Summary
Este protocolo describe el registro intracelular in vivo de motoneurones lumbares de rata con estimulación simultánea de corriente directa trans-espinal. El método nos permite medir las propiedades de la membrana y registrar la cocción rítmica de motoneurones antes, durante y después de la polarización anodal o catódal de la médula espinal.
Abstract
El registro intracelular de motoneurones espinales in vivo proporciona un "estándar de oro" para determinar las características electrofisiológicas de las células en la red espinal intacta y posee ventajas significativas en relación con las técnicas clásicas de registro in vitro o extracelular. Una ventaja de las grabaciones intracelulares in vivo es que este método se puede realizar en animales adultos con un sistema nervioso completamente maduro, y por lo tanto muchos mecanismos fisiológicos observados se pueden traducir a aplicaciones prácticas. En este documento metodológico, describimos este procedimiento combinado con la estimulación de corriente constante aplicada externamente, que imita los procesos de polarización que ocurren dentro de las redes neuronales espinales. La estimulación de corriente directa trans-espinal (tsDCS) es un método innovador cada vez más utilizado como una intervención neuromoduladora en la rehabilitación después de diversas lesiones neurológicas, así como en deportes. La influencia de tsDCS en el sistema nervioso sigue siendo mal entendida y los mecanismos fisiológicos detrás de sus acciones son en gran parte desconocidos. La aplicación del tsDCS simultáneamente con grabaciones intracelulares nos permite observar directamente los cambios de las propiedades de la membrana del motoneurón y las características de la cocción rítmica en respuesta a la polarización de la red neuronal espinal, que es crucial para la comprensión de las acciones tsDCS. Por otra parte, cuando el protocolo presentado incluye la identificación del motoneuron con respecto a un músculo inervado y su función (flexor versus extensor) así como el tipo fisiológico (rápido versus lento) proporciona una oportunidad para investigar selectivamente la influencia de tsDCS en los componentes identificados del circuito espinal, que parecen verse afectados de manera diferente por la polarización. El procedimiento presentado se centra en la preparación quirúrgica para grabaciones intracelulares y estimulación con énfasis en los pasos que son necesarios para lograr la estabilidad de la preparación y la reproducibilidad de los resultados. Los detalles de la metodología de la aplicación anodal o cathodal tsDCS se discuten mientras se presta atención a cuestiones prácticas y de seguridad.
Introduction
La estimulación de corriente directa trans-espinal (tsDCS) está ganando reconocimiento como un método potente para modificar la excitabilidad del circuito espinal en la salud y la enfermedad1,2,3. En esta técnica, se pasa una corriente constante entre un electrodo activo situado por encima de los segmentos espinales seleccionados, con un electrodo de referencia situado ventralmente o más rostralmente4. Varios estudios ya han confirmado que el tsDCS se puede utilizar en el manejo de ciertas condiciones patológicas, como el dolor neuropático5,la espasticidad6,la lesión de la médula espinal7 o para facilitar la rehabilitación8. Los investigadores sugieren que tsDCS evoca alteraciones en la distribución iónica entre el espacio intracelular y el espacio extracelular a través de la membrana celular, y esto puede facilitar o inhibir la actividad neuronal dependiendo de la orientación actual9,10,11. Sin embargo, hasta hace poco, faltaba una confirmación directa de esta influencia en las motoneurones.
Aquí, describimos un protocolo detallado para llevar a cabo el registro intracelular in vivo de potenciales eléctricos de motoneurones espinales lumbares en la rata anestesiada con aplicación simultánea de tsDCS, con el fin de observar cambios en la membrana de motoneuron y propiedades de disparo en respuesta a la polarización anodal o cathodal de la red neuronal espinal. Las grabaciones intracelulares abren varias áreas de investigación de las propiedades de las neuronas, no disponibles para las técnicas extracelulares utilizadas anteriormente9,,12. Por ejemplo, es posible medir con precisión la respuesta de voltaje de membrana de motoneuron al flujo de corriente directa inducido por tsDCS, indicar el umbral de voltaje para la generación de picos, o analizar los parámetros potenciales de acción. Además, esta técnica nos permite determinar las propiedades de la membrana pasiva del motoneurón, como la resistencia a la entrada, y observar la relación entre la corriente de estimulación intracelular y la frecuencia de cocción rítmica de motoneurones. La identificación antidrómica del motoneurón registrado, basada en la estimulación de los nervios identificados funcionalmente (es decir, los nervios que proporcionan aferentes a flexores o extensores) nos permite identificar adicionalmente tipos de unidades motoras inervadas (rápidas frente a lentas), lo que da la oportunidad de probar si la polarización influye de manera diferente en los elementos individuales del sistema neuronal espinal maduro. Debido a la extensa cirugía anterior al registro y a los altos requisitos de estabilidad y fiabilidad de las grabaciones, esta técnica es muy difícil, pero permite una evaluación directa y a largo plazo de las características electrofisiológicas de un motoneuron: antes, durante y después de la aplicación de tsDCS, lo que es crucial para determinar tanto sus acciones agudas como los efectos persistentes13. Como un motoneuron activa directamente las fibras musculares extrafusales14 y participa en el control de retroalimentación de una contracción muscular y fuerza desarrollada15,16 cualquier influencia observada de tsDCS en la unidad motora o propiedades contráctiles musculares pueden estar vinculadas a modulaciones de excitabilidad de motoneuron o características de disparo.
