Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تحليل نظم الاستجابة العصبية الالتهابية والديناميكا الدموية لإصابات الدماغ الرضحية

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/61504
Automatic Translation
*1, *2,3, 1,3, *1,2,3, *1,4,5
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta
* These authors contributed equally

Summary

يقدم هذا البروتوكول طرقا لتوصيف الاستجابة العصبية الالتهابية والديناميكية الدموية لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة ودمج هذه البيانات كجزء من تحليل الأنظمة متعددة المتغيرات باستخدام الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى.

Abstract

تعد إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة (mTBIs) مشكلة صحية عامة كبيرة. يمكن أن يؤدي التعرض المتكرر ل mTBI إلى عجز وظيفي تراكمي طويل الأمد. أظهرت العديد من الدراسات التي أجرتها مجموعتنا وغيرها أن mTBI يحفز التعبير عن السيتوكين وينشط الخلايا الدبقية الصغيرة ، ويقلل من تدفق الدم الدماغي والتمثيل الغذائي ، ويضعف التفاعل الدماغي الوعائي. علاوة على ذلك ، أبلغت العديد من الأعمال عن وجود ارتباط بين الاختلالات في هذه العلامات العصبية الالتهابية والديناميكية الدموية والإعاقات المعرفية. هنا نفصل طرق لتوصيف استجابة الأنسجة العصبية الالتهابية والديناميكية الدموية ل mTBI في الفئران. على وجه التحديد ، نصف كيفية إجراء نموذج انخفاض الوزن من mTBI ، وكيفية قياس تدفق الدم الدماغي طوليا باستخدام تقنية بصرية غير غازية تسمى التحليل الطيفي للارتباط المنتشر ، وكيفية إجراء مقايسة مناعية متعددة الإرسال من Luminex على عينات أنسجة المخ لتحديد كمية السيتوكينات وبروتينات الفوسفو المناعية (على سبيل المثال ، ضمن مسارات MAPK و NFκB) التي تستجيب وتنظم نشاط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا المناعية العصبية الأخرى. وأخيرا، نفصل كيفية دمج هذه البيانات باستخدام نهج تحليل النظم متعددة المتغيرات لفهم العلاقات بين كل هذه المتغيرات. إن فهم العلاقات بين هذه المتغيرات الفسيولوجية والجزيئية سيمكننا في النهاية من تحديد الآليات المسؤولة عن mTBI.

Introduction

نظره عامه
تؤثر إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة (mTBIs) على حوالي 1.6-3.8 مليون رياضي سنويا1. هذه الإصابات، بما في ذلك الإصابات تحت الارتجاج والارتجاج، يمكن أن تترك المرضى مع أعراض جسدية وعاطفية ونفسية ومعرفية عابرة2. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي mTBI المتكرر (rmTBI) الذي يتم الحفاظ عليه داخل "نافذة الضعف" إلى شدة تراكمية ومدة العواقب المعرفية التي تستمر لفترة أطول من آثار mTBI واحد وحده3 ، وفي النهاية حتى إلى فقدان دائم للوظيفة 4,5,6. على الرغم من أن العديد من المرضى يتعافون في إطار زمني قصير نسبيا (<1 أسبوع) ، إلا أن 10-40٪ من المرضى يعانون من آثار أطول أمدا ل mTBI لمدة شهر واحد > ، مع استمرار بعضها لمدة تصل إلى سنة واحدة 3,7,8,9. وعلى الرغم من ارتفاع معدل انتشار هذه الإصابات وعواقبها الدائمة، فإن آليات الإصابة غير مفهومة بشكل جيد ولا توجد استراتيجيات علاجية فعالة.

وبالنظر إلى التباين الكبير في النتائج بعد mTBI/rmTBI، فإن أحد التحديات في تحديد المحفزات الجزيئية في المراحل المبكرة من الأنسجة التي تم الحصول عليها في دراسات mTBI/rmTBI الطرفية هو عدم وجود بيانات طولية تظهر "روابط جزيئية حادة" نهائية لهذه المحفزات الجزيئية إلى نتائج طويلة الأجل. للتغلب على هذا التحدي ، اكتشفت مجموعتنا أن انخفاض تدفق الدم الدماغي بشكل حاد تم قياسه بشكل حاد باستخدام أداة بصرية تسمى التحليل الطيفي للارتباط المنتشر (DCS) ، يرتبط ارتباطا وثيقا بالنتيجة المعرفية طويلة الأجل في نموذج الماوس من rmTBI10. باستخدام هذه العلامة الحيوية الديناميكية الدموية ، أظهرنا أن الفئران ذات التدفق الدماغي المنخفض بشكل حاد (وبالتالي ، النتيجة المتوقعة على المدى الطويل الأسوأ) لديها زيادات حادة مصاحبة في إشارات الفوسفو العصبية داخل كل من مسارات MAPK و NFκB ، وزيادات في التعبير العصبي للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، وزيادات في التعبير عن البلعمة / علامة الخلايا الدبقية الدقيقة Iba111 . تشير هذه البيانات إلى دور محتمل لإشارات الفوسفو العصبية ، والتعبير عن السيتوكين ، وتنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة في كل من التنظيم الحاد لتدفق الدم الدماغي بعد الإصابة وكذلك في إطلاق سلسلة إشارات تؤدي إلى خلل وظيفي عصبي ونتائج معرفية أسوأ. هنا ، نفصل نهجنا في التحقيق في وقت واحد في كل من البيئة الديناميكية الدموية والعصبية بعد rmTBI وكيفية دمج مجموعات البيانات المعقدة هذه. على وجه التحديد ، نوجز إجراءات لأربع خطوات رئيسية لهذا النهج الشامل: (1) نموذج انخفاض الوزن لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة ، (2) تقييم تدفق الدم الدماغي مع التحليل الطيفي للارتباط المنتشر ، (3) تحديد كمية البيئة الالتهابية العصبية ، و (4) تكامل البيانات (الشكل 1). أدناه ، نقدم مقدمة موجزة لكل خطوة من هذه الخطوات الرئيسية للمساعدة في توجيه القراء من خلال الأساس المنطقي وراء أساليبنا. يوفر الجزء المتبقي من المخطوطة بروتوكولا مفصلا لكل خطوة من هذه الخطوات الرئيسية.

نموذج انخفاض الوزن لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة
على الرغم من وجود العديد من النماذج الممتازة قبل السريرية ل TBI الخفيف المتكرر 12،13،14،15،16،17،18 ، فإننا نستخدم نموذجا راسخا ومناسبا سريريا لإصابات الرأس المغلقة لانخفاض الوزن. تشمل السمات الرئيسية لهذا النموذج (1) التأثير الحاد للجمجمة / فروة الرأس السليمة متبوعا بدوران غير مقيد للرأس حول الرقبة ، (2) عدم وجود إصابة هيكلية علنية في الدماغ ، وذمة ، تلف حاجز الدم في الدماغ ، موت الخلايا الحاد ، أو فقدان أنسجة المخ المزمن ، و (3) العجز المعرفي المستمر (حتى عام واحد) الذي يظهر فقط بعد ضربات متعددة19 (الشكل 2).

تقييم تدفق الدم الدماغي باستخدام التحليل الطيفي للارتباط المنتشر
التحليل الطيفي للارتباط المنتشر (DCS) هو تقنية بصرية غير جراحية تقيس تدفق الدم5،20،21. في DCS ، يتم وضع مصدر ضوء قريب من الأشعة تحت الحمراء على سطح الأنسجة. يتم وضع كاشف على مسافة ثابتة من المصدر على سطح النسيج للكشف عن الضوء الذي يتكاثر المتناثر عبر الأنسجة (الشكل 3). يؤدي تشتت خلايا الدم الحمراء المتحركة إلى تقلب شدة الضوء المكتشفة مع مرور الوقت. يستخدم نموذج تحليلي بسيط يعرف باسم نظرية انتشار الارتباط لربط تقلبات الشدة هذه بمؤشر تدفق الدم (CBFi ، الشكل 4). على الرغم من أن وحدات CBF i (سم2 / ثانية) ليست وحدات التدفق التقليدية (مل / دقيقة / 100 جم) ، فقد أظهرت دراسة سابقة أجريت على الفئران أن CBFi يرتبط ارتباطا وثيقا بتدفق الدم الدماغي الذي يقاس بالدوران الشرياني المسمى التصوير بالرنين المغناطيسي21.

