Summary
Este protocolo descreve a gravação intracelular in vivo de motoneurons lombares de rato com estimulação simultânea de corrente trans-espinhal. O método permite medir as propriedades da membrana e registrar disparos rítmicos de motoneurons antes, durante e depois da polarização anodal ou catódal da medula espinhal.
Abstract
O registro intracelular de motoneurons espinhais in vivo fornece um "padrão-ouro" para determinar as características eletrofisiológicas das células na rede espinhal intacta e contém vantagens significativas em relação às técnicas clássicas de gravação in vitro ou extracelular. Uma vantagem das gravações intracelulares in vivo é que esse método pode ser realizado em animais adultos com um sistema nervoso totalmente maduro, e, portanto, muitos mecanismos fisiológicos observados podem ser traduzidos para aplicações práticas. Neste artigo metodológico, descrevemos esse procedimento combinado com a estimulação de corrente constante aplicada externamente, que imita processos de polarização ocorridos dentro das redes neuronais espinhais. A estimulação de corrente direta trans-espinhal (TSDCS) é um método inovador cada vez mais utilizado como intervenção neuromodulatória na reabilitação após várias lesões neurológicas, bem como em esportes. A influência do TSDCS no sistema nervoso permanece mal compreendida e os mecanismos fisiológicos por trás de suas ações são amplamente desconhecidos. A aplicação do tsDCS simultaneamente com gravações intracelulares permite observar diretamente as alterações das propriedades da membrana motoneuron e características do disparo rítmico em resposta à polarização da rede neuronal espinhal, o que é crucial para a compreensão das ações do TSDCS. Além disso, quando o protocolo apresentado inclui a identificação do motoneuron no que diz respeito a um músculo inervado e sua função (flexor versus extensor), bem como o tipo fisiológico (rápido versus lento) proporciona uma oportunidade de investigar seletivamente a influência do TSDCS em componentes identificados de circuitos espinhais, que parecem ser diferentemente afetados pela polarização. O procedimento apresentado foca na preparação cirúrgica para gravações intracelulares e estimulação com ênfase nas etapas necessárias para alcançar a estabilidade da preparação e a reprodutibilidade dos resultados. Os detalhes da metodologia da aplicação anodal ou cathodal tsDCS são discutidos enquanto prestam atenção às questões práticas e de segurança.
Introduction
A estimulação da corrente direta trans-espinhal (tsDCS) está ganhando reconhecimento como um método potente para modificar a excitabilidade do circuito espinhal na saúde e na doença1,,2,3. Nesta técnica, é passada uma corrente constante entre um eletrodo ativo localizado acima dos segmentos espinhais selecionados, com um eletrodo de referência localizado ventrally ou mais rostrally4. Vários estudos já confirmaram que o TSDCS pode ser usado no gerenciamento de certas condições patológicas, como dor neuropática5, espasticidade6,lesão medular7 ou para facilitar a reabilitação8. Os pesquisadores sugerem que o TSDCS evoca alterações na distribuição de íons entre o espaço intracelular e o espaço extracelular através da membrana celular, e isso pode facilitar ou inibir a atividade neuronal dependendo da orientação atual9,,10,,11. No entanto, até recentemente, faltava uma confirmação direta dessa influência sobre os motoneurons.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para realizar o registro intracelular in vivo de potenciais elétricos de motoneurons lombares no rato anesthetizado com aplicação simultânea de TSDCS, a fim de observar alterações na membrana motoneuron e propriedades de disparo em resposta à polarização anodal ou catódal da rede neuronal espinhal. Gravações intracelulares abrem diversas áreas de investigação de propriedades de neurônios, indisponíveis para técnicas extracelulares previamente utilizadas9,12. Por exemplo, é possível medir com precisão a resposta de tensão da membrana do motoneuron ao fluxo de corrente direta induzido pelo TSDCS, indicar limiar de tensão para geração de picos ou analisar parâmetros potenciais de ação. Além disso, essa técnica nos permite determinar as propriedades da membrana passiva do motoneuron, como a resistência à entrada, e observar a relação entre a corrente de estimulação intracelular e a frequência de disparo rítmico de motoneurons. A identificação antidrómica do motoneuron registrado, com base na estimulação de nervos identificados funcionalmente (ou seja, nervos que fornecem eferentes a flexores ou extensores) permite identificar adicionalmente tipos de unidades motoras inervadas (rápida versus lenta), o que dá a oportunidade de testar se a polarização influencia de forma diferente elementos individuais do sistema neuronal espinhal maduro. Devido à extensa cirurgia que precede o registro e aos altos requisitos de estabilidade e confiabilidade das gravações, essa técnica é altamente desafiadora, mas permite a avaliação direta e a longo prazo das características eletrofisiológicas de um motoneuron: antes, durante e depois da aplicação do TSDCS, que é crucial para determinar tanto suas ações agudas quanto os efeitos persistentes13. Como um motoneuron ativa diretamente as fibras musculares extrafusais14 e participa do controle de feedback de uma contração muscular e desenvolveu força15,16 qualquer influência observada de tsDCS na unidade motora ou propriedades contratuais musculares pode estar ligada a modulações de excitabilidade do motoneuron ou características de disparo.