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Protocol
Todos los procedimientos relacionados con este protocolo han sido aceptados por las autoridades competentes (por ejemplo, el Comité Local de ética) y siguen las normas nacionales e internacionales sobre bienestar y gestión de los animales.
NOTA: Cada participante involucrado en el procedimiento tiene que estar debidamente capacitado en procedimientos quirúrgicos básicos y tiene que tener una licencia válida para realizar experimentos con animales.
1. Anestesia y premedicación
- Anestesiar a una rata con inyecciones intraperitoneales de pentobarbital sódico (una dosis inicial de 60 mg-kg-1 para ratas Wistar macho de 6 meses de edad que pesan 400-u2012550g).
NOTA: Este protocolo no se limita a la cepa indicada, el sexo o la edad de las ratas. Además, la anestesia alternativa como la mezcla de ketamina-xilazina, alfa-cloralosa o fentanilo+midazolam+medetomidina se puede utilizar si es más adecuado para diferentes objetivos de investigación o cuando sea requerido por el comité de ética. - Después de aproximadamente 5 minutos, compruebe la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del frente de la rata con fórceps rommosos. Continúe con los siguientes pasos del protocolo solo cuando no se observe ninguna acción reflex.
- Inyectar 0,05 ml de atropina por vía subcutánea para reducir la producción de moco después de la intubación.
- Inyectar por vía subcutánea 5 ml de tampón de fosfato que contenga 4% de solución de glucosa, NaHCO3 (1 %) y gelatina (14%). Este tampón será absorbido por los vasos cutáneos a lo largo de un experimento y ayudará a mantener el equilibrio de fluidos.
- A lo largo de la cirugía, revise periódicamente al animal en busca de acciones reflejos y complemente la anestesia si es necesario (10 mg-kg-1-h-1de pentobarbital sódico).
2. Cirugía
- Preparar al animal para el tratamiento quirúrgico afeitando el pelaje sobre la parte dorsal de la extremidad posterior izquierda, desde el tobillo hasta la cadera, la parte posterior, desde la cola hasta los segmentos torácicos altos, el lado izquierdo del pecho y el lado ventral de la zona del cuello por encima del esternón por encima del esternón por encima del esternón por encima del esternón
- Colocación de la vía intravenosa
- Coloque la rata sobre su espalda en una almohadilla de calentamiento de bucle cerrado (y fíjela con fijaciones de extremidades).
- Usando una hoja 21, haz un corte longitudinal a través de la piel desde un esternón hasta una barbilla.
- Sostenga la piel con fórceps y sepárela del tejido subyacente.
- El uso de técnicas de disección contundentes expone la vena yugular derecha. Diseccionar cuidadosamente la vena de los tejidos circundantes.
- Localice la parte de la vena sin puntos de ramificación, deslice dos ligaduras 4-0 debajo de ella.
- Haga un nudo suelto en el extremo proximal del segmento no ramificado previamente identificado de la vena y un nudo suelto en el extremo distal de este segmento de la vena. Sujeta la vena proximal al corazón y luego liga la parte distal de la vena.
- Usando tijeras de iris, haga una incisión entre la abrazadera y la ligadura distante. Sostenga una solapa de la vena e introduzca un catéter precargado hasta el punto donde está bloqueado por la abrazadera.
- Mientras sostiene la vena y el catéter junto con fórceps, retire la abrazadera y empuje el catéter varios milímetros en la vena. Asegure ambos extremos del catéter a la vena y agregue un punto de fijación adicional a la piel.
- Introducción del tubo traqueal
- El uso de fórceps contundentes separa las dos glándulas mandibulares que cubren los músculos esternohoides. Separe los músculos esternohoides en la línea media para exponer la tráquea.
- Deslice tres ligaduras 4-0 debajo de la tráquea, luego haga dos nudos por debajo del punto de inserción del tubo traqueal y un nudo por encima.
