Summary
이 프로토콜은 동시 트랜스 척추 직접 전류 자극을 가진 쥐 요추 모토뉴런의 생체 내 세포 내 기록을 설명합니다. 이 방법을 통해 멤브레인 특성을 측정하고 척수의 무음 또는 음극 편광 전, 도중 및 후에 모토뉴런의 리듬 발사를 기록할 수 있습니다.
Abstract
생체 내에서 척추 운동신경의 세포내 기록은 그대로 척추 네트워크에서 세포의 전기 생리적 특성을 결정하기위한 "금 본위제"를 제공하고 고전적인 체외 또는 세포 외 기록 기술에 비해 상당한 장점을 보유하고 있습니다. 생체 내 세포 내 기록의 장점은 이 방법이 완전히 성숙한 신경계를 가진 성인 동물에서 수행될 수 있고, 따라서 많은 관찰된 생리적 기계장치가 실제 적인 응용 프로그램으로 번역될 수 있다는 것입니다. 이 방법론 논문에서, 우리는 척추 신경 네트워크 내에서 발생하는 편광 과정을 모방 외부적으로 적용 된 일정한 전류 자극과 결합된이 절차를 설명합니다. 트랜스 척추 직접 전류 자극 (tsDCS)은 스포츠뿐만 아니라 다양한 신경 손상 후 재활에 신경 조절 개입으로 점점 더 많이 사용되는 혁신적인 방법입니다. 신경계에 tsDCS의 영향은 제대로 이해 되지 남아 있으며 그것의 행동 뒤에 생리 적 메커니즘은 크게 알 수 없습니다. tsDCS를 세포내 기록과 동시에 적용하면 tsDCS 동작에 대한 이해가 중요한 척추 뉴런 네트워크의 편광에 대응하여 모토뉴런 막 특성및 리듬 발사특성의 변화를 직접 관찰할 수 있습니다. 더욱이, 제시된 프로토콜이 내측 근육 및 그 기능(굴곡 대 엑스텐서)과 생리적 유형(fast vs slow)에 대하여 모토뉴런의 식별을 포함할 때, 이는 편광에 의해 다르게 영향을 받는 척수 회로의 식별된 구성 요소에 대한 tsDCS의 영향을 선택적으로 조사할 수 있는 기회를 제공한다. 제시된 절차는 결과의 준비 안정성 및 재현성을 달성하는 데 필요한 단계에 중점을 두고 세포 내 기록 및 자극을 위한 외과 준비에 중점을 둡니다. 무음 또는 음극 tsDCS 응용 프로그램의 방법론의 세부 사항은 실용적이고 안전 문제에주의를 기울이면서 논의됩니다.
Introduction
트랜스-척추 직접 전류 자극(tsDCS)은 건강과,질병1,2,23에서척추 회로 흥분성을 수정하는 강력한 방법으로 인정을 받고 있다. 이 기법에서, 일정한 전류는 선택된 척추 세그먼트 위에 위치한 활성 전극 사이에 전달되며, 기준 전극은 통풍구 또는 더 rostrally4에위치한다. 여러 연구는 이미 tsDCS가 신경병증 통증5,경련6,척수 손상7 또는 재활을 용이하게하기 위해 특정 병리학 적 상태를 관리하는 데 사용될 수 있음을 확인했다8. 연구원은 tsDCS가 세포막을 가로 질러 세포내 및 세포 외 공간 사이 이온 분포에 있는 변경을 불러 일으킨다는 것을 건의하고, 이것은 현재방향에따라서 신경 활동을 촉진하거나 억제할 수 있습니다9,10,,11. 그러나, 최근까지, 모토 뉴런에 이 영향의 직접적인 확인이 부족했다.