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Protocol
Todos os procedimentos ligados a este protocolo foram aceitos pelas autoridades competentes (por exemplo, Comitê de Ética Local) e seguem as regras nacionais e internacionais sobre bem-estar e gestão animal.
NOTA: Cada participante envolvido no procedimento deve ser devidamente treinado em procedimentos cirúrgicos básicos e tem que ter uma licença válida para a realização de experimentos em animais.
1. Anestesia e premeditação
- Anestesiar um rato com injeções intraperitoneais de pentobarbital de sódio (uma dose inicial de 60 mg·kg-1 para ratos Wistar machos de 6 meses de idade pesando 400\u2012550g).
NOTA: Este protocolo não se limita à tensão indicada, sexo ou idade dos ratos. Além disso, anestesia alternativa como mistura cetamina-xilazina, alfa-clorona ou fentanil+midazolam+medetomidina pode ser usada se mais adequada para diferentes objetivos de pesquisa ou quando exigida pelo comitê de ética. - Após aproximadamente 5 minutos, verifique a profundidade da anestesia beliscando o dedo do membro traseiro do rato com fórceps contundentes. Proceda com os próximos passos do protocolo somente quando nenhuma ação reflexa for observada.
- Injete 0,05 mL de atropina subcutânea para reduzir a produção de muco após a intubação.
- Injete subcutâneamente 5 mL de tampão fosfato contendo 4% de solução de glicose, NaHCO3 (1 %) e gelatina (14%). Este buffer será absorvido pelos vasos cutâneos durante um experimento e ajudará a manter o equilíbrio dos fluidos.
- Durante toda a cirurgia, verifique periodicamente o animal quanto às ações reflexas e suplementa se necessário (10 mg·kg-1·h-1de pentobarbital de sódio).
2. Cirurgia
- Prepare o animal para tratamento cirúrgico, raspando pele sobre a parte dorsal da linha traseira esquerda, do tornozelo ao quadril, da parte traseira, da cauda aos segmentos torácticos elevados, do lado esquerdo do peito e do lado ventral da área do pescoço acima do esterno
- Colocação da linha intravenosa
- Coloque o rato de costas em uma almofada de aquecimento de laço fechado (e fixe-o com fixações de membros).
- Usando uma lâmina 21, faça um corte longitudinal através da pele de um esterno para um queixo.
- Segure a pele com fórceps e separe-a do tecido subjacente.
- O uso de técnicas de dissecção contundente expõe a veia jugular direita. Dissecar cuidadosamente a veia dos tecidos circundantes.
- Localize a parte da veia sem pontos de ramificação, deslize duas ligaduras 4-0 abaixo dela.
- Faça um nó solto na extremidade proximal do segmento não ramificado anteriormente identificado da veia e um nó solto na extremidade distal deste segmento da veia. Fixar a veia proximal ao coração, e então ligar a parte distal da veia.
- Usando uma tesoura de íris, faça uma incisão entre o grampo e a ligadura distante. Segure uma aba da veia e introduza um cateter pré-preenchido ao ponto em que é bloqueado pelo grampo.
- Enquanto segura a veia e o cateter junto com fórceps, remova o grampo e empurre o cateter vários milímetros para dentro da veia. Fixar as duas extremidades do cateter na veia e adicionar um ponto de fixação adicional à pele.
- Introdução do tubo traqueal
- O uso de fórceps contundentes separa as duas glândulas mandibulares que cobrem os músculos esternohióides. Separe os músculos esternonióides na linha média para expor a traqueia.
- Deslize três ligaduras 4-0 abaixo da traqueia, em seguida, faça dois nós abaixo do ponto de inserção do tubo traqueal e um nó acima.
