствующими мышцами.
- Поместите пропитанный раствором кусок ваты под открытые нервы.
- Закройте кожу над прооперовой областью.
- Ламинэктомия
- С помощью 21 лезвия сделайте продольный разрез от крестца до грудных позвонков.
- Отделить кожу от основных мышц.
- Вырезать longissimus мышцы по обе стороны грудной и поясничной спинных процессов.
- Используя тупо краями скальпель втягивать мышцы из позвоночника подвергать поперечных процессов каждого позвонка.
- С помощью тупых ножниц кончика вырезать сухожилия мышц, связанных с поперечными процессами вдоль открытых позвоночника. При необходимости применять гемостатические агенты.
- Определите позвонок Th13 как самый низкий грудной сегмент с вставкой ребра и с помощью тонких rongeurs удалить спинные процессы и ламина от Th13 до L2 позвонков подвергать поясничных сегментов спинного мозга. Помните, чтобы не повредить L3 спинной процесс, который будет использоваться в качестве точки фиксации для стабилизации позвоночника.
- Удалите спинной процесс Th12 и сгладить спинную поверхность позвонка как можно больше.
- Использование тупых методов вскрытия отделяет мышцы от позвонка Th11 для создания точек вставки держателя.
- Поместите тонкую пропитанную раствором вату над открытыми сегментами спинного мозга.
- Перемести крысу на изготовленный на заказ металлический каркас с двумя параллельными прутьями и двумя регулируемыми руками с зажимами для поддержки и стабилизации позвоночника.
3. Подготовка к записи и стимуляции
- Фиксация позвоночных столбов и расположение нервов
- Поместите крысу в специально изготовленную рамку на грелку, подключенную к системе отопления замкнутой петли для поддержания температуры тела животного на уровне 37 градусов по Цельсию.
- Вставьте электроды ЭКГ под кожу и подключим к усилителю для мониторинга сердечного ритма.
- Используя лоскуты кожи, образуют глубокий бассейн над открытым спинным мозгом.
- Используя металлические зажимы, зафиксировать позвоночника, поставив зажимы ниже Th12 поперечных процессов и на L3 спинного процесса.
- Убедитесь, что позвонковая колонка защищена и расположена горизонтально, а затем применить спинно-вентральное давление по обе стороны колонны, чтобы втянуть мышцы.
- Заполните бассейн теплым (37 градусов по Цельсию) минеральным маслом и поддерживать его при такой температуре.
- Нить 4-0 лигатуры через ахиллово сухожилие, поднять и растянуть оперировали левой задней конечности так, что лодыжка выравнивается с бедром.
- Использование лоскутов кожи сделать глубокий бассейн над подвергаются тибиальной, MG и LGS нервов.
- Заполните бассейн теплым (37 градусов по Цельсию) минеральным маслом.
- Поместите MG и LGS нервы на биполярный серебряный провод стимулирующих электродов и подключить их к квадратному стимулятору импульса. Используйте отдельные каналы стимуляции для каждого нерва.
- Размещение поверхностных электродов
- Поместите электрод серебряного шара на левой хвостовой стороне открытого спинного мозга, со эталонным электродом, вставленным в мышцы спины, и соедините оба электрода с дифференциальным усилителем постоянного тока. Электрод поверхностного шара будет использоваться для записи афферентных залпов из нервов.
- Используя стимулятор постоянного тока, стимулируйте нервы MG и LGS с квадратными импульсами продолжительностью 0,1 мс, повторяемые с частотой 3 Гц, и наблюдайте за афферентными залпами.
- Определите порог (T) для активации нерва, стимулировать каждый нерв примерно на 3 " T интенсивность, и запись амплитуды афферентного залпа для каждого нерва.
- Переместите поверхностный электрод ростральный и повторите процедуру определения сегментов позвоночника, при которых амплитуды залпов являются самыми высокими для каждого нерва. Определив максимальное местоположение залпа, перемести поверхностный электрод на безопасное расстояние от спинного мозга.
