Summary
Ce protocole décrit l’enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurons lombaires de rat avec la stimulation simultanée de courant direct trans-spinal. La méthode nous permet de mesurer les propriétés de la membrane et d’enregistrer le tir rythmique des motoneurons avant, pendant et après la polarisation anodale ou cathodale de la moelle épinière.
Abstract
L’enregistrement intracellulaire des motoneurones spinaux in vivo fournit une « norme d’or » pour déterminer les caractéristiques électrophysiologiques des cellules dans le réseau spinal intact et détient des avantages significatifs par rapport aux techniques classiques d’enregistrement in vitro ou extracellulaire. Un avantage des enregistrements intracellulaires in vivo est que cette méthode peut être effectuée sur des animaux adultes avec un système nerveux entièrement mature, et donc de nombreux mécanismes physiologiques observés peuvent être traduits à des applications pratiques. Dans cet article méthodologique, nous décrivons cette procédure combinée avec la stimulation de courant constant appliquée à l’extérieur, qui imite les processus de polarisation se produisant dans les réseaux neuronaux spinaux. La stimulation trans-spinale à courant continu (tsDCS) est une méthode novatrice de plus en plus utilisée comme intervention neuromodulatoire en réadaptation après diverses lésions neurologiques ainsi que dans le sport. L’influence du tsDCS sur le système nerveux reste mal comprise et les mécanismes physiologiques derrière ses actions sont largement inconnus. L’application du tsDCS simultanément avec des enregistrements intracellulaires nous permet d’observer directement les changements des propriétés de la membrane du motoneuron et les caractéristiques de la cuisson rythmique en réponse à la polarisation du réseau neuronal de la colonne vertébrale, ce qui est crucial pour la compréhension des actions tsDCS. En outre, lorsque le protocole présenté inclut l’identification du motoneuron en ce qui concerne un muscle innervé et sa fonction (fléchisseur contre extenseur) ainsi que le type physiologique (rapide par rapport à lent), il fournit l’occasion d’étudier sélectivement l’influence de tsDCS sur les composants identifiés des circuits rachidiens, qui semblent être affectés différemment par la polarisation. La procédure présentée se concentre sur la préparation chirurgicale pour les enregistrements intracellulaires et la stimulation en mettant l’accent sur les étapes qui sont nécessaires pour atteindre la stabilité de préparation et la reproductibilité des résultats. Les détails de la méthodologie de l’application anodal ou cathodal tsDCS sont discutés tout en prêtant attention aux questions pratiques et de sécurité.
Introduction
La stimulation trans-spinale à courant direct (tsDCS) gagne en reconnaissance comme méthode puissante pour modifier l’excitabilité du circuit spinal dans la santé et la maladie1,2,3. Dans cette technique, un courant constant est passé entre une électrode active située au-dessus de segments de la colonne vertébrale sélectionnés, avec une électrode de référence située soit ventrally ou plus rostrally4. Plusieurs études ont déjà confirmé que tsDCS peut être utilisé dans la gestion de certaines conditions pathologiques, telles que la douleur neuropathique5, spasticité6, lésion de la moelle épinière7 ou pour faciliter la réadaptation8. Les chercheurs suggèrent que le tsDCS évoque des altérations de la distribution des ions entre l’espace intracellulaire et l’espace extracellulaire à travers la membrane cellulaire, ce qui peut faciliter ou inhiber l’activité neuronale en fonction de l’orientation actuelle9,10,11. Cependant, jusqu’à récemment, il manquait une confirmation directe de cette influence sur les motoneurons.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour mener l’enregistrement intracellulaire in vivo des potentiels électriques des motoneurones lombaires spinaux dans le rat anesthésié avec application simultanée de tsDCS, afin d’observer des changements dans la membrane de motoneuron et les propriétés de tir en réponse à la polarisation anodale ou cathodale du réseau neuronal spinal. Les enregistrements intracellulaires ouvrent plusieurs domaines d’investigation des propriétés des neurones, non disponibles pour les techniques extracellulaires précédemment utilisées9,12. Par exemple, il est possible de mesurer avec précision la réponse de la tension de la membrane motoneuron au flux de courant direct induit par tsDCS, d’indiquer le seuil de tension pour la génération de pointes ou d’analyser les paramètres potentiels d’action. En outre, cette technique nous permet de déterminer les propriétés de la membrane passive motoneuron, telles que la résistance aux entrées, et d’observer la relation entre le courant de stimulation intracellulaire et la fréquence de tir rythmique des motoneurons. L’identification antidromique du motoneuron enregistré, basée sur la stimulation des nerfs fonctionnellement identifiés (c.-à-d. les nerfs fournissant des efferents aux fléchisseurs ou aux extenseurs) nous permet d’identifier en outre les types d’unités motrices innervés (rapides ou lentes), ce qui donne l’occasion de tester si la polarisation influence différemment les éléments individuels du système neuronal rachidien mature. En raison d’une intervention chirurgicale étendue précédant l’enregistrement et des exigences élevées en matière de stabilité et de fiabilité des enregistrements, cette technique est très difficile, mais permet une évaluation directe et à long terme des caractéristiques électrophysiologiques d’un motoneuron : avant, pendant et après l’application de tsDCS, ce qui est crucial pour déterminer à la fois ses actions aiguës et ses effets persistants13. Comme un motoneuron active directement les fibres musculaires extrafusales14 et prend part au contrôle de rétroaction d’une contraction musculaire et a développé la force15,16 toute influence observée de tsDCS sur l’unité motrice ou les propriétés contractiles musculaires peuvent être liées à des modulations de l’excitation motoneuron ou des caractéristiques de tir.
