Summary
Questo protocollo descrive la registrazione intracellulare in vivo dei motoneuroni lombari con stimolazione simultanea della corrente diretta trans-spinale. Il metodo ci permette di misurare le proprietà della membrana e di registrare la cottura ritmica dei motoneuroni prima, durante e dopo la polarizzazione anodale o tadale del midollo spinale.
Abstract
La registrazione intracellulare dei motoneuroni spinali in vivo fornisce uno "standard d'oro" per determinare le caratteristiche elettrofisiologiche delle cellule nella rete spinale intatta e contiene vantaggi significativi rispetto alle tecniche classiche di registrazione in vitro o extracellulare. Un vantaggio delle registrazioni intracellulari in vivo è che questo metodo può essere eseguito su animali adulti con un sistema nervoso completamente maturo, e quindi molti meccanismi fisiologici osservati possono essere tradotti in applicazioni pratiche. In questo documento metodologico, descriviamo questa procedura combinata con la stimolazione a corrente costante applicata esternamente, che imita i processi di polarizzazione che si verificano all'interno delle reti neuronali spinali. La stimolazione trans-spinale a corrente diretta (tsDCS) è un metodo innovativo sempre più utilizzato come intervento neuromodulatore nella riabilitazione dopo varie lesioni neurologiche e nello sport. L'influenza di tsDCS sul sistema nervoso rimane poco compresa e i meccanismi fisiologici dietro le sue azioni sono in gran parte sconosciuti. L'applicazione del tsDCS contemporaneamente alle registrazioni intracellulari ci permette di osservare direttamente i cambiamenti delle proprietà della membrana del motoneurone e le caratteristiche della cottura ritmica in risposta alla polarizzazione della rete neuronale spinale, che è fondamentale per la comprensione delle azioni tsDCS. Inoltre, quando il protocollo presentato include l'identificazione del motoneurone rispetto a un muscolo innervato e la sua funzione (flessore contro estensore) così come il tipo fisiologico (veloce contro lento) offre l'opportunità di indagare selettivamente l'influenza del tsDCS sui componenti identificati dei circuiti spinali, che sembrano essere influenzati in modo diverso dalla polarizzazione. La procedura presentata si concentra sulla preparazione chirurgica per le registrazioni intracellulari e la stimolazione con un'enfasi sui passi necessari per ottenere la stabilità di preparazione e la riproducibilità dei risultati. I dettagli della metodologia dell'applicazione tsDCS anodale o catodale sono discussi prestando attenzione alle questioni pratiche e di sicurezza.
Introduction
La stimolazione a corrente diretta trans spinale (tsDCS) sta guadagnando riconoscimento come metodo potente per modificare l'eccitabilità del circuito spinale in salute emalattia 1,2,3. In questa tecnica, una corrente costante viene passata tra un elettrodo attivo situato sopra i segmenti spinali selezionati, con un elettrodo di riferimento situato sia ventralemente che più rostralmente4. Diversi studi hanno già confermato che il tsDCS può essere utilizzato nella gestione di determinate condizioni patologiche, come il doloreneuropatico 5, la spasticità6, la lesione del midollospinale 7 o per facilitare la riabilitazione8. I ricercatori suggeriscono che il tsDCS evoca alterazioni nella distribuzione degli ioni tra lo spazio intracellulare e lo spazio extracellulare attraverso la membrana cellulare, e questo può facilitare o inibire l'attività neuronale a secondadell'orientamento corrente 9,10,11. Tuttavia, fino a poco tempo fa, mancava una conferma diretta di questa influenza sui motoneuroni.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per condurre in vivo la registrazione intracellulare dei potenziali elettrici dai motoneuroni lombari spinali nel ratto anethetizzato con applicazione simultanea di tsDCS, al fine di osservare i cambiamenti nella membrana motoneurone e le proprietà di cottura in risposta alla polarizzazione anodale o cathodale della rete neuronale spinale. Le registrazioni intracellulari aprono diverse aree di indagine delle proprietà dei neuroni, non disponibili per le tecniche extracellulari utilizzate inprecedenza 9,12. Ad esempio, è possibile misurare con precisione la risposta di tensione della membrana del motoneurone al flusso di corrente diretta indotto da tsDCS, indicare la soglia di tensione per la generazione di picchi o analizzare i potenziali parametri di azione. Inoltre, questa tecnica ci permette di determinare le proprietà della membrana passiva del motoneurone, come la resistenza all'ingresso, e di osservare la relazione tra la corrente di stimolazione intracellulare e la frequenza di cottura ritmica dei motoneuroni. L'identificazione antidromica del motoneurone registrato, basata sulla stimolazione dei nervi identificati dal punto di vista funzionale (cioè i nervi che forniscono efferenti ai flessori o agli estensori) ci permette di identificare inoltre i tipi di unità motorie innervate (veloce o lento), il che offre l'opportunità di verificare se la polarizzazione influenza in modo diverso i singoli elementi del sistema neuronale spinale maturo. A causa di un'estesa chirurgia che precede la registrazione e di elevati requisiti di stabilità e affidabilità delle registrazioni, questa tecnica è altamente impegnativa ma consente una valutazione diretta e a lungo termine delle caratteristiche elettrofisiologiche di un motoneurone: prima, durante e dopo l'applicazione di tsDCS, che è fondamentale per determinare sia le sue azioni acute che gli effetti persistenti13. Come un motoneuron attiva direttamente le fibre muscolari extrafuso14 e prende parte al controllo di feedback di una contrazione muscolare e sviluppato forza15,16 qualsiasi influenza osservata di tsDCS sull'unità motoria o le proprietà contraili muscolari possono essere collegati a modulazioni di motoneurone eccitabilità o caratteristiche di cottura.