- Мышечный паралич и формирование пневмоторакса для уменьшения дыхательных движений
- Парализуйте крысу внутривенно с помощью нервно-мышечного блокатора и подключите трахеевую трубку к внешнему аппарату искусственной вентиляции легких в соответствии с капнометром, совместимым с грызунами (бромид панкурония, при начальной дозе0,4 мг/кг -1, дополняется каждые 30 мин в дозах 0,2мг кг -1)
- Мониторинг концентрации СО2 в конце прилива и поддержание его на уровне около 3-20124% за счет корректировки параметров вентиляции (частота, давление воздуха и объемы потока).
- Сделайте продольный разрез в коже между 5-м и 6-м ребром на стороне записи.
- Используя тупые ножницы кончика вырезать чрезмерно мышцы, чтобы визуализировать межреберной пространство между ребрами.
- Используя небольшие острые ножницы, сделайте небольшой разрез в межреберных мышцах и в плевре, затем вставьте кончик тупых миппов края в отверстие, заботясь о том, чтобы не давить на легкие.
- Разрешить типсы расширить или вставить небольшую трубку, чтобы сохранить пневмоторакс открытым на протяжении всего эксперимента.
- После нервно-мышечного блока, контролировать глубину анестезии, проверяя частоту ЭКГ, и дополнить обезболивающее средство, если частота сердечных сокращений превышает 400 bpm. Мышечный паралич и формирование пневмоторакса для уменьшения дыхательных движений, что улучшит стабильность записи
- Открытие дуры и пиа-матер
- Используя #55 миппы, аккуратно поднимите dura mater и вырежьте его caudally от сегмента L5, рострально до сегмента L4.
- Используя пару ультратонких 5SF типсов сделать небольшой патч в пиа покрытие спинной колонны, между кровеносными сосудами, точно на уровне максимального афферентного залпа из MG или нерва LGS.
- Используйте небольшие кусочки пропитанной солевым раствором и высушенной гелевой пены, чтобы блокировать кровотечение, если это необходимо.
- размещение электродов tsDCS
- Сделайте небольшой разрез в коже на брюшной полости крысы на ростро-каудальном уровне, соответствующем расположению сегментов позвоночника L4-L5.
- Захватите открытый лоскут кожи с металлическим зажимом, который будет служить эталонным электродом.
- Поместите пропитанную раствором губку на спинную сторону позвонка Th12. Убедитесь, что размер губки равен размеру активного электрода tsDCS (кругообразная пластина из нержавеющей стали диаметром 5 мм).
- Используя тонкий манипулятор, нажмите губку с активным электродом tsDCS к кости и убедитесь, что вся поверхность электрода нажата одинаково.
- Подключите как эталонные, так и активные электроды tsDCS к блоку стимуляторов постоянного тока, способного обеспечить непрерывный поток прямого тока.
- Приготовление микропипет
- Используя шкив микроэлектрода, подготовь микроэлектрод.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба нити и не-нити электроды могут быть использованы, однако, помните, что хвостовик электрода должно быть достаточно долго, чтобы достичь брюшного рога, будучи достаточно тонким, чтобы не сжимать спинной мозг во время спуска.- Отрегулируйте настройку выдвижного хвостовика, чтобы хвостовик, поступающий в спинной мозг, был примерно 3 мм в длину, в то время как кончик электрода составляет не более 1 20122 мкм в диаметре, а сопротивление микроэлектроприемки составляет от 10 до 20 МЗ.
- Заполните микроэлектроды электролитом 2М калия-цитрата.
- Накрените подготовленный микроэлектрод на микроманипуляторе, позволяющий ступенчатое движение 1'u20122 и стереотаксисную калибровку.
- Подключите микроэлектрод к внутриклеточному усилителю со эталонным электродом, помещенным в мышцы спины.
- Используя шкив микроэлектрода, подготовь микроэлектрод.
- После нервно-мышечного блока, контролировать глубину анестезии, проверяя частоту ЭКГ, и дополнить обезболивающее средство, так что частота сердечных сокращений крыс не превышает 400 bpm.