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Protocol
Toutes les procédures liées à ce protocole ont été acceptées par les autorités compétentes (par exemple, comité local d’éthique) et respectent les règles nationales et internationales relatives au bien-être et à la gestion des animaux.
REMARQUE : Chaque participant à la procédure doit être correctement formé aux interventions chirurgicales de base et doit avoir une licence valide pour effectuer des expériences sur des animaux.
1. Anesthésie et prémédication
- Anesthéser un rat avec des injections intrapéritonéales de pentobarbital de sodium (une dose initiale de 60 mg·kg-1 pour les rats Wistar mâles de 6 mois pesant 400\u2012550g).
REMARQUE : Ce protocole ne se limite pas à la souche, au sexe ou à l’âge indiqués des rats. En outre, l’anesthésie alternative telle que le mélange kétamine-xylazine, alpha-chloralose ou fentanyl+midazolam+medetomidine peut être utilisée si elle convient mieux à différents objectifs de recherche ou si nécessaire par le comité d’éthique. - Après environ 5 min, vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant l’orteil du membre postérieur du rat avec des forceps émoussés. Procédez aux étapes suivantes du protocole uniquement lorsqu’aucune action réflexe n’est observée.
- Injecter 0,05 mL d’atropine sous-cutanéement afin de réduire la production de mucus après l’intubation.
- Injecter sous-cutanéement 5 mL de tampon de phosphate contenant 4% de solution de glucose, NaHCO3 (1 %) et la gélatine (14 %). Ce tampon sera absorbé par les vaisseaux cutanés tout au long d’une expérience et aidera à maintenir l’équilibre des fluides.
- Tout au long de la chirurgie, vérifiez périodiquement l’animal pour les actions réflexes et compléter l’anesthésie si nécessaire (10 mg·kg-1·h-1de pentobarbital de sodium).
2. Chirurgie
- Préparer l’animal pour un traitement chirurgical en rasant la fourrure sur la partie dorsale de l’arrière gauche, de la cheville à la hanche, le dos, de la queue aux segments thoraciques élevés, le côté gauche de la poitrine, et le côté ventral de la zone du cou au-dessus du sternum
- Placement de la ligne intraveineuse
- Placez le rat sur le dos sur un coussin chauffant en boucle fermée (et fixez-le avec des fixations des membres).
- À l’aide d’une lame de 21, faire une coupe longitudinale à travers la peau d’un sternum à un menton.
- Maintenez la peau avec des forceps et séparez-la du tissu sous-jacent.
- L’utilisation de techniques de dissection émoussée exposent la veine jugulaire droite. Disséquer soigneusement la veine des tissus environnants.
- Localiser la partie de la veine sans points de branchement, glisser deux ligatures 4-0 en dessous.
- Faire un nœud lâche à l’extrémité proximale du segment non ramifié précédemment identifié de la veine et un nœud lâche à l’extrémité distale de ce segment de la veine. Pincez la veine proximale au cœur, puis l’bride la partie distale de la veine.
- À l’aide de ciseaux d’iris, faire une incision entre la pince et la ligature lointaine. Tenez un rabat de la veine et introduisez un cathéter prérempli au point où il est bloqué par la pince.
- Tout en maintenant la veine et le cathéter avec des forceps, retirez la pince et poussez le cathéter plusieurs millimètres dans la veine. Fixer les deux extrémités du cathéter à la veine, et ajouter un point de fixation supplémentaire à la peau.
- Introduction du tube trachéal
- L’utilisation de forceps émoussés sépare les deux glandes mandibulaires couvrant les muscles sternohyoïdes. Séparer les muscles sternohyoïdes à la ligne médiane pour exposer la trachée.
- Glissez trois ligatures 4-0 sous la trachée, puis faites deux noeuds en dessous du point d’insertion du tube trachéal et un nœud au-dessus.
