I detta dokument beskriver vi en metod för att mäta glykolys och mitokondriell respiration i primära mänskliga Natural Killer (NK) celler isolerats från perifert blod, i vila eller efter IL15-inducerad aktivering. Det protokoll som beskrivs skulle lätt kunna utvidgas till primära mänskliga NK celler aktiveras av andra cytokiner eller lösliga stimuli.
Natural Killer (NK) celler medla främst medfödda anti-tumör och anti-viral immunsvar och svara på en mängd olika cytokiner och andra stimuli för att främja överlevnad, cellulära spridning, produktion av cytokiner såsom interferon gamma (IFNγ) och /eller cytotoxicitet program. NK cell aktivering av cytokin stimulering kräver en betydande ombyggnad av metaboliska vägar för att stödja deras bioenergetiska och biosyntetiska krav. Det finns en stor mängd bevis som tyder på att nedsatt NK cell metabolism är associerad med ett antal kroniska sjukdomar inklusive fetma och cancer, som belyser den kliniska betydelsen av tillgången till en metod för att bestämma NK cell metabolism. Här beskriver vi användningen av en extracellulär fluxanalysator, en plattform som möjliggör realtidsmätningar av glykolys och mitokondriell syreförbrukning, som ett verktyg för att övervaka förändringar i energimetabolismen hos mänskliga NK-celler. Den metod som beskrivs här möjliggör också övervakning av metaboliska förändringar efter stimulering av NK-celler med cytokiner som IL-15, ett system som för närvarande undersöks i ett brett spektrum av kliniska prövningar.
Natural Killer (NK) celler är medfödda lymfocyter som medla anti-tumör och anti-viral svar. NK-celler omfattar 5-15% av alla lymfocyter i humant perifert blod, och kan också hittas i mjälte, lever, benmärg och lymfkörtlar. NK-celler uttrycker inte polymorfiska clonotypic-receptorer, såsom T-cellsreceptorer (TCR) eller B-cellsreceptorer (BCR). Däremot är aktiveringen av deras cytolytiska funktioner föranledd av engagemang av receptorer som känner igen invariable ligander på ytan av en målcell1,2.
Vila mänskliga NK celler isolerats från perifert blod kan överleva i flera dagar i kultur medium kompletteras med humant serum. Aktivering av NK-celler genom cytokiner som IL-15 eller IL-2 driver cellerna till spridning och till en ökning av deras avlivningsförmåga, bland andraeffekter 3,4,5. Flera studier har visat ett direkt samband mellan NK-cellaktivering och förändringar i deras metaboliska aktivitet6. Dessa metaboliska förändringar är avsedda att uppfylla de särskilda krav som finns i cellerna när det gäller energi och biosyntes.
Aeroba celler och organismer erhåller energi genom en serie kemiska reaktioner som involverar katabolism och oxidation av kolhydrater, fett och proteiner. Genom en kombination av glykolys, trikarboxylsyra (TCA) cykel och oxidativ fosforylering, eukaryota celler möta majoriteten av deras ATP efterfrågan och få intermediärer som krävs som byggstenar för makromolekyler väsentliga för celltillväxt och spridning. Processen för glykolys (Figur 1A) börjar med inträde av glukos i cellen. I cytosolen fosforyleras glukos och omvandlas till pyruvat (med en nettoproduktion av 2 molekyler atp per glukosmolekyl), som kan reduceras till laktat eller transporteras in i mitokondrierna för att omvandlas till Acetyl-CoA och gå in i TCA-cykeln. TCA cykeln fortsätter cykling drivs med fler molekyler av Acetyl-CoA och producerar CO2 (som så småningom kommer att diffusa utanför cellen och, genom att reagera med H2O i mediet, kommer att generera kolsyra som kommer att leda till försurning av mediet) och NADH, molekylen som ansvarar för att donera elektroner till elektrontransportkedjan (ETC). Elektronerna färdas genom olika proteinkomplex och accepteras slutligen av syre. Dessa komplex (I, III och IV) pumpar också H+ från den mitokondriematrisen in i intermembraneutrymmet. Som en följd av den elektrokemiska gradienten som genereras, kommer H+ in igen till matrisen genom den komplexa V (ATP-syntas), investera den potentiella energi som samlats in i generering av ATP.