- Localice el cartílago cricoide de la laringe y haga una incisión debajo del tercer cartílago traqueal.
- Inserte un tubo traqueal por la tráquea y fije el tubo en su lugar con ligaduras pre-preparadas, luego agregue una ligadura adicional a la piel.
- Coloque un pequeño trozo de lana de algodón por encima de los músculos separados y sutura la piel sobre el área operada.
- Disección de los nervios de las extremidades posteriores
- Usando 21 cuchillas, haz un corte longitudinal en el lado posterior de la extremidad posterior izquierda, desde el tendón de Aquiles hasta la cadera.
- Agarre la piel con fórceps, y el uso de técnicas de disección contundente separan la piel de los músculos subyacentes en ambos lados de la incisión.
- Localice la fosa popliteal en la parte posterior de la articulación de la rodilla, que está cubierta por el músculo femoris del bíceps, y usando tijeras hacen un corte entre la parte anterior y posterior de este músculo.
- Moverse hacia arriba corta dos cabezas del bíceps femoris hasta la cadera para exponer el nervio ciático. Cauterizar según sea necesario para prevenir el sangrado.
- Identificar las ramas sural, tibial y peroneal común del nervio ciático.
- Usando tijeras, separe el lateral de la cabeza medial del músculo gastrocnemius para exponer el nervio tibial y sus ramas.
- Usando 55 fórceps agarrar el extremo distal del nervio sural, cortarlo distalmente y diseccionar en la medida de lo posible.
- Repita el procedimiento con el nervio peroneo común.
- Usando una varilla de vidrio contundente separar el nervio tibial de los tejidos circundantes, teniendo cuidado de no dañar los vasos sanguíneos, y cortarlo distalmente.
- Identificar los nervios gastrocnemius medial (MG) y los nervios laterales gastrocnemius y soleus (LGS).
- Usando 55 fórceps, disecciona cuidadosamente los nervios MG y LGS, desconectándolos de los tejidos circundantes, pero manteniendo su conexión con los músculos respectivos.
- Coloque un trozo de lana de algodón empapado en solución salina debajo de los nervios expuestos.
- Cierre la piel sobre el área operada.
- Laminectomy
- Usando 21 cuchillas hacer una incisión longitudinal desde el sacro hasta las vértebras torácicas.
- Separe la piel de los músculos subyacentes.
- Corte el músculo longissimus a ambos lados de los procesos torácicos y lumbares espinosos.
- El uso de bisturí de bordes rommosos retrae los músculos de la columna vertebral para exponer los procesos transversales de cada vértebra.
- El uso de tijeras de punta contundentes cortar los tendones de los músculos conectados a los procesos transversales a lo largo de la columna vertebral expuesta. Aplicar agentes hemostáticos si es necesario.
- Identifique la vértebra Th13 como el segmento torácico más bajo con inserción de costillas y el uso de rongeurs finos elimina los procesos espinosos y las láminas de las vértebras Th13 a L2 para exponer los segmentos lumbares de la médula espinal. Recuerde no dañar el proceso espinoso L3 que se utilizará como punto de fijación para la estabilización de la columna vertebral.
- Retire el proceso espinoso Th12 y alisa la superficie dorsal de la vértebra tanto como sea posible.
- El uso de técnicas de disección contundente separa los músculos de la vértebra Th11 para crear puntos de inserción del soporte.
- Coloque lana de algodón fina empapada en solución salina sobre los segmentos expuestos de la médula espinal.
- Mueva la rata al marco de metal hecho a medida con dos barras paralelas y dos brazos ajustables con abrazaderas para apoyar y estabilizar la columna vertebral.
3. Preparación para la grabación y estimulación
- Fijación de la columna vertebral y disposición nerviosa
- Coloque la rata en el marco a medida sobre una almohadilla de calentamiento, conectada al sistema de calentamiento de bucle cerrado para mantener la temperatura corporal del animal a 37 oC a 1oC.
- Inserte electrodos ECG debajo de la piel y conéctelo a un amplificador para la monitorización de la frecuencia cardíaca.
- Usando los colgajos de la piel, forme una piscina profunda sobre la médula espinal expuesta.
- Usando abrazaderas metálicas, fije la columna vertebral colocando abrazaderas por debajo de los procesos transversales Th12 y en el proceso espinoso L3.
- Asegúrese de que la columna vertebral esté asegurada y dispuesta horizontalmente, y luego aplique presión dorso-ventral en ambos lados de la columna para retraer los músculos.
- Llenar la piscina con aceite mineral caliente (37 oC) y mantenerla a esta temperatura.