- Localiser le cartilage cricoide du larynx et faire une incision en dessous du troisième cartilage trachéal.
- Insérez un tube trachéal dans la trachée et fixez le tube en place avec des ligatures pré-préparées, puis ajoutez une ligature supplémentaire à la peau.
- Placez un petit morceau de coton au-dessus des muscles séparés, et suturez la peau sur la zone actionnée.
- Dissection des nerfs des membres postérieurs
- À l’aide de 21 lames, faire une coupe longitudinale sur le côté postérieur du membre postérieur gauche, du tendon d’Achille à la hanche.
- Prenez la peau avec des forceps, et en utilisant des techniques de dissection émoussée séparer la peau des muscles sous-jacents des deux côtés de l’incision.
- Localiser la fossa popliteal à l’arrière de l’articulation du genou, qui est couvert par le muscle biceps femoris, et à l’aide de ciseaux faire une coupure entre la partie antérieure et postérieure de ce muscle.
- Se déplaçant vers le haut couper deux têtes du biceps femoris tout le chemin à la hanche pour exposer le nerf sciatique. Cautériser au besoin pour prévenir les saignements.
- Identifier les branches périonales surales, tibiales et communes du nerf sciatique.
- À l’aide de ciseaux, séparer le latéral de la tête médiale du muscle gastrocnemius pour exposer le nerf tibial et ses branches.
- En utilisant 55 forceps saisir l’extrémité distale du nerf sural, le couper distally et disséquer autant que possible.
- Répétez la procédure avec le nerf péronéal commun.
- À l’aide d’une tige de verre émoussée séparer le nerf tibial des tissus environnants, en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux sanguins, et le couper distally.
- Identifier les nerfs médiaux gastrocnemius (MG) et gastrocnemius latéraux et soleus (LGS).
- En utilisant 55 forceps, disséquer soigneusement les nerfs MG et LGS, les déconnecter des tissus environnants, mais en maintenant leur connexion aux muscles respectifs.
- Placez un morceau de coton imbibé de solution saline sous les nerfs exposés.
- Fermez la peau sur la zone opérée.
- Laminectomie
- À l’aide de 21 lames, faire une incision longitudinale du sacrum jusqu’aux vertèbres thoraciques.
- Séparez la peau des muscles sous-jacents.
- Couper le muscle longissimus des deux côtés des processus spineux thoraciques et lombaires.
- À l’aide d’un scalpel à tranchant émoussé, les muscles de la colonne vertébrale se rétractent pour exposer les processus transversaux de chaque vertèbre.
- À l’aide de ciseaux à pointe émoussée, les tendons des muscles reliés aux processus transversaux le long de la colonne vertébrale exposée. Appliquer des agents hémostatiques si nécessaire.
- Identifiez la vertèbre Th13 comme le segment thoracique le plus bas avec l’insertion de côtes et en utilisant des rongeurs fins enlever les processus épineux et laminee de Th13 à L2 vertèbres pour exposer les segments lombaires de la moelle épinière. N’oubliez pas d’endommager le processus épineux L3 qui sera utilisé comme point de fixation pour la stabilisation de la colonne vertébrale.
- Retirez le processus épineux Th12 et lissez la surface dorsale de la vertèbre autant que possible.
- L’utilisation de techniques de dissection émoussée sépare les muscles de la vertèbre Th11 pour créer des points d’insertion de support.
- Placez la laine de coton fine imbibée de solutions salines sur les segments de la moelle épinière exposés.
- Déplacez le rat vers le cadre métallique fait sur mesure avec deux barres parallèles et deux bras réglables avec des pinces pour soutenir et stabiliser la colonne vertébrale.
3. Préparation à l’enregistrement et à la stimulation
- Fixation de colonne vertébrale et arrangement de nerf
- Placez le rat dans le cadre sur mesure sur un coussin chauffant, relié au système de chauffage en boucle fermée pour maintenir la température du corps animal à 37 ± 1°C.
- Insérez des électrodes ECG sous la peau et connectez-vous à un amplificateur pour la surveillance de la fréquence cardiaque.
- À l’aide des volets cutanés, former une piscine profonde sur la moelle épinière exposée.
- À l’aide de pinces métalliques, fixez la colonne vertébrale en plaçant les pinces en dessous des processus transversaux Th12 et au processus épineux L3.
- Assurez-vous que la colonne vertébrale est fixée et disposée horizontalement, puis appliquez une pression dorso-ventrale des deux côtés de la colonne pour rétracter les muscles.
- Remplissez la piscine d’huile minérale chaude (37 °C) et maintenez-la à cette température.
- Enfiler une ligature 4-0 à travers le tendon d’Achille, soulever et étirer le membre arrière gauche opéré de sorte que la cheville est nivelée avec la hanche.