여기서, 우리는 척추 신경 망의 무음 또는 음극 양극화에 대응하여 모토뉴런 막및 발사 특성의 변화를 관찰하기 위해, tsDCS의 동시 적용과 함께 마취 쥐에서 요추 척추 운동신경으로부터 전기 전위의 생체 내 세포 내 기록을 수행하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 세포 내 기록은 이전에 사용 된 세포 외 기술9,12에사용할 수없는 뉴런 특성의 조사의 여러영역을엽니 다. 예를 들어, tsDCS에 의해 유도된 직접 전류 흐름에 대한 모토뉴런 멤브레인 전압 반응을 정밀하게 측정하거나, 스파이크 생성을 위한 전압 임계값을 표시하거나, 동작 잠재적 파라미터를 분석할 수 있다. 더욱이, 이 기술은 입력 저항과 같은 모토뉴런 수동 막 특성을 결정하고, 세포내 자극 전류와 모토뉴런의 리듬 발사 빈도 사이의 관계를 관찰할 수 있게 한다. 기능적으로 확인된 신경(즉, 굴곡 또는 엑스텐서에 efferents을 제공하는 신경)의 자극에 기초하여 기록된 motoneuron의 항드로믹 식별은 편광이 성숙한 척추 뉴런 시스템의 개별 요소에 다르게 영향을 미치는지 여부를 테스트할 수 있는 기회를 제공하는 내부 모터 유닛(fast vs slow)의 유형을 추가로 식별할 수 있게 해줍니다. 기록의 안정성과 신뢰성에 대한 광범위한 수술과 높은 요구 사항으로 인해이 기술은 매우 도전적이지만 하나의 motoneuron의 전기 생리적 특성에 대한 직접적이고 장기적인 평가를 허용합니다 : 급성 행동과 지속적인효과(13)를결정하는 데 중요한 tsDCS의 적용 전, 도중 및 후. motoneuron직접 외경 근육섬유를 활성화 하 고 근육 수축및 개발 된 힘(15)의피드백 제어에 참여 하고,16 모터 단위 또는 근육 수축 특성에 tsDCS의 관찰 된 영향 motoneuron 흥분 성 또는 발사 특성의 변조에 연결 될 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜과 관련된 모든 절차는 해당 당국(예: 지역 윤리위원회)에 의해 받아들여졌으며 동물 복지 및 관리에 관한 국내 및 국제 규칙을 따릅니다.
참고: 절차에 관여하는 각 참가자는 기본적인 외과 적 수술에 적절하게 훈련되어야하며 동물 실험을 수행하기위한 유효한 라이센스를 가져야합니다.
1. 마취 및 사전 약물
- 나트륨 pentobarbital의 관면 주사로 쥐를 마취시킵니다 (400\u2012550g의 무게6 개월 된 남성 위스타 쥐에 대한 60 mg, kg-1의 초기 용량).
참고 : 이 프로토콜은 표시된 변형, 성별 또는 쥐의 나이에 국한되지 않습니다. 또한 케타민 자일라진 믹스, 알파 클로랄로오스 또는 펜타닐+미다졸람+메데토미딘과 같은 대체 마취는 다른 연구 목표에 더 적합하거나 윤리위원회에서 요구하는 경우 사용될 수 있다. - 약 5분 후, 쥐의 뒷팔두다리 발가락을 무딘 집게로 꼬집어 마취의 깊이를 확인하십시오. 반사 작용이 관찰되지 않은 경우에만 프로토콜의 다음 단계를 진행합니다.
- 삽관 후 점액 생산을 줄이기 위해 0.05 mL의 아트로핀을 피하하십시오.
- 4% 포도당 용액을 함유한 인산염 완충제 5mL, NaHCO3 (1%) 주입 및 젤라틴 (14 %). 이 버퍼는 실험 전반에 걸쳐 배분 용기에 흡수되며 유체 균형을 유지하는 데 도움이 됩니다.
- 수술 내내, 주기적으로 반사 작용에 대 한 동물을 확인 하 고 필요한 경우 마취를 보충 (10mg·kg·1·h-1나트륨 펜토바르비탈의).
2. 수술
- 왼쪽 뒷다리의 등쪽 부분, 발목에서 엉덩이, 뒤쪽, 꼬리에서 높은 흉부 세그먼트, 가슴의 왼쪽, 흉골 위의 목 부위의 복부 에 모피를 면도하여 외과 적 치료를위한 동물을 준비합니다.
- 정맥 라인의 배치
- 닫기 루프 가열 패드에 뒷면에 쥐를 배치 (사지 고정으로 고정).
- 21개의 블레이드를 사용하여 흉골에서 턱까지 피부를 세로로 자른다.
- 집게로 피부를 잡고 기본 조직에서 분리하십시오.
- 무딘 해부 기술을 사용하면 올바른 경정맥이 노출됩니다. 주변 조직에서 정맥을 조심스럽게 해부합니다.
- 분기 점 없이 정맥의 부분을 찾아, 그 아래에 두 개의 4-0 합자 미끄러.
- 정맥의 이전에 식별 된 비 분기 세그먼트의 근접 단부에 하나의 느슨한 매듭을 만들고 정맥의이 세그먼트의 말단 끝에 하나의 느슨한 매듭을. 정맥 근위를 심혼에 고정한 다음 정맥의 말단 부분을 리게이트합니다.
- 홍채 가위를 사용하여 클램프와 먼 합자 사이에 절개를 합니다. 정맥의 플랩을 잡고 클램프에 의해 차단되는 지점에 미리 채워진 카테터를 소개합니다.
- 정맥과 카테터를 집게와 함께 들고 있는 동안 클램프를 제거하고 카테터를 몇 밀리미터 밀어 정맥으로 밀어 넣습니다. 카테터의 양쪽 끝을 정맥에 고정하고 피부에 고정 점을 추가합니다.
- 기관관 의 도입
- 무딘 집게를 사용하여 스테르노하이드 근육을 덮는 두 개의 하악 샘을 분리합니다. 중간선에 스테인디스 근육을 분리하여 기관진을 노출시합니다.