- Localize a cartilagem cricoide da laringe e faça uma incisão abaixo da terceira cartilagem traqueal.
- Insira um tubo traqueal pela traqueia e fixe o tubo no lugar com ligaduras pré-preparadas e adicione uma ligadura adicional à pele.
- Coloque um pequeno pedaço de lã de algodão acima dos músculos separados, e sutura a pele sobre a área operada.
- Dissecção dos nervos do membro traseiro
- Usando 21 lâminas, faça um corte longitudinal no lado posterior do membro traseiro esquerdo, do tendão de Aquiles até o quadril.
- Pegue a pele com fórceps, e usando técnicas de dissecção sem cortes separam a pele dos músculos subjacentes em ambos os lados da incisão.
- Localize a fossa popliteal na parte de trás da articulação do joelho, que é coberta pelo músculo bíceps femoral, e usando uma tesoura faça um corte entre a parte anterior e posterior deste músculo.
- Movendo-se para cima cortou duas cabeças do bíceps femoral todo o caminho até o quadril para expor o nervo ciático. Cauterize conforme necessário para evitar sangramento.
- Identifique os ramos surais, tibiais e peroneais comuns do nervo ciático.
- Usando uma tesoura, separe a lateral da cabeça medial do músculo gastrocnemius para expor o nervo tibial e seus ramos.
- Usando 55 fórceps pegue a extremidade distal do nervo sural, corte-a distally e disseca o mais longe possível.
- Repita o procedimento com o nervo peroneal comum.
- Usando uma haste de vidro sem corte, separe o nervo tibial dos tecidos circundantes, tomando cuidado para não danificar os vasos sanguíneos, e cortá-lo distally.
- Identifique os nervos gastrocnemius medial (MG) e os nervos gastrocnemius lateral e soleus (LGS).
- Utilizando 55 fórceps, disseco cuidadosamente os nervos MG e LGS, desconectando-os dos tecidos circundantes, mas mantendo sua conexão com os respectivos músculos.
- Coloque um pedaço de algodão encharcado de soro sob os nervos expostos.
- Feche a pele sobre a área operada.
- Laminectomia
- Usando 21 lâminas faça uma incisão longitudinal do sacro até as vértebras torácicas.
- Separe a pele dos músculos subjacentes.
- Corte o músculo longissimus em ambos os lados dos processos torácicos e lombares.
- O uso de bisturi de bordas cegas retrai os músculos da coluna vertebral para expor os processos transversais de cada vértebra.
- O uso de uma tesoura de ponta sem corte cortou os tendões dos músculos ligados aos processos transversais ao longo da coluna vertebral exposta. Aplique agentes hemostáticos, se necessário.
- Identifique a vértebra Th13 como o segmento torácico mais baixo com inserção da costela e usando rongeurs finos removem processos espinhosos e laminas de vértebras Th13 a L2 para expor segmentos lombares da medula espinhal. Lembre-se de não danificar o processo spinous L3 que será usado como ponto de fixação para estabilização da coluna vertebral.
- Remova o processo espinhoso th12 e suavize a superfície dorsal da vértebra o máximo possível.
- O uso de técnicas de dissecção contundente separa os músculos da vértebra Th11 para criar pontos de inserção do suporte.
- Coloque lã de algodão salina fina sobre os segmentos da medula espinhal exposta.
- Mova o rato para a estrutura metálica feita sob medida com duas barras paralelas e dois braços ajustáveis com grampos para apoiar e estabilizar a coluna vertebral.
3. Preparação para a gravação e estimulação
- Fixação da coluna vertebral e arranjo nervoso
- Coloque o rato na estrutura personalizada em uma almofada de aquecimento, conectada ao sistema de aquecimento de laço fechado para manter a temperatura do corpo animal a 37 ± 1°C.
- Insira eletrodos ECG sob a pele e conecte-se a um amplificador para monitoramento da frequência cardíaca.
- Usando os retalhos da pele, forme uma piscina profunda sobre a medula espinhal exposta.
- Utilizando grampos metálicos, fixar a coluna vertebral colocando grampos abaixo de processos transversais th12 e em processo spinous L3.
- Certifique-se de que a coluna vertebral está fixa e organizada horizontalmente e, em seguida, aplique pressão dorso-ventral em ambos os lados da coluna para retrair os músculos.
- Encha a piscina com óleo mineral quente (37 °C) e mantenha-a nesta temperatura.