- L’utilisation des volets de peau faire une piscine profonde sur les nerfs tibial, MG et LGS exposés.
- Remplir la piscine d’huile minérale chaude (37 °C).
- Placez les nerfs MG et LGS sur des électrodes bipolaires stimulantes de fil d’argent et connectez-les à un stimulateur d’impulsion carré. Utilisez des canaux de stimulation distincts pour chaque nerf.
- Placement de l’électrode de surface
- Placez une électrode de boule d’argent sur le côté caudal gauche de la moelle épinière exposée, avec une électrode de référence insérée dans les muscles du dos, et connectez les deux électrodes à l’amplificateur différentiel de DC. L’électrode de balle de surface sera utilisée pour enregistrer les volées afférentes des nerfs.
- À l’aide d’un stimulateur à courant constant, stimuler les nerfs MG et LGS avec des impulsions carrées de 0,1 ms de durée, répété à une fréquence de 3 Hz, et observer des volées afférentes.
- Déterminer le seuil (T) pour l’activation nerveuse, stimuler chaque nerf à environ 3· Intensité T, et amplitude record de volée afférente pour chaque nerf.
- Déplacez l’électrode de surface rostral et répétez la procédure pour identifier les segments rachidiens auxquels les amplitudes des volées sont les plus élevées pour chaque nerf. Après avoir déterminé l’emplacement maximal de la volée, déplacez l’électrode de surface à une distance sécuritaire de la moelle épinière.
- Paralysie musculaire et formation d’un pneumothorax afin de réduire les mouvements respiratoires
- Paralyser le rat par voie intraveineuse avec un bloqueur neuromusculaire et connecter le tube trachéal à un ventilateur externe en ligne avec un capnomètre compatible avec les rongeurs (bromure de Pancuronium, à une dose initiale de 0,4 mg·kg-1, complétée toutes les 30 min à des doses de 0,2 mg·kg-1)
- Surveiller la concentration de CO2 en fin de marée et la maintenir à environ 3\u20124 % en ajustant les paramètres de ventilation (fréquence, pression de l’air et volumes d’écoulement).
- Faire une incision longitudinale dans la peau entre la 5ème et la 6ème côte sur un côté de l’enregistrement.
- À l’aide de ciseaux à pointe émoussée, couper les muscles qui s’ensumentent pour visualiser l’espace intercostal entre les côtes.
- À l’aide de petits ciseaux pointus, faire une petite incision dans les muscles intercostaux et dans la pleura, puis insérer une pointe d’un bord émoussé forceps dans l’ouverture, en prenant soin de ne pas appuyer sur les poumons.
- Laissez les forceps se développer ou insérez un petit tube pour garder le pneumothorax ouvert tout au long de l’expérience.
- Après le bloc neuromusculaire, surveiller la profondeur de l’anesthésie en vérifiant la fréquence ECG, et compléter l’agent anesthésique si la fréquence cardiaque dépasse 400 bpm. Paralysie musculaire et formation d’un pneumothorax afin de réduire les mouvements respiratoires, ce qui améliorera la stabilité de l’enregistrement
- Ouverture de la dura et pia mater
- À l’aide de #55 forceps, soulevez doucement le dura mater et coupez-le de façon caudiale du segment L5, rostrally jusqu’au segment L4.
- En utilisant une paire de forceps 5SF ultra-mince faire un petit patch dans la pia couvrant la colonne dorsale, entre les vaisseaux sanguins, exactement au niveau de la volée maximale afférente de la MG ou le nerf LGS.
- Utilisez de petits morceaux de mousse de gel saline et séchée pour bloquer les saignements si nécessaire.
- placement d’électrodes tsDCS
- Faire une petite incision dans la peau sur le côté ventral d’un abdomen de rat au niveau rostro-caudal correspondant à l’emplacement des segments de la colonne vertébrale L4-L5.
- Prenez le rabat de la peau exposée avec un clip en métal qui servira d’électrode de référence.
- Déposer une éponge imbibée de solution saline sur le côté dorsal de la vertèbre Th12. Assurez-vous que la taille de l’éponge est égale à celle d’une électrode tsDCS active (plaque en acier inoxydable en forme de cercle de 5 mm de diamètre).
- À l’aide d’un manipulateur fin, appuyez sur l’éponge à l’aide d’une électrode tsDCS active jusqu’à l’os et assurez-vous que toute la surface de l’électrode est pressée de façon égale.
- Connectez les électrodes tsDCS de référence et actives à une unité de stimulateur à courant constant, capable de fournir un flux continu de courant direct.
- Préparation de micropipettes
- À l’aide d’un puller microélectrodes, préparez un microélectrode.