للإشارة ، تم بناء أداة DCS المستخدمة هنا داخليا وتتكون من ليزر بطول تماسك طويل 852 نانومتر ، ومجموعة من 4 صمامات ثنائية ضوئية لحساب الفوتون ، ولوحة ارتباط تلقائي للأجهزة (تاو واحد ، 8 قنوات ، 100 نانو ثانية الحد الأدنى لوقت العينة) 21,22. يتم الحصول على البيانات باستخدام برنامج محلي الصنع مكتوب في LabView. تتكون الواجهة الحيوانية للجهاز من ألياف مصدر متعددة الأوضاع 400 ميكرومتر (نطاق الطول الموجي 400-2200 نانومتر ، نواة السيليكا النقية ، تكسية TECS الصلبة) وألياف كاشف أحادية الوضع 780 نانومتر (نطاق الطول الموجي 780-970 نانومتر ، نواة السيليكا النقية ، الكسوة الصلبة TECS ، قطع الوضع الثاني 730 ± 30 نانومتر) متباعدة 6 مم ومدمجة في مستشعر أسود مطبوع 3D (4 مم × 8 مم ، الشكل 3).

تحديد كمية البيئة العصبية الالتهابية
على الرغم من أن الالتهاب العصبي يتم تنظيمه من خلال عمليات خلوية متنوعة ، إلا أن هناك آليتين رئيسيتين ذات صلة هما الإشارات خارج الخلية بواسطة السيتوكينات / الكيموكينات والإشارات داخل الخلايا بواسطة بروتينات الفوسفو. للتحقيق في البيئة العصبية الالتهابية للدماغ بعد الإصابة ، يتم استخراج الأدمغة من الفئران ، والتشريح المجهري ، ويتم تحديد كمية السيتوكينات / الكيموكينات والبروتينات الفوسفو باستخدام Luminex (الشكل 5 ، الشكل 6 ، الشكل 7). تتيح المقايسات المناعية متعددة الإرسال من Luminex التحديد الكمي المتزامن لمجموعة متنوعة من هذه البروتينات عن طريق اقتران مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) بالخرز المغناطيسي الموسوم بالفلورسنت. يتم استخدام علامات الفلورسنت المميزة لكل بروتين ذي أهمية ، ويتم تشغيل حبات كل علامة مع جسم مضاد التقاط ضد هذا البروتين المحدد. يتم خلط مئات الخرز لالتقاط كل بروتين معا ، وتوضع في طبق بئر 96 ، وتحضن مع العينة. بعد حضانة العينة ، يتم استخدام مغناطيس لحبس الخرز في البئر أثناء غسل العينة. بعد ذلك ، يرتبط الجسم المضاد للكشف عن البيوتينيل بالتحليل ذي الأهمية لتشكيل شطيرة مستضد الأجسام المضادة على غرار ELISA التقليدي ، ولكن مع ELISA لكل بروتين يحدث على حبة مختلفة موسومة بالفلورسنت. إضافة الستربتافيدين المقترن بالفيكويريثرين (SAPE) يكمل كل تفاعل. ثم تقوم أداة Luminex بقراءة الخرز وفصل الإشارة وفقا لكل علامة / بروتين فلورسنت.

تكامل البيانات
نظرا للعدد الكبير من التحليلات (على سبيل المثال ، السيتوكينات) التي تم قياسها في فحص Luminex ، قد يكون من الصعب تفسير تحليل البيانات إذا تم تحليل كل بروتين كمي على حدة. لتبسيط التحليل والتقاط الاتجاهات التي لوحظت بين التحليلات، نستخدم طريقة تحليل متعددة المتغيرات تسمى الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى (PLSR، الشكل 8)23. يعمل PLSR من خلال تحديد محور الأوزان المقابلة لكل بروتين تم قياسه (أي السيتوكينات أو بروتينات الفوسفو ، والتي يشار إليها باسم "متغيرات التنبؤ") التي تفسر معا على النحو الأمثل التباين المشترك للبروتينات المقاسة مع متغير الاستجابة (على سبيل المثال ، تدفق الدم الدماغي). يشار إلى الأوزان باسم "الأحمال" ويتم تجميعها في متجه يعرف باسم المتغير الكامن (LV). من خلال إسقاط (يشار إليها باسم "تسجيل") بيانات البروتين المقاسة على كل من LVs اثنين ، يمكن إعادة رسم البيانات من حيث هذه LVs. بعد حساب PLSR ، نستخدم دوران varimax لتحديد LV جديد يزيد من التباين المشترك بين إسقاطات العينة على LV ومتغير التنبؤ24. يسمح لنا هذا النهج بتعريف LV1 على أنه المحور الذي يتم فيه شرح تباين متغير الاستجابة بشكل أفضل. يزيد LV2 من التباين المشترك بين متغير الاستجابة والبيانات المتبقية LV1 ، والتي قد تكون مرتبطة بالتباين البيولوجي أو التقني بين العينات. أخيرا ، نجري التحقق من صحة Leave One Out Cross (LOOCV) للتأكد من أن نموذج PLSR لا يعتمد بشكل كبير على أي عينة واحدة23.

في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل طرق لتوصيف استجابة الأنسجة العصبية الالتهابية والديناميكية الدموية ل mTBI. ويرد في الشكل 1 موجز لسير العمل العام. في هذا البروتوكول ، تخضع الفئران لواحد أو أكثر من mTBIs باستخدام نموذج إصابة الرأس المغلق بانخفاض الوزن. يتم قياس تدفق الدم الدماغي طوليا قبل الإصابة وفي نقاط زمنية متعددة بعدها. في الوقت المناسب نقطة الاهتمام للاستجواب من التغيرات الالتهابية العصبية ، يتم القتل الرحيم للحيوان ، ويتم استخراج الدماغ. يتم عزل مناطق الدماغ ذات الأهمية عن طريق التشريح المجهري ثم يتم تحليلها لاستخراج البروتين. ثم يتم استخدام الليزات لكل من المقايسات المناعية متعددة الإرسال من لومينكس للسيتوكين وتعبير بروتين الفوسفو وكذلك اللطخة الغربية. وأخيرا، يتم دمج مجموعة البيانات الشاملة هذه باستخدام تحليل انحدار جزئي للمربعات الصغرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة إيموري (IACUC) واتباع إرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر.