- Enfie uma ligadura de 4-0 através do tendão de Aquiles, levante e estique o membro traseiro esquerdo operado para que o tornozelo seja nivelado com o quadril.
- Usando os retalhos da pele fazem uma piscina profunda sobre os nervos tibial expostos, MG e LGS.
- Encha a piscina com óleo mineral quente (37 °C).
- Coloque os nervos MG e LGS em eletrodos estimulantes de fio prateado bipolar e conecte-os a um estimulador de pulso quadrado. Use canais de estimulação separados para cada nervo.
- Colocação de eletrodos de superfície
- Coloque um eletrodo de bola de prata no lado esquerdo caudal da medula espinhal exposta, com um eletrodo de referência inserido nos músculos das costas, e conecte ambos os eletrodos ao amplificador DC diferencial. O eletrodo de bola de superfície será usado para gravar voleios diferentes dos nervos.
- Utilizando um estimulador de corrente constante, estimule os nervos MG e LGS com pulsos quadrados de duração de 0,1 ms, repetidos em uma frequência de 3 Hz, e observe voleios diferentes.
- Determine o limiar (T) para ativação nervosa, estimule cada nervo a aproximadamente 3· Intensidade T, e amplitude recorde de voleio diferente para cada nervo.
- Mova o rostral de eletrodo superficial e repita o procedimento para identificar segmentos espinhais em que amplitudes das voleios são as mais altas para cada nervo. Depois de determinar a localização máxima do voleio, mova o eletrodo da superfície para uma distância segura da medula espinhal.
- Paralisia muscular e formação de pneumotórax para reduzir os movimentos respiratórios
- Paralise o rato por via intravenosa com um bloqueador neuromuscular e conecte o tubo traqueal a um ventilador externo em linha com um capnômetro compatível com roedores (brometo de pancurônio, em uma dose inicial de 0,4 mg·kg-1, suplementado a cada 30 minutos em doses de 0,2 mg·kg-1)
- Monitore a concentração de CO2 de maré final e mantenha-a em cerca de 3\u20124% ajustando parâmetros de ventilação (frequência, pressão de ar e volumes de fluxo).
- Faça uma incisão longitudinal na pele entre a 5ª e a 6ª costela em um lado da gravação.
- Usando uma tesoura de ponta sem corte, corte os músculos sobreladais para visualizar o espaço intercostal entre as costelas.
- Usando uma pequena tesoura afiada, faça uma pequena incisão nos músculos intercostais e na pleura, em seguida, insira uma ponta de uma borda cega fórceps na abertura, tomando cuidado para não pressionar os pulmões.
- Permita que as fórceps se expandam ou insira um pequeno tubo para manter o pneumotórax aberto durante todo o experimento.
- Após o bloqueio neuromuscular, monitore a profundidade da anestesia verificando a frequência do ECG e complemente o agente anestésico se a frequência cardíaca exceder 400 bpm. Paralisia muscular e formação de pneumotórax para reduzir os movimentos respiratórios, o que melhorará a estabilidade do registro
- Abrindo o dura e pia mater
- Usando #55 fórceps, levante suavemente a dura mater, e corte-a caudally do segmento L5, rostrally até o segmento L4.
- Usando um par de fórceps 5SF ultrafinos fazem um pequeno patch na pia cobrindo a coluna dorsal, entre os vasos sanguíneos, exatamente ao nível do voleio máximo diferente do MG ou do nervo LGS.
- Use pequenos pedaços de espuma de gel salino e seca para bloquear o sangramento, se necessário.
- colocação de eletrodos tsDCS
- Faça uma pequena incisão na pele no lado ventral de um abdômen de rato no nível rostro-caudal correspondente à localização dos segmentos espinhais L4-L5.
- Pegue a aba de pele exposta com um clipe de metal que servirá como um eletrodo de referência.
- Coloque uma esponja encharcada de soro fisiológico no lado dorsal da vértebra Th12. Certifique-se de que o tamanho da esponja é igual ao de um eletrodo tsDCS ativo (placa de aço inoxidável em forma de círculo de 5 mm de diâmetro).
- Usando um manipulador fino, pressione a esponja com um eletrodo tsDCS ativo no osso e certifique-se de que toda a superfície do eletrodo seja pressionada igualmente.
- Conecte eletrodos tsDCS de referência e ativos a uma unidade estimuladora de corrente constante, capaz de fornecer um fluxo contínuo de corrente direta.
- Preparação de micropipettos
- Usando um puxador de microeletrodo, prepare uma microeletrídua.