- 기관 아래에 3 개의 4-0 합자 세 개를 미끄러 진 다음 기관 관 삽입 점 아래에 두 개의 매듭을 만들고 위의 매듭 을 만듭니다.
- 후두의 크리시드 연골을 찾아 세 번째 기관 연골 아래에 절개를합니다.
- 기관관을 기관아래로 삽입하고 미리 준비된 합자로 튜브를 고정한 다음 피부에 합자를 추가합니다.
- 분리된 근육 위에 작은 면모를 놓고 수술 부위에 피부를 봉합합니다.
- 뒷다리 신경의 해부
- 21개의 블레이드를 사용하여 아킬레스 건에서 엉덩이에 이르기까지 왼쪽 뒷다리의 후방 쪽에 세로 컷을 만듭니다.
- 집게로 피부를 잡고 무딘 해부 기술을 사용하여 절개 양쪽의 기본 근육과 피부를 분리합니다.
- 이두근 여성근 근육으로 덮인 무릎 관절 의 뒷면에 있는 포라이트 포사를 찾아가 가위를 사용하여 이 근육의 전방과 후방 부분 사이에 절단합니다.
- 위쪽으로 이동하면 이두근 의 두 머리를 엉덩이까지 잘라 주신경을 노출시합니다. 출혈을 방지하기 위해 필요에 따라 소터리.
- 상골 신경의 sural, 경골 및 일반적인 정경 및 일반적인 간연 한 가지를 확인합니다.
- 가위를 사용하여, 위장관 근육의 내측 머리에서 측면을 분리하여 경골 신경과 가지를 노출시하십시오.
- 55 개의 집게를 사용하여 sural 신경의 해사 끝을 잡고, 그것을 잘라 가능한 한 멀리 해부.
- 일반적인 회내 신경으로 절차를 반복하십시오.
- 무딘 유리 막대를 사용하여 주변 조직으로부터 티비알 신경을 분리하고 혈관을 손상시키지 않도록주의를 기울이고, 이를 절단합니다.
- 내측 위트로테뉴(MG) 및 측면 위장혈증 및 솔레우스(LGS) 신경을 식별한다.
- 사용 하 여 55 집게, 신중 하 게 MG와 LGS 신경해 부, 주변 조직에서 그들을 분리, 하지만 각 근육에 그들의 연결을 유지.
- 노출된 신경 아래에 식염수에 흠뻑 젖은 면모 조각을 놓습니다.
- 수술 부위에 피부를 닫습니다.
- 라미네절제술
- 21개의 블레이드를 사용하여 천골에서 흉부 척추까지 세로 절개를 합니다.
- 피부를 근본적인 근육과 분리하십시오.
- 흉부와 요추 가시 과정의 양쪽에 긴 경연 근육을 잘라.
- 무딘 가장자리메스를 사용하여 척추에서 근육을 철회하여 각 척추의 횡방향 과정을 노출시킵니다.
- 무딘 팁 가위를 사용하여 노출 된 척추를 따라 횡방향 과정에 연결된 근육의 힘줄을 잘라냅니다. 필요한 경우 혈전성 에이전트를 적용하십시오.
- Th13 척추를 갈비뼈 삽입과 미세 한 난관으로 가장 낮은 흉부 세그먼트로 식별하고 미세 rongeurs를 사용하여 척수의 요추 세그먼트를 노출하기 위해 Th13에서 L2 척추까지 가시 공정과 라미네를 제거합니다. 척추 안정화를 위한 고정 지점으로 사용될 L3 가시 공정을 손상시키지 않도록 하십시오.
- Th12 가시 공정을 제거하고 척추 등쪽 표면을 가능한 한 부드럽게 합니다.
- 무딘 해부 기술을 사용하여 근육을 Th11 척추와 분리하여 홀더 삽입 점을 만듭니다.
- 노출된 척수 세그먼트 위에 얇은 식염수에 흠뻑 젖은 면모를 놓습니다.
- 쥐를 두 개의 병렬 막대와 두 개의 조정 가능한 팔로 사용자 정의 만든 금속 프레임으로 이동하여 척추를 지지하고 안정화합니다.
3. 녹음 및 자극 준비
- 척추 열 고정 및 신경 배열
- 37 ± 1 °C에서 동물의 체온을 유지하기 위해 폐쇄 루프 가열 시스템에 연결된 가열 패드에 사용자 정의 된 프레임에 쥐를 배치합니다.
- 심전도 전극을 피부 밑에 삽입하고 심박수 모니터링을 위한 앰프에 연결합니다.
- 피부 플랩을 사용하여 노출된 척수 위에 깊은 풀을 형성하십시오.
- 금속 클램프를 사용하여 Th12 횡방향 공정 과 L3 스핀스 공정 에 클램프를 배치하여 척추 컬럼을 수정합니다.