REMARQUE : Les électrodes de filament et de non-filament peuvent être employées, cependant, rappelez-vous que la tige de l’électrode doit être assez longue pour atteindre la corne ventrale tout en étant assez mince pour ne pas comprimer la moelle épinière pendant la descente.- Ajuster le réglage du puller de sorte que la tige entrant dans la moelle épinière soit d’environ 3 mm de long, tandis que la pointe de l’électrode n’est pas supérieure à 1\u20122 μm de diamètre et que la résistance aux microélectrodes se situe entre 10 et 20 MΩ.
- Remplissez les microélectrodes d’électrolyte de potassium-citrate de 2M.
- Monter le microélectrodes préparé sur le micromanipulateur permettant 1\u20122 μm mouvement de marche et étalonnage stéréotaxique.
- Connectez la microélectrode à l’amplificateur intracellulaire avec l’électrode de référence placée dans les muscles du dos.
- À l’aide d’un puller microélectrodes, préparez un microélectrode.
- Après le bloc neuromusculaire, surveiller la profondeur de l’anesthésie en vérifiant la fréquence ECG, et compléter l’agent anesthésique de sorte que la fréquence cardiaque du rat ne dépasse pas 400 bpm.
4. Suivi et pénétration du motoneuron
- Remettre l’électrode d’enregistrement de la volée afférente sur la surface dorsale de la moelle épinière, au niveau du segment L6.
- Stimuler les nerfs MG et LGS avec des impulsions électriques de 0,1 ms à une fréquence de 3 Hz, et l’intensité 3T, pour activer tous les axones d’alpha-motoneurones dans un nerf sélectionné.
- Conduisez la micropipette dans un patch sélectionné dans la pia avec un angle médio-latéral de 15\u201220° (avec une pointe dirigée latéralement).
- Après la descente sous la surface, calibrer la microélectrode et compenser sa capacité et le décalage de tension, et continuer la pénétration de la moelle épinière lorsque tous les paramètres sont stables. Un potentiel de champ antidromique de la piscine de motoneuron sera visible à la trace de tension microélectrode tout en approchant d’un noyau moteur dédié pendant la stimulation du nerf respectif.
- Procéder à la pénétration avec le microélectrode à 1\u20122 μm étapes, et utiliser périodiquement la fonction de bourdonnement de l’amplificateur intracellulaire pour effacer la pointe de l’électrode de tout résidu.
- Observez la pénétration du motoneuron qui sera caractérisée par une hyperpolarisation soudaine de la trace de tension enregistrée et l’apparition d’un potentiel de pointe antidromique.
5. Enregistrement de la membrane motoneuron et des propriétés de cuisson
- Dans un mode de pont de l’amplificateur intracellulaire, identifier le motoneuron sur la base de l’aspect « out ou rie » du potentiel d’action antidromique en stimulant les branches nerveuses respectives. Enregistrez 20 traces ultérieures pour une moyenne ultérieure.
- Mettre en œuvre un critère d’inclusion strict pour garantir des données de haute qualité : potentiel de membrane de repos d’au moins -50 mV en amplitude; amplitudes potentielles d’action supérieures à 50 mV, avec un dépassement positif; potentiel de membrane stable pendant au moins 5 min avant l’enregistrement.
- Dans un mode de pince de courant discontinu (mode de vitesse de commutation actuel 4–8 kHz) de l’amplificateur intracellulaire, évoquent un potentiel d’action orthodromique dans un motoneuron utilisant des impulsions de courant intracellulaire dépolarisantes de 0,5 ms. Répétez au moins 20 fois la moyenne hors connexion.
- Stimuler un motoneuron avec 40 impulsions courtes (100 ms) de courant hyperpolarisant (1 nA) afin de calculer la résistance à l’entrée cellulaire.
- Stimuler un motoneuron avec des impulsions d’onde carrée de 50 ms à des amplitudes croissantes pour déterminer la valeur rhéobase comme l’amplitude minimale du courant de dépolarisation nécessaire pour obtenir un seul pic.
- Injectez 500 ms d’impulsions à ondes carrées de courant dépolarisant, à des amplitudes croissantes en étapes de 0,1–2 nA pour évoquer les décharges rythmiques de motoneurons.
6. Stimulation trans-spinale à courant direct (TsDCS)
- Tout en maintenant une pénétration stable du motoneuron, commencer la procédure de polarisation par l’application trans-spinale du courant direct. Ajuster l’intensité actuelle et le temps d’application à la conception de l’expérience (p. ex., 0,1 mA pendant 15 min).
- Immédiatement après avoir allumé le DC, observez le potentiel de la membrane motoneuron. La polarisation anodale (l’électrode active comme anode) devrait entraîner une dépolarisation du potentiel membranaire, tandis que la polarisation cathodale (l’électrode active comme cathode) devrait évoquer un effet inverse. Observez si un changement dans le potentiel de membrane de repos en réponse à la stimulation de courant continu est constant, ce qui garantit que l’intensité du champ électrique n’est pas affectée.
