Summary
Dit protocol beschrijft in vivo intracellulaire opname van rat lumbale motoneurons met gelijktijdige trans-spinale directe stroom stimulatie. De methode stelt ons in staat om membraaneigenschappen te meten en ritmisch afvuren van motoneurons op te nemen voor, tijdens en na anodale of kathodale polarisatie van het ruggenmerg.
Abstract
Intracellulaire opname van spinale motoneurons in vivo biedt een "gouden standaard" voor het bepalen van de elektrofysiologische kenmerken van de cellen in het intacte spinale netwerk en heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van klassieke in vitro of extracellulaire opnametechnieken. Een voordeel van in vivo intracellulaire opnames is dat deze methode kan worden uitgevoerd op volwassen dieren met een volledig volwassen zenuwstelsel, en daarom kunnen veel waargenomen fysiologische mechanismen worden vertaald naar praktische toepassingen. In dit methodologisch papier beschrijven we deze procedure in combinatie met extern toegepaste constante stroomstimulatie, die polarisatieprocessen in spinale neuronale netwerken nabootst. Trans-spinale directe stroomstimulatie (tsDCS) is een innovatieve methode die steeds vaker wordt gebruikt als een neuromodulatory interventie in revalidatie na verschillende neurologische verwondingen en in de sport. De invloed van tsDCS op het zenuwstelsel blijft slecht begrepen en de fysiologische mechanismen achter zijn acties zijn grotendeels onbekend. De toepassing van de tsDCS gelijktijdig met intracellulaire opnames stelt ons in staat om veranderingen van motoneuron membraaneigenschappen en kenmerken van ritmisch vuren direct waar te nemen in reactie op de polarisatie van het spinale neuronale netwerk, wat cruciaal is voor het begrijpen van tsDCS-acties. Bovendien, wanneer het gepresenteerde protocol de identificatie van de motoneuron met betrekking tot een innervated spier en zijn functie (flexor versus extensor) evenals het fysiologische type (snel versus langzaam) omvat, biedt het een kans om selectief de invloed van tsDCS op geïdentificeerde componenten van spinale circuits te onderzoeken, die anders lijken te worden beïnvloed door polarisatie. De gepresenteerde procedure richt zich op chirurgische voorbereiding voor intracellulaire opnames en stimulatie met de nadruk op de stappen die nodig zijn om voorbereidingsstabiliteit en reproduceerbaarheid van de resultaten te bereiken. De details van de methodologie van de anodale of kathodale tsDCS applicatie worden besproken met aandacht voor praktische en veiligheidskwesties.
Introduction
Trans-spinale directe stroomstimulatie (tsDCS) krijgt erkenning als een krachtige methode om spinale circuit excitability in gezondheid en ziekte1,2,3te wijzigen . In deze techniek wordt een constante stroom doorgegeven tussen een actieve elektrode boven geselecteerde spinale segmenten, met een referentieelektrode die ventrally of meer rostrally4bevindt. Verschillende studies hebben al bevestigd dat tsDCS kan worden gebruikt bij het beheer van bepaalde pathologische aandoeningen, zoals neuropathische pijn5,spasticiteit6,dwarslaesie7 of om revalidatie te vergemakkelijken8. Onderzoekers suggereren dat tsDCS veranderingen oproept in de ionenverdeling tussen de intracellulaire en de extracellulaire ruimte over het celmembraan, en dit kan de neuronale activiteit vergemakkelijken of remmen, afhankelijk van de huidige oriëntatie9,10,11. Tot voor kort ontbrak echter een directe bevestiging van deze invloed op motoneurons.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om in vivo intracellulaire registratie van elektrische potentialen van lumbale spinale motoneurons in de verdoofde rat uit te voeren met gelijktijdige toepassing van tsDCS, om veranderingen in motoneuronmembraan en afvurende eigenschappen in reactie op anodale of kathodale polarisatie van het spinale neuronale netwerk waar te nemen. Intracellulaire opnamen openen verschillende onderzoeksgebieden van neuroneigenschappen, niet beschikbaar voor eerder gebruikte extracellulaire technieken9,12. Het is bijvoorbeeld mogelijk om de reactie van motoneuronmembraanspanning op gelijkstroomstroom veroorzaakt door tsDCS nauwkeurig te meten, om de spanningsdrempel voor piekgeneratie aan te geven of om actiepotentieelparameters te analyseren. Bovendien stelt deze techniek ons in staat om de passieve membraaneigenschappen van motoneuron te bepalen, zoals invoerweerstand, en om de relatie tussen intracellulaire stimulatiestroom en frequentie van ritmisch afvuren van motoneurons te observeren. Antidromische identificatie van geregistreerde motoneuron, gebaseerd op de stimulatie van functioneel geïdentificeerde zenuwen (d.w.z. zenuwen die efferents leveren aan flexoren of extensoren) stelt ons in staat om bovendien soorten innervated motoreenheden te identificeren (snel versus langzaam), wat een kans geeft om te testen of polarisatie op verschillende manieren individuele elementen van het volwassen spinale neuronale systeem beïnvloedt. Vanwege een uitgebreide operatie voorafgaand aan de opname en hoge eisen aan stabiliteit en betrouwbaarheid van opnames, is deze techniek zeer uitdagend, maar maakt een directe en langdurige beoordeling van elektrofysiologische kenmerken van één motoneuron mogelijk: voor, tijdens en na toepassing van tsDCS, wat cruciaal is om zowel de acute acties als de aanhoudende effecten te bepalen13. Als een motoneuron activeert direct extrafusale spiervezels14 en neemt deel aan feedback controle van een spiercontractie en ontwikkelde kracht15,16 elke waargenomen invloed van tsDCS op de motorische eenheid of spier contractiele eigenschappen kunnen worden gekoppeld aan modulaties van motoneuron excitability of vuren kenmerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die verband houden met dit protocol zijn aanvaard door de bevoegde autoriteiten (bijvoorbeeld de lokale ethische commissie) en volgen de nationale en internationale regels inzake dierenwelzijn en beheer.