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Protocol
Tutte le procedure connesse al presente protocollo sono state accettate dalle autorità competenti (ad esempio, comitato etico locale) e seguono le norme nazionali e internazionali in materia di benessere e gestione degli animali.
NOTA: Ogni partecipante coinvolto nella procedura deve essere adeguatamente addestrato nelle procedure chirurgiche di base e deve avere una licenza valida per l'esecuzione di esperimenti sugli animali.
1. Anestesia e premedicazione
- Anestesizzare un ratto con iniezioni intraperitoneali di pentobarbital di sodio (una dose iniziale di 60mg-kg -1 per i ratti Wistar maschi di 6 mesi del peso di 400-u2012550g).
NOTA: Questo protocollo non è limitato al ceppo indicato, al sesso o all'età dei ratti. Inoltre, l'anestesia alternativa come il mix di ketamina-xylazina, l'alfa-cloalosa o il fentanil-midazolam-medetomidina può essere utilizzata se più adatta a diversi obiettivi di ricerca o quando richiesto dal comitato etico. - Dopo circa 5 minuti, controllare la profondità dell'anestesia pizzicando il dito dell'arto posteriore del ratto con pince smussate. Procedere con i passaggi successivi del protocollo solo quando non viene osservata alcuna azione riflessiva.
- Iniettare 0,05 mL di atropina sottocutaneamente al fine di ridurre la produzione di muco dopo l'intubazione.
- Iniettare sottocutaneamente 5 mL di tampone fosfato contenente 4% soluzione di glucosio, NaHCO3 (1 %) e gelatina (14%). Questo buffer sarà assorbito dai vasi cutanei durante un esperimento e contribuirà a mantenere l'equilibrio dei fluidi.
- Durante l'intervento, controllare periodicamente l'animale per le azioni di riflesso e integrare l'anestesia, se necessario (10mg-kg -1-1 -1di pentobarbital di sodio).
2. Chirurgia
- Preparare l'animale per il trattamento chirurgico radendo la pelliccia sulla parte dorsale dell'hindlimb sinistro, dalla caviglia all'anca, dalla parte posteriore, dalla coda ai segmenti toracci alti, il lato sinistro del torace e il lato ventrale della zona del collo sopra lo sterno
- Posizionamento della linea endovenosa
- Posizionare il ratto sulla schiena su un tampone riscaldante ad anello chiuso (e fissarlo con fissazioni degli arti).
- Utilizzando una lama 21, fare un taglio longitudinale attraverso la pelle da uno sterno a un mento.
- Tenere la pelle con le finte e separarla dal tessuto sottostante.
- Utilizzando tecniche di dissezione smussate espongono la vena giugulare destra. Sezionare attentamente la vena dai tessuti circostanti.
- Individuare la parte della vena senza punti di diramazione, scivolare due legature 4-0 sotto di esso.
- Fare un nodo sciolto sull'estremità prossimale del segmento non ramificante precedentemente identificato della vena e un nodo sciolto sull'estremità distale di questo segmento della vena. Bloccare la vena prossimale al cuore, e poi liga la parte distale della vena.
- Utilizzando le forbici dell'iride, fare un'incisione tra il morsetto e la legatura distante. Tenere un lembo della vena e introdurre un catetere pre-riempito fino al punto in cui è bloccato dal morsetto.
- Tenendo la vena e il catetere insieme con le forcetti, rimuovere il morsetto e spingere il catetere diversi millimetri nella vena. Fissare entrambe le estremità del catetere alla vena e aggiungere un ulteriore punto di fissazione alla pelle.
- Introduzione del tubo tracheale
- Utilizzando le forcezze smussate separano le due ghiandole mandibolari che coprono i muscoli sternohyoidi. Separare i muscoli sternoid alla linea mediana per esporre la trachea.
- Scivolare tre legature 4-0 sotto la trachea, quindi fare due nodi sotto il punto di inserimento del tubo tracheale e un nodo sopra.