4. Мотонейрон отслеживания и проникновения
- Поместите афферентный залп записи электрода обратно на спинной поверхности спинного мозга, caudally к месту записи сайта, на уровне сегмента L6.
- Стимулируя нервы MG и LGS электрическими импульсами 0,1 мс с частотой 3 Гц и интенсивностью 3Т, чтобы активировать все аксоны альфа-мотонейронов в пределах выбранного нерва.
- Привод micropipette в выбранный патч в пиа с медио-боковой угол 15'u201220 "(с наконечником направлены боково).
- После спуска под поверхностью откалибровать микроэлектрод и компенсировать его способность и напряжение смещения, и продолжить проникновение спинного мозга, когда все параметры стабильны. Антидромный полевой потенциал мотонейронового бассейна будет виден на микроэлектроном следе напряжения при приближении к специальному моторному ядру во время стимуляции соответствующего нерва.
- Продолжить проникновение с микроэлектрода на 1'u20122 мкм шаги, и периодически использовать функцию buzz внутриклеточного усилителя, чтобы очистить кончик электрода от любых остатков.
- Наблюдайте проникновение мотонейрона, которое будет характеризоваться внезапной гиперполяризацией записанного следа напряжения и появлением антидромного всплеска потенциала.
5. Запись мотонейроновой мембраны и огневых свойств
- В мостовом режиме внутриклеточного усилителя определите мотонейрон на основе «все-или-ничего» появления антидромного потенциала действия путем стимулирования соответствующих нервных ветвей. Запись 20 последующих следов для последующего усреднения.
- Внедрение строгого критерия включения для обеспечения высококачественных данных: потенциал мембраны отдыха не менее -50 мВ при амплитуде; потенциальные амплитуды действия, более 50 мВ, с положительным превышением; мембранный потенциал стабилен в течение не менее 5 минут до записи.
- В режиме прерывания тока (текущий режим скорости переключения 4-8 кГц) внутриклеточного усилителя, вызывают ортодромный потенциал действия в мотонейроне с использованием 0,5 мс внутриклеточного деполяризации текущих импульсов. Повторите по крайней мере 20 раз для автономного усреднения.
- Стимулировать мотонейрон с 40 короткими импульсами (100 мс) гиперполяризирующего тока (1 nA) для расчета сопротивления входных данных клеток.
- Стимулировать мотонейрон с 50 мс квадратных волн импульсов при увеличении амплитуды, чтобы определить значение реобазы, как минимальная амплитуда деполяризации тока, необходимого для получения одного всплеска.
- Ввилите 500 мс квадратных волновых импульсов деполяризации тока, при увеличении амплитуды в шагах 0,1-2 нА, чтобы вызвать ритмические разряды мотонейронов.
6. Транскондальная стимуляция прямого тока (tsDCS)
- Сохраняя стабильное проникновение мотонейрона, начните процедуру поляризации путем трансколонного применения прямого тока. Отрегулируйте текущую интенсивность и время применения к конструкции эксперимента (например, 0,1 мА за 15 мин).
- Сразу после включаемый ДК, наблюдайте за потенциалом мембраны мотонейрона. Анодальная поляризация (активный электрод как анод) должна привести к деполяризации мембранного потенциала, в то время как катодальная поляризация (активный электрод как катод) должна вызывать обратный эффект. Наблюдайте, является ли изменение потенциала мембраны отдыха в ответ на стимуляцию постоянного ДК, что гарантирует, что интенсивность электрического поля не влияет.
- Во время непрерывного текущего применения повторите шаги 5.3'u20125.6 с интервалом в 5 минут.
- Выключите DC и продолжайте повторять шаги 5.3'u20125.6 с интервалом в 5 минут до тех пор, пока записи не станут нестабильными или критерии включения не будут скомпрометированы.