1. نموذج انخفاض الوزن لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة

  1. قم بإعداد إعداد خفض الوزن. قم بتركيب وجه على سطح مستو باستخدام أنبوب توجيه بطول 1 متر (قطر داخلي 2.54 سم) محاذاة رأسيا (تحقق باستخدام مستوى). استخدم مسمارا بوزن 54 جم (قطر الجسم الأساسي 0.95 سم ، قطر الرأس 2 سم ، طول 10.2 سم) للتأثير.
  2. تخدير الماوس لفترة وجيزة. حث الماوس مع 4.5 ٪ من الايزوفلوران في الأكسجين 100 ٪ لمدة 45 ثانية. تأكد من عمق التخدير الكافي من خلال عدم وجود استجابة قرصة إصبع القدم.
  3. الحث على الإصابة.
    1. قم بإزالة الماوس بسرعة من التخدير ووضع الماوس عرضة على وسط غشاء رقيق (نسيج 11.2 سم × 21.3 سم).
    2. استخدم كلتا يديك لتثبيت الأنسجة المشدودة مع وجود الماوس في المنتصف. قم بتأمين ذيل الماوس تحت الإبهام. ضع رأس الماوس تحت أنبوب التوجيه (الشكل 2).
    3. قم بإسقاط الترباس من أعلى أنبوب التوجيه على الجانب الظهري من رأس الماوس ، بهدف التأثير بين الجزء الخلفي من العينين والجزء الأمامي من الأذنين. عند الاصطدام ، سوف يخترق الماوس الأنسجة ، مما يسمح بالتسارع السريع للرأس حول الرقبة (الشكل 2).
  4. الانتعاش
    1. بعد الاصطدام ، ضع الماوس ضعيفا على وسادة تسخين 37 درجة مئوية في هواء الغرفة. راقب التعافي لمدة 1 ساعة بعد الإصابة. في غضون 1 ساعة ، يجب أن تكون الفئران قادرة على التجول بشكل طبيعي ، والعثور على الطعام والماء ، وعدم إظهار عجز حركي جسيم.
      ملاحظة: لا يتم استخدام التسكين وفقا لموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها ، وهو أمر مبرر بسبب التأثير المربك للتسكين على المعلمات ذات الاهتمام (أي تدفق الدم الدماغي ، علامات الالتهاب). من المتوقع فقدان الوعي ، الذي يعرف بأنه الوقت من الإزالة من التخدير إلى وقت استعادة رد الفعل التصحيحي ، ويستمر عادة من 20 ثانية إلى 3 دقائق (الجدول التكميلي 1). يمكن ملاحظة نوبات قصيرة (<30 ثانية) من انقطاع النفس و / أو النشاط الشبيه بالنوبات ، خاصة بعد إصابات الرأس المتكررة المتباعدة مرة واحدة يوميا.
  5. كرر حسب الحاجة. قد تتكرر هذه الإصابة مرة واحدة يوميا أو أسبوعيا أو شهريا. يعتمد عدد الإصابات وتباعدها على شدة الإصابة المطلوبة. عادة ، نستخدم خمس ضربات متباعدة مرة واحدة يوميا للحث على عجز قوي في التعلم المكاني والذاكرة.
    ملاحظة: أظهرت الدراسات السابقة أن خمس ضربات متباعدة مرة واحدة يوميا كافية للحث على العجز في التعلم المكاني والذاكرة التي تستمر لأكثر من 1 سنة بعد الإصابة دون وذمة أو نزيف أو إصابة هيكلية علنية للدماغ19. يتم وزن الفئران يوميا ومراقبتها عن كثب بحثا عن علامات الجفاف والعجز الحركي وفقدان الشهية. إذا كانت الفئران تعاني من الجفاف ، يتم إعطاء تشاو رطب وحقن تحت الجلد من 1 مل من المياه المالحة مرة واحدة يوميا. من أجل منع المعاناة غير الضرورية وضمان نقطة نهاية إنسانية ، يتم القتل الرحيم للفئران إذا: استمر الجفاف أو تفاقم >24 ساعة بعد العلاج الملحي تحت الجلد ، وانخفض وزن الجسم بأكثر من 20٪ من خط الأساس قبل الإصابة ، ويظهر العجز الحركي مثل الدوران أو سحب الكفوف ويستمر >1 ساعة بعد الإصابة.

2. تقييم تدفق الدم الدماغي مع التحليل الطيفي للارتباط المنتشر

  1. الحصول على بيانات DCS
    1. إزالة الشعر على فروة الرأس. نظرا لأن DCS يعمل بشكل أفضل في غياب الشعر ، فمن الضروري إزالة الفراء على الرأس قبل بدء التجارب. عادة ، تتم إزالة الشعر قبل 1-3 أيام من بدء الدراسة.
      1. حث الفئران مع 4.5 ٪ من الايزوفلوران في 100 ٪ من الأكسجين لمدة 45 ثانية والحفاظ على 1-2 ٪ من الايزوفلوران في الأكسجين 100 ٪.
      2. حلق الرأس بين العينين والأذنين. ثم ، استخدم كريم إزالة الشعر لإزالة الفراء على الرأس كما في الشكل 3.
      3. اسمح للحيوان بالتعافي من التخدير على وسادة الاحترار ثم العودة إلى القفص.
    2. قياس تدفق الدم الدماغي مع DCS. لتقليل القطع الأثرية المتحركة أثناء القياس ، قم بدراسة الفئران تحت تخدير إيسوفلوران قصير.
      ملاحظة: راقب بصريا التنفس واستجابة قرصة إصبع القدم طوال القياسات واضبط تركيز الأيزوفلوران حسب الحاجة لضمان عمق ثابت للتخدير. الاختلافات الكبيرة في عمق التخدير يمكن أن تغير تدفق الدم بالنظر إلى الآثار الوعائية المعروفة للإيسوفلوران25.
      1. حث مع 4.5 ٪ isoflurane في 100 ٪ من الأكسجين لمدة 45 ثانية ، ثم الحفاظ على 1.0-1.75 ٪ isoflurane في 100 ٪ من الأكسجين. تأكد من عمق التخدير الكافي من خلال عدم وجود استجابة قرصة إصبع القدم والتنفس الطبيعي (بين ~ 60-80 نفسا في الدقيقة).
      2. بعد فترة 2 دقيقة من التثبيت ، ضع مستشعر DCS برفق فوق نصف الكرة الأيمن بحيث تصطف الحافة العلوية للمستشعر البصري مع الجزء الخلفي من العين ويصطف جانب المستشعر على طول خط الوسط (الشكل 3). ضع يده على المستشعر للحماية من ضوء الغرفة. احصل على 5 ثوان من البيانات (اكتساب 1 هرتز).
      3. أعد وضع المستشعر فوق نصف الكرة الأيسر، واحصل على 5 ثوان من البيانات.
      4. كرر 3 مرات / نصف الكرة الأرضية لحساب عدم التجانس المحلي تحت سطح الأنسجة.
    3. الانتعاش
      1. قم بإزالة الماوس من التخدير وضعه على وسادة الاحترار.
      2. بعد أن يستعيد الماوس منعكس التصحيح ، أعده إلى القفص.
  2. تحليل بيانات DCS
    1. إجراء مراقبة الجودة الأولية. يتكون كل إطار من بيانات DCS من دالة ارتباط تلقائي للشدة الطبيعية المقاسة ، (الشكل 4A) ، Equation 110 ومعدل عدد الفوتون (kHz).
      1. لإزالة إطارات البيانات ذات القطعة الأثرية ذات الحركة الهامة، تجاهل إطارات البيانات التي تبلغ القيمة المتوسطة لذيل المنحنى Equation 110 (أي Equation 111) > 1.005.
      2. لإزالة إطارات البيانات ذات النسبة الضعيفة للإشارة إلى الضوضاء، تجاهل إطارات البيانات إذا كان معدل عدد الفوتونات المكتشف < 20 كيلو هرتز.
    2. استخراج مؤشر تدفق الدم الدماغي. باستخدام fminsearch في Matlab ، تناسب كل إطار Equation 112بيانات تم قياسه ل CBF i (i). تقييد يناسب Equation 113، والعثور على قيمة CBFi التي تقلل من دالة التكلفة التالية:
      Equation 114
      حيث يكون المجموع فوق جميع أوقات التأخير المقاسة،Equation 115Equation 116 وهو الحل المتجانس شبه اللانهائي لمعادلة انتشار الارتباط (الشكل 4B):
      Equation 117
      هنا β هو عامل تماسك يحدده الإعداد التجريبي ، ، ، ، ، ، Equation 8Equation11Equation 10Equation 9Reff = 0.493 لمؤشر الأنسجة المفترض للانكسار البالغ 1.4 ، ρ هو 6 مم ، μ a و μ هما معامل الامتصاص وانخفاض التشتت للأنسجة (يفترض أن يكون 0.25 و 9.4 / سم ، على التوالي10،26،Equation 727).
      ملاحظة: نظرا لأن β يمكن أن تختلف بنسبة 10٪ تقريبا بمرور الوقت ، فقم باحتواء كل إطار بيانات β و CBFi في وقت واحد.
    3. أداء مراقبة الجودة الثانوية. داخل كل تكرار (يتكون من 5 إطارات بيانات) ، تجاهل القيم المتطرفة. يتم تعريف القيم المتطرفة على أنها قيم CBF i التي تقع خارج الانحرافات المعيارية 1.5 لمتوسط CBFi لهذا التكرار. إذا تم تحديد أكثر من 1 نقطة بيانات على أنها شاذة، فتجاهل التكرار بأكمله.
    4. تقدير متوسط مؤشر تدفق الدم الدماغي: تقدير متوسط CBFi لكل نصف كرة عن طريق أخذ المتوسط عبر جميع إطارات البيانات لجميع التكرارات (الشكل 4C). إذا لم تلاحظ فروق كبيرة في نصف الكرة الأرضية ، فقم بالمتوسط عبر نصفي الكرة الأرضية للحصول على تقدير لمتوسط CBF العالميi.