- Individuare la cartilagine cricoide della la renace e fare un'incisione sotto la terza cartilagine tracheale.
- Inserire un tubo tracheale lungo la trachea e fissare il tubo in posizione con legature pre-preparate, quindi aggiungere un'ulteriore legatura alla pelle.
- Posizionare un piccolo pezzo di cotone sopra i muscoli separati e suturare la pelle sopra l'area azionata.
- Dissezione dei nervi degli arti posteriori
- Utilizzando 21 lama, fare un taglio longitudinale sul lato posteriore dell'arto posteriore sinistro, dal tendine d'Achille all'anca.
- Afferrare la pelle con le finzioni, e utilizzando tecniche di dissezione smussata separare la pelle dai muscoli sottostanti su entrambi i lati dell'incisione.
- Individuare la fossa popliteale nella parte posteriore dell'articolazione del ginocchio, che è coperto dal muscolo femoris bicipite, e utilizzando le forbici fare un taglio tra la parte anteriore e posteriore di questo muscolo.
- Muovendosi verso l'alto tagliare due teste del bicipite femoris tutta la strada fino all'anca per esporre il nervo sciatico. Cauterizzare come necessario per prevenire il sanguinamento.
- Identificare i rami surali, tibiali e comuni peroneali del nervo sciatico.
- Utilizzando le forbici, separare la testa laterale dalla testa mediale del muscolo gastrocnemio per esporre il nervo tibiale e i suoi rami.
- Utilizzando 55 forceps afferrare l'estremità distale del nervo surale, tagliarlo distaamente e sezionare il più possibile.
- Ripetere la procedura con il nervo peroneale comune.
- Utilizzando un'asta di vetro smussata separare il nervo tibiale dai tessuti circostanti, facendo attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni, e tagliarlo distally.
- Identificare il gastrocnemius mediale (MG) e i nervi a gastrocnemius e soleus (LGS) laterale.
- Utilizzando 55 forcelle, sezionare attentamente i nervi MG e LGS, scollegandoli dai tessuti circostanti, ma mantenendo la loro connessione ai rispettivi muscoli.
- Mettere un pezzo di cotone imbevuto di salina sotto i nervi esposti.
- Chiudere la pelle sopra l'area azionata.
- Laminectomy
- Utilizzando 21 lama fare un'incisione longitudinale dal sacro fino alle vertebre toracica.
- Separare la pelle dai muscoli sottostanti.
- Tagliare il muscolo longissimus su entrambi i lati dei processi toracica e lombare spinosa.
- Utilizzando bisturi dai bordi smussati ritraggono i muscoli dalla colonna vertebrale per esporre i processi trasversali di ogni vertebra.
- Utilizzando forbici punta smussata tagliare i tendini dei muscoli collegati ai processi trasversali lungo la colonna vertebrale esposta. Se necessario, applicare agenti emostatici.
- Identificare la vertebra Th13 come il segmento toracico più basso con inserimento delle costole e utilizzando rongeurs fini rimuovere i processi spinosi e laminae da Th13 a L2 vertebre per esporre segmenti lombari del midollo spinale. Ricordarsi di non danneggiare il processo spinoso L3 che verrà utilizzato come punto di fissazione per la stabilizzazione della colonna vertebrale.
- Rimuovere il processo spinoso Th12 e lisciare la superficie dorsale vertebra il più possibile.
- Utilizzando tecniche di dissezione smussate separano i muscoli dalla vertebra Th11 per creare punti di inserimento del supporto.
- Posizionare il sottile batuffolo di cotone saline sopra i segmenti del midollo spinale esposti.
- Spostare il ratto sul telaio metallico su misura con due barre parallele e due bracci regolabili con morsetti per sostenere e stabilizzare la colonna vertebrale.
3. Preparazione per la registrazione e la stimolazione
- Fissazione della colonna vertebrale e disposizione del nervo
- Posizionare il ratto nel telaio su misura su una pastiglie riscaldante, collegato al sistema di riscaldamento a circuito chiuso per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 x 1oC.
- Inserire elettrodi ECG sotto la pelle e collegarsi a un amplificatore per il monitoraggio della frequenza cardiaca.
- Utilizzando i lembi della pelle, formare una piscina profonda sul midollo spinale esposto.
- Utilizzando morsetti metallici, fissare la colonna vertebrale mettendo morsetti sotto i processi trasversali Th12 e al processo spinoso L3.
- Assicurarsi che la colonna vertebrale sia fissata e disposta orizzontalmente, quindi applicare la pressione dorso-ventrale su entrambi i lati della colonna per ritrarre i muscoli.
- Riempire la piscina con olio minerale caldo (37 gradi centigradi) e mantenerla a questa temperatura.
- Infilare una legatura 4-0 attraverso il tendine d'Achille, sollevare e allungare l'arto posteriore sinistro operato in modo che la caviglia sia livellata con l'anca.