- Прекратите эксперимент и усыпляйте животное с помощью внутривенного введения смертельной дозы пентобарбитального натрия (180 мгкг -1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Параметры действия потенциалов и нескольких мембранных свойств могут быть рассчитаны на основе внутриклеточных записей при условии стабильных условий проникновения клеток. Рисунок 1A представляет собой типичный потенциал ортодромного действия, вызванный внутриклеточной стимуляцией, которая отвечает всем критериям для включения данных (потенциал отдыха мембраны не менее -50 мВ, и амплитуды шипа выше 50 мВ, с положительным превышением). Можно измерить потенциальные параметры действия, такие как амплитуда шипа, амплитуда амплитуды послеперполяризации или послегипеперполяризация полуунижения (AHP-HDT). Значение последнего параметра в крысиных мотонейронах служит надежным критерием для различения быстрых и медленных мотонейронов (AHP-HDT, 20 мс для медленного, в то время как AHP-HDT lt;20 мс для быстрых мотонейронов)17. Рисунок 1B показывает реакцию клетки на 100 мс гиперполяризирующего тока импульса 1nA, из которого можно определить как пиковое, так и плато входное сопротивление (ИК) мотонейрона по отклонению напряжения. На рисунке 1С показан расширенный след напряжения реобасического шипа с четко обозначенным порогом напряжения шипа, указывающий на уровень деполяризации мембраны, при котором активируются каналы натрия, закрытые напряжением, чтобы инициировать потенциал действия. Все эти записи могут повторяться несколько раз во время и после применения tsDCS, что позволяет сравнивать соответствующие параметры до тех пор, пока потенциал мембраны отдыха стабилен и выполняются другие критерии стимуляции и протокола записи.
Несколько исследований косвенно показали, что tsDCS изменяет мотонейрон возбудимость и стрельбушаблон 9,18. На рисунке 2 показаны примеры внутриклеточного напряжения следы от двух мотонейронов стимулировали внутриклеточно с 500 мс квадратных импульсов деполяризации тока до, во время и после применения tsDCS. В стабильных условиях записи повторяются несколько минут один за другим могут быть выполнены, и motoneuron стрельбы моделей можно надежно сравнить. Было установлено, что anodal (к) tsDCS действует в направлении увеличения возбудимости мотонейрона и более высоких частотритмической стрельбы (рисунок 2A),в то время как катодальные (-) tsDCS действовали в направлении ингибирования стрельбы (Рисунок 2B). Кроме того, последствия обоих типов tsDCS пережил период поляризации. Следует также отметить, что наблюдаемые изменения в возбудимости и схеме стрельбы являются не просто результатом деполяризации клеточной мембраны или гиперполяризации анодалом или катодальным tsDCS, соответственно, а демонстрируют глубокие изменения, не связанные с изменением мембранного потенциала, поскольку они сохранялись, несмотря на то, что этот параметр вернулся к исходной точке после окончания поляризации.
И наконец, следует подчеркнуть, что любые отклонения от представленного протокола, скорее всего, приведут к неудачному эксперименту из-за ухудшения подготовки и/или глубокого снижения надежности данных. На рисунке 3 показаны примеры записей, когда критерии включения данных были скомпрометированы либо из-за несовершенствапроникновения клеток (рисунок 3A),пренебрежения, чтобы компенсировать устойчивость и емкость микроэлектрода(рисунок 3B) или нестабильности спинного мозга (Рисунок 3C). Важно, чтобы исследователи выявляют такие неоптимальных записи и внедряют надлежащие корректирующие действия или игнорируют такие результаты из набора данных.
Рисунок 1: Параметры действия потенциалов и мембранных свойств.
(A)потенциал ортодромного действия, вызываемый внутриклеточной стимуляцией, с указанными основными параметрами, которые могут быть рассчитаны из этой записи. АМП AP ампляторная амплитуда действия; AHP усилитель - амплитуляция послегипеперполяризации; AHP-HDT - послегипеперполяризация на пол-разложения. (B)След напряжения мембранной реакции на короткий (100 мс) деполяризирующий текущий импульс интенсивности 1nA, что позволяет рассчитать входное сопротивление (ИК). Обратите внимание на пик потенциального отклонения (ПИК ИК), за которым следует небольшое снижение и следующая фаза плато мембранного потенциала (ИК-плато). (C)Расширенный след напряжения реобасического шипа с пунктирной горизонтальной линией, указывающей на порог напряжения шипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Влияние поляризации на стрельбу из мотонейрона.