LET OP: Elke deelnemer die betrokken is bij de procedure moet goed worden opgeleid in elementaire chirurgische ingrepen en moet beschikken over een geldige vergunning voor het uitvoeren van dierproeven.
1. Anesthesie en premedicatie
- Verdoven een rat met intraperitoneale injecties van natriumpentobarbital (een eerste dosis van 60 mg·kg-1 voor 6 maanden oude mannelijke Wistar ratten met een gewicht van 400\u2012550g).
LET OP: Dit protocol is niet beperkt tot de aangegeven stam, geslacht of leeftijd van ratten. Ook alternatieve anesthesie zoals ketamine-xylazine mix, alfa-chloralose of fentanyl + midazolam + medetomidine kan worden gebruikt als meer geschikt voor verschillende onderzoeksdoelen of wanneer vereist door de ethische commissie. - Controleer na ongeveer 5 minuten de diepte van anesthesie door de achterste ledematen van de rat met stompe tangen te knijpen. Ga alleen verder met de volgende stappen van het protocol wanneer er geen reflexactie wordt waargenomen.
- Injecteer 0,05 mL atropine onderhuids om de slijmproductie na intubatie te verminderen.
- Injecteer onderhuids 5 mL fosfaatbuffer met 4% glucoseoplossing, NaHCO3 (1 %) en gelatine (14%). Deze buffer zal worden geabsorbeerd door de cutane vaten tijdens een experiment en zal helpen bij het handhaven van vochtbalans.
- Controleer het dier tijdens de operatie periodiek op reflexacties en vul anesthesie indien nodig aan (10 mg·kg-1·h-1natriumpentobarbital).
2. Chirurgie
- Bereid het dier voor op chirurgische behandeling door het scheren van bont over het dorsale deel van de linker achterpoot, van de enkel tot de heup, de achterkant, van staart tot de hoge thoracale segmenten, de linkerkant van de borst, en de ventrale kant van het nekgebied boven het borstbeen
- Plaatsing van de intraveneuze lijn
- Plaats de rat op zijn rug op een gesloten-loop verwarmingskussen (en zet hem vast met ledemaatfixaties).
- Met behulp van een 21 mes, maak een longitudinale snede door de huid van een borstbeen tot een kin.
- Houd de huid met tangen en scheid deze van het onderliggende weefsel.
- Met behulp van stompe dissectie technieken bloot de rechter halsader. Ontleden zorgvuldig de ader uit omliggende weefsels.
- Zoek het deel van de ader zonder vertakking punten, slip twee 4-0 ligaturen eronder.
- Maak een losse knoop op het proximale uiteinde van het eerder geïdentificeerde niet-vertakkende segment van de ader en een losse knoop aan het distale uiteinde van dit segment van de ader. Klem de ader proximale naar het hart, en vervolgens ligate het distale deel van de ader.
- Maak met behulp van een irisschaar een incisie tussen de klem en verre ligatuur. Houd een flap van de ader, en introduceer een voorgevulde katheter op het punt waar het wordt geblokkeerd door de klem.
- Terwijl u de ader en de katheter met tangen vasthoudt, verwijdert u de klem en duwt u de katheter enkele millimeters in de ader. Zet beide uiteinden van de katheter vast aan de ader en voeg een extra fixatiepunt toe aan de huid.
- Introductie van de tracheale buis
- Met behulp van stompe tangen scheiden de twee mandibulaire klieren die de sternohyoid spieren. Aparte sternohyoïde spieren op de middellijn om de luchtpijp bloot te leggen.
- Slip drie 4-0 ligaturen onder de luchtpijp, maak dan twee knopen onder de tracheale buis invoegpunt en een knoop boven.
- Zoek het cricoïde kraakbeen van het strottenhoofd en maak een incisie onder het derde tracheale kraakbeen.