- 척추 열이 수평으로 고정되고 배열되어 있는지 확인한 다음 컬럼 양쪽에 등대 복부 압력을 적용하여 근육을 후퇴시킵니다.
- 따뜻한 (37 °C) 미네랄 오일로 수영장을 채우고이 온도에서 유지합니다.
- 아킬레스 건을 통해 4-0 합자를 스레드, 리프트 및 발목이 엉덩이와 수평되도록 수술 왼쪽 뒷다리를 스트레칭.
- 피부 플랩을 사용하여 노출된 티비알, MG 및 LGS 신경 위에 깊은 풀을 만듭니다.
- 따뜻한 (37 °C) 미네랄 오일로 수영장을 채웁니다.
- 양극성 실버 와이어 자극 전극에 MG와 LGS 신경을 배치하고 사각형 펄스 자극기에 연결합니다. 각 신경에 대해 별도의 자극 채널을 사용합니다.
- 표면 전극 배치
- 노출된 척수의 왼쪽 소달 측에 은공 전극을 배치하고, 등 근육에 기준 전극이 삽입되어 전극을 차동 DC 증폭기에 연결합니다. 표면 볼 전극은 신경에서 발포성 발리를 기록하는 데 사용됩니다.
- 상류 자극기사용, 0.1 ms 지속 시간의 정사각형 펄스로 MG 및 LGS 신경을 자극하고, 3Hz의 주파수에서 반복되고, 포성 발리를 관찰한다.
- 신경 활성화를 위한 임계값(T)을 결정하고, 각 신경을 약 3에서 자극합니다. T 강도, 각 신경에 대한 발포성 발리의 진폭을 기록합니다.
- 표면 전극 장밋랄을 이동하고 발리의 진폭이 각 신경에 대해 가장 높은 척추 세그먼트를 식별하기 위해 절차를 반복합니다. 최대 발리 위치를 결정한 후 표면 전극을 척수에서 안전한 거리로 이동합니다.
- 호흡기 의 움직임을 줄이기 위해 근육 마비 및 기흉 형성
- 신경 근육 차단기로 정맥 내 쥐를 마비시키고 설치류 호환 캡노미터 (Pancuronium bromide, 0.4mg·kg-1의초기 용량에서) 및 일치하는 외부 인공호흡기에 기관관을 연결하여 0.2mg/kg의용량으로 30분마다 보충합니다.
- 최종 조수CO2 농도를 모니터링하고 환기 파라미터(주파수, 기압 및 유량 부피)를 조정하여 약 3\u20124%로 유지합니다.
- 레코딩 의 측면에 5 및 6 갈비뼈 사이의 피부에 세로 절개를합니다.
- 무딘 팁 가위를 사용하여 갈비뼈 사이의 늑간 공간을 시각화하기 위해 오버헤드 근육을 잘라냅니다.
- 작은 날카로운 가위를 사용하여, 늑간 근육과 흉막에 작은 절개를 한 다음, 폐를 누르지 않도록주의, 개구부에 무딘 가장자리 집게의 끝을 삽입.
- 집게가 작은 튜브를 확장하거나 삽입하여 실험 내내 기동을 열어 두도록 합니다.
- 신경 근육 블록 후 심전도 주파수를 확인하여 마취 깊이를 모니터링하고 심박수가 400 bpm을 초과하는 경우 마취제를 보충하십시오. 호흡 운동을 감소시키기 위하여 근육 마비 및 기질 형성, 기록 안정성을 향상시킬 것입니다
- 듀라와 피아 마터 열기
- #55 집게를 사용하여 듀라 마터를 부드럽게 들어 올리고 L5 세그먼트에서 소커를 잘라 L4 세그먼트까지 장밋빛으로 자릅니다.
- 초박형 5SF 집게 쌍을 사용하여 MG 또는 LGS 신경에서 최대 포성 발리의 수준에서 혈관 사이 등갈 컬럼을 덮는 피아에 작은 패치를 만듭니다.
- 식염수에 흠뻑 젖고 말린 젤 폼의 작은 조각을 사용하여 필요한 경우 출혈을 차단하십시오.
- tSDCS 전극 배치
- L4-L5 척추 세그먼트의 위치에 해당하는 로스트로-코살 수준에서 쥐 복부의 복부에 피부에 작은 절개를 합니다.
- 노출 된 피부 플랩을 참조 전극역할을하는 금속 클립으로 잡아.
- Th12 척추의 등쪽에 식염수에 흠뻑 젖은 스폰지를 놓습니다. 스폰지 크기가 활성 tsDCS 전극 (직경 5mm의 원형 모양의 스테인레스 스틸 플레이트)와 동일한지 확인하십시오.
- 미세 조작기를 사용하여 활성 tsDCS 전극으로 스폰지를 뼈에 누르고 전극의 전체 표면이 동등하게 눌러지 확인합니다.