3. القياس الكمي المتعدد للسيتوكينات وبروتينات الفوسفو باستخدام مقايسات لومينكس

  1. استخراج الأنسجة
    ملاحظة: يتطلب التحديد الكمي للسيتوكينات الدماغية وبروتينات إشارات الفوسفو باستخدام Luminex استخراج الأنسجة.
    1. تخدير الفأر باستخدام 4.5٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين بنسبة 100٪ لمدة 1-2 دقيقة. تحقق من وجود مستوى عميق من التخدير عن طريق عدم وجود استجابة قرصة إصبع القدم. القتل الرحيم عن طريق قطع الرأس.
    2. حصاد الأنسجة.
      1. إزالة الدماغ. عادة ، قم بإصلاح نصف الكرة الأيسر لعلم الأنسجة والتشريح المجهري لعدة مناطق من نصف الكرة الأيمن داخل القشرة والحصين (الشكل 5).
      2. ضع عينات تشريح في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، وتجميد فلاش في النيتروجين السائل. لتحليل البروتينات الحساسة للتجميد ، من الأفضل تقسيم أقسام الأنسجة قبل التجميد السريع لتجنب ذوبان الجليد لاحقا.
        ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا، ويمكن تخزين عينات الأنسجة عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لتحليل العينات. بدلا من ذلك ، يمكن تحليل العينات ، ثم تخزينها عند -80 درجة مئوية.
    3. عينات ليز.
      1. قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل عن طريق إضافة مثبط الأنزيم البروتيني وفلوريد فينيل ميثيل سلفونيل 2 mM إلى المخزن المؤقت للتحلل.
      2. أضف 150 ميكرولتر من مخزن التحلل المختلط لكل 3 ميكروغرام تقريبا من الأنسجة الحيوانية. كمرجع ، عينات أنسجة القشرة البصرية للفأر حوالي 3 ميكروغرام.
      3. لتجانس الأنسجة ، قم بترقيم الأنسجة ميكانيكيا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ~ 15-20 مرة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. للحصول على العينة المثلى ، يمكن استخدام مدقة مجانسة.
      4. ضع أنابيب العينة على دوار لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      5. الطرد المركزي للعينات في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند حوالي 15000 × غرام ، وجمع supernatant. يمكن معالجة العينات على الفور أو تخزينها عند -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
        ملاحظة: تتوافق عينات المحللات المعدة باستخدام هذا البروتوكول مع اللطخة الغربية ، والتي يمكن من خلالها تحليل علامة البلعمة / الخلايا الدبقية الدقيقة Iba1 و / أو علامة تنشيط الخلايا النجمية GFAP لاستكمال تحليل السيتوكين وبروتين الفوسفو لدراسات التهاب الأعصاب11.
  2. بروتوكول الفحص المناعي متعدد الإرسال للسيتوكينات وبروتينات الفوسفو
    ملاحظة: على الرغم من التشابه بشكل عام ، إلا أن هناك بعض الاختلافات الطفيفة في بروتوكولات مجموعات السيتوكين وبروتين الفوسفو. يتم ملاحظة الاختلافات في كل خطوة. يتم توضيح خطوات إعداد العينات لفحص Luminex أدناه.
    1. تحضير الكواشف (اليوم 1 ، نفس الشيء بالنسبة للسيتوكينات وبروتينات الفوسفو)
      1. اسمح للكواشف بالدفء إلى درجة حرارة الغرفة (~ 30 دقيقة).
      2. سونيكات زجاجة الخرز المغناطيسي متعدد الإرسال لمدة 30 ثانية تليها 1 دقيقة من الدوامة. تأكد من حماية الخرز المغناطيسي متعدد الإرسال من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم أو استخدام زجاجات واقية من الضوء مقدمة.
      3. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل عن طريق خلط 0.1٪ Tween20 في 1xPBS أو بدلا من ذلك استخدم المخزن المؤقت للغسيل الموجود في المجموعة.
    2. تحضير عينات الأنسجة المحللة (اليوم 1 ، نفس الشيء بالنسبة للسيتوكينات وبروتينات الفوسفو)
      1. إذا تم تجميدها سابقا ، فقم بإزالة عينات الأنسجة المحللة من الفريزر واتركها تذوب على الجليد (~ 20 دقيقة). عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 9,167 × g لإزالة الراسب.
      2. تحضير 25 ميكرولتر من العينة عند تركيز البروتين الأمثل الذي يحدده تحليل المدى الخطي (انظر القسم 3.3). لتطبيع الحجم الإجمالي لجميع العينات، قم بتخفيف العينات في مخزن الفحص المخزن المؤقت المتوفر في المجموعة.
    3. تحضير 96 صفيحة بئر (اليوم 1 ، نفس الشيء بالنسبة للسيتوكينات وبروتينات الفوسفو)
      1. استخدم لوحة البئر 96 المضمنة في المجموعة أو لوحة ذات قاع رقيق (على سبيل المثال ، Brand Tech).
      2. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل (أو 1x PBS ، 0.1٪ Tween) في كل بئر واخلطه على شاكر الطبق لمدة 10 دقائق عند 750 دورة في الدقيقة.
      3. المخزن المؤقت لغسل الملصقات واضغط على الطبق على منشفة ورقية لإزالة البقايا.
    4. إجراء المقايسة المناعية للسيتوكينات (اليوم 1)
      1. أضف ما يلي إلى كل بئر بالترتيب.
        1. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى جميع الآبار.
          1. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت الإضافي للمقايسة فقط إلى آبار الخلفية. لكل تشغيل تجريبي ، لديك بئران خلفيتان على الأقل. لا تحتوي الآبار الخلفية على عينة محملة وتحدد كثافة الفلورسنت التي يقرأها الجهاز بدون عينة.
          2. أضف 25 ميكرولتر من كل عينة مخففة إلى آبار العينة المقابلة.
          3. أضف 25 ميكرولتر من 1x حبات مغناطيسية متعددة الإرسال إلى جميع الآبار (الشكل 6). تأكد من دوامة الخرز لمدة 1 دقيقة قبل الإضافة إلى الآبار.
      2. ختم لوحة مع لوحة مانعة للتسرب وتغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم. احتضان بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) في 2-8 درجة مئوية.
    5. إجراء المقايسة المناعية للسيتوكينات (اليوم 2)
      1. ضع 96 صفيحة بئر على الفاصل المغناطيسي ، مع التأكد من محاذاة الآبار مع المغناطيس. اتركيه لمدة 2 دقيقة. صب محتويات البئر بينما لا تزال اللوحة متصلة بالفاصل المغناطيسي.
      2. اغسل اللوحة 2 مرات باستخدام الخطوات التالية.