- Pendant l’application en cours continue, répétez les étapes 5.3\u20125.6 en intervalles de 5 min.
- Désactivez le contrôleur de domaine et continuez à répéter les étapes 5.3\u20125.6 en intervalles de 5 min jusqu’à ce que les enregistrements deviennent instables ou que les critères d’inclusion soient compromis.
- Mettre fin à l’expérience et euthanasier l’animal en utilisant l’administration intraveineuse d’une dose mortelle de sodium pentobarbital (180 mg·kg-1).
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Representative Results
Les paramètres des potentiels d’action et plusieurs propriétés membranaires peuvent être calculés sur la base d’enregistrements intracellulaires lorsque des conditions stables de pénétration cellulaire sont assurées. La figure 1A présente un potentiel d’action orthodrémique typique évoqué par la stimulation intracellulaire, qui répond à tous les critères d’inclusion des données (le potentiel de membrane de repos d’au moins -50 mV, et l’amplitude des pointes supérieure à 50 mV, avec un dépassement positif). Les paramètres potentiels d’action, tels que l’amplitude des pointes, l’amplitude de l’après-hyperpolarisation ou le temps de semi-décomposition après l’hyperpolarisation (AHP-HDT) peuvent être mesurés. Une valeur de ce dernier paramètre dans les motoneurons de rat sert de critère fiable pour distinguer entre les motoneurones rapides et lents (AHP-HDT > 20 ms pour lent, tandis que AHP-HDT <20 ms pour les motoneurones rapides)17. La figure 1B montre une réponse cellulaire à une impulsion de courant hyperpolarisante de 1nA de 100 ms, à partir de laquelle la résistance aux entrées de pointe et de plateau (IR) d’un motoneuron peut être déterminée à partir de la déviation de la tension. La figure 1C montre une trace de tension étendue d’un pic rhénobasique avec un seuil de tension clairement marqué du pic, indiquant le niveau de dépolarisation de la membrane à laquelle les canaux de sodium à tension sont activés pour initier le potentiel d’action. Tous ces enregistrements peuvent être répétés plusieurs fois pendant et après l’application tsDCS, ce qui nous permet de comparer les paramètres respectifs tant que le potentiel de membrane de repos est stable et que d’autres critères de stimulation et de protocole d’enregistrement sont remplis.
Plusieurs études ont indirectement montré que tsDCS modifie l’excitabilité du motoneuron et le modèle de cuisson9,18. La figure 2 montre des exemples de traces de tension intracellulaire provenant de deux motoneurones stimulés intracellulairement avec des impulsions carrées de 500 ms de courant de dépolarisation avant, pendant et après l’application tsDCS. Dans des conditions stables, des enregistrements répétés plusieurs minutes l’un après l’autre peuvent être effectués, et les modèles de tir de motoneuron peuvent être comparés de manière fiable. Anodal (+) tsDCS s’est avéré agir vers une augmentation de l’excitabilité du motoneuron et des fréquences plus élevées de tir rythmique (Figure 2A), tandis que cathodal (-) tsDCS a agi vers l’inhibition du tir (Figure 2B). De plus, les effets des deux types de tsDCS ont survécu à la période de polarisation. Il convient également de noter que les changements observés dans l’excitabilité et le modèle de cuisson ne sont pas simplement le résultat de la dépolarisation de la membrane cellulaire ou de l’hyperpolarisation par anodal ou cathodal tsDCS, respectivement, mais montrent des altérations profondes non liées au changement d’un potentiel membranaire, car ils ont persisté malgré le fait que ce paramètre est revenu à une ligne de base après la fin de la polarisation.
Enfin, il convient de souligner que toute déviation par rapport au protocole présenté entraînera probablement un échec de l’expérience, en raison d’une détérioration de la préparation et/ou d’un déclin profond de la fiabilité des données. La figure 3 montre des exemples d’enregistrements lorsque les critères d’inclusion des données ont été compromis soit en raison d’une pénétration des cellules imparfaites (figure 3A),d’une négligence pour compenser la résistance et la capacité des microélectrodes (figure 3B)ou d’une instabilité de la moelle épinière (figure 3C). Il est important que les chercheurs identifient ces enregistrements non optimaux et mettent en œuvre des mesures correctives appropriées ou ne tiennent pas compte de ces résultats de l’ensemble de données.
Figure 1 : Paramètres des potentiels d’action et des propriétés de la membrane.