- 기준 및 활성 tsDCS 전극을 상류 전류 자극기 장치에 연결하여 직류의 연속 흐름을 전달할 수 있습니다.
- 마이크로 파이프의 준비
- 마이크로 전하 풀러를 사용하여 미세 전극을 준비합니다.
참고: 필라멘트와 비필라멘트 전극을 모두 사용할 수 있지만, 전극의 생크는 하강하는 동안 척수를 압축하지 않을 만큼 얇으면서 복부 경적에 도달할 만큼 충분히 길어야 한다는 것을 기억하십시오.- 척수에 들어가는 생크가 약 3mm 길이가되도록 풀러 설정을 조정하고, 전극의 끝은 직경이 1\u20122 μm 이하이고 미세 전극 저항은 10~20MΩ 사이입니다.
- 2M 칼륨-구연산 전해질로 마이크로 전극을 채웁니다.
- 1\u20122 μm 스테핑 움직임과 스테레오탁틱 교정을 허용하는 마이크로 조작기에 준비된 마이크로 전자전차를 장착합니다.
- 소전극을 세포내 앰프에 연결하여 뒤 근육에 배치된 기준 전극을 연결합니다.
- 마이크로 전하 풀러를 사용하여 미세 전극을 준비합니다.
- 신경 근육 블록 후, 심전도 주파수를 확인 하여 마취 깊이를 모니터링 하 고 쥐 심박수가 400 bpm을 초과 하지 않도록 마취제를 보충.
4. 모토뉴런 추적 및 침투
- 포심발리 레코딩 전극을 척수의 등쪽 표면에 다시 놓고, L6 세그먼트의 수준에서 기록 부위의 위치에 소굴로 놓습니다.
- 3Hz 및 3T 강도의 주파수에서 전기 0.1 ms 펄스로 MG 및 LGS 신경을 자극하여 선택한 신경 내에서 알파 모토뉴런의 모든 축축을 활성화시합니다.
- 마이크로피펫을 15\u201220°의 메디오 측각으로 피아의 선택한 패치로 구동합니다(팁은 측면으로 지시됨).
- 표면 아래로 내려온 후, 마이크로 전극을 보정하고 커패시턴스 및 전압 오프셋을 보정하고 모든 매개 변수가 안정되면 척수의 침투를 계속합니다. 모토뉴런 풀의 항드로믹 필드 전위는 각각의 신경을 자극하는 동안 전용 모터 핵에 접근하는 동안 마이크로 전극 전압 추적에서 볼 수 있습니다.
- 1\u2012μm 단계에서 마이크로 전극으로 침투를 진행하고 주기적으로 세포 내 앰프의 버즈 기능을 사용하여 모든 잔류물에서 전극 끝을 지웁울 수 있습니다.
- 기록된 전압 추적의 급격한 과극화를 특징으로 하는 모토뉴런 침투를 관찰하고 항드로믹 스파이크 전위.
5. 모토뉴런 멤브레인 및 발사 특성 기록
- 세포 내 증폭기의 다리 모드에서, 각 신경 분기를 자극하여 항드로믹 작용 잠재력의 "전부 또는 아무것도"모양에 기초하여 운동 신경을 식별합니다. 나중에 평균화할 경우 20개의 후속 추적을 기록합니다.
- 고품질 데이터를 보장하기 위해 엄격한 포함 기준을 구현합니다: 진폭에서 적어도 -50 mV의 휴식 막 전위; 50mV보다 큰 작용 전위 진폭, 양성 오버슈트; 멤브레인 전위는 기록하기 전에 최소 5분 동안 안정적입니다.
- 세포내 증폭기의 불연속 전류 클램프 모드(현재 스위치 속도 모드 4-8kHz)에서 0.5ms 세포 내 탈극성 전류 펄스를 사용하여 모토뉴런에서 정형소드로이드 작용 전위를 불러일으킨다. 오프라인 평균을 위해 적어도 20번 반복합니다.
- 세포 입력 저항을 계산하기 위해 40개의 짧은 펄스(100ms)의 과극 전류(1nA)로 운동신경을 자극한다.
- 진폭을 증가시키는 50ms 제곱파 펄스로 모토뉴런을 자극하여 단일 스파이크를 유도하는 데 필요한 탈극 전류의 최소 진폭으로 레오베이스 값을 결정합니다.
- 500 ms 사각 파 펄스를 주입 전류, 0.1-2 nA의 단계에서 진폭을 증가에 모토 뉴런의 리듬 배출을 연상.
6. 트랜스 척추 직접 전류 자극 (tsDCS)
- 모토뉴런의 안정적인 침투를 유지하면서, 직접 전류의 척추 횡단 응용에 의해 편광 절차를 시작합니다. 실험 설계(예: 15분 동안 0.1mA)로 전류 강도 및 적용 시간을 조정합니다.