- Steek een tracheale buis in de luchtpijp en zet de buis op zijn plaats met vooraf voorbereide ligaturen, voeg dan een extra ligatuur aan de huid.
- Plaats een klein stukje watten boven de gescheiden spieren, en hecht de huid over het geopereerde gebied.
- Dissectie van de zenuwen van de achterledemak
- Met behulp van 21 mes, maak een longitudinale snede op de achterste kant van de linker achterste ledemaat, van de achillespees tot de heup.
- Pak de huid met tangen, en met behulp van stompe dissectie technieken scheiden de huid van de onderliggende spieren aan beide zijden van de incisie.
- Zoek de popliteal fossa aan de achterkant van het kniegewricht, die wordt bedekt door de biceps femoris spier, en met behulp van een schaar maken een snede tussen de voorste en achterste deel van deze spier.
- Bewegen naar boven gesneden twee hoofden van de biceps femoris helemaal naar de heup om de heup zenuw bloot. Cauterize als dat nodig is om bloedingen te voorkomen.
- Identificeer de surale, scheenbeen en gemeenschappelijke peroneale takken van de heupzenuw.
- Met behulp van een schaar, scheid de laterale van de mediale hoofd van de gastrocnemius spier om de scheenbeen zenuw en zijn takken bloot te stellen.
- Met behulp van 55 tangen pak het distale uiteinde van de surale zenuw, snijd het distaal en ontleden zo ver mogelijk.
- Herhaal de procedure met de gemeenschappelijke peroneale zenuw.
- Met behulp van een stompe glazen staaf scheiden de scheenzenuw van de omliggende weefsels, zorg ervoor dat de bloedvaten niet beschadigen, en snijd het distally.
- Identificeer de mediale gastrocnemius (MG) en de laterale gastrocnemius en soleus (LGS) zenuwen.
- Met behulp van 55 tangen, zorgvuldig ontleden de MG en LGS zenuwen, loskoppelen van omliggende weefsels, maar het behoud van hun verbinding met de respectieve spieren.
- Plaats een zoutgeweekd stuk watten onder de blootgestelde zenuwen.
- Sluit de huid over het geopereerde gebied.
- Laminectomie
- Met behulp van 21 mes maak een longitudinale incisie van het heiligbeen tot aan de thoracale wervels.
- Scheid de huid van de onderliggende spieren.
- Snijd de longissimus spier aan beide zijden van de thoracale en lumbale spineuze processen.
- Met behulp van stompe scalpel trekken de spieren uit de wervelkolom om de dwarse processen van elke wervel bloot te leggen.
- Met behulp van stompe punt schaar snijd de pezen van de spieren aangesloten op de dwarse processen langs de blootgestelde wervelkolom. Breng indien nodig hemostatische middelen aan.
- Identificeer de Th13 wervel als het laagste thoracale segment met ribinbrengen en verwijder fijne rongeurs spineuze processen en laminae van Th13 tot L2 wervels om lendensegmenten van het ruggenmerg bloot te leggen. Vergeet niet om het L3 spineuze proces dat zal worden gebruikt als een fixatiepunt voor wervelkolom stabilisatie beschadigen.
- Verwijder het Th12 spinous proces en maak het rugoppervlak zoveel mogelijk glad.
- Met behulp van stompe dissectie technieken scheiden de spieren van Th11 wervel om houder invoegpunten te creëren.
- Plaats dunne zout-doorweekte watten over de blootgestelde ruggenmergsegmenten.
- Verplaats de rat naar het op maat gemaakte metalen frame met twee parallelle staven en twee verstelbare armen met klemmen om de wervelkolom te ondersteunen en te stabiliseren.
3. Voorbereiding op de opname en stimulatie
- Wervelkolomfixatie en zenuwopstelling
- Plaats de rat in het op maat gemaakte frame op een verwarmingskussen, aangesloten op het gesloten verwarmingssysteem om de lichaamstemperatuur van het dier op 37 ± 1°C te houden.
- Steek ECG-elektroden onder de huid en sluit aan op een versterker voor hartslagbewaking.
- Met behulp van de huid flappen, vormen een diep zwembad over het blootgestelde ruggenmerg.
- Bevestig met behulp van metalen klemmen de wervelkolom door klemmen onder Th12-dwarsprocessen en bij L3-spinachtig proces te plaatsen.
- Zorg ervoor dat de wervelkolom is bevestigd en horizontaal gerangschikt, en breng vervolgens dorso-ventrale druk aan beide zijden van de kolom om de spieren in te trekken.
- Vul het zwembad met warme (37 °C) minerale olie en houd het op deze temperatuur.
- Rijg een 4-0 ligatuur door de achillespees, til en strek de geopereerde linker achterpoot zodat de enkel is genivelleerd met de heup.
- Met behulp van de huid kleppen maken een diepe pool over de blootgestelde scheental, MG en LGS zenuwen.