- Enhebrar una ligadura 4-0 a través del tendón de Aquiles, levantar y estirar la extremidad posterior izquierda operada para que el tobillo se nivele con la cadera.
- El uso de las solapas de la piel hace una piscina profunda sobre los nervios tibial, MG y LGS expuestos.
- Llenar la piscina con aceite mineral caliente (37 oC).
- Coloque los nervios MG y LGS en electrodos estimulantes bipolares de alambre de plata y conéctelos a un estimulador de pulso cuadrado. Utilice canales de estimulación separados para cada nervio.
- Colocación de electrodos superficiales
- Coloque un electrodo de bola de plata en el lado caudal izquierdo de la médula espinal expuesta, con un electrodo de referencia insertado en los músculos de la espalda, y conecte ambos electrodos al amplificador diferencial de CC. El electrodo de bola de superficie se utilizará para registrar voleas aferentes de los nervios.
- Usando un estimulador de corriente constante, estimular los nervios MG y LGS con pulsos cuadrados de 0,1 ms de duración, repetidos a una frecuencia de 3 Hz, y observar voleas aferentes.
- Determinar el umbral (T) para la activación del nervio, estimular cada nervio a aproximadamente 3o Intensidad T, y registrar la amplitud de la volea aferente para cada nervio.
- Mueva el electrodo de superficie rostral y repita el procedimiento para identificar los segmentos espinales en los que las amplitudes de las voleas son las más altas para cada nervio. Después de determinar la ubicación máxima de la volea, mueva el electrodo de superficie a una distancia segura de la médula espinal.
- Parálisis muscular y formación de neumotórax para reducir los movimientos respiratorios
- Paralice la rata por vía intravenosa con un bloqueador neuromuscular y conecte el tubo traqueal a un respirador externo en línea con un capnómetro compatible con roedores (bromuro de pancuronio, a una dosis inicial de 0,4 mg-kg-1, complementado cada 30 min en dosis de 0,2 mg-kg-1)
- Supervise la concentración deCO2 de marea final y mantenla en aproximadamente 3-u20124% ajustando los parámetros de ventilación (frecuencia, presión de aire y volúmenes de flujo).
- Haga una incisión longitudinal en la piel entre la 5a y la 6a costilla en un lado de la grabación.
- El uso de tijeras de punta contundentes cortar los músculos superables para visualizar el espacio intercostal entre las costillas.
- Usando tijeras afiladas pequeñas, haz una pequeña incisión en los músculos intercostales y en la pleura, luego inserta una punta de un borde romo fórceps en la abertura, teniendo cuidado de no presionar los pulmones.
- Permita que los fórceps se expandan o inserte un tubo pequeño para mantener el neumotórax abierto durante todo el experimento.
- Después del bloqueo neuromuscular, controlar la profundidad de la anestesia mediante la comprobación de la frecuencia del ECG, y complementar el agente anestésico si la frecuencia cardíaca supera los 400 ppm. Parálisis muscular y formación de neumotórax con el fin de reducir los movimientos respiratorios, lo que mejorará la estabilidad de grabación
- Abrir la dura y la pia mater
- Usando fórceps #55, levante suavemente el dura mater, y córtelo caudalmente desde el segmento L5, rostralmente hasta el segmento L4.
- Usando un par de fórceps 5SF ultradelgadas hacen un pequeño parche en la pia que cubre la columna dorsal, entre los vasos sanguíneos, exactamente al nivel de la volea aferente máxima del MG o el nervio LGS.
- Utilice pequeños trozos de espuma de gel seca y empapada de solución salina para bloquear el sangrado si es necesario.
- colocación de electrodos tsDCS
- Hacer una pequeña incisión en la piel en el lado ventral de un abdomen de rata a nivel de rostro-caudal correspondiente a la ubicación de los segmentos de la columna vertebral L4-L5.
- Agarre la solapa de la piel expuesta con un clip de metal que servirá como electrodo de referencia.
- Coloque una esponja empapada en solución salina en el lado dorsal de la vértebra Th12. Asegúrese de que el tamaño de la esponja sea igual al de un electrodo tsDCS activo (placa de acero inoxidable en forma de círculo de 5 mm de diámetro).
- Usando un manipulador fino, presione la esponja con un electrodo tsDCS activo en el hueso y asegúrese de que toda la superficie del electrodo esté presionada por igual.
- Conecte los electrodos tsDCS de referencia y activos a una unidad estimuladora de corriente constante, capaz de proporcionar un flujo continuo de corriente directa.
- Preparación de micropipetas
- Con un tirador de microelectrodo, prepare un microelectrodo.