        1. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى كل بئر وضعه على الخلاط لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
        2. ضع لوحة البئر على الفاصل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
        3. صب محتويات البئر بينما لا تزال لوحة البئر متصلة بفاصل مغناطيسي.
      3. أضف 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكشف لكل بئر (الشكل 6). يغطى بورق القصدير. احتضان لمدة 1 ساعة على شاكر لوحة (750 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
      4. اترك الجسم المضاد للكشف وأضف 25 ميكرولتر من الستربتافيدين فيكويريثرين (SAPE) إلى كل بئر (الشكل 6). يغطى بورق القصدير. احتضان لمدة 30 دقيقة على شاكر لوحة (750 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
      5. ضع صفيحة البئر على فاصل مغناطيسي واتركها لمدة 2 دقيقة. صب محتويات البئر وفصلها عن الفاصل المغناطيسي.
      6. اغسل الطبق جيدا مرتين (انظر الخطوة 3.2.5.2).
      7. أضف 75 ميكرولتر من سائل محرك Luminex (في حالة استخدام أداة MAGPIX) إلى كل بئر أو مخزن مؤقت للفحص (إذا كنت تستخدم أداة 200 أو FlexMap 3D). أعد تعليق الخرز على شاكر الطبق لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      8. اقرأ على Luminex Instrument (MAGPIX أو 200 أو FlexMap 3D) ، في إشارة إلى دليل المستخدم للتشغيل السليم (الشكل 6).
    6. إجراء المقايسة المناعية لبروتينات الفوسفو (اليوم 1)
      1. أضف ما يلي إلى كل بئر بالترتيب.
        1. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى جميع الآبار.
          1. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت الإضافي للمقايسة فقط إلى آبار الخلفية. لكل تشغيل تجريبي ، يوصى بالحصول على بئرين خلفيين على الأقل. لا تحتوي الآبار الخلفية على عينة محملة وتحدد كثافة الفلورسنت التي يقرأها الجهاز بدون عينة.
          2. أضف 25 ميكرولتر من كل عينة مخففة إلى كل عينة بشكل جيد.
          3. أضف 25 ميكرولتر من 1x حبات مغناطيسية متعددة الإرسال إلى جميع الآبار (الشكل 6).
            ملاحظة: توفر مجموعة مقايسة Luminex حبة مغناطيسية متعددة الإرسال في حل مخزون 20x. تأكد من دوامة 20x مخزون حل الخرزة المغناطيسية متعددة الإرسال لمدة 2 دقيقة ، ثم تخفيفه في المخزن المؤقت للفحص إلى محلول 1x. دوامة 1x تعليق حبة مغناطيسية متعددة الإرسال لمدة 1 دقيقة قبل إضافتها إلى الآبار.
        2. ختم لوحة مع لوحة مانعة للتسرب وتغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم. احتضان بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) في 2-8 درجة مئوية.
    7. إجراء المقايسة المناعية لبروتينات الفوسفو (اليوم 2)
      1. ضع صفيحة البئر على فاصل مغناطيسي ، مع التأكد من محاذاة صفيحة البئر بالكامل مع الفاصل المغناطيسي. اتركيه لمدة 2 دقيقة. صب محتويات البئر بينما لا تزال لوحة البئر متصلة بالفاصل المغناطيسي.
      2. اغسل الصفيحة مرتين (انظر الخطوة ب في اليوم 2 من إجراء المقايسة المناعية للسيتوكين).
      3. قم بتخفيف الجسم المضاد للكشف عن المخزون 20x إلى محلول 1x في المخزن المؤقت للفحص. أضف 25 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف عن 1x لكل بئر (الشكل 6). يغطى بورق القصدير. احتضان لمدة 1 ساعة على لوحة الاهتزاز (750 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
      4. ضع لوحة البئر 96 على الفاصل المغناطيسي ، واتركها لمدة 2 دقيقة. صب محتويات البئر ، وفصل عن الفاصل المغناطيسي.
      5. تمييع 25x الأسهم SAPE في المخزن المؤقت المقايسة إلى 1x المخزن المؤقت. أضف 25 ميكرولتر من 1x SAPE (الشكل 6). يغطى بورق القصدير ويحضن لمدة 15 دقيقة على شاكر الطبق (750 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
      6. اترك SAPE في الآبار ، وأضف 25 ميكرولتر من مخزن التضخيم المؤقت إلى كل بئر. يغطى بورق القصدير.
      7. احتضن لمدة 15 دقيقة على شاكر الطبق (750 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
      8. ضع لوحة البئر على الفاصل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. صب محتويات البئر والانفصال عن الفاصل المغناطيسي.
      9. أضف 75 ميكرولتر من Luminex Drive Fluid (في حالة استخدام أداة MAGPIX) أو مخزن مؤقت للفحص (في حالة استخدام أداة 200 أو FlexMap 3D). أعد تعليق الخرز على شاكر الطبق لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      10. اقرأ على جهاز Luminex (MAGPIX أو 200 أو FlexMap 3D) ، في إشارة إلى دليل المستخدم للتشغيل السليم (الشكل 6).
  3. خطية منحنى تخفيف العينة
    1. تحضير العينات: عينات اختبار مخففة بشكل متسلسل بتركيز مختلف من البروتين الكلي. بالنسبة لأنسجة المخ السائبة ، قم بتحميل التخفيفات التسلسلية من 0-25 ميكروغرام للسيتوكينات و 0-12 ميكروغرام لبروتينات الفوسفو. يمكن قياس تركيز البروتين الكلي باستخدام فحص حمض البيتشينكونينيك (BCA).
    2. المقايسة المناعية متعددة الإرسال: قم بإجراء فحص Luminex (انظر القسم 3.2) على عينات مختارة.
    3. تحليل البيانات
      1. كثافة الفلورسنت لكل بروتين مقابل كمية البروتين المحملة (الشكل 7).
      2. لكل تحليل، حدد نطاق البروتين الكلي المحمل الذي تكون العلاقة بين البروتين الكلي وقراءة كثافة الفلورسنت خطية (الشكل 7).
      3. لتحديد كمية البروتين الكلي التي يجب تحميلها لتشغيل الفحص الكامل ، حدد الجزء الخطي من المنحنى لكل تحليل ثم حدد تركيز البروتين الذي يقع ضمن النطاق الخطي لمعظم التحليلات.
        ملاحظة: على الرغم من أن معظم البروتينات تشترك في نطاق خطي مماثل، إلا أن النطاقات الخطية قد لا تتداخل مع جميع البروتينات. إذا كان هذا هو الحال ، فقد يكون من الضروري تشغيل كل عينة عدة مرات بكميات مختلفة من البروتين الكلي الذي يتم تحميله. بدلا من ذلك ، قد يتم استبعاد العينات غير الخطية من التحليل. بالإضافة إلى ذلك ، قد لا يكون لبعض البروتينات نطاق خطي على الإطلاق.

4. الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى

ملاحظة: يتم توفير نموذج التعليمات البرمجية R ونموذج جدول بيانات البيانات لإجراء التحليل الجزئي للمربعات الصغرى.

  1. إعداد البيانات: تنسيق البيانات كما هو موضح في جدول بيانات عينة البيانات المقدم ، "MyData". قم بتضمين أسماء المتغيرات في الصف 1، وأسماء العينات في العمود A، ومتغير الاستجابة في العمود B، وجميع متغيرات التنبؤ في الأعمدة C+. املأ الصفين الأخيرين ببيانات الخلفية، واضبط كلا الاسمين النموذجيين على "الخلفية".
  2. الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى في RStudio
    1. قم بتثبيت R من www.r-project.org (مجاني ومفتوح المصدر).
    2. قم بتثبيت RStudio Desktop من www.rstudio.com (ترخيص مجاني مفتوح المصدر).
    3. قم بتنزيل نموذج التعليمات البرمجية R المتوفرة مع هذا المنشور "PLSR_Sample_Code.R" واحفظه في نفس المجلد الذي يحتوي على جدول بيانات البيانات. افتح ملف التعليمات البرمجية في RStudio.
    4. في قسم إدخال المستخدم، قم بتغيير "dataFileName" إلى اسم جدول بيانات البيانات.
    5. نفذ الخطوات التالية عن طريق تمييز قسم التعليمات البرمجية المراد تشغيله والنقر فوق تشغيل في الزاوية العلوية اليسرى من البرنامج النصي.
      1. قم بتحميل حزم R الضرورية والوظائف وعنوان دليل العمل وقيم إدخال المستخدم في RStudio (القسم الفرعي "Preliminaries").
      2. قم بتحميل البيانات في RStudio وقم بإعداد البيانات الخام للمعالجة عن طريق طرح متوسط إشارة الخلفية من جميع القياسات وتسجيل z لكل تحليل (القسم الفرعي "قراءة البيانات وطرح الخلفية") (الشكل 8A).
      3. إجراء الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى في RStudio باستخدام حزمة plsRglm v1.2.528 المتوفرة على شبكة أرشيف R الشاملة (CRAN). قم بإجراء دوران varimax (حزمة الإحصائيات v3.6.2)23 في المستوى LV1-LV2 لتحديد محور أفقي جديد يفصل العينات بشكل أفضل بواسطة متغير الاستجابة (القسم الفرعي "PLS") (الشكل 8B).
      4. قم بإجراء التحقق المتقاطع (LOOCV) الذي يتم فيه استبعاد عينة واحدة بشكل متكرر من البيانات وإعادة حساب نموذج PLSR. حساب الانحراف المعياري لعمليات تحميل التحليل عبر جميع عمليات تشغيل LOOCV (القسم الفرعي "LOOCV").
  3. إنشاء مخططات تمثيلية: قم بتشغيل نموذج التعليمات البرمجية المقدم كما هو مفصل أعلاه لإنشاء مخططات تمثيلية يتم تصديرها تلقائيا كملفات pdf إلى دليل العمل (المجلد الذي يحتوي على البيانات وملفات التعليمات البرمجية).
    1. إنشاء خريطة حرارية للبيانات المعالجة كما هو موضح في الشكل 8A (القسم الفرعي "PLS"). قم بتلوين كل إدخال على طول طيف محدد بواسطة z-score. فرز التحليلات حسب الترتيب المحسوب في المتغير الكامن للفائدة.
    2. قم بإنشاء مخطط درجات مع درجات LV1 مرسومة على طول المحور الأفقي ودرجات LV2 مرسومة على طول المحور الرأسي ، كما هو موضح في الشكل 8B (القسم الفرعي "PLS"). قم بتلوين كل نقطة بيانات وفقا لقياس متغير الاستجابة الخاص بها لتصور العلاقة بين كل متغير كامن ومتغير الاستجابة.
    3. قم بإنشاء مخطط شريط يعرض الأحمال لكل متغير من متغيرات التنبؤ الخاصة بك لتصور كيفية مساهمة كل محلل في المتغيرات الكامنة ، كما هو موضح في الشكل 8C (القسم الفرعي "LOOCV").
    4. قم بإنشاء مخطط يتراجع درجات LV1 مقابل متغير الاستجابة الخاص بك لتصور مدى جودة فصل نموذج PLSR بين العينات ، كما هو موضح في الشكل 8D (القسم الفرعي "PLS").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم أخذ البيانات التي تم جمعها سابقا من العمل السابق الذي تعرضت فيه مجموعة من ثمانية فئران C57BL/6 لثلاث إصابات مغلقة الرأس (الشكل 2) متباعدة مرة واحدة يوميا11. في هذا العمل ، تم قياس تدفق الدم الدماغي باستخدام التحليل الطيفي المنتشر للارتباط 4 ساعات بعد الإصابة الأخيرة (الشكل 3 ، الشكل 4). بعد تقييم CBF بعد الإصابة ، تم قتل الحيوانات الرحيم ، وتم استخراج أنسجة المخ لتحديد كمية السيتوكينات والبروتينات الفوسفو عن طريق المقايسة المناعية (الشكل 5). قمنا أيضا بقياس علامة تنشيط البلعمة / الخلايا الدبقية الدقيقة Iba1 عبر اللطخة الغربية (الطرق الموضحة في11). تم تحليل أنسجة المخ من كل فأر ، وتم قياس تركيز البروتين الكلي باستخدام فحص BCA. تم إجراء قياس كمي متعدد السيتوكين باستخدام ماوس Milliplex MAP Cytokine/Chemokine 32-Plex ، والذي تمت قراءته باستخدام نظام Luminex MAGPIX (الشكل 6). تم إجراء تحليل نطاق خطي لتحديد تحميل البروتين المناسب (12 ميكروغرام من البروتين لكل 12.5 ميكرولتر من الليزات) (الشكل 7) قبل جمع البيانات من جميع العينات.

تم إعداد بيانات السيتوكين للتحليل عن طريق طرح قياسات الخلفية من بيانات العينة ، ثم بيانات تسجيل z لكل تحليل (الشكل 8A). تم إنشاء خريطة حرارية من البيانات التي تم تسجيلها على z لتصور الاختلافات في التعبير عن السيتوكين بين الحيوانات. تم إجراء الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى (PLSR) باستخدام علامة تنشيط الخلايا البلعمية / الدبقية الدقيقة Iba1 كمتغير استجابة وقياسات السيتوكين كمتغيرات التنبؤ (الشكل 8B). تم إجراء دوران varimax لزيادة التباين المشترك للبيانات على LV1 مع قياسات Iba1 إلى أقصى حد (الشكل 8D). تتوافق أوزان التحميل العالية في LV1 (الشكل 8C) مع تعبير السيتوكين الأكثر ارتباطا بالتعبير العالي عن Iba1. تظهر الانحدارات الخطية بين Iba1 والسيتوكينات أن تلك السيتوكينات ذات الأوزان الأكبر للتحميل في LV1 كانت ذات دلالة إحصائية أيضا (الشكل 8E).