- Vul het zwembad met warme (37 °C) minerale olie.
- Plaats MG en LGS zenuwen op bipolaire zilverdraad stimulerende elektroden en sluit ze aan op een vierkante puls stimulator. Gebruik aparte stimulatiekanalen voor elke zenuw.
- Plaatsing van oppervlakteelektrode
- Plaats een zilveren bal elektrode aan de linkerkant van het blootgestelde ruggenmerg, met een referentieelektrode ingevoegd in de rugspieren, en sluit beide elektroden aan op het differentiële DC-versterker. De oppervlaktebalelektrode zal worden gebruikt om afferentevolle volleys van zenuwen op te nemen.
- Met behulp van een constant-stroom stimulator, stimuleren van de MG en LGS zenuwen met vierkante pulsen van 0,1 ms duur, herhaald op een frequentie van 3 Hz, en observeren afferent volleys.
- Bepaal de drempel (T) voor zenuwactivering, stimuleer elke zenuw op ongeveer 3· T intensiteit, en record amplitude van afferent volley voor elke zenuw.
- Verplaats de oppervlakteelektrode rostral en herhaal de procedure om spinale segmenten te identificeren waarbij amplitudes van de volleys het hoogst zijn voor elke zenuw. Na het bepalen van de maximale volley locatie, verplaats de oppervlakteelektrode op een veilige afstand van het ruggenmerg.
- Spierverlamming en het vormen van pneumothorax om ademhalingsbewegingen te verminderen
- Verlam de rat intraveneus met een neuromusculaire blokker en sluit de tracheale buis aan op een externe ventilator in overeenstemming met een knaagdier-compatibele capnometer (Pancuronium bromide, bij een eerste dosis van 0,4 mg·kg-1, aangevuld om de 30 min in doses van 0,2 mg·kg-1)
- Monitor de co2-concentratie van eindgetijden en houd deze op ongeveer 3\u20124% door ventilatieparameters aan te passen (frequentie, luchtdruk en stroomvolumes).
- Maak een longitudinale incisie in de huid tussen de 5e en 6e rib aan een kant van de opname.
- Met behulp van botte tip schaar snijd de bovenliggende spieren te visualiseren intercostale ruimte tussen de ribben.
- Met behulp van kleine scherpe schaar, maak een kleine incisie in de intercostale spieren en in het borstvlies, dan steek een punt van een stompe rand tangen in de opening, waarbij zorg niet te drukken op de longen.
- Laat tangen uit te breiden of steek een kleine buis om de pneumothorax open te houden tijdens het experiment.
- Na het neuromusculaire blok, controleer anesthesie diepte door het controleren van ECG frequentie, en vul de verdovingsmiddel als de hartslag hoger is dan 400 bpm. Spierverlamming en het vormen van pneumothorax om ademhalingsbewegingen te verminderen, wat de opnamestabiliteit zal verbeteren
- Opening van de dura en pia mater
- Til met #55 tangen de dura mater voorzichtig op en snijd deze uit het L5-segment, rostrally tot aan het L4-segment.
- Met behulp van een paar ultradunne 5SF tangen maken een kleine patch in de pia die de dorsale kolom, tussen de bloedvaten, precies op het niveau van de maximale afferent volley van de MG of de LGS zenuw.
- Gebruik kleine stukjes zout geweekt en gedroogd gelschuim om bloedingen te blokkeren indien nodig.
- tsDCS-elektrodeplaatsing
- Maak een kleine incisie in de huid aan de ventrale kant van een rattenbuik op het rostro-caudal niveau dat overeenkomt met de locatie van L4-L5 spinale segmenten.
- Pak de blootgestelde huidflap met een metalen clip die zal dienen als referentie-elektrode.
- Plaats een zoutgeweekte spons op de rugzijde van de Th12 wervel. Zorg ervoor dat de sponsgrootte gelijk is aan die van een actieve tsDCS-elektrode (cirkelvormige roestvrijstalen plaat met een diameter van 5 mm).
- Druk met een fijne manipulator op de spons met een actieve tsDCS-elektrode tot op het bot en zorg ervoor dat het hele oppervlak van de elektrode gelijkmatig wordt ingedrukt.
- Sluit zowel referentie- als actieve tsDCS-elektroden aan op een constant-stroom stimulator-eenheid, die in staat is om een continue stroom van gelijkstroom te leveren.
- Bereiding van micropipetten
- Bereid met behulp van een micro-elektrodentrekker een micro-elektroden.
OPMERKING: Zowel filament als niet-filamentelektroden kunnen worden gebruikt, maar vergeet niet dat de steel van de elektrode lang genoeg moet zijn om de ventrale hoorn te bereiken terwijl ze dun genoeg zijn om het ruggenmerg niet te comprimeren tijdens het afdalen.- Stel de instelling van de trekker zo in dat de steel die het ruggenmerg binnenkomt ongeveer 3 mm lang is, terwijl de punt van de elektrode niet meer dan 1\u20122 μm in diameter is en de micro-elektrodenweerstand tussen 10 en 20 MΩ ligt.