- Utilizzando i lembi della pelle fare una piscina profonda sopra il tibial esposto, mg e nervi LGS.
- Riempire la piscina con olio minerale caldo (37 gradi centigradi).
- Posizionare i nervi MG e LGS su elettrodi stimolanti bipolari filo d'argento e collegarli a uno stimolatore a impulsi quadrati. Utilizzare canali di stimolazione separati per ogni nervo.
- Posizionamento degli elettrodi superficiali
- Posizionare un elettrodo a sfera d'argento sul lato caudal sinistro del midollo spinale esposto, con un elettrodo di riferimento inserito nei muscoli della schiena, e collegare entrambi gli elettrodi all'amplificatore MDD differenziale. L'elettrodo della sfera di superficie sarà utilizzato per registrare raffiche afferenti dai nervi.
- Utilizzando uno stimolatore a corrente costante, stimolare i nervi MG e LGS con impulsi quadrati di durata di 0,1 ms, ripetuti a una frequenza di 3 Hz, e osservare raffiche afferenti.
- Determinare la soglia (T) per l'attivazione del nervo, stimolare ogni nervo a circa 3 Intensità T, e registrare l'ampiezza di afferente volley per ogni nervo.
- Spostare l'elettrodo superficiale rostrale e ripetere la procedura per identificare i segmenti spinali in cui le ampiezze delle raffiche sono le più alte per ogni nervo. Dopo aver determinato la posizione massima della raffica, spostare l'elettrodo di superficie a una distanza di sicurezza dal midollo spinale.
- Paralisi muscolare e formazione di uno pneumotorace al fine di ridurre i movimenti respiratori
- Paralizzare il ratto per via endovenosa con un bloccante neuromuscolare e collegare il tubo tracheale ad un ventilatore esterno in linea con un capnometro compatibile con i roditori (bromuro di pancuronio, ad una dose iniziale di 0,4mg-kg -1, integrato ogni 30 min in dosi di 0,2mg-kg -1)
- Monitorare la concentrazione di CO2 di marea finale e mantenerla a circa il 3-u20124% regolando i parametri di ventilazione (frequenza, pressione dell'aria e volumi di flusso).
- Fare un'incisione longitudinale nella pelle tra la 5a e la 6a costola su un lato della registrazione.
- Utilizzando forbici a punta smussata tagliare i muscoli sovrasto per visualizzare lo spazio intercostale tra le costole.
- Utilizzando piccole forbici affilate, fare una piccola incisione nei muscoli intercostali e nella pleura, quindi inserire una punta di un bordo smussato forza nell'apertura, facendo attenzione a non premere sui polmoni.
- Consentire alle forcep di espandersi o inserire un piccolo tubo per mantenere lo pneumotorace aperto per tutta l'esperimento.
- Dopo il blocco neuromuscolare, monitorare la profondità dell'anestesia controllando la frequenza ECG e integrare l'agente anestetico se la frequenza cardiaca supera i 400 bpm. Paralisi muscolare e formazione di uno pneumotorace al fine di ridurre i movimenti respiratori, che migliorerà la stabilità di registrazione
- Apertura della dura e pia mater
- Utilizzando #55, sollevare delicatamente la dura mater, e tagliarla caudally dal segmento L5, rostralmente fino al segmento L4.
- Utilizzando un paio di forceppa 5SF ultra-sottili fare un piccolo cerotto nella pia che copre la colonna dorsale, tra i vasi sanguigni, esattamente al livello della massima afferente volley dal mg o il nervo LGS.
- Utilizzare piccoli pezzi di schiuma di gel salina imbevuta e secca per bloccare il sanguinamento, se necessario.
- Posizionamento degli elettrodi tsDCS
- Fare una piccola incisione nella pelle sul lato ventrale di un addome del ratto a livello rostro-caudal corrispondente alla posizione dei segmenti spinali L4-L5.
- Afferra il lembo di pelle esposto con una clip metallica che servirà come elettrodo di riferimento.
- Posizionare una spugna imbevuta di salina sul lato dorsale della vertebra Th12. Assicurarsi che la dimensione della spugna sia uguale a quella di un elettrodo tsDCS attivo (piastra in acciaio inossidabile a forma di cerchio di 5 mm di diametro).
- Utilizzando un manipolatore fine, premere la spugna con un elettrodo tsDCS attivo all'osso e assicurarsi che l'intera superficie dell'elettrodo sia premuta allo stesso modo.
- Collegare sia gli elettrodi tsDCS di riferimento che attivi a un'unità stimolatore a corrente costante, in grado di fornire un flusso continuo di corrente diretta.
- Preparazione delle micropipette
- Utilizzando un puller microelettrodo, preparare un microelettrode.