Både glykolys och mitokondriell andning kan blockeras på olika punkter genom att använda inhibitorer. Kunskapen om och användningen av dessa hämmare låg till grund för utvecklingen av den extracellulära fluxanalysen. Genom att mäta två enkla parametrar i realtid som pH och syre, den extracellulära flux analysatorn härda till hastigheten av glykolys och mitokondriell andning i en 96-brunnsplatta. Glykolysstresstestet utförs i ett basalt medium utan glukos (Figur 1B)7. De första mätningarna av extracellulär försurningsgraden (ECAR) är indikativ för glykolysoberoende försurning. Det benämns icke-glykolytisk försurning och korrelerar med CO2 som produceras av TCA som, som förklarats tidigare, kombinerar med H2O i mediet för att generera H+ (TCA-linked ECAR). Den första injektionen är glukos för att inducera glukosutnyttjande och öka glykolys. Den andra injektionen kombinerar både rotenon, en Komplex I-hämmare, och antimycin A, en Complex III-hämmare tillsammans, för att blockera ETC. Cellerna svarar på denna dramatiska minskning av mitokondriell ATP-produktion genom att aktivera glykolys för att upprätthålla cellulära ATP-nivåer, och detta representerar mängden glykolys som inte används av cellen i basalt tillstånd men som potentiellt skulle kunna rekryteras som svar på ökningar i ATP-efterfrågan (kompenserande glys). Den tredje injektionen är glukosanalogin 2-Deoxyglukos (GD), som konkurrerar med glukos som substrat för enzymet hexokinas. Produkten av denna fosforylering, 2-deoxyglukos-6-fosfat kan inte omvandlas till pyruvat, och därför är glykolys blockerad, vilket sänker ECAR till sitt minimum. Ecar som mäts på denna punkt omfattar andra källor till extracellulär försurning som inte tillskrivs glykolys eller andningsaktivitet samt eventuell kvarvarande glykolys som inte helt hämmas av 2-DG (post 2-DG-acidification).
Mitokondriellt stresstestet utförs i ett medium med glukos (Bild 1C)8. De första mätningarna av syreförbrukningshastigheten (OCR) motsvarar baslinjen för mitokondriell respiration (basal respiration). Den första injektionen är oligomycin, som hämmar avkastningen av protoner genom ATP-syntas (komplexa V), blockerar ATP-syntes och därmed snabbt hyperpolarisera mitokondriellt membran, vilket förhindrar ytterligare protonpumpning genom andningskomplex, och leder till en minskning av OCR. Jämförelsen mellan respirationen vid baslinjen och det värde som ges genom tillsats av oigoycin representerar den ATP-kopplade respirationen. Den återstående oligomycin-okänsliga syreförbrukningens hastighet kallas protonläcka, som representerar flödet av protoner genom lipidbilayern eller proteiner i det inre mitokondriella membranet såsom transloosan adeninnukleotal9. Den andra injektionen är den uncoupler 2,4-dinitrofenol (DNP), en jonofor som inducerar en massiv inträde av H+ i mitokondriell matris, vilket leder till depolarisering av mitokondriellt membran och störningar av mitokondriellt ATP syntes. Celler svarar på proton-motivets avledning genom att öka elektrontransportens och syreförbrukningens hastighet till högsta nivåer i ett fruktlöst försök att återvinna membranpotentialen (maximal andningskapacitet). Skillnaden mellan den maximala luftvägarna kapacitet och den basala andningen är den extra respiratoriska kapaciteten av cellen, som föreställer beloppet av respiration som inte används av cellen för att frambringa ATP i det basala statligt men kunde vara potentiellt rekryterat som svar på förhöjningar i ATP-begäran eller under villkorar av spänning8. Den tredje injektionen är en kombination av rotenon och antimycin A. Denna injektion stoppar helt ETC och OCR minskar till sin lägsta nivå, med den återstående syreförbrukningen är icke-mitokondriell (orsakas av NADPH-oxidaser, etc.).
Förändringar i metaboliska vägar skulle på något sätt kunna förutsäga funktionen av NK-celler, eftersom det har föreslagits att kontinuerlig aktivering av NK-celler med cytokiner in vitro skulle kunna leda till NK-cellutmattning genom studier av olika metaboliskavägar 10,11. Korrelationen mellan NK-cellens metaboliska status och funktion är mycket viktig ur cancerimmunterapins synvinkel. I detta fält har aktivering av NK-celler med infusion av IL-15, ensam eller i kombination med monoklonala terapeutiska antikroppar testats i syfte att förbättra tumörcellsdödandet12,13,14. Kunskapen om NK-cellernas metaboliska status som svar på dessa behandlingsstrategier skulle ge en värdefull prediktor för NK-cellaktiveringsstatus och avlivningsfunktion.