NOTA: Tanto los electrodos de filamento como los no filamentos se pueden utilizar, sin embargo, recuerde que el vástago del electrodo debe ser lo suficientemente largo como para alcanzar el cuerno ventral mientras es lo suficientemente delgado como para no comprimir la médula espinal mientras desciende.- Ajuste el ajuste del tirador de modo que el vástago que entra en la médula espinal sea de aproximadamente 3 mm de largo, mientras que la punta del electrodo no es más de 1 u20122 m de diámetro y la resistencia a los microelectromos está entre 10 y 20 M.
- Llene los microelectrodos con electrolito de potasio-citrato 2M.
- Monte el microelectrodo preparado en el micromaniprulador, lo que permite un movimiento escalonado de 1-u20122 y una calibración estereotaxia.
- Conecte el microelectrodo al amplificador intracelular con el electrodo de referencia colocado en los músculos de la espalda.
- Con un tirador de microelectrodo, prepare un microelectrodo.
- Después del bloqueo neuromuscular, controlar la profundidad de la anestesia mediante la comprobación de la frecuencia del ECG, y complementar el agente anestésico para que la frecuencia cardíaca de la rata no exceda 400 bpm.
4. Seguimiento y penetración de Motoneuron
- Coloque el electrodo de grabación de volea aferente de nuevo en la superficie dorsal de la médula espinal, caudalmente a la ubicación del sitio de grabación, a nivel del segmento L6.
- Estimular los nervios MG y LGS con pulsos eléctricos de 0,1 ms a una frecuencia de 3 Hz, e intensidad 3T, para activar todos los axones de alfa-motoneurons dentro de un nervio seleccionado.
- Conduzca la micropipeta en un parche seleccionado en la pia con un ángulo medio-lateral de 15o u201220o (con una punta dirigida lateralmente).
- Después de descender por debajo de la superficie, calibrar el microelectrodo y compensar su capacitancia y compensación de voltaje, y continuar la penetración de la médula espinal cuando todos los parámetros son estables. Un potencial de campo antidrómico de la piscina de motoneuron será visible en la traza de voltaje de microelectrodo mientras se acerca a un núcleo motor dedicado durante la estimulación del nervio respectivo.
- Proceda a la penetración con el microelectrodo a pasos de 1-u20122 m, y utilice periódicamente la función de zumbido del amplificador intracelular para eliminar la punta del electrodo de cualquier residuo.
- Observe la penetración de motoneuron que se caracterizará por una hiperpolarización repentina de la traza de voltaje registrada y la aparición de un potencial de pico antidrómico.
5. Grabación de la membrana del motoneurón y propiedades de disparo
- En un modo puente del amplificador intracelular, identifique el motoneuron sobre la base de la apariencia de "todo o nada" del potencial de acción antidrómica estimulando las respectivas ramas nerviosas. Registre 20 seguimientos posteriores para promediación posterior.
- Implementar un criterio de inclusión estricto para garantizar datos de alta calidad: potencial de membrana en reposo de al menos -50 mV de amplitud; amplitudes potenciales de acción superiores a 50 mV, con un exceso positivo; potencial de membrana estable durante al menos 5 minutos antes de la grabación.
- En un modo de abrazadera de corriente discontinua (modo de velocidad de conmutación de corriente 4-8 kHz) del amplificador intracelular, evocan un potencial de acción ortodrómica en una motoneuron utilizando pulsos de corriente despolarizante intracelular de 0,5 ms. Repita al menos 20 veces para el promediado sin conexión.
- Estimular un motoneuron con 40 pulsos cortos (100 ms) de corriente hiperpolarizante (1 nA) con el fin de calcular la resistencia de entrada de la célula.
- Estimular una motoneuron con pulsos de onda cuadrada de 50 ms en amplitudes crecientes para determinar el valor de la reobase como la amplitud mínima de corriente despolarizante necesaria para provocar un solo pico.
- Inyectar pulsos de onda cuadrada de 500 ms de corriente despolarizante, a amplitudes crecientes en pasos de 0.1–2 nA para evocar descargas rítmicas de motoneurones.
6. Estimulación de corriente directa trans-espinal (tsDCS)
- Mientras mantiene una penetración estable del motoneuron, inicie el procedimiento de polarización mediante la aplicación trans-espinal de corriente directa. Ajuste la intensidad actual y el tiempo de aplicación al diseño del experimento (por ejemplo, 0,1 mA durante 15 min).