- DC를 전환 한 직후, 모토 뉴런 멤브레인 전위를 관찰한다. 음극 편광(양극으로서의 활성 전극)은 막 전위력의 탈극을 초래해야 하며, 음극 편광(음극으로서의 활성 전극)은 반대의 효과를 불러일으켜야 한다. DC 자극에 대한 응답으로 휴식 막 전위전위가 일정하는지 관찰하여 전기장 강도가 영향을 받지 않도록 합니다.
- 연속 현재 응용 프로그램 동안 5분 간격으로 5.3\u20125.6단계를 반복합니다.
- DC를 끄고 기록이 불안정해지거나 포함 기준이 손상될 때까지 5분 간격으로 5.3\u20125.6 단계를 계속 반복합니다.
- 실험을 종료하고 안락사펜토바르비탈 나트륨 (180mg·kg-1)의치명적인 복용량의 정맥 투여를 사용하여 동물.
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Representative Results
세포 침투의 안정적인 조건이 보장될 때 작업 잠재력 및 여러 멤브레인 특성의 매개 변수는 세포 내 기록에 기초하여 계산될 수 있다. 도 1A는 세포 내 자극에 의해 발생되는 전형적인 직교 작용 잠재력을 제시하며, 이는 데이터 포함에 대한 모든 기준을 충족합니다(적어도 -50 mV의 휴식 막 전위, 및 50mV 이상의 스파이크 진폭은 양성 오버슈트로). 스파이크 진폭, 후극극 진폭 또는 과극 후 반부패 시간(AHP-HDT)과 같은 작용 전위 파라미터를 측정할 수 있다. 쥐 모토뉴런의 후자 파라미터의 값은 빠르고 느린 모토뉴런(AHP-HDT > 20ms 저속, 빠른 motoneurons용 AHP-HDT <20 ms)을 구별하기 위한 신뢰할 수 있는 기준 역할을한다. 도 1B는 1nA의 100ms 과극전류 펄스에 대한 세포 반응을 나타내며, 이로부터 모토뉴런의 피크 및 고원 입력 저항(IR)은 전압 편향으로부터 결정될 수 있다. 도 1C는 스파이크의 명확하게 표시된 전압 임계값을 가진 레오베이트 스파이크의 확장된 전압 추적을 나타내며, 전압 게이트 나트륨 채널이 활성화되어 작업 전위를 개시하는 멤브레인 탈극화 수준을 나타낸다. 이러한 모든 레코딩은 tsDCS 적용 중 및 후 여러 번 반복될 수 있으며, 이는 휴게막 전위가 안정적이고 자극 및 기록 프로토콜의 다른 기준이 충족되는 한 각각의 매개 변수를 비교할 수 있습니다.
여러 연구는 tsDCS가 모토뉴런 흥분성 및 발사 패턴9,,18을변경하는 것으로 간접적으로 나타났습니다. 도 2는 tsDCS 적용 전, 도중 및 그 후에 전류를 탈극화하는 500ms 제곱 펄스로 세포내 자극된 두 개의 모토뉴런으로부터의 세포내 전압 추적의 예를 보여줍니다. 안정된 조건에서, 녹음은 차례로 몇 분 반복 수행 될 수 있으며, 모토 뉴런 발사 패턴을 안정적으로 비교할 수 있습니다. 아노달(+) tsDCS는 리듬발사의 증가된 모토뉴런 흥분성 및 높은 주파수(도2A)를향해 작용하는 것으로 나타났으며, 음극(-) tsDCS는 발사 억제(도2B)를향해 작용하였다. 더욱이, tsDCS의 두 가지 유형의 효과는 양극화 기간을 지속. 또한 흥분성 및 발사 패턴의 관찰된 변화는 아노달 또는 음극 tsDCS에 의한 세포막 탈극성 또는 극성 화의 결과일 뿐 아니라, 이 파라미터가 극화종료 후 기준선으로 돌아왔다는 사실에도 불구하고 지속된 멤브레인의 변화와 관련이 없는 심오한 변화를 나타낸다는 점도 주목할 가치가 있다.
마지막으로, 제시된 프로토콜의 편차가 준비 의 악화 및/또는 데이터 신뢰성의 심오한 감소로 인해 실패한 실험으로 이어질 가능성이 높다는 점을 강조해야 합니다. 도 3은 불완전한 세포침투(도 3A),소극성(도3B)또는 척수불안정(도 3C)을보상하기 위한 방치로 인해 데이터 포함 기준이 손상되었을 때 기록의 예를 나타낸다. 연구원은 이러한 비최적 기록을 식별하고 적절한 시정 조치를 구현하거나 데이터 집합에서 이러한 결과를 무시하는 것이 중요합니다.
그림 1: 작업 잠재력 및 멤브레인 속성의 매개 변수입니다.