NOTA: Sia gli elettrodi filamentali che gli elettrodi non filamentali possono essere utilizzati, tuttavia, ricordate che il gambo dell'elettrodo deve essere abbastanza lungo da raggiungere il corno ventrale pur essendo abbastanza sottile da non comprimere il midollo spinale durante la discesa.- Regolare l'impostazione dell'e tiratore in modo che il gambo che entra nel midollo spinale sia lungo circa 3 mm, mentre la punta dell'elettrodo non è superiore a 1,20122 m di diametro e la resistenza ai microelettrodi è compresa tra 10 e 20 MΩ.
- Riempire i microelettrodi con 2M elettrolita di citrato di potassio.
- Montare il microelettrode preparato sul micromanipatore, consentendo il movimento di stepping di 1,20122 m e la calibrazione stereotassica.
- Collegare il microelettrodo all'amplificatore intracellulare con l'elettrodo di riferimento posto nei muscoli della schiena.
- Utilizzando un puller microelettrodo, preparare un microelettrode.
- Dopo il blocco neuromuscolare, monitorare la profondità dell'anestesia controllando la frequenza ECG e integrare l'agente anestetico in modo che la frequenza cardiaca del ratto non superi i 400 bpm.
4. Tracciamento e penetrazione Motoneuron
- Posizionare l'elettrodo di registrazione della raffica afferente sulla superficie dorsale del midollo spinale, caudally alla posizione del sito di registrazione, al livello del segmento L6.
- Stimolare i nervi MG e LGS con impulsi elettrici di 0,1 ms ad una frequenza di 3 Hz e intensità 3T, per attivare tutti gli assoni di alfa-motoneuroni all'interno di un nervo selezionato.
- Guidare la micropipetta in una patch selezionata nel pia con un angolo medio-laterale di 15-u201220 (con una punta diretta lateralmente).
- Dopo essere sceso sotto la superficie, calibrare il microelettrode e compensare la sua capacità e l'offset di tensione, e continuare la penetrazione del midollo spinale quando tutti i parametri sono stabili. Un potenziale di campo antidromico della piscina motoneurone sarà visibile alla traccia di tensione microelettrode mentre si avvicina un nucleo motore dedicato durante la stimolazione del rispettivo nervo.
- Procedere alla penetrazione con il microelettrode a 1,20122 gradini di m e utilizzare periodicamente la funzione di ronzio dell'amplificatore intracellulare per eliminare la punta dell'elettrodo da qualsiasi residuo.
- Osservare la penetrazione del motoneurone che sarà caratterizzata da un'improvvisa iperpolarizzazione della traccia di tensione registrata e dalla comparsa di un potenziale di picco antidromatico.
5. Registrazione della membrana del motoneurone e delle proprietà di cottura
- In una modalità ponte dell'amplificatore intracellulare, identificare il motoneurone sulla base dell'aspetto "tutto o niente" del potenziale di azione antidromica stimolando i rispettivi rami nervosi. Registrare 20 tracce successive per una media successiva.
- implementare un rigoroso criterio di inclusione per garantire dati di alta qualità: potenziale di membrana a riposo di almeno -50 mV in ampiezza; l'ampiezza potenziale dell'azione superiore a 50 mV, con un superamento positivo; potenziale di membrana stabile per almeno 5 minuti prima della registrazione.
- In una modalità discontinua di corrente (modalità di commutazione corrente 4-8 kHz) dell'amplificatore intracellulare, evoca un potenziale di azione ortodromica in un motoneurone utilizzando impulsi di corrente depolarizzazione intracellulare di 0,5 ms. Ripetere almeno 20 volte per la media offline.
- Stimolare un motoneurone con 40 impulsi brevi (100 ms) di corrente iperpolare (1 nA) al fine di calcolare la resistenza all'ingresso cellulare.
- Stimolare un motoneurone con impulsi di onde quadrate di 50 ms a quantità crescenti per determinare il valore di reobase come l'ampiezza minima della corrente di depolarizzazione necessaria per suscitare un singolo picco.
- Iniettare 500 ms impulsi ad onda quadra di corrente depolarizzazione, ad amplificazione crescente in gradini di 0,1–2 nA per evocare scariche ritmiche di motoneuroni.
6. Stimolazione a corrente diretta trans spinale (tsDCS)
- Pur mantenendo una penetrazione stabile del motoneurone, avviare la procedura di polarizzazione mediante l'applicazione trans-spinale della corrente diretta. Regolare l'intensità corrente e il tempo di applicazione al progetto dell'esperimento (ad esempio, 0,1 mA per 15 min).
- Subito dopo l'accensione del DC, osservare il potenziale della membrana del motoneurone. La polarizzazione anodale (l'elettrodo attivo come anodo) dovrebbe portare alla depolarizzazione del potenziale della membrana, mentre la polarizzazione cathodale (l'elettrodo attivo come un catodo) dovrebbe evocare un effetto opposto. Osservare se un cambiamento nel potenziale di membrana a riposo in risposta alla stimolazione DC è costante, il che assicura che l'intensità del campo elettrico non sia influenzata.