- Inmediatamente después de encender el CC, observe el potencial de la membrana de la motoneurón. La polarización anodal (el electrodo activo como ánodo) debe dar lugar a la despolarización del potencial de la membrana, mientras que la polarización catodal (el electrodo activo como cátodo) debe evocar un efecto opuesto. Observe si un cambio en el potencial de la membrana en reposo en respuesta a la estimulación de CC es constante, lo que garantiza que la intensidad del campo eléctrico no se vea afectada.
- Durante la aplicación de corriente continua, repita los pasos 5.3-u20125.6 en intervalos de 5 min.
- Apague el controlador de dominio y continúe repitiendo los pasos 5.3-u20125.6 en intervalos de 5 minutos hasta que las grabaciones se vuelvan inestables o los criterios de inclusión se vean comprometidos.
- Terminar el experimento y eutanasiar al animal mediante la administración intravenosa de una dosis letal de pentobarbital sódico (180 mg-kg-1).
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Representative Results
Los parámetros de los potenciales de acción y varias propiedades de membrana se pueden calcular sobre la base de grabaciones intracelulares cuando se aseguran condiciones estables de penetración celular. La Figura 1A presenta un potencial de acción ortodrómica típico evocado por la estimulación intracelular, que cumple con todos los criterios de inclusión de datos (el potencial de membrana en reposo de al menos -50 mV, y la amplitud del pico superior a 50 mV, con un exceso positivo). Se pueden medir los parámetros potenciales de acción, como la amplitud del pico, la amplitud de la posthiperpolarización o el tiempo de semicando de la afterhiperpolarización (AHP-HDT). Un valor de este último parámetro en motoneurones de rata sirve como un criterio fiable para distinguir entre motoneurones rápidos y lentos (AHP-HDT > 20 ms para lento, mientras que AHP-HDT <20 ms para motoneurones rápidos)17. La Figura 1B muestra una respuesta celular a un pulso de corriente hiperpolarizante de 100 ms de 1nA, a partir del cual se puede determinar tanto la resistencia de entrada de pico como la meseta (IR) de un motoneuron a partir de la desviación de voltaje. La Figura 1C muestra un trazado de voltaje expandido de un pico reobásico con un umbral de voltaje claramente marcado del pico, que indica el nivel de despolarización de la membrana en el que se activan los canales de sodio cerrados por voltaje para iniciar el potencial de acción. Todas estas grabaciones se pueden repetir varias veces durante y después de la aplicación tsDCS, lo que nos permite comparar los parámetros respectivos siempre y cuando el potencial de la membrana en reposo sea estable y se cumplan otros criterios de estimulación y protocolo de registro.
Varios estudios han demostrado indirectamente que tsDCS altera la excitabilidad de la motoneuron y el patrón de disparo9,18. La Figura 2 muestra ejemplos de trazas de voltaje intracelular de dos motoneurones estimulados intracelularmente con pulsos cuadrados de 500 ms de corriente despolarizante antes, durante y después de la aplicación de tsDCS. En condiciones estables, se pueden realizar grabaciones repetidas varios minutos uno tras otro, y los patrones de disparo de motoneuron se pueden comparar de forma fiable. Se encontró que el tsDCS anodal (+) actuaba para aumentar la excitabilidad del motoneurón y las frecuencias más altas de disparo rítmico(Figura 2A),mientras que el cathodal (-) tsDCS actuó para activar la inhibición (Figura 2B). Además, los efectos de ambos tipos de tsDCS superaron el período de polarización. También vale la pena señalar que los cambios observados en la excitabilidad y el patrón de disparo no son simplemente el resultado de la despolarización de la membrana celular o la hiperpolarización por anodal o cathodal tsDCS, respectivamente, pero muestran alteraciones profundas no relacionadas con el cambio de un potencial de membrana, ya que persistieron a pesar del hecho de que este parámetro volvió a una línea de base después del final de la polarización.
Por último, hay que subrayar que cualquier desviación del protocolo presentado probablemente dará lugar a un experimento fallido, debido al deterioro de la preparación y / o una profunda disminución de la fiabilidad de los datos. La Figura 3 muestra ejemplos de grabaciones cuando los criterios de inclusión de datos se vieron comprometidos ya sea debido a la penetración de células imperfectas (Figura 3A), descuido para compensar la resistencia y capacitancia de los microelectrodos (Figura 3B) o una inestabilidad de la médula espinal (Figura 3C). Es importante que los investigadores identifiquen estas grabaciones no óptimas e implementen acciones correctivas adecuadas o ignoren dichos resultados del conjunto de datos.
Figura 1: Parámetros de potencial de acción y propiedades de membrana.