NOTA: Tanto os eletrodos de filamento quanto os eletrodos não filamentos podem ser usados, no entanto, lembre-se que a haste do eletrodo deve ser longa o suficiente para atingir o chifre ventral enquanto é fina o suficiente para não comprimir a medula espinhal durante a descida.- Ajuste a configuração do puxador para que a haste que entra na medula espinhal tenha aproximadamente 3 mm de comprimento, enquanto a ponta do eletrodo não é superior a 1\u20122 μm de diâmetro e a resistência à microeletrísola está entre 10 e 20 MΩ.
- Encha os microeletrodos com eletrólitos de potássio de 2M.
- Monte a microeletrínda preparada no micromanipulador permitindo 1\u20122 μm movimento de pisada e calibração estereotaxic.
- Conecte o microeletro ao amplificador intracelular com o eletrodo de referência colocado nos músculos das costas.
- Usando um puxador de microeletrodo, prepare uma microeletrídua.
- Após o bloqueio neuromuscular, monitore a profundidade da anestesia verificando a frequência do ECG e complemente o agente anestésico para que a frequência cardíaca do rato não exceda 400 bpm.
4. Rastreamento e penetração de motoneuron
- Coloque o diferente eletrodo de gravação de voleio de volta na superfície dorsal da medula espinhal, caudalmente à localização do local de gravação, ao nível do segmento L6.
- Estimule os nervos MG e LGS com pulsos elétricos de 0,1 ms em uma frequência de 3 Hz, e intensidade 3T, para ativar todos os axônios de alfa-motoneurons dentro de um nervo selecionado.
- Dirija a micropipette em um patch selecionado na pia com um ângulo medio-lateral de 15\u201220° (com uma ponta direcionada lateralmente).
- Depois de descer abaixo da superfície, calibrar a microeletrância e compensar sua capacitância e deslocamento de tensão, e continuar a penetração da medula espinhal quando todos os parâmetros estiverem estáveis. Um potencial de campo antidérmico da piscina de motoneuron será visível no traço de tensão de microeletrodes enquanto se aproxima de um núcleo motor dedicado durante a estimulação do respectivo nervo.
- Proceda a penetração com a microeletrídula a passos de 1\u20122 μm e use periodicamente a função de zumbido do amplificador intracelular para limpar a ponta do eletrodo de qualquer resíduo.
- Observe a penetração do motoneuron que será caracterizada por uma hiperpolarização súbita do traço de tensão registrado e aparência de um potencial de pico antidrómico.
5. Gravação de membrana de motoneuron e propriedades de disparo
- Em um modo de ponte do amplificador intracelular, identifique o motoneuron com base na aparência "tudo ou nada" do potencial de ação antidrómica estimulando seus respectivos ramos nervosos. Registos 20 subsequentes para a média posterior.
- Implementar um critério de inclusão rigoroso para garantir dados de alta qualidade: potencial de membrana de repouso de pelo menos -50 mV em amplitude; amplitudes potenciais de ação superiores a 50 mV, com um sobrev positivo; potencial de membrana estável por pelo menos 5 minutos antes de gravar.
- Em um modo de fixação atual descontínua (modo de taxa de comutação atual de 4 a 8 kHz) do amplificador intracelular, evoque um potencial de ação ortodrómica em um motoneuron usando pulsos de corrente despolarizantes intracelulares de 0,5 ms. Repita pelo menos 20 vezes para a média offline.
- Estimule um motoneuron com 40 pulsos curtos (100 ms) de corrente hiperpolarizadora (1 nA) a fim de calcular a resistência à entrada celular.
- Estimule um motoneuron com pulsos de onda quadrada de 50 ms em amplitudes crescentes para determinar o valor da reobase como a amplitude mínima de corrente despolarizadora necessária para provocar um único pico.
- Injete pulsos de onda quadrada de 500 ms de corrente despolarizadora, aumentando as amplitudes em passos de 0,1-2 nA para evocar descargas rítmicas de motoneurons.
6. Estimulação de corrente direta trans-espinhal (tsDCS)
- Mantendo uma penetração estável do motoneuron, inicie o procedimento de polarização por aplicação trans-espinhal de corrente direta. Ajuste a intensidade atual e o tempo de aplicação ao design do experimento (por exemplo, 0,1 mA por 15 min).