Figure 1
الشكل 1: سير العمل النموذجي. أولا ، تخضع الفئران لإصابة في الرأس مغلقة لانخفاض الوزن ، ثم يتم قياس تدفق الدم الدماغي (CBF) باستخدام التحليل الطيفي المنتشر للارتباط. بعد ذلك ، يتم جمع الأدمغة ، ويتم تشريح المناطق ذات الأهمية الدقيقة وتجميدها باستخدام النيتروجين السائل. استعدادا للفحص المناعي Luminex ، يتم تحليل البروتينات ، ويتم قياس تركيز البروتين الكلي بواسطة فحص حمض البيتشينكونينيك. تستخدم الليزات في اللطخة الغربية للبروتينات ذات الأهمية ومقايسات لومينكس للسيتوكينات وبروتينات الفوسفو. يتم دمج البيانات من CBF و Western blot و Luminex باستخدام الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى (PLSR). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نموذج انخفاض وزن الرأس المغلق لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة. (أ) يتم الإمساك بالفأر المخدر بواسطة الذيل ووضعه على غشاء ذبيحة مشدود أسفل أنبوب توجيهي. يتم إسقاط وزن 54 جم من 1 متر على الجانب الظهري من الرأس. (ب) في غضون ~ 1 مللي ثانية بعد الاصطدام ، استدار رأس الفأر بسرعة حول الرقبة أثناء اختراقه للغشاء الأضحي. (C) في غضون ~ 5 مللي ثانية بعد الاصطدام ، سقط الماوس بأكمله وهو معلق من ذيله الممسك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: قياس تدفق الدم الدماغي بواسطة التحليل الطيفي للارتباط المنتشر. (أ) يتم تثبيت مستشعر بصري يدويا بلطف فوق نصف الكرة الأيمن لقياس تدفق الدم في ماوس مخدر. (ب) وضع مستشعر تمثيلي في نصف الكرة الأيمن. يتم تمثيل مخطط المستشعر على شكل مستطيل أسود متقطع ، وموقع ألياف المصدر والكاشف في دوائر حمراء وزرقاء ، على التوالي. يتم وضع المستشعر بحيث تصطف الحافة القصيرة للمستشعر مع الجزء الخلفي من العين وتتماشى الحافة الطويلة للمستشعر مع خط الوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل بيانات التحليل الطيفي للارتباط المنتشر. (أ) منحنيات الارتباط الذاتي للشدة المقاسة تمثيليا، g2 (τ)، عند خط الأساس، خط الأساس قبل الإصابة (أخضر) و 4 ساعات بعد 5 إصابات مغلقة في الرأس متباعدة مرة واحدة يوميا (أرجواني). يعكس التحول الصحيح في المنحنى من قبل الإصابة إلى ما بعد الإصابة انخفاضا في تدفق الدم. (ب) يتم الحصول على بيانات gEquation(τ) عند 1 هرتز لمدة 5 ثوان لكل نصف كرة وتكرار 3x/نصف الكرة الأرضية. كل منحنى gEquation(τ) مقاس مناسب للحل شبه اللانهائي لمعادلة انتشار الارتباط لمؤشر تدفق الدم الدماغي (CBFi). (ج) يتم حساب متوسط قيم CBFi عبر جميع الإطارات والتكرار للحصول على متوسط مؤشر تدفق الدم الدماغي لكل نصف كرة (يشار إليه بشريط أسود أفقي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التشريح المجهري لدماغ الفأر. (أ) بعد استخراج الدماغ من الفأر ، يتم تقسيمه على طول الخط المتقطع. يتم إصلاح نصف الكرة الأيسر لعلم الأنسجة ، ويتم تشريح نصف الكرة الأيمن المجهري لعلم الأمراض. (ب) منظر القوس لقشرة نصف الكرة الأيمن. يتم تشريح نصف الكرة الأيمن إلى مناطق مرمزة بالألوان المقابلة. لتحليل البروتينات الحساسة للتجميد ، من الأفضل تقسيم أقسام الأنسجة قبل التجميد السريع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: رسم توضيحي لإجراء لومينكس. (أ) إضافة عينات إلى الخرز الموسوم بالفلورسنت. يتم طلاء الخرز مسبقا بجسم مضاد محدد لكل بروتين مثير للاهتمام. (ب) إضافة أجسام مضادة للكشف عن البيوتينيلات. ترتبط الأجسام المضادة للكشف عن البيوتين بالتحليلات ذات الأهمية وتشكل شطيرة مستضد الأجسام المضادة. (ج) إضافة الستربتافيدين المقترن بالفيكويريثرين (PE). يرتبط SAPE بالأجسام المضادة للكشف عن البيوتينيل ، ويكمل التفاعل. بالنسبة لبروتينات الفوسفو ، تتم إضافة مخزن مؤقت للتضخيم (فقط لفحوصات بروتين الفوسفو) بعد الإضافة إلى SAPE لتعزيز إشارة الفحص. (D) أداة Luminex (MAGPIX أو 200 أو FlexMap 3D) تقرأ التفاعل على كل حبة موسومة بالفلورسنت عبر مزيج من الإضاءة الحمراء / الخضراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 7: رسم توضيحي لمنحنى تخفيف العينة لتحديد النطاق الخطي. تركيز البروتين للعينات المخففة بشكل متسلسل مقابل كثافة الفلورسنت المقاسة من فحص Luminex. يعرف النطاق الخطي بأنه نطاق تركيز البروتين الذي تكون العلاقة بين تركيز البروتين وكثافة الفلورسنت خطية (سهم). في بعض التحليلات، يمكن أن تؤدي زيادة تركيز البروتين إلى ما وراء حد معين إلى تقليل ارتباط الأجسام المضادة بحيث يصبح منحنى التخفيف غير خطي أو مقلوب (تأثير هوك). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 8: التحليل التمثيلي الجزئي للانحدار الجزئي للمربعات الصغرى (PLSR). (أ) لوحة تعبير بروتين السيتوكين (الأعمدة اليسرى) جنبا إلى جنب مع تعبير Iba1 (العمود الأيمن) في الفئران 3xCHI (n = 8 ، z-scored). (ب) يعين PLSR الأوزان (الأحمال) للسيتوكينات المقاسة لكل متغير كامن. يتم تطبيق الأوزان على البيانات المقاسة لحساب الدرجات لكل عينة على كل متغير كامن. (ج) حدد PLSR لعينات 3xCHI مقابل Iba1 لمحة مرجحة للسيتوكينات ، LV1 ، والتي ميزت العينات بواسطة Iba1. تم تنظيم السيتوكينات ذات الأوزان السلبية في العينات ذات الأوزان المنخفضة Iba1 بينما تم تنظيم السيتوكينات ذات الأوزان الإيجابية في العينات ذات الأوزان العالية Iba1 (متوسط ± SD باستخدام LOOCV). (د) الانحدار الخطي لدرجات LV1 لكل عينة مقابل Iba1. يقيس R2PLS مدى ملاءمة الملاءمة بين Iba1 و LV1. (ه) الانحدار الفردي ل Iba1 ضد كل من السيتوكينات ذات الأوزان الأكبر في LV1 في C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فيما يلي تفاصيل طرق تقييم استجابة الدورة الدموية والالتهابات العصبية لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة المتكررة. علاوة على ذلك ، أظهرنا كيفية دمج هذه البيانات كجزء من تحليل الأنظمة متعددة المتغيرات باستخدام الانحدار الجزئي للمربعات الصغرى. في النص أدناه ، سنناقش بعض الخطوات والقيود الرئيسية المرتبطة بالبروتوكول بالإضافة إلى مزايا / عيوب الأساليب على الطرق الحالية.

نموذج انخفاض الوزن لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة. هذه الطريقة في تحريض إصابات الدماغ الرضحية مفيدة من حيث أنها تتميز بتأثير حاد يليه تسارع دوراني أمامي خلفي سريع شائع في إصابات الرأس المرتبطة بالرياضة10,19. من المؤكد أن دماغ الفأر اللساني الدماغي لا يلخص تماما تعقيد الدماغ البشري الجيروسيفالي. ومع ذلك ، فإن هذا النموذج يحفز العديد من نفس العواقب السريرية والسلوكية ل mTBI البشري ، بما في ذلك العجز المستمر في التعلم المكاني والذاكرة مع الإصابات المتكررة. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن التأثير خفيف بطبيعته (لا يوجد ضرر هيكلي / عصبي ، ولا نفاذية حاجز دموي في الدماغ ، والعجز المعرفي الذي يظهر فقط بعد ضربات متعددة ، وما إلى ذلك.19) ، فإنه يؤدي إلى فقدان كبير للوعي ، على عكس البشر حيث يكون فقدان الوعي أقل شيوعا. قد يكون هذا الفقدان المتزايد للوعي بسبب التفاعل مع التخدير الذي تم إعطاؤه مباشرة قبل التأثير ، على الرغم من أن السبب الدقيق غير مفهوم جيدا. أخيرا ، نلاحظ أن محاذاة أنبوب التوجيه بحيث يؤثر الترباس بين الغرز الإكليلية واللامدوية أمر بالغ الأهمية. لقد لاحظنا أن التأثيرات التي تكون أكثر خلفية يمكن أن تسبب عجزا حركيا كبيرا يتطلب القتل الرحيم.

تقييم تدفق الدم الدماغي باستخدام التحليل الطيفي للارتباط المنتشر. تشكل القياسات الطولية غير الغازية لتدفق الدم الدماغي (CBF) مع الطرائق التقليدية المستخدمة في الدراسات البشرية / الحيوانية الكبيرة ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي للتروية أو الموجات فوق الصوتية دوبلر عبر الجمجمة ، تحديا في الفئران لأسباب مختلفة ، بما في ذلك صغر حجم الدماغ وإجمالي حجم الدم29. التحليل الطيفي للارتباط المنتشر مناسب تماما في الفئران ويوفر مزايا إضافية تتمثل في كونه غير جراحي وغير مكلف نسبيا مقارنة بالطرائق الأخرى20,30. نظرا لأن DCS حساس للتحف المتحركة ، يجب تخدير الفئران لفترة وجيزة أو تقييدها31 للتقييم. نحن عادة ما نستخدم تخدير الأيزوفلوران بسبب تحريضه السريع وتعافيه. ومع ذلك ، فإن الأيزوفلوران هو موسع للأوعية الدماغية ، ويجب تفسير تقديرات تدفق الدم تحت الأيزوفلوران بحذر. يمكن أن يكون الانخفاض في تدفق الدم الذي شوهد بعد الإصابة مقارنة بالحيوانات المصابة بالعدوى الزائفة مرتبكا بسبب فشل الأوعية الدموية الدماغية المصابة في الأوعية الدموية استجابة للأيزوفلوران. أخيرا ، لقد أظهرنا سابقا قابلية ممتازة للتكرار داخل المستخدم لقياسات تدفق الدم مع DCS في الفئران ولكن فقط التكرار العادل داخل المستخدم21. لهذا السبب ، نوصي بأن يحصل نفس المشغل على قياسات DCS للتجارب التي تتطلب تقييما طوليا لتدفق الدم الدماغي.