- Vul de micro-elektroden met 2M kalium-citraat elektrolyt.
- Monteer de bereide micro-elektrodrode op de micromanipulator, waardoor 1\u20122 μm stepping beweging en stereotaxic kalibratie mogelijk is.
- Sluit de micro-elektrod aan op de intracellulaire versterker met de referentieelektrode in de rugspieren.
- Bereid met behulp van een micro-elektrodentrekker een micro-elektroden.
- Na het neuromusculaire blok, controleer anesthesie diepte door het controleren van ECG frequentie, en vul de verdovingsmiddel, zodat de rat hartslag niet meer dan 400 bpm.
4. Motoneuron tracking en penetratie
- Plaats de afferente volley opname elektrode terug op het dorsale oppervlak van het ruggenmerg, caudally naar de locatie van de opnameplaats, op het niveau van het L6-segment.
- Stimuleer de MG- en LGS-zenuwen met elektrische 0,1 ms pulsen met een frequentie van 3 Hz en 3T-intensiteit om alle axonen van alfa-motoneurons binnen een geselecteerde zenuw te activeren.
- Drijf de micropipet in een geselecteerde patch in de pia met een medio-laterale hoek van 15\u201220° (met een tip die zijwaarts wordt gericht).
- Na het afdalen onder het oppervlak, kalibreren van de micro-elektrod en compenseren de capaciteit en spanning offset, en blijven penetratie van het ruggenmerg wanneer alle parameters stabiel zijn. Een antidromisch veldpotentieel van de motoneuronpool zal zichtbaar zijn bij het micro-elektrodenspanningspoor terwijl het naderen van een speciale motorkerus tijdens stimulatie van de respectieve zenuw.
- Ga penetratie met de micro-elektrodrode op 1\u20122 μm stappen, en periodiek gebruik maken van de buzz functie van de intracellulaire versterker om de elektrode tip duidelijk van eventuele residu.
- Observeer motoneuron penetratie die zal worden gekenmerkt door een plotselinge hyperpolarisatie van de geregistreerde spanning spoor en het verschijnen van een antidromische piek potentieel.
5. Het opnemen van motoneuronmembraan en vuureigenschappen
- In een brugmodus van de intracellulaire versterker, identificeer de motoneuron op basis van de "alles-of-niets" verschijning van het antidromische werkingspotentieel door het stimuleren van de respectieve zenuwtakken. Record 20 volgende sporen voor latere gemiddelding.
- Een strikt inclusiecriterium implementeren om gegevens van hoge kwaliteit te waarborgen: rustmembraanpotentieel van ten minste -50 mV in amplitude; actiepotentieel van meer dan 50 mV, met een positieve overschrijding; membraanpotentieel stabiel gedurende ten minste 5 minuten voorafgaand aan de opname.
- In een discontinu stroomklemmodus (huidige schakelmodus 4-8 kHz) van de intracellulaire versterker, roept een orthodromische werkingspotentieel op in een motoneuron met behulp van 0,5 ms intracellulaire depolariserende stroompulsen. Herhaal dit minstens 20 keer voor offline middeling.
- Stimuleer een motoneuron met 40 korte pulsen (100 ms) hyperpolariserende stroom (1 nA) om celinvoerweerstand te berekenen.
- Stimuleer een motoneuron met 50 ms square-wave pulsen bij toenemende amplitudes om de rheobase waarde te bepalen als de minimale amplitude van depolariserende stroom die nodig is om een enkele piek uit te lokken.
- Injecteer 500 ms square-wave pulsen van depolariserende stroom, bij toenemende amplitudes in stappen van 0,1–2 nA om ritmische ontladingen van motoneurons op te roepen.
6. Trans-spinale directe stroomstimulatie (tsDCS)
- Met behoud van een stabiele penetratie van de motoneuron, start de polarisatie procedure door trans-spinale toepassing van gelijkstroom. Pas de huidige intensiteit en toepassingstijd aan het experimentontwerp aan (bijvoorbeeld 0,1 mA voor 15 minuten).
- Onmiddellijk na het inschakelen van de DC, observeren de motoneuron membraan potentieel. Anodale polarisatie (de actieve elektrode als anode) moet leiden tot depolarisatie van het membraanpotentieel, terwijl kathodale polarisatie (de actieve elektrode als kathode) een tegenovergesteld effect moet oproepen. Let op of een verandering in het rustmembraanpotentieel in reactie op DC-stimulatie constant is, wat ervoor zorgt dat de intensiteit van het elektrische veld niet wordt beïnvloed.
- Herhaal tijdens de continue huidige toepassing stap 5.3\u20125.6 in intervallen van 5 minuten.