- Durante l'applicazione a corrente continua, ripetere i passaggi 5.3-u20125.6 in intervalli di 5 minuti.
- Spegnere il controller di dominio e continuare a ripetere i passaggi 5.3-u20125.6 in intervalli di 5 minuti fino a quando le registrazioni diventano instabili o i criteri di inclusione vengono compromessi.
- Terminare l'esperimento ed eutanasializzare l'animale utilizzando la somministrazione endovenosa di una dose letale di sodio pentobarbitale (180mg-kg -1).
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Representative Results
I parametri dei potenziali di azione e diverse proprietà della membrana possono essere calcolati sulla base di registrazioni intracellulari quando sono garantite condizioni stabili di penetrazione cellulare. La figura 1A presenta un tipico potenziale di azione ortodromica evocato dalla stimolazione intracellulare, che soddisfa tutti i criteri per l'inclusione dei dati (il potenziale di membrana a riposo di almeno -50 mV e un'ampiezza di picco superiore a 50 mV, con un superamento positivo). È possibile misurare i parametri potenziali di azione, come l'ampiezza del picco, l'ampiezza dopo l'ipolarizzazione o il tempo di mezza decadimento dopo l'imperpolarizzazione (AHP-HDT). Un valore di quest'ultimo parametro in motoneurons rat serve come un criterio affidabile per distinguere tra motoneuroni veloci e lenti (AHP-HDT > 20 ms per lento, mentre AHP-HDT <20 ms per motoneuroni veloci)17. La figura 1B mostra una risposta cellulare a un impulso di corrente iperpolarizzante di 100 ms di 1nA, da cui è possibile determinare sia la resistenza all'ingresso di picco che quella dell'altopiano (IR) di un motoneurone dalla deflessione della tensione. La figura 1C mostra una traccia di tensione espansa di un picco di reobasica con una soglia di tensione chiaramente marcata del picco, che indica il livello di depolarizzazione della membrana a cui vengono attivati i canali di sodio a tensione per avviare il potenziale di azione. Tutte queste registrazioni possono essere ripetute più volte durante e dopo l'applicazione tsDCS, che ci permette di confrontare i rispettivi parametri fino a quando il potenziale della membrana a riposo è stabile e altri criteri di stimolazione e protocollo di registrazione sono soddisfatti.
Diversi studi hanno indirettamente dimostrato che tsDCS altera l'eccitabilità del motoneurone e il modello dicottura 9,18. La figura 2 mostra esempi di tracce di tensione intracellulare da due motoneuroni stimolati intracellulare con impulsi quadrati di 500 ms impulsi quadrati di depolarizzazione della corrente prima, durante e dopo l'applicazione tsDCS. In condizioni stabili, le registrazioni ripetute diversi minuti uno dopo l'altro possono essere eseguite e i modelli di cottura del motoneurone possono essere confrontati in modo affidabile. Si è scoperto che anodal (-) tsDCS agisce verso una maggiore eccitabilità del motoneurone e frequenze più elevate di cottura ritmica (Figura 2A), mentre cathodal (-) tsDCS ha agito per l'inibizione di cottura (Figura 2B). Inoltre, gli effetti di entrambi i tipi di tsDCS hanno superato il periodo di polarizzazione. Vale anche la pena notare che i cambiamenti osservati nell'eccitabilità e nel modello di cottura non sono semplicemente il risultato della depolarizzazione della membrana cellulare o dell'iperpolarizzazione da parte di tsDCS anodali o catodale, rispettivamente, ma mostrano profonde alterazioni non correlate al cambiamento di un potenziale di membrana, in quanto persistevano nonostante il fatto che questo parametro fosse tornato a una linea di base dopo la fine della polarizzazione.
Infine, va sottolineato che eventuali deviazioni dal protocollo presentato probabilmente si tradurranno in un esperimento fallito, a causa del deterioramento della preparazione e/o di un profondo declino dell'affidabilità dei dati. Nella figura 3 sono illustrati esempi di registrazioni in cui i criteri di inclusione dei dati sono stati compromessi a causa di una penetrazione di cellule imperfette (Figura 3A), negligenza per compensare la resistenza e la capacità di microelettrode (Figura 3B) o un'instabilità del midollo spinale (Figura 3C). È importante che i ricercatori identifichino tali registrazioni non ottimali e implementino azioni correttive adeguate o ignori tali risultati dal set di dati.
Figura 1: Parametri dei potenziali di azione e delle proprietà della membrana.