(A) Un potencial de acción ortodrómica provocado por la estimulación intracelular, con parámetros básicos indicados que se pueden calcular a partir de este registro. AP ampl - amplitud potencial de acción; AHP ampl - amplitud de posthiperpolarización; AHP-HDT : tiempo de semicarriente de la perhiperpolarización después de la perhiperpolarización. (B) El rastro de tensión de una respuesta de membrana a un pulso de corriente despolarizante corto (100 ms) de intensidad 1nA, que nos permite calcular la resistencia de entrada (IR). Observe el pico de una posible desviación (IR Peak) seguido de una pequeña disminución y la siguiente fase de meseta del potencial de membrana (meseta IR). (C) La traza de tensión expandida de un pico reósico con una línea horizontal punteada que indica el umbral de tensión de pico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efectos de la polarización en el disparo de motoneuron.
(A) Registros intracelulares de una motoneuron estimulado intracelularmente con 7,5 nA para 500 ms, realizados antes (izquierda), durante tsDCS anodal (0,1 mA, medio) y 10 min después del final de la polarización (derecha). Tenga en cuenta el aumento gradual de la excitabilidad de motoneuron a la misma intensidad de estímulo. (B) Registros intracelulares de otra motoneuron estimulado intracelularmente con 6 nA para 500 ms, realizados antes (izquierda), durante tsDCS cathodal (0,1 mA, medio), y 10 min después del final de la polarización (derecha). Observe una inhibición gradual de la frecuencia de disparo de motoneuron a la misma intensidad de estímulo. A continuación se proporcionan trazas de corriente de estimulación intracelular. Las barras de calibración en la parte inferior derecha se aplican a todas las grabaciones intracelulares presentadas. Los valores del potencial de membrana de reposo se proporcionan a la izquierda de cada grabación. Las frecuencias de disparo de estado estacionario, calculadas a partir de los medios de los tres intervalos de interspike finales, se indican en los registros anteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de registros subóptimos como resultado de desviaciones del protocolo experimental.
(A) El pico antidrómico registrado por una motoneuron inadecuadamente penetrada. El potencial de membrana en reposo es insuficiente (-45 mV), y a pesar de una forma adecuada del pico con todas las fases consecutivas de despolarización, repolarización e hiperpolarización, su amplitud es demasiado baja (41 mV) y sin un exceso. (B) Un pico reobásico generado a un umbral de tensión poco realista (membrana despolarizada a +68 mV). Este tipo de error suele deberse a un microelectrodo bloqueado, con resistencia y capacitancia no compensadas. También se puede ver que este registro está fuertemente contaminado por un ruido eléctrico de 50 Hz. (C) Una disparo rítmica de motoneurón en respuesta a la corriente despolarizante de 500 ms, con grandes fluctuaciones de un potencial de membrana, causada predominantemente por la penetración inestable de microelectrodos, posiblemente debido a movimientos respiratorios excesivos. Para todos los casos presentados, la membrana calculada o las propiedades de cocción no serían fiables. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Si se realiza correctamente, la parte quirúrgica del protocolo descrito debe completarse en un plazo aproximado de tres horas. Uno debe tener especial cuidado en mantener condiciones fisiológicas estables de un animal durante la cirugía, en particular la temperatura corporal y la profundidad de la anestesia. Aparte de consideraciones éticas obvias, la falta de anestesia adecuada puede resultar en movimientos excesivos de las extremidades durante la disección nerviosa o laminectomía y conducir a daños en la preparación o una terminación prematura del experimento. Al paralizar un animal antes de penetrar la médula espinal con un microelectrodo, es crucial controlar la profundidad de la anestesia y la frecuencia cardíaca y aplicar parámetros de ventilación adecuados basados en el peso animal y la capacidad pulmonar. Cualquier desviación de los parámetros fisiológicos deseados debe modificarse inmediatamente para garantizar el éxito del procedimiento. Después de la cirugía, las condiciones de registro estables deben ser posibles de mantener durante al menos cuatro horas.
Después de la penetración de un motoneuron, la estabilidad de grabación es de gran importancia. Es imperativo que un potencial de membrana permanezca constante durante las grabaciones de control, ya que cualquier fluctuación influirá significativamente en la corriente de la reobase y un umbral de disparo rítmico. La fijación adecuada de la columna vertebral debe proporcionar estabilidad básica, mientras que el objetivo de un neumotórax es disminuir los movimientos de la médula espinal evocados por la respiración. Por otra parte, uno tiene que estar seguro de que las contracciones musculares se suprimen por completo antes de intentar la penetración y el bloqueador neuromuscular se administra a intervalos regulares.