- Schakel het DC uit en herhaal stappen 5.3\u20125.6 in intervallen van 5 minuten totdat opnamen instabiel worden of inclusiecriteria worden aangetast.
- Beëindig het experiment en euthanaseer het dier met behulp van intraveneuze toediening van een dodelijke dosis pentobarbitaal natrium (180 mg·kg-1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Parameters van het werkingspotentieel en verschillende membraaneigenschappen kunnen worden berekend op basis van intracellulaire opnamen wanneer stabiele omstandigheden van celpenetratie zijn gewaarborgd. Figuur 1A presenteert een typisch orthodromisch werkingspotentieel dat wordt opgeroepen door intracellulaire stimulatie, die voldoet aan alle criteria voor gegevensopname (het rustmembraanpotentieel van ten minste -50 mV en spike amplitude hoger dan 50 mV, met een positieve overschrijding). Actie potentiële parameters, zoals de spike amplitude, de afterhyperpolarisatie amplitude of de afterhyperpolarization half-verval tijd (AHP-HDT) kan worden gemeten. Een waarde van de laatste parameter in rat motoneurons dient als een betrouwbaar criterium voor het onderscheid tussen snelle en langzame motoneurons (AHP-HDT > 20 ms voor langzaam, terwijl AHP-HDT <20 ms voor snelle motoneurons)17. Figuur 1B toont een celreactie op een 100 ms hyperpolariserende stroompuls van 1nA, waaruit zowel piek- als plateauinputbestendigheid (IR) van een motoneuron kan worden bepaald aan de hand van de spanningsafbuiging. Figuur 1C toont een uitgebreid spanningsspoor van een rheobasische piek met een duidelijk gemarkeerde spanningsdrempel van de piek, wat het niveau van membraandepolarisatie aangeeft waarbij spanningsgatte natriumkanalen worden geactiveerd om het actiepotentieel te initiëren. Al deze opnames kunnen meerdere keren worden herhaald tijdens en na tsDCS-toepassing, waardoor we de respectieve parameters kunnen vergelijken zolang het rustmembraanpotentieel stabiel is en aan andere criteria van stimulatie en registratieprotocol is voldaan.
Verschillende studies hebben indirect aangetoond dat tsDCS motoneuron excitability en vuurpatroon9,18verandert . Figuur 2 toont voorbeelden van intracellulaire spanningssporen van twee motoneurons die intracellulair werden gestimuleerd met 500 ms vierkante pulsen van depolariserende stroom voor, tijdens en na tsDCS-toepassing. Onder stabiele omstandigheden kunnen opnames die meerdere minuten na elkaar worden herhaald, worden uitgevoerd en kunnen motoneuron-vuurpatronen betrouwbaar worden vergeleken. Anodale (+) tsDCS bleek te werken aan verhoogde motoneuron excitability en hogere frequenties van ritmisch vuren(figuur 2A), terwijl kathode (-) tsDCS handelde in de richting van vuurremming (Figuur 2B). Bovendien overleefden de effecten van beide soorten tsDCS de periode van polarisatie. Het is ook vermeldenswaard dat de waargenomen veranderingen in prikkelbaarheid en vuurpatroon niet alleen een gevolg zijn van celmembraandepolarisatie of hyperpolarisatie door respectievelijk anodale of kathodetDCS, maar ingrijpende veranderingen vertonen die geen verband houden met de verandering van een potentieel membraan, omdat ze bleven bestaan ondanks het feit dat deze parameter na het einde van de polarisatie terugkeerde naar een basislijn.
Ten slotte moet worden benadrukt dat eventuele afwijkingen van het gepresenteerde protocol waarschijnlijk zullen leiden tot een mislukt experiment, als gevolg van verslechtering van de voorbereiding en/of een ernstige afname van de betrouwbaarheid van de gegevens. Figuur 3 toont voorbeelden van opnames waarin criteria voor gegevensopname werden gecompromitteerd als gevolg van onvolmaakte celpenetratie(figuur 3A),verwaarlozing om micro-elektrodenresistentie en capaciteit(figuur 3B) of een instabiliteit van het ruggenmerg(figuur 3C)te compenseren. Het is belangrijk dat onderzoekers dergelijke niet-optimale opnames identificeren en goede corrigerende maatregelen uitvoeren of dergelijke resultaten uit de gegevensset negeren.
Figuur 1: Parameters van actiemogelijkheden en membraaneigenschappen.
(A) Een orthodromische werking die kan worden opgewekt door intracellulaire stimulatie, met aangegeven basisparameters die uit deze registratie kunnen worden berekend. AP ampl = actie potentiële amplitude; AHP ampl = afterhyperpolarization amplitude; AHP-HDT = afterhyperpolarization half-decay time. (B) Het spanningsspoor van een membraanrespons op een korte (100 ms) depolariserende stroompuls van 1nA intensiteit, waardoor we input resistance (IR) kunnen berekenen. Let op de piek van een potentiële afbuiging (IR Peak) gevolgd door een kleine daling en de volgende plateaufase van het membraanpotentieel (IR-plateau). (C) Het geëxpandeerde spanningsspoor van een rheobasische piek met een gestippelde horizontale lijn die de piekspanningsdrempel aangeeft. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Effecten van polarisatie op het afvuren van motoneuron.