(A) Un potenziale di azione ortodromica suscitato dalla stimolazione intracellulare, con parametri di base indicati che possono essere calcolati da questo record. AP amp - potenziale ampiezza d'azione; amplificazione AHP - ampiezza dopo l'imperpolarizzazione; AHP-HDT - dopo l'imperpolarizzazione tempo di mezza decadimento. (B) La traccia di tensione di una risposta di membrana a un breve (100 ms) depolarizzando l'impulso di corrente di intensità 1nA, che ci permette di calcolare la resistenza all'ingresso (IR). Si noti il picco di una potenziale deflessione (IR Peak) seguito da una piccola diminuzione e dalla successiva fase dell'altopiano del potenziale di membrana (altopiano IR). (C) La traccia di tensione espansa di un picco di rheobasic con una linea orizzontale tratteggiata che indica la soglia di tensione del picco. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetti della polarizzazione sulla cottura del motoneurone.
(A) Record intracellulari da un motoneurone stimolato intracellularmente con 7,5 nA per 500 ms, effettuate prima (a sinistra), durante tsDCS anodale (0,1 mA, metà), e 10 min dopo la fine della polarizzazione (a destra). Si noti il graduale aumento dell'eccitabilità del motoneurone alla stessa intensità di stimolo. (B) Record intracellulari da un altro motoneurone stimolato intracellulare con 6 nA per 500 ms, fatto prima (a sinistra), durante tsDCS catodale (0,1 mA, metà), e 10 min dopo la fine della polarizzazione (a destra). Si noti una graduale inibizione della frequenza di cottura del motoneurone alla stessa intensità di stimolo. Di seguito le registrazioni, vengono fornite tracce di corrente di stimolazione intracellulare. Le barre di calibrazione in basso a destra si applicano a tutte le registrazioni intracellulari presentate. I valori del potenziale di membrana a riposo sono forniti a sinistra di ogni registrazione. Le frequenze di cottura a stato costante, calcolate dai mezzi degli ultimi tre intervalli interspike, sono date sopra i record. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempi di record non ottimali come risultato di deviazioni dal protocollo sperimentale.
(A) Il picco antidromico registrato da un motoneurone non è penetrato in modo inadeguato. Il potenziale di membrana a riposo è insufficiente (-45 mV), e nonostante una forma appropriata del picco con tutte le fasi consecutive di depolarizzazione, repolarizzazione e iperpolarizzazione, la sua ampiezza è troppo bassa (41 mV) e senza un superamento. (B) Un picco di rheobasic generato a una soglia di tensione irrealistica (membrana depolarizzata a 68 mV). Questo tipo di errore è di solito dovuto a un microelettrodo bloccato, con resistenza e capacità non ricompensate. Si può anche vedere che questo record è fortemente contaminato da 50 Hz di rumore elettrico. (C) Una cottura ritmica motoneurone in risposta a 500 ms di depolarizzazione corrente, con grandi fluttuazioni di un potenziale di membrana, prevalentemente causata da penetrazione instabile microelettrodi, probabilmente a causa di movimenti respiratori eccessivi. Per tutti i casi presentati la membrana calcolata o le proprietà di cottura sarebbero inaffidabili. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Se eseguita correttamente, la parte chirurgica del protocollo descritto deve essere completata entro circa tre ore. Si dovrebbe fare particolare attenzione nel mantenere condizioni fisiologiche stabili di un animale durante l'intervento chirurgico, in particolare la temperatura corporea e la profondità dell'anestesia. A parte ovvie considerazioni etiche, la mancanza di un'anestesia adeguata può provocare eccessivi movimenti degli arti durante la dissezione nervosa o la laminectomia e portare a danni alla preparazione o a una terminazione prematura dell'esperimento. Quando paralizza un animale prima di penetrare il midollo spinale con un microelettrodo, è fondamentale monitorare la profondità dell'anestesia e della frequenza cardiaca e applicare adeguati parametri di ventilazione in base al peso animale e alla capacità polmonare. Eventuali deviazioni dai parametri fisiologici desiderati devono essere modificate immediatamente per garantire il successo della procedura. Dopo l'intervento chirurgico, condizioni di registrazione stabili dovrebbero essere possibili per mantenere per almeno quattro ore.
Dopo la penetrazione di un motoneurone, la stabilità di registrazione è di grande importanza. È imperativo che un potenziale di membrana rimanga costante durante le registrazioni di controllo, poiché qualsiasi fluttuazioni influenzerà significativamente la corrente di reobase e una soglia di cottura ritmica. Una corretta fissazione della colonna vertebrale dovrebbe fornire stabilità di base, mentre l'obiettivo di uno pneumotorace è quello di diminuire i movimenti del midollo spinale evocati dalla respirazione. Inoltre, si deve essere sicuri che le contrazioni muscolari sono completamente abolite prima di tentare la penetrazione e il bloccante neuromuscolare viene somministrato a intervalli regolari.