(A) Внутриклеточные записи из одного мотонейрона стимулировали внутриклеточно с 7,5 нА на 500 мс, сделанные до (слева), во время анодального tsDCS (0,1 мА, средний), и 10 минут после окончания поляризации (справа). Обратите внимание на постепенное увеличение возбудимости мотонейрона при той же интенсивности стимула. (B)Внутриклеточные записи из другого мотонейрона стимулировали внутриклеточно с 6 nA для 500 мс, сделанные до (слева), во время катодальных tsDCS (0,1 мА, средний), и 10 минут после окончания поляризации (справа). Обратите внимание на постепенное ингибирование частоты стрельбы мотонейроном при той же интенсивности стимула. Ниже записи, следы внутриклеточного тока стимуляции предоставляются. Калибровочные решетки в правом нижнем углу применяются ко всем представленным внутриклеточным записям. Значения потенциала мембраны покоя предоставляются слева от каждой записи. Частоты стрельбы с устойчивым состоянием, рассчитанные из трех последних интервалов interspike, даются выше записей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Примеры неоптимальных записей в результате отклонений от экспериментального протокола.
(A)Антидромный всплеск, записанный из мотонейрона, недостаточно проник. Потенциал мембраны отдыха недостаточен (-45 мВ), и, несмотря на соответствующую форму шипа со всеми последовательными фазами деполяризации, реполяризации и гиперполяризации, его амплитуда слишком низка (41 мВ) и без превышения. (B)реобасический всплеск, генерируемый на нереальном пороге напряжения (мембрана деполяризована до 68 мВ). Такая ошибка, как правило, из-за заблокированного микроэлектрода, с некомпенсированным сопротивлением и емкости. Можно также видеть, что эта запись сильно загрязнена 50 Гц электрического шума. (C) Мотонейрон ритмической стрельбы в ответ на 500 мс деполяризации тока, с большими колебаниями мембранного потенциала, в основном вызванные нестабильной проникновения микроэлектрода, возможно, из-за чрезмерных дыхательных движений. Для всех представленных случаев рассчитанные мембранные или огневые свойства были бы ненадежными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При правильной работе хирургическая часть описанного протокола должна быть завершена в течение примерно трех часов. Особо следует позаботиться о поддержании стабильных физиологических условий животного во время операции, в частности температуры тела и глубины анестезии. Помимо очевидных этических соображений, отсутствие надлежащей анестезии может привести к чрезмерным движениям конечностей во время вскрытия нерва или ламинэктомии и привести к повреждению препарата или преждевременному прекращению эксперимента. При парализуе животного перед проникновением в спинной мозг с помощью микроэлектрода крайне важно контролировать глубину анестезии и пульс и применять надлежащие параметры вентиляции на основе веса животных и емкости легких. Любые отклонения от желаемых физиологических параметров должны быть немедленно изменены, чтобы обеспечить успех процедуры. После операции, стабильные условия записи должны быть возможны для поддержания, по крайней мере четыре часа.
После проникновения мотонейрона, стабильность записи имеет большое значение. Крайне важно, чтобы мембранный потенциал остается постоянным во время контрольных записей, так как любые колебания будут существенно влиять на реобазию тока и порог ритмической стрельбы. Правильная фиксация позвоночного столба должна обеспечить базовую стабильность, в то время как цель пневмоторакса состоит в том, чтобы уменьшить движения спинного мозга, вызванные дыханием. Кроме того, нужно быть уверенным, что мышечные сокращения полностью отменены перед попыткой проникновения и нервно-мышечный блокатор вводится через регулярные промежутки времени.