(A)이 기록에서 계산할 수 있는 표시된 기본 매개변수를 가진 세포 내 자극에 의해 유도된 직교 작용 잠재력. AP 증폭 = 작용 잠재적 진폭; AHP 증폭 = 과극 화 후 진폭; AHP-HDT = 과극 후 반 감쇠 시간. (B)1nA 강도의 전류 펄스를 극화하는 짧은(100ms)에 대한 멤브레인 반응의 전압 추적을 통해 입력 저항(IR)을 계산할 수 있습니다. 잠재적 편향(IR Peak)의 피크를 주목하고 멤브레인 전위(IR 고원)의 작은 감소 및 다음 고원 상이 뒤따릅니다. (C)스파이크 전압 임계값을 나타내는 점선 수평 선이 있는 레오베이트 스파이크의 확장된 전압 추적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 모토뉴런 발사에 대한 편광의 영향.
(A)편광종료 후 10분 동안 500ms에 대해 7.5nA로 세포내 를 자극한 한 모토뉴런의 세포내 기록(왼쪽), 아노달 tsDCS(0.1mA, 중간) 및 10분 동안 세포내를 자극하였다. 동일한 자극 강도에서 모토뉴런 흥분성의 점진적 증가를 주목하십시오. (B)다른 모토뉴런으로부터의 세포내 기록은 500ms에 대해 6nA로 세포내 자극을 받았으며, 양극 tsDCS(0.1 mA, 가운데) 중, 편광이 끝난 후 10분(오른쪽)으로 만든 전(왼쪽). 동일한 자극 강도에서 모토뉴런 발사 주파수의 점진적 억제를 주목하십시오. 아래 기록, 세포 내 자극 전류의 흔적이 제공됩니다. 오른쪽 하단의 교정 막대는 제시된 모든 셀룰러 내 레코딩에 적용됩니다. 나머지 멤브레인 전위값은 각 기록의 왼쪽에 제공됩니다. 최종 세 번의 인터스파이크 간격의 수단에서 계산된 정상 상태 발사 빈도는 위의 레코드를 부여합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 실험 프로토콜의 편차 결과로 최적이 아닌 레코드의 예입니다.
(A)모토뉴런으로부터 기록된 항드로믹 스파이크가 부적절하게 침투하였다. 휴식 막 전위는 불충분 (-45 mV), 그리고 탈극화, 재극화 및 과극화의 모든 연속 단계를 가진 스파이크의 적절한 모양에도 불구하고, 그 진폭은 너무 낮습니다 (41 mV) 오버 슈트없이. (B)비현실적인 전압 임계값(멤브레인이 +68mV로 탈극화)에서 생성된 레오베이트 스파이크. 이러한 종류의 오류는 일반적으로 보정되지 않은 저항과 커패시턴스를 가진 차단된 미세 전극 때문입니다. 또한 이 레코드가 50Hz의 전기 소음으로 강하게 오염된다는 것을 알 수 있습니다. (C)500ms 탈극전류에 반응하여 모토뉴런 리듬발사, 과도한 호흡 운동으로 인한 불안정한 미세전하 침투로 인한 멤브레인 전위의 큰 변동이 있다. 제시된 모든 경우에 계산된 멤브레인 또는 발사 특성은 신뢰할 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
올바르게 수행되는 경우, 설명된 프로토콜의 수술 부분은 약 3시간 이내에 완료되어야 한다. 하나는 수술 중 동물의 안정적인 생리 적 상태를 유지에 특히주의해야한다, 특히 체온과 마취의 깊이. 명백한 윤리적 고려 사항 외에도 적절한 마취가 부족하면 신경 해부 또는 라미네절제술 중 과도한 사지 운동이 발생할 수 있으며 준비 또는 조기 실험 종료에 손상을 초래할 수 있습니다. 척수를 미세 전극으로 관통하기 전에 동물을 마비시면 마취와 심박수의 깊이를 모니터링하고 동물의 체중과 폐 용량에 따라 적절한 환기 매개 변수를 적용하는 것이 중요합니다. 원하는 생리 학적 매개 변수에서 임의의 편차는 절차 성공을 보장하기 위해 즉시 수정해야합니다. 수술 후, 안정적인 기록 조건은 적어도 4 시간 동안 유지 해야합니다.
모토뉴런의 침투 후, 레코딩 안정성이 매우 중요합니다. 어떤 변동도 류베이스 전류와 리듬 발사의 임계값에 크게 영향을 미치기 때문에 멤브레인 잠재력은 제어 기록 중에 일정하게 유지되는 것이 필수적입니다. 척추 기둥의 적절한 고정은 기본적인 안정성을 제공해야하며, 기압의 목표는 호흡에 의해 유발된 척수 움직임을 줄이는 것입니다. 또한, 하나는 근육 수축 은 침투를 시도 하기 전에 완전히 폐지 하 고 신경 근육 차단 정기적으로 관리 해야 합니다.