A seguito di una penetrazione di penetrazione di successo l'identificazione antidromica del motoneurone registrato può essere eseguita stimolando un rispettivo ramo nervoso. Questo è un vero vantaggio di una preparazione in vivo, in cui gli assoni di motoneuron sono tenuti in continuità con i muscoli innervati in riferimento alle registrazioni intracellulari in vitro eseguite su fette spinali, che solo di recente sono state possibili negli animali adulti16, ma non consentono l'identificazione del motoneurone registrato. Tuttavia, è importante che i ricercatori abbiano una chiara comprensione della differenza tra l'attivazione antidromica e ortodromica del motoneurone19 per evitare un'errata interpretazione dei dati. È importante mantenere la stimolazione nervosa periferica il più bassa possibile (meno di 0,5 V) per prevenire l'attivazione di nervi aggiuntivi a causa della diffusione corrente e prestare attenzione a una costante e breve latenza del picco antidromatico19.
Un altro vantaggio della tecnica presentata è che i motoneuroni possono essere inoltre classificati come tipi veloci o lenti sulla base dei loro parametri potenziali di azione, vale a dire la durata AHP-HDT17. La differenziazione tra i motoneuroni che innervonano le fibre muscolari di tipo veloce e lento è fondamentale per quanto riguarda il loro diverso contributo alle prestazioni muscolari durante i movimenti. Inoltre, i motoneuroni veloci e lenti possono reagire in modo diverso alla polarizzazione9.
Per garantire risultati affidabili della polarizzazione si dovrebbe prestare attenzione all'impostazione di parametri adeguati di tsDCS. L'intensità attuale dovrebbe, da un lato, fornire una densità di campo desiderata nell'area selezionata per evocare effetti sulle reti neuronali, mentre dall'altro dovrebbe essere entro i limiti di sicurezza per il dannotissu/tessuto 20. Anche le dimensioni degli elettrodi attivi e di riferimento e il loro posizionamento per quanto riguarda un sito di registrazione sono elementi importanti daconsiderare 4, e il tempo di applicazione della durata tsDCS dovrebbe essere sufficiente a evocare gli effettidesiderati 16,17,22. In questo caso, i risultati rappresentativi sono stati ottenuti mediante l'applicazione di una polarizzazione catodale o anodale di 100 A per 15 min. Tenendo conto della forma e del diametro dell'elettrodo, la rispettiva intensità del campo elettrico direttamente sotto l'elettrodo era di 39,25 mm2. Tuttavia, si dovrebbe capire che il valore preciso del campo elettrico nel sito di motoneuron registrato è impossibile pre-determinare come posizione motoneuron rispetto all'elettrodo di polarizzazione varia, e la densità del campo e scende significativamente con una maggiore profondità e diminuzione della dimensione degli elettrodi4,24. Inoltre, l'orientamento dei compartimenti motoneuroni rispetto al campo elettrico applicato è importante per la generazione di potenzialid'azione 22,25,26, e questo non può essere previsto per le singole celle. Inoltre, è molto importante capire che gli effetti tsDCS non si limitano a un periodo di polarizzazione e che gli effetti persistenti e duraturi sono ben documentati22,27. Pertanto, a seguito anche di una singola, breve sessione di polarizzazione, tutte le registrazioni successive nella stessa preparazione verrebbero eseguite in condizioni di post-polarizzazione, il che limita il numero di possibili registrazioni acute di polarizzazione a una per animale.
Ulteriori modifiche della procedura presentata possono essere apportate per rispondere a domande di ricerca specifiche. Questo protocollo con modifiche minime può essere utilizzato come standard per diversi progetti sperimentali, ad esempio quando si testano varie durate e/o ampiezze di tsDCS applicati o quando si confrontano effetti a breve o lungo termine di tsDCS in vari pool di motoneuroni. L'uso di diversi modelli di malattia genetica (ad esempio modello di ratto SOD1 G93A di sclerosi laterale amiotrofica) o nervi diversi per l'attivazione del nervo antidromatico (peroneale, tibiale, saphenous, ecc.) è accettabile. Tuttavia, si dovrebbe anche essere consapevoli delle limitazioni di procedura. Ad esempio, l'uso di barbiturici per l'anestesia inibisce l'attività delle correnti indiversi persistenti28, mentre l'introduzione sistemica di specifici bloccanti comunemente utilizzati nei preparati in vitro (ad esempio, stricnina per bloccare i recettori nicotinici) può rivelarsi fatale per l'animale. Si consiglia ai ricercatori di considerare queste limitazioni prima di selezionare il protocollo sperimentale appropriato.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Science Center n. 2017/25/B/N/7/00373. Gli autori vorrebbero riconoscere il lavoro di Hanna Drzymaa-Celichowska e W'odzimierz Mr'cwczy'ski, che hanno entrambi contribuito alla raccolta e all'analisi dei risultati presentati in questo documento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
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