После успешного проникновения антидромная идентификация записанного мотонейрона может быть выполнена путем стимуляции соответствующей нервной ветви. Это реальное преимущество препарата in vivo, в котором мотонейроны аксоны хранятся в непрерывности с иннерватированными мышцами со ссылкой на внутриклеточные записи in vitro, выполненные на ломтиках позвоночника, которые совсем недавнобыли возможны у взрослых животных 16,но не позволяют идентифицировать записанный мотонейрон. Тем не менее, важно, чтобы исследователи имеют четкое понимание разницы между антидромной и ортодромной активациимотонейрона 19, чтобы избежать неправильного толкования данных. Важно сохранить стимуляцию периферического нерва как можно ниже (менее 0,5 В), чтобы предотвратить активацию дополнительных нервов из-за текущего распространения и обратить внимание на постоянную и короткую задержку антидромного всплеска19.
Еще одним преимуществом представленной техники является то, что мотонейроны могут быть дополнительно классифицированы как быстрые или медленные типы на основе их потенциальных параметров действия, а именно AHP-HDTпродолжительность 17. Дифференциация между мотонейроны иннерватирования быстрого типа и медленного типа мышечных волокон имеет решающее значение в связи с их различным вкладом в производительность мышц во время движений. Кроме того, быстрые и медленные мотонейроны могут по-разному реагировать наполяризацию 9.
Для обеспечения надежных результатов поляризации следует обратить внимание на установление надлежащих параметров tsDCS. Текущая интенсивность должна, с одной стороны, обеспечить желаемую плотность поля в выбранной области, чтобы вызвать воздействие на нейронные сети, в то время как с другой стороны, должны быть в пределах безопасностидля повреждения тканей 20. Размер активных и эталонных электродов и их размещение в отношении места записи также являются важнымиэлементами для рассмотрения 4, и tsDCS продолжительность применения времени должно быть достаточно, чтобы вызватьжелаемые эффекты 16,17,22. В этом документе методов репрезентативные результаты были получены путем применения 100 катодальной или анодальной поляризации в течение 15 минут. С учетом формы и диаметра электрода, соответствующая интенсивность электрического поля непосредственно под электродом составила 39,25 замм 2. Однако следует понимать, что точное значение электрического поля на записанном сайте мотонейронов невозможно заранее определить, так как расположение мотонейрона в отношении электрода поляризации варьируется, а плотность электронного поля значительно падает с увеличенной глубиной и уменьшеннымразмером электрода 4,24. Кроме того, ориентация отсеков мотонейронов по отношению к прикладному электрическому полю важна длягенерации потенциалов действия 22,,25,,26,и это невозможно предсказать для отдельных клеток. Кроме того, очень важно понимать, что эффекты tsDCS не ограничиваются периодом поляризации, и что стойкие, долгосрочные эффектыхорошо документированы 22,27. Поэтому после хотя бы одной короткой сессии поляризации все последовательные записи в одной и той же подготовке будут выполняться в условиях постполяризации, что ограничивает количество возможных записей острой поляризации одним на животное.
Дополнительные изменения представленной процедуры могут быть внесены для ответа на конкретные исследовательские вопросы. Этот протокол с минимальными изменениями может быть использован в качестве стандарта для нескольких экспериментальных конструкций, например, при тестировании различной продолжительности и/или амплитуды применяемых tsDCS или при сравнении краткосрочных или долгосрочных эффектов tsDCS в различных пулах мотонейронов. Приемлемо использование нескольких моделей генетических заболеваний (например, модель крысы SOD1 G93A бокового амиотрофического склероза) или различных нервов для активации антидромного нерва (перонеальная, трибиальная, сафенозная и т.д.). Однако следует также знать об ограничениях процедуры. Например, использование барбитуратов для анестезии подавляет активность стойких внутреннихтечений 28, в то время как системное введение конкретных блокаторов, обычно используемых в препаратах in vitro (например, стрихнин для блокирования никотиновых рецепторов) может оказаться фатальным для животного. Исследователя целесообразно рассматривать эти ограничения перед выбирать правильный экспериментальный протокол.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национального научного центра No 2017/25/B/N'7/00373. Авторы хотели бы признать работу Ханны Дзымаши-Челиховской и Влодзимьежа Мравчински, которые внесли свой вклад в сбор и анализ результатов, представленных в настоящем документе.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), Bethesda, Md. 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, Pt 1 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, Pt 3 663-677 (2006).