(A) Intracellulaire records van een motoneuron gestimuleerd intracellulair met 7,5 nA voor 500 ms, gemaakt voor (links), tijdens anodale tsDCS (0,1 mA, midden), en 10 min na het einde van polarisatie (rechts). Let op de geleidelijke toename van de motoneuron excitability op dezelfde stimulus intensiteit. (B) Intracellulaire records van een andere motoneuron gestimuleerd intracellulair met 6 nA voor 500 ms, gemaakt vóór (links), tijdens kathodale tsDCS (0,1 mA, midden), en 10 min na het einde van polarisatie (rechts). Let op een geleidelijke remming van motoneuron vuurfrequentie bij dezelfde stimulus intensiteit. Hieronder worden sporen van intracellulaire stimulatiestroom verstrekt. De kalibratiebalken rechtsonder zijn van toepassing op alle gepresenteerde intracellulaire opnames. De waarden van het rustmembraanpotentieel worden aan de linkerkant van elke opname verstrekt. Frequenties van steady-state vuren, berekend op basis van de middelen van de laatste drie interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike interspike intersp Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Voorbeelden van suboptimale records als gevolg van afwijkingen van het experimentele protocol.
(A) De antidromische piek opgenomen van een motoneuron onvoldoende doorgedrongen. Het rustmembraanpotentieel is onvoldoende (-45 mV), en ondanks een geschikte vorm van de piek met alle opeenvolgende fasen van depolarisatie, repolarisatie en hyperpolarisatie, is de amplitude te laag (41 mV) en zonder een overschrijding. (B) Een rheobasische piek gegenereerd bij een onrealistische spanningsdrempel (membraan gedepolariseerd tot +68 mV). Dit soort fouten is meestal te wijten aan een geblokkeerde micro-elektrodrode, met ongecompenseerde weerstand en capaciteit. Men kan ook zien dat dit record sterk verontreinigd is door 50 Hz elektrische ruis. (C) Een motoneuron ritmische afvuren in reactie op 500 ms depolariserende stroom, met grote schommelingen van een membraanpotentieel, voornamelijk veroorzaakt door onstabiele micro-elektrodrode penetratie, mogelijk als gevolg van overmatige ademhalingsbewegingen. Voor alle gepresenteerde gevallen zouden de berekende membraan- of afvurende eigenschappen onbetrouwbaar zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indien correct uitgevoerd, moet het chirurgische deel van het beschreven protocol binnen ongeveer drie uur worden voltooid. Men moet bijzondere zorg in het handhaven van stabiele fysiologische omstandigheden van een dier tijdens de operatie, met name lichaamstemperatuur en diepte van anesthesie. Afgezien van duidelijke ethische overwegingen, een gebrek aan de juiste anesthesie kan leiden tot overmatige bewegingen van ledematen tijdens zenuwdissectie of laminectomie en leiden tot schade aan de voorbereiding of een voortijdige beëindiging van het experiment. Bij het verlammen van een dier voordat het ruggenmerg met een micro-elektroneedrode wordt doorgedrongen, is het van cruciaal belang om de diepte van anesthesie en hartslag te controleren en de juiste ventilatieparameters toe te passen op basis van het gewicht en de longcapaciteit van dieren. Eventuele afwijkingen van de gewenste fysiologische parameters moeten onmiddellijk worden gewijzigd om het succes van de procedure te garanderen. Na de operatie moeten stabiele opnameomstandigheden mogelijk zijn om ten minste vier uur te handhaven.
Na penetratie van een motoneuron is de opnamestabiliteit van groot belang. Het is absoluut noodzakelijk dat een membraanpotentieel constant blijft tijdens controleopnames, omdat eventuele schommelingen de rheobase-stroom en een drempel van ritmisch vuren aanzienlijk zullen beïnvloeden. Een goede fixatie van de wervelkolom moet basisstabiliteit bieden, terwijl het doel van een pneumothorax is om de ruggenmergbewegingen te verminderen die worden opgeroepen door ademhaling. Bovendien moet men er zeker van zijn dat spiercontracties volledig worden afgeschaft voordat de penetratie wordt geprobeerd en de neuromusculaire blokker op regelmatige tijdstippen wordt toegediend.