- Imediatamente após ligar o DC, observe o potencial da membrana do motoneuron. A polarização anodal (o eletrodo ativo como ânodo) deve resultar na despolarização do potencial da membrana, enquanto a polarização catódal (o eletrodo ativo como um cátodo) deve evocar um efeito oposto. Observe se uma mudança no potencial da membrana de repouso em resposta à estimulação dc é constante, o que garante que a intensidade do campo elétrico não seja afetada.
- Durante a aplicação contínua de corrente, repita as etapas 5.3\u20125.6 em intervalos de 5 minutos.
- Desligue o DC e continue repetindo as etapas 5.3\u20125.6 em intervalos de 5 minutos até que as gravações se tornem instáveis ou os critérios de inclusão sejam comprometidos.
- Termine o experimento e eutanize o animal usando administração intravenosa de uma dose letal de sódio pentobarbital (180 mg·kg-1).
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Representative Results
Parâmetros de potencial de ação e várias propriedades de membrana podem ser calculados com base em gravações intracelulares quando condições estáveis de penetração celular são garantidas. A Figura 1A apresenta um potencial típico de ação ortodrómica evocado pela estimulação intracelular, que atende a todos os critérios de inclusão de dados (o potencial de membrana de repouso de pelo menos -50 mV, e a amplitude de pico superior a 50 mV, com uma superação positiva). Os parâmetros potenciais de ação, como a amplitude do pico, a amplitude pós-hidratação ou o tempo de meia-decadência pós-hidratação (AHP-HDT) podem ser medidos. Um valor deste último parâmetro em motoneurons de ratos serve como um critério confiável para distinguir entre motoneurons rápidos e lentos (AHP-HDT > 20 ms para lento, enquanto AHP-HDT <20 ms para motoneurons rápidos)17. A Figura 1B mostra uma resposta celular a um pulso de corrente hiperpolarizadora de 1nA de 1nA, a partir do qual tanto a resistência de entrada de pico quanto de platô (IR) de um motoneuron pode ser determinada a partir da deflexão de tensão. A Figura 1C mostra um traço de tensão expandido de um pico reobasic com um limiar de tensão claramente marcado do pico, indicando o nível de despolarização da membrana em que os canais de sódio fechados por tensão são ativados para iniciar o potencial de ação. Todas essas gravações podem ser repetidas várias vezes durante e após a aplicação do TSDCS, o que nos permite comparar os respectivos parâmetros, desde que o potencial da membrana de repouso seja estável e outros critérios de protocolo de estimulação e gravação sejam preenchidos.
Vários estudos têm mostrado indiretamente que o TSDCS altera a excitabilidade do motoneuron e o padrão de disparo9,,18. A Figura 2 mostra exemplos de traços de tensão intracelular de dois motoneurons estimulados intracelularmente com pulsos quadrados de 500 ms de corrente despolarizadora antes, durante e depois da aplicação do TDCS. Em condições estáveis, as gravações se repetem vários minutos após a outra, e padrões de disparo de motoneuron podem ser comparados de forma confiável. Anodal (+) tsDCS foi encontrado para atuar em direção ao aumento da excitabilidade do motoneuron e maiores frequências de disparo rítmico(Figura 2A),enquanto o cásDCS agiu em direção à inibição de disparo(Figura 2B). Além disso, os efeitos de ambos os tipos de TSDCS superaram o período de polarização. Vale ressaltar também que as alterações observadas na excitabilidade e no padrão de disparo não são meramente resultado da despolarização da membrana celular ou da hiperpolarização por tsDCS anodal ou cathodal, respectivamente, mas apresentam alterações profundas não relacionadas à mudança de um potencial de membrana, pois persistiram apesar do fato de que este parâmetro retornou a uma linha de base após o fim da polarização.
Finalmente, deve-se ressaltar que quaisquer desvios do protocolo apresentado provavelmente resultarão em um experimento fracassado, devido à deterioração da preparação e/ou a um declínio profundo da confiabilidade dos dados. A Figura 3 mostra exemplos de registros quando os critérios de inclusão de dados foram comprometidos, seja devido à penetração celular imperfeita(Figura 3A),negligência em compensar a resistência e a capacitância da microeletrídrica(Figura 3B) ou uma instabilidade medular(Figura 3C). É importante que os pesquisadores identifiquem essas gravações não ideais e implementem ações corretivas adequadas ou desconsiderem tais resultados do conjunto de dados.
Figura 1: Parâmetros de potenciais de ação e propriedades de membrana.