Studien av metaboliska vägar i andra myeloisk och lymfoida celler såsom monocyter, T och B-celler har beskrivits15 och optimerade metoder har publicerats16. I detta protokoll tillhandahåller vi en metod som kombinerar både ett NK-isoleringsprotokoll som ger ett stort antal rena och livskraftiga NK-celler och ett optimerat protokoll för att mäta metabolisk aktivitet med hjälp av en extracellulär fluxanalysator. Här visar vi att detta är en giltig metod för studier av metaboliska förändringar i vila och IL-15 aktiverat mänskliga NK celler. För den extracellulära fluxanalysen har parametrar som celltal och läkemedelskoncentrationer testats och optimerats. Jämfört med andra respirometriska metoder, extracellulära flux analysator är helt automatiserad och kunna testa i realtid, med mycket låga mängder celler, upp till 92 prover samtidigt, och därmed tillåter hög genomströmning screenings (med flera prover och replikat) på ett relativt snabbt sätt17.
Denna metod kan användas av forskare som är intresserade av att bedöma NK-cellens funktion genom att studera NK-cellmetabolism. Det kan tillämpas också på celler som aktiveras av andra cytokiner, antikroppar eller lösliga stimuli.
I detta dokument har vi etablerat ett protokoll för att effektivt isolera och culturing ren och livskraftig primära mänskliga NK celler från perifert blod. Vi har också optimerat förutsättningarna för mätning av den metaboliska aktiviteten hos dessa NK-celler bedömda genom syreförbrukningshastighet och extracellulär försurningshastighet genom att använda en extracellulär fluxanalysator. Jämfört med andra respirometriska metoder, den extracellulära flux analysator är snabb, kräver ett litet antal celle…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Dr Michael N. Sack (National Heart, Lung, och Blood Institute) för stöd och diskussion. Denna studie stöddes av intramural Research Programs av National Institutes of Health, National Cancer Institute och National Heart, Lung, och Blood Institute. JT stöds av Ramon y Cajal-programmet (grant RYC2018-026050-I) av MICINN (Spanien).
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glycolyisis stress test injector compound |
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound |
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid | Costar | 3799 | NK cell culture |
Antimycin A | MilliporeSigma | A8674 | Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
BD FACSDIVA Software | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
BD LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive |
CyQUANT cell proliferation assay | ThermoFisher Scientific | C7026 | Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye |
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II | Stemcell technologies | 17851 | NK cell isolation from PBMCs |
EasySep Human NK cell Enrichment Kit | Stemcell technologies | 19055 | NK cell isolation from PBMCs |
EasySep Magnet | Stemcell technologies | 18001 | NK cell isolation from PBMCs |
EDTA 0.5 M, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK sell separation buffer |
FACS tubes | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Flow cytometry experiment |
Falcon 50 ml Conical tubes | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK cell separation |
Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK cell separation buffer |
FlowJo Software | BD Biosciences | Flow data analysis | |
Glucose | MilliporeSigma | G8270 | Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound |
Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer |
Human IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK cell stimulation |
Human serum (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK cell culture medium supplement |
IMDM | Gibco | 12440053 | NK cell culture medium |
L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Component of stress test media |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34965 | Viability dye for flow cytometry staining |
LSM | mpbio | 50494X | PBMCs separation from human blood |
Mouse anti-human CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T cell flow cytometry staining |
Mouse anti-human CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK flow cytometry staining |
Mouse anti-human NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK flow cytometry staining |
Oligomycin | MilliporeSigma | 75351 | Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound |
PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK cell separation buffer |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | For determination of protein concentration |
RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | Cell lysis |
Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
Seahorse Wave Controller Software | Agilent | Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer | |
Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | For data analysis | |
Seahorse XF Base Medium | Agilent | 102353-100 | Extracellular Flux assay base medium |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Extracellular Flux Analyzer | |
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml). |
Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S5761 | To prepare the Cell-Tak solution |
Sodium pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test medium |