(A) Un potentiel d’action orthodromique obtenu par stimulation intracellulaire, avec des paramètres de base indiqués qui peuvent être calculés à partir de cet enregistrement. Ampl AP = amplitude potentielle d’action; AHP ampl = amplitude après l’hyperpolarisation; AHP-HDT = temps de demi-décomposition après l’hyperpolarisation. (B) La trace de tension d’une réponse membranaire à une courte (100 ms) délépolarisant l’impulsion de courant de 1nA intensité, ce qui nous permet de calculer la résistance aux entrées (IR). Remarquez le pic d’une déviation potentielle (pic IR) suivie d’une petite diminution et de la phase de plateau suivante du potentiel membranaire (plateau IR). (C) La trace de tension élargie d’un pic rhénobasique avec une ligne horizontale pointillée indiquant le seuil de tension de pointe. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Effets de polarisation sur le tir de motoneuron.
(A) Les enregistrements intracellulaires d’un motoneuron stimulés intracellulairement avec 7,5 nA pour 500 ms, réalisés avant (à gauche), pendant l’anodal tsDCS (0,1 mA, milieu) et 10 min après la fin de la polarisation (à droite). Notez l’augmentation progressive de l’excitabilité du motoneuron à la même intensité de stimulus. (B) Enregistrements intracellulaires d’un autre motoneuron stimulé intracellulairement avec 6 nA pour 500 ms, réalisés avant (à gauche), pendant le tsDCS cathodal (0,1 mA, milieu), et 10 min après la fin de la polarisation (à droite). Notez une inhibition progressive de la fréquence de tir de motoneuron à la même intensité de stimulus. Ci-dessous les enregistrements, des traces de courant de stimulation intracellulaire sont fournies. Les barres d’étalonnage en bas à droite s’appliquent à tous les enregistrements intracellulaires présentés. Les valeurs du potentiel de membrane de repos sont fournies à gauche de chaque enregistrement. Les fréquences de tir à l’état stable, calculées à partir des moyens des trois derniers intervalles interspike, sont données au-dessus des enregistrements. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Exemples d’enregistrements sous-optimaux en raison de déviations par rapport au protocole expérimental.
(A) Le pic antidromique enregistré à partir d’un motoneuron insuffisamment pénétré. Le potentiel de membrane de repos est insuffisant (-45 mV), et malgré une forme appropriée de la pointe avec toutes les phases consécutives de dépolarisation, de repolarisation et d’hyperpolarisation, son amplitude est trop faible (41 mV) et sans dépassement. (B) Un pic rhéobasique généré à un seuil de tension irréaliste (membrane dépolarisée à +68 mV). Ce type d’erreur est généralement due à un microélectrode bloqué, avec une résistance et une capacité non compensées. On peut également voir que ce disque est fortement contaminé par le bruit électrique de 50 Hz. (C) Un tir rythmique motoneuron en réponse à 500 ms depolarisation du courant, avec de grandes fluctuations d’un potentiel membranaire, principalement causée par la pénétration instable microélectrode, peut-être en raison de mouvements respiratoires excessifs. Pour tous les cas présentés, la membrane calculée ou les propriétés de cuisson ne seraient pas fiables. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
S’il est exécuté correctement, la partie chirurgicale du protocole décrit doit être complétée dans un délai d’environ trois heures. Il faut prendre un soin particulier dans le maintien des conditions physiologiques stables d’un animal pendant la chirurgie, en particulier la température corporelle et la profondeur de l’anesthésie. Outre les considérations éthiques évidentes, un manque d’anesthésie appropriée peut entraîner des mouvements excessifs des membres pendant la dissection nerveuse ou laminectomie et conduire à des dommages à la préparation ou une interruption prématurée de l’expérience. En paralysant un animal avant de pénétrer la moelle épinière avec une microélectrode, il est crucial de surveiller la profondeur de l’anesthésie et de la fréquence cardiaque et d’appliquer des paramètres de ventilation appropriés basés sur le poids animal et la capacité pulmonaire. Toute déviation par rapport aux paramètres physiologiques souhaités doit être modifiée immédiatement pour assurer le succès de la procédure. Après la chirurgie, des conditions d’enregistrement stables devraient être possibles pour maintenir pendant au moins quatre heures.
Après la pénétration d’un motoneuron, la stabilité d’enregistrement est de grande importance. Il est impératif qu’un potentiel membranal reste constant pendant les enregistrements témoins, car toutes les fluctuations influenceront de manière significative le courant rhéobase et un seuil de tir rythmique. La fixation appropriée de la colonne vertébrale devrait fournir la stabilité de base, tandis que le but d’un pneumothorax est de diminuer les mouvements de moelle épinière évoqués par la respiration. En outre, il faut s’assurer que les contractions musculaires sont entièrement abolies avant de tenter la pénétration et le bloqueur neuromusculaire est administré à intervalles réguliers.