(A) Um potencial de ação ortodrómica provocado por estimulação intracelular, com parâmetros básicos indicados que podem ser calculados a partir deste registro. AP ampl = amplitude potencial de ação; Ampl aHP = amplitude pós-hidratação; AHP-HDT = tempo de meia-decadência pós-hidratação. (B) O traço de tensão de uma resposta de membrana a um pulso de corrente despolarizador curto (100 ms) de intensidade de 1nA, o que nos permite calcular a resistência à entrada (IR). Observe o pico de uma possível deflexão (Pico ir) seguida de uma pequena diminuição e a seguinte fase do planalto do potencial de membrana (planalto ir). (C) O traço de tensão expandida de um pico reobasic com uma linha horizontal pontilhada indicando o limiar de tensão de espigão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeitos da polarização no disparo de motoneuron.
(A) Registros intracelulares de um motoneuron estimulado intracelularmente com 7,5 nA para 500 ms, feitos antes (esquerda), durante tsDCS anodal (0,1 mA, médio), e 10 min após o fim da polarização (direita). Note o aumento gradual da excitabilidade do motoneuron na mesma intensidade de estímulo. (B) Registros intracelulares de outro motoneuron estimulado intracelularmente com 6 nA para 500 ms, feitos antes (esquerda), durante tsDCS cathodal (0,1 mA, médio), e 10 minutos após o fim da polarização (direita). Note uma inibição gradual da frequência de disparo de motoneuron na mesma intensidade de estímulo. Abaixo das gravações, são fornecidos vestígios de corrente de estimulação intracelular. As barras de calibração no canto inferior direito aplicam-se a todas as gravações intracelulares apresentadas. Os valores do potencial da membrana de repouso são fornecidos à esquerda de cada gravação. As frequências de disparo de estado estável, calculadas a partir dos meios dos três intervalos finais de interspike, são dadas acima dos registros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplos de registros subótimos como resultado de desvios do protocolo experimental.
(A) O pico antidômico registrado a partir de um motoneuron penetrado inadequadamente. O potencial de membrana de repouso é insuficiente (-45 mV), e apesar de uma forma adequada do pico com todas as fases consecutivas de despolarização, repolarização e hiperpolarização, sua amplitude é muito baixa (41 mV) e sem uma superação. (B) Um pico reobasic gerado em um limiar de tensão irreal (membrana despolarizada para +68 mV). Esse tipo de erro geralmente se deve a uma microeletríscula bloqueada, com resistência e capacitância não compensadas. Pode-se também ver que este registro está fortemente contaminado por ruído elétrico de 50 Hz. (C) Um disparo rítmico de motoneuron em resposta à corrente despolarizadora de 500 ms, com grandes flutuações de um potencial de membrana, predominantemente causado pela penetração instável de microeletrodes, possivelmente devido a movimentos respiratórios excessivos. Para todos os casos apresentados, a membrana calculada ou propriedades de disparo não seriam confiáveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Se realizada corretamente, a parte cirúrgica do protocolo descrito deve ser concluída dentro de aproximadamente três horas. Deve-se tomar cuidado especial na manutenção de condições fisiológicas estáveis de um animal durante a cirurgia, em especial a temperatura corporal e a profundidade da anestesia. Além de considerações éticas óbvias, a falta de anestesia adequada pode resultar em movimentos excessivos de membros durante a dissecção nervosa ou laminectomia e levar a danos à preparação ou a um término prematuro do experimento. Ao paralisar um animal antes de penetrar na medula espinhal com um microeletro, é crucial monitorar a profundidade da anestesia e da frequência cardíaca e aplicar parâmetros adequados de ventilação com base no peso animal e na capacidade pulmonar. Quaisquer desvios dos parâmetros fisiológicos desejados devem ser alterados imediatamente para garantir o sucesso do procedimento. Após a cirurgia, é possível manter as condições estáveis de registro por pelo menos quatro horas.
Após a penetração de um motoneuron, a estabilidade do registro é de alta importância. É imperativo que um potencial de membrana permaneça constante durante as gravações de controle, pois quaisquer flutuações influenciarão significativamente a corrente reobase e um limiar de disparo rítmico. A fixação adequada da coluna vertebral deve fornecer estabilidade básica, enquanto o objetivo de um pneumotórax é diminuir os movimentos da medula espinhal evocados pela respiração. Além disso, é preciso ter certeza de que as contrações musculares são totalmente abolidas antes de tentar a penetração e o bloqueador neuromuscular é administrado em intervalos regulares.