Na een succesvolle penetratie kan antidromische identificatie van de geregistreerde motoneuron worden uitgevoerd door stimulatie van een respectieve zenuwtak. Dit is een echt voordeel van een in vivo preparaat, waarbij motoneuron axonen in continuïteit worden gehouden met de innervated spieren in verwijzing naar in vitro intracellulaire opnames uitgevoerd op spinale plakjes, die pas onlangs mogelijk waren bij volwassen dieren16, maar geen identificatie van geregistreerde motoneuron toestaan. Het is echter belangrijk dat de onderzoekers een duidelijk inzicht hebben in het verschil tussen antidromische en orthodromische activering van motoneuron19 om verkeerde interpretatie van de gegevens te voorkomen. Het is belangrijk om de perifere zenuwstimulatie zo laag mogelijk te houden (minder dan 0,5 V) om de activering van extra zenuwen als gevolg van de huidige verspreiding te voorkomen en aandacht te besteden aan een constante en korte latentie van de antidromische piek19.
Een ander voordeel van de gepresenteerde techniek is dat motoneurons bovendien kunnen worden geclassificeerd als snelle of langzame types op basis van hun actie potentiële parameters, namelijk de AHP-HDT duur17. Differentiatie tussen motoneurons innervating fast-type en slow-type spiervezels is van cruciaal belang met betrekking tot hun verschillende bijdrage aan de prestaties van de spier tijdens bewegingen. Bovendien kunnen snelle en langzame motoneurons anders reageren op de polarisatie9.
Om betrouwbare resultaten van polarisatie te garanderen moet men aandacht besteden aan het instellen van de juiste parameters van tsDCS. De huidige intensiteit moet enerzijds een gewenste velddichtheid in het geselecteerde gebied bieden om effecten op neuronale netwerken op te roepen, terwijl aan de andere kant binnen veiligheidsgrenzen voor weefselschade moet zijn20. De grootte van actieve en referentieelektroden en de plaatsing ervan met betrekking tot een opnamelocatie zijn ook belangrijke elementen om rekening te houden met4, en de toepassingstijd van de tsDCS-duur moet voldoende zijn om de gewenste effecten16,17,22op te roepen . In dit methodepapier werden de representatieve resultaten verkregen door toepassing van 100 μA kathode- of anodale polarisatie gedurende 15 minuten. Rekening houdend met de vorm en diameter van de elektrode, bedroeg de respectieve elektrische veldintensiteit direct onder de elektrode 39,25 μA·mm2. Men moet echter begrijpen dat de precieze waarde van het elektrische veld op de geregistreerde motoneuron-site onmogelijk is om vooraf te bepalen als motoneuronlocatie met betrekking tot polarisatieelektrode varieert, en de e-field dichtheid daalt aanzienlijk met verhoogde diepte en verminderde elektrodegrootte4,24. Bovendien is de oriëntatie van de motoneuroncompartimenten ten opzichte van het toegepaste elektrische veld belangrijk voor het genereren van actiemogelijkheden22,25,26, en dit is niet te voorspellen voor individuele cellen. Daarnaast is het zeer belangrijk om te begrijpen dat tsDCS-effecten niet beperkt zijn tot een periode van polarisatie en dat aanhoudende, langdurige effecten goed gedocumenteerd zijn22,27. Daarom zouden na zelfs een enkele, korte polarisatiesessie alle opeenvolgende opnames in hetzelfde preparaat worden uitgevoerd in postpolarisatieomstandigheden, waardoor het aantal mogelijke acute polarisatie-opnames beperkt tot één per dier.
Aanvullende wijzigingen van de voorgestelde procedure kunnen worden aangebracht om specifieke onderzoeksvragen te beantwoorden. Dit protocol met minimale wijzigingen kan worden gebruikt als standaard voor verschillende experimentele ontwerpen, bijvoorbeeld bij het testen van verschillende duur en/of amplitudes van toegepaste tsDCS of bij het vergelijken van korte of lange termijn effecten van tsDCS in verschillende zwembaden motoneurons. Het gebruik van verschillende genetische ziektemodellen (bijvoorbeeld SOD1 G93A ratmodel van amyotrofische laterale sclerose) of verschillende zenuwen voor antidromische zenuwactivering (peroneale, scheenbeen, saphenous, enz.) is aanvaardbaar. Men moet zich echter ook bewust zijn van de beperkingen van de procedure. Bijvoorbeeld, het gebruik van barbituraten voor anesthesie remt de activiteit van aanhoudende innerlijke stromen28, terwijl de systemische introductie van specifieke blokkers vaak gebruikt in in vitro preparaten (bijvoorbeeld strychnine om nicotinische receptoren te blokkeren) fataal kan blijken voor het dier. Het is raadzaam voor onderzoekers om deze beperkingen te overwegen alvorens het juiste experimentele protocol te selecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben geen belangenconflict te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Science Center subsidie Nr. 2017/25/B/NZ7/00373. De auteurs willen het werk erkennen van Hanna Drzymała-Celichowska en Włodzimierz Mrówczyński, die beide hebben bijgedragen aan het verzamelen van gegevens en de analyse van de resultaten die in dit document worden gepresenteerd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), Bethesda, Md. 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, Pt 1 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, Pt 3 663-677 (2006).