기록된 모토뉴런의 성공적인 침투 항드로믹 식별에 따라 각각의 신경 분기의 자극에 의해 수행될 수 있다. 이것은 운동 신경 축축이 최근에 성인 동물16에서가능했던 척추 조각에서 수행된 체외 세포 내 기록을 참조하여 내부 근육과 연속성을 유지하지만 기록 된 motoneuron의 식별을 허용하지 않는 생체 내 제제의 진정한 이점입니다. 그러나, 연구원은 데이터의 오해를 피하기 위해 모토 뉴런19의 항드로믹과 정형 소성 활성화사이의 차이의 명확한 이해가 중요하다. 현재 확산으로 인한 추가 신경의 활성화를 방지하고 항드로믹스파이크(19)의일정하고 짧은 대기 시간에 주의를 기울이기 위해 말초 신경 자극을 가능한 한 낮게 유지하는 것이 중요하다(0.5 V 미만).
제시 된 기술의 또 다른 장점은 motoneurons가 추가로 자신의 작업 잠재적 인 매개 변수, 즉 AHP-HDT 기간17에기초하여 빠르거나 느린 유형으로 분류 될 수 있다는 것입니다. 운동 중 근육 성능에 대한 다른 기여와 관련하여 빠르게 유형의 근육 섬유와 느린 유형의 근육 섬유를 내면으로 조절하는 모토뉴런 간의 차별화는 매우 중요합니다. 더욱이, 빠르고 느린 모토뉴런은 편광9에다르게 반응할 수 있다.
편광의 신뢰할 수있는 결과를 보장하기 위해 하나는 tsDCS의 적절한 매개 변수를 설정에주의를 기울여야한다. 현재 강도는 한편으로는 선택된 부위에서 원하는 필드 밀도를 제공하여 신경 망에 미치는 영향을 불러 일으켜야 하며, 다른 한편으로는 조직손상(20)에대한 안전 한계 내에 있어야 한다. 기록 부위에 관한 활성 및 기준 전극의 크기와 배치도4를고려하는 중요한 요소이며, tsDCS 지속 시간 적용 시간은 원하는 효과를 연상시키기에 충분해야16,,17,,22. 본 방법 논문에서, 대표적인 결과는 100μA 음극 또는 무달 편광을 15분 동안 적용하여 얻어졌다. 전극 형상과 직경을 고려하여 전극 바로 아래의 각 전기장 강도는 39.25 μA·mm2였다. 그러나, 기록된 모토뉴런 부위에서 전기장의 정확한 값이 편광 전극에 대하여 모토뉴런 위치로 미리 판단할 수 없으며, 전자필드 밀도가 깊이가 증가하고 전극 크기4,,24가크게 떨어지면서 미리 판단할 수 없다는 것을 이해해야 한다. 더욱이, 적용된 전기장에 비해 모토뉴런 구획의 배향은 작용 전위22,,25,,26의생성에 중요하며, 이는 개별 세포에 대해 예측할 수 없다. 또한, tsDCS 효과는 편광 기간에 국한되지 않으며 지속적이고 오래 지속되는 효과가22,,27로잘 문서화되어 있음을 이해하는 것이 매우 중요합니다. 따라서, 단일, 짧은 편광 세션에 따라 모든 연속된 기록은 극성 후 조건에서 수행될 것이고, 이는 동물당 하나의 급성 편광 기록의 수를 제한한다.
제시된 절차의 추가 수정은 특정 연구 질문에 대답하기 위하여 할 수 있습니다. 최소한의 수정을 가진 이 프로토콜은 적용된 tsDCS의 다양한 지속 시간 및/또는 진폭을 테스트하거나 다양한 풀 모토뉴런에서 tsDCS의 단기 또는 장기 효과를 비교할 때와 같은 여러 실험 설계에 대한 표준으로 사용할 수 있습니다. 여러 유전 질환 모델의 사용 (예를 들어 SOD1 G93A 근위축성 측삭 경화증의 쥐 모델) 또는 항드로믹 신경 활성화에 대한 다른 신경 (peroneal, tibial, saphenous 등) 허용된다. 그러나 절차 제한도 알고 있어야 합니다. 예를 들어, 마취를 위한 바르비투르산염의 사용은 지속적인내전류(28)의활성을 억제하며, 시험관 내 제제(예를 들어, 니코틴 수용체를 차단하는 스트리크닌)에서 일반적으로 사용되는 특정 차단제의 전신 도입은 동물에게 치명적임을 증명할 수 있다. 적절한 실험 프로토콜을 선택하기 전에 연구원이 이러한 한계를 고려하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 센터 보조금 번호에 의해 지원되었다 2017/25/ B / NZ7/00373. 저자는 한나 Drzymała-Celichowska와 Włodzimierz Mrówczyinski의 작품을 인식하고 싶습니다, 둘 다 이 논문에 제시된 결과의 데이터 수집 및 분석에 기여했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
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