Après une identification antidromique réussie de pénétration du motoneuron enregistré peut être exécutée par stimulation d’une branche nerveuse respective. Il s’agit d’un véritable avantage d’une préparation in vivo, dans laquelle les axones motoneuron sont maintenus en continuité avec les muscles innervés en référence aux enregistrements intracellulaires in vitro effectués sur des tranches spinales, qui seulement récemment ont été possibles chez les animaux adultes16, mais ne permettent pas l’identification de motoneuron enregistré. Cependant, il est important que les chercheurs aient une compréhension claire de la différence entre l’activation antidromique et orthodromique du motoneuron19 pour éviter une mauvaise interprétation des données. Il est important de maintenir la stimulation nerveuse périphérique aussi faible que possible (moins de 0,5 V) pour empêcher l’activation des nerfs supplémentaires dus à la propagation du courant et de prêter attention à une latence constante et courte du pic antidromique19.
Un autre avantage de la technique présentée est que les motoneurones peuvent être classés en outre comme types rapides ou lents sur la base de leurs paramètres potentiels d’action, à savoir la durée AHP-HDT17. La différenciation entre les motoneurones innervant les fibres musculaires de type rapide et le type lent est cruciale en ce qui concerne leur contribution différente à la performance musculaire pendant les mouvements. En outre, les motoneurons rapides et lents peuvent réagir différemment à la polarisation9.
Pour assurer des résultats fiables de polarisation, il faut faire attention à la définition des paramètres appropriés de tsDCS. L’intensité actuelle devrait, d’une part, fournir une densité de champ souhaitée à la zone sélectionnée pour évoquer des effets sur les réseaux neuronaux, tandis que d’autre part devrait être dans les limites de sécurité pour les dommages tissulaires20. La taille des électrodes actives et de référence et leur placement en ce qui concerne un site d’enregistrement sont également des éléments importants à considérer4, et le temps d’application de durée tsDCS devrait être suffisant pour évoquer les effets souhaités16,17,22. Dans ce document de méthodes, les résultats représentatifs ont été obtenus par application de 100 μA cathodal ou polarisation anodale pendant 15 min. Compte tenu de la forme et du diamètre des électrodes, l’intensité du champ électrique respective directement sous l’électrode était de 39,25 μA·mm2. Cependant, il faut comprendre que la valeur précise du champ électrique sur le site de motoneuron enregistré est impossible à pré-déterminer que l’emplacement motoneuron en ce qui concerne l’électrode de polarisation varie, et la densité du champ électronique diminue de manière significative avec une profondeur accrue et une diminution de la taille des électrodes4,24. En outre, l’orientation des compartiments motoneuron par rapport au champ électrique appliqué est importante pour la génération de potentiels d’action22,25,26, et cela ne peut pas être prédit pour les cellules individuelles. En outre, il est très important de comprendre que les effets tsDCS ne se limitent pas à une période de polarisation, et que les effets persistants et durables sont bien documentés22,27. Par conséquent, après même une seule et brève séance de polarisation, tous les enregistrements successifs dans la même préparation seraient exécutés dans des conditions post-polarisation, ce qui limite le nombre d’enregistrements de polarisation aiguë possibles à un par animal.
D’autres modifications de la procédure présentée peuvent être apportées pour répondre à des questions de recherche spécifiques. Ce protocole avec des modifications minimales peut être utilisé comme une norme pour plusieurs conceptions expérimentales, par exemple, lors de l’essai de différentes durées et/ou amplitudes de tsDCS appliqués ou lors de la comparaison des effets à court ou à long terme de tsDCS dans divers bassins motoneurons. L’utilisation de plusieurs modèles de maladies génétiques (par exemple le modèle de rat SOD1 G93A de la sclérose latérale amyotrophique) ou de différents nerfs pour l’activation des nerfs antidromiques (pérional, tibial, saphénous, etc.) est acceptable. Toutefois, il faut également être conscient des limitations de la procédure. Par exemple, l’utilisation de barbituriques pour l’anesthésie inhibe l’activité des courants intérieurs persistants28, tandis que l’introduction systémique de bloqueurs spécifiques couramment utilisés dans les préparations in vitro (par exemple, la strychnine pour bloquer les récepteurs nicotiniques) peut s’avérer fatale pour l’animal. Il est conseillé aux chercheurs de tenir compte de ces limitations avant de choisir le protocole expérimental approprié.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas de conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par la subvention du National Science Center no 2017/25/B/NZ7/00373. Les auteurs souhaitent reconnaître le travail de Hanna Drzymała-Celichowska et Włodzimierz Mrówczyński, qui ont tous deux contribué à la collecte et à l’analyse des données des résultats présentés dans cet article.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
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