Após uma identificação antidróica de penetração bem sucedida do motoneuron registrado pode ser realizada por estimulação de um respectivo ramo nervoso. Esta é uma verdadeira vantagem de uma preparação in vivo, na qual os axônios de motoneuron são mantidos em continuidade com os músculos inervados em referência às gravações intracelulares in vitro realizadas em fatias espinhais, que só recentemente foram possíveis em animais adultos16, mas não permitem a identificação de motoneuron gravado. No entanto, é importante que os pesquisadores tenham uma compreensão clara da diferença entre ativação antidrómica e ortodrómica do motoneuron19 para evitar a má interpretação dos dados. É importante manter a estimulação do nervo periférico o mais baixa possível (menos de 0,5 V) para evitar a ativação de nervos adicionais devido à propagação atual e prestar atenção a uma latência constante e curta do pico antidrómico19.
Outra vantagem da técnica apresentada é que os motoneurons podem ser classificados adicionalmente como tipos rápidos ou lentos com base em seus parâmetros potenciais de ação, ou seja, a duração AHP-HDT17. A diferenciação entre motoneurons que inervam fibras musculares de tipo rápido e lento é crucial no que diz respeito à sua contribuição diferente para o desempenho muscular durante os movimentos. Além disso, motoneurons rápidos e lentos podem reagir de forma diferente à polarização9.
Para garantir resultados confiáveis de polarização deve-se prestar atenção à definição de parâmetros adequados de tsDCS. A intensidade atual deve, por um lado, fornecer uma densidade de campo desejada na área selecionada para evocar efeitos nas redes neuronais, enquanto, por outro lado, deve estar dentro dos limites de segurança para danos teciduais20. O tamanho dos eletrodos ativos e de referência e sua colocação em relação a um local de gravação também são elementos importantes a considerar4, e o tempo de aplicação de duração do TSDCS deve ser suficiente para evocar os efeitos desejados16,,17,,22. Neste artigo de métodos, os resultados representativos foram obtidos por aplicação de 100 μA de polarização cathodal ou anodal por 15 min. Levando-se em conta a forma e o diâmetro do eletrodo, a respectiva intensidade do campo elétrico diretamente sob o eletrodo foi de 39,25 μA·mm2. No entanto, deve-se entender que o valor preciso do campo elétrico no local do motoneuron registrado é impossível de determinar como localização de motoneuron em relação à polarização eletrodo varia, e a densidade do campo eletrônico cai significativamente com aumento de profundidade e diminuição do tamanho do eletrodo4,24. Além disso, a orientação dos compartimentos de motoneuron em relação ao campo elétrico aplicado é importante para a geração de potenciais de ação22,,25,,26, e isso não pode ser previsto para células individuais. Além disso, é altamente importante entender que os efeitos tsDCS não se limitam a um período de polarização, e que efeitos persistentes e duradouros são bem documentados22,27. Portanto, após mesmo uma sessão única e breve de polarização, todas as gravações sucessivas na mesma preparação seriam realizadas em condições pós-polarização, o que limita o número de possíveis gravações de polarização aguda a um por animal.
Modificações adicionais do procedimento apresentado podem ser feitas para responder a questões específicas de pesquisa. Este protocolo com modificações mínimas pode ser usado como padrão para vários projetos experimentais, por exemplo, ao testar várias duraçãos e/ou amplitudes de tsDCS aplicados ou quando comparar efeitos de curto ou longo prazo do TSDCS em várias piscinas motoneurons. O uso de vários modelos de doenças genéticas (por exemplo, modelo de rato SOD1 G93A de esclerose lateral amiotrófica) ou nervos diferentes para ativação do nervo antidrómico (peroneal, tibial, saphenous, etc.) é aceitável. No entanto, deve-se também estar atento às limitações do procedimento. Por exemplo, o uso de barbitúricos para anestesia inibe a atividade de correntes interiores persistentes28,enquanto a introdução sistêmica de bloqueadores específicos comumente usados em preparações in vitro (por exemplo, estricnina para bloquear receptores nicotínicos) pode ser fatal para o animal. É aconselhável que os pesquisadores considerem essas limitações antes de selecionar o protocolo experimental adequado.
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Disclosures
Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência nº 2017/25/B/NZ7/00373. Os autores gostariam de reconhecer o trabalho de Hanna Drzymała-Celichowska e Włodzimierz Mrówczyński, que contribuíram para a coleta e análise dos resultados apresentados neste artigo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
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