Después de una penetración exitosa la identificación antidrómica de la motoneuron registrada se puede realizar mediante la estimulación de una rama nerviosa respectiva. Esta es una ventaja real de una preparación in vivo, en la que las axones de motoneuron se mantienen en continuidad con los músculos inervados en referencia a las grabaciones intracelulares in vitro realizadas en rodajas espinales, que sólo recientemente fueron posibles en animales adultos16,pero no permiten la identificación de motoneuron registrado. Sin embargo, es importante que los investigadores tengan una clara comprensión de la diferencia entre la activación antidrómica y ortorrómica de motoneurón19 para evitar la mala interpretación de los datos. Es importante mantener la estimulación nerviosa periférica lo más baja posible (menos de 0,5 V) para evitar la activación de nervios adicionales debido a la propagación actual y prestar atención a una latencia constante y corta del pico antidrómico19.
Otra ventaja de la técnica presentada es que las motoneurones pueden clasificarse adicionalmente como tipos rápidos o lentos sobre la base de sus parámetros potenciales de acción, a saber, la duración AHP-HDT17. La diferenciación entre motoneurones que inerva las fibras musculares de tipo rápido y lento es crucial en cuanto a su diferente contribución al rendimiento muscular durante los movimientos. Además, las motoneurones rápidas y lentas pueden reaccionar de manera diferente a la polarización9.
Para garantizar resultados fiables de polarización se debe prestar atención a la configuración de los parámetros adecuados de tsDCS. La intensidad actual debe, por un lado, proporcionar una densidad de campo deseada en la zona seleccionada para evocar efectos sobre las redes neuronales, mientras que, por otro lado, debe estar dentro de los límites de seguridad para el daño tisular20. El tamaño de los electrodos activos y de referencia y su colocación con respecto a un sitio de grabación también son elementos importantes a tener en cuenta4, y el tiempo de aplicación de la duración tsDCS debe ser suficiente para evocar los efectos deseados16,17,22. En este documento de métodos, los resultados representativos se obtuvieron mediante la aplicación de 100 a polarización catódal o anodal durante 15 min. Teniendo en cuenta la forma y el diámetro del electrodo, la intensidad de campo eléctrico respectiva directamente debajo del electrodo fue de 39,25 mm2. Sin embargo, uno debe entender que el valor preciso del campo eléctrico en el sitio de motoneuron registrado es imposible de pre-determinar como la ubicación del motoneuron con respecto al electrodo de polarización varía, y la densidad del campo electrónico cae significativamente con mayor profundidad y disminución del tamaño del electrodo4,,24. Además, la orientación de los compartimentos de motoneurón en relación con el campo eléctrico aplicado es importante para la generación de potenciales de acción22,25,26, y esto no se puede predecir para las células individuales. Además, es muy importante entender que los efectos tsDCS no se limitan a un período de polarización, y que los efectos persistentes y duraderos están bien documentados22,,27. Por lo tanto, después incluso de una sola breve sesión de polarización, todas las grabaciones sucesivas en la misma preparación se realizarían en condiciones posteriores a la polarización, lo que limita el número de posibles grabaciones de polarización aguda a una por animal.
Se pueden realizar modificaciones adicionales del procedimiento presentado para responder a preguntas específicas de investigación. Este protocolo con modificaciones mínimas se puede utilizar como estándar para varios diseños experimentales, por ejemplo, al probar varias duraciones y/o amplitudes de tsDCS aplicados o al comparar efectos a corto o largo plazo de tsDCS en varias motoneuronas de piscinas. El uso de varios modelos de enfermedades genéticas (por ejemplo, el modelo de rata SOD1 G93A de esclerosis lateral amiotrófica) o diferentes nervios para la activación de los nervios antidrómicos (peroneal, tibial, safenoso, etc.) es aceptable. Sin embargo, también hay que tener en cuenta las limitaciones del procedimiento. Por ejemplo, el uso de barbitúricos para la anestesia inhibe la actividad de las corrientes internas persistentes28,mientras que la introducción sistémica de bloqueadores específicos comúnmente utilizados en preparaciones in vitro (por ejemplo, estricnina para bloquear los receptores nicotínicos) puede resultar fatal para el animal. Es aconsejable que los investigadores consideren estas limitaciones antes de seleccionar el protocolo experimental adecuado.
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Disclosures
Los autores no tienen conflicto de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención No 2017/25/B/NZ7/00373 del Centro Nacional de Ciencias. A los autores les gustaría reconocer el trabajo de Hanna Drzyma-a-Celichowska y W-odzimierz Mrówczy-ski, quienes contribuyeron a la recopilación de datos y al análisis de los resultados presentados en este documento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
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