تحديد كمي متعدد الإرسال للسيتوكينات وبروتينات الفوسفو باستخدام مقايسات لومينيكس. أحد التحديات الرئيسية مع أي ELISA هو تأثير هوك ، حيث يمكن أن تقلل زيادة تركيز البروتين من تقارب الأجسام المضادة للبروتين المستهدف ، مما يؤدي إلى انخفاض إشارة الفحص استجابة لزيادة البروتين32 (الشكل 7). يمكن أن يتفاقم هذا التأثير عند تحليل الأنسجة الكاملة ، حيث يمكن أن تتداخل البروتينات السائبة بالمثل. وبالتالي ، فإن الخطوة الأولى في استخدام مقايسات Luminex هي تحديد ما إذا كانت هناك مجموعة من تركيزات البروتين المحملة والتي تختلف قراءة الفحص خطيا مع كمية البروتين المحملة. وينبغي استبعاد التحليلات التي ليس لها مثل هذا النطاق الخطي (الشكل 7) من التحليل. نلاحظ أيضا أن مستويات السيتوكين في الدماغ عادة ما تكون منخفضة جدا وتظهر بالقرب من حد الكشف الأدنى الذي تم تقييمه عبر المنحنيات القياسية المزودة بمجموعة Luminex. لهذا السبب ، من الضروري إجراء تحليل نطاق خطي لتحديد ما إذا كانت قراءة الأداة تعكس حقا كمية العينة المحملة. بالنسبة للبروتينات الرئيسية ذات الأهمية ، يمكن استكمال تحليل النطاق الخطي هذا باختبار استرداد الارتفاع حيث يتم رفع البروتين المؤتلف إلى عينة ، ويتم تقييم الخطية في قراءة الأداة33.

نظرا لأن الالتهاب العصبي يتم تنظيمه بواسطة بروتينات فوسفو متنوعة داخل الخلايا وسيتوكينات خارج الخلية ، فمن الأهمية بمكان قياس مجموعة واسعة من هذه البروتينات في وقت واحد من أجل فهم الاستجابة المناعية العصبية للدماغ ل mTBI. تتيح المقايسات المناعية متعددة الإرسال من Luminex التحديد الكمي المتزامن لعشرات السيتوكينات وبروتينات الفوسفو من عينة واحدة ، مما يوفر رؤية شاملة للاستجابة المناعية للأنسجة بعد الإصابة. على الرغم من أن هذه التحليلات توفر رؤية واسعة للسيتوكينات / الكيموكينات وكذلك البروتينات الفوسفو ، فإن الفحص يحدد الكمية الإجمالية لكل بروتين من تجانس الأنسجة. وبالتالي ، فإنه لا ينتج بيانات محددة من نوع الخلية. يمكن تحديد خصوصية نوع الخلية من خلال متابعة الكيمياء النسيجية المناعية لتحديد توطين البروتينات العليا ذات الأهمية مع علامات لأنواع الخلايا (على سبيل المثال ، الخلايا العصبية ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، الخلايا النجمية ، إلخ.) 11.

تحليل انحدار المربعات الصغرى الجزئي لتكامل البيانات. استجابة الأنسجة ل mTBI متعددة العوامل ، تتكون من التغيرات الفسيولوجية في تدفق الدم جنبا إلى جنب مع التغيرات في علامة تنشيط البلعمة / الخلايا الدبقية الدقيقة Iba1 ، والسيتوكينات المتنوعة ، وبروتينات الفوسفو ، من بين أمور أخرى11. ونظرا للطبيعة المتعددة للبيانات التي تم جمعها، هناك حاجة إلى طريقة منهجية لمراعاة تعدد أبعاد العلاقات بين مختلف متغيرات التنبؤ. يوفر PLSR حلا مناسبا لهذه المشكلة من خلال تحديد LVs التي تحدد إلى أقصى حد التباين المشترك بين متغيرات التنبؤ ومتغير النتيجة (على سبيل المثال ، Iba1 في الشكل 8). الأهم من ذلك ، أن تلك البروتينات التي وجد أنها ترتبط ارتباطا وثيقا بمتغير التنبؤ (أي تلك التي تحتوي على أحمال عالية على LV1) غالبا ما ترتبط في تحليل الانحدار أحادي المتغير أيضا (الشكل 8E). نظرا لأن PLSR غالبا ما يستخدم لملاءمة عدد كبير من متغيرات التنبؤ بعدد أقل من العينات كما في الشكل 8 ، فمن الأهمية بمكان فهم حساسية الأوزان على LV1 للعينات الفردية. بالنسبة لعدد صغير من العينات (<10) ، يكون LOOCV مفيدا لتقييم حساسية الأوزان (المشار إليها عبر أشرطة خطأ SD في الشكل 8C). وبالنسبة لعدد أكبر من العينات، سيكون من المهم تقييم الحساسية عن طريق ترك عينات متعددة في وقت واحد باستخدام نهج مونت كارلو لأخذ العينات الفرعية34. نحيل القارئ إلى تحليل البيانات متعدد و Megavariate24 لإجراء مناقشة متعمقة لنهج PLSR واستخداماته. وأخيرا، نلاحظ أن أحد القيود الرئيسية لهذا النوع من التحليل هو أنه مرتبط بحت. لا يثبت PLSR وجود علاقة ميكانيكية بين متغيرات التنبؤ ومتغير النتيجة. نحن ننظر إلى PLSR على أنه نهج قيم لتوليد الفرضيات يستخدم لاقتراح أهداف قابلة للسحب لتعديلها في التجارب المستقبلية التي تنشئ علاقات سببية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

اي.

Acknowledgments

تم دعم هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة R21 NS104801 (EMB) و R01 NS115994 (LBW / EB) وجائزة الرعاية الصحية للأطفال في أتلانتا للكلية المبتدئة (EMB). تم دعم هذا العمل أيضا من قبل وزارة الدفاع الأمريكية من خلال برامج البحوث الطبية الموجهة من الكونغرس بموجب الجائزة رقم. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي آراء المؤلف ولا تؤيدها بالضرورة وزارة الدفاع. تستند هذه المواد إلى العمل المدعوم من قبل برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم 1937971. أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المادة هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر المؤسسة الوطنية للعلوم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adjustable pipettes any adjustable pipette
Aluminum foil VWR 89107-726
Bio-Plex cell lysis kit C Bio-Rad 171304012
BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile BrandTech 781602 96
Complete mini protease inhibitor tablet Sigma-Aldrich 11836153001
Depilatory cream Amazon Nair
DiH2O VWR VWRL0200-1000
Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates Millipore Sigma Catalogue 40-285
Hardware Autocorrelator Board www.correlator.com Flex05-8ch
Isoflurane 250 mL MED-VET INTERNATIONAL RXISO-250
Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) VWR 21905-026
Laboratory vortex mixer VWR 10153-838
LabView National Instruments LabVIEW
Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software Luminex Corporation
Luminex Drive Fluid Luminex MPXDF-4PK
Luminex sheath fluid EMD Millipore SHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay Millipore Sigma MCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay Millipore Sigma 48-660MAG
Mini LabRoller rotator VWR 10136-084
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
Phosphate-buffered Saline (PBS) VWR 97064-158
Plate Sealer VWR 82050-992
Polypropylene microfuge tubes VWR 20901-547
Mini LabRoller Millipore Sigma Z674591
Reagent Reservoirs VWR 89094-668
R Programming Language
RStudio www.rstudio.com
Sonicator
Titer plate shaker VWR 12620-926
Tween20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
1 m acrylic guide tube McMaster-Carr 49035K85
4 photon counting avalanche photodiode Perkin-Elmer SPCM-AQ4C-IO
400 um multimode source fiber Thorlabs Inc. FT-400-EMT
54 g bolt Ace Hardware 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length
780 nm single mode detector fiber Thorlabs Inc. 780HP
852 nm long-coherence length laser TOPTICA Photonics iBeam smart

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
  2. Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
  3. Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
  4. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  5. Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , National Academies Press (US). Washington (DC). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169016/ (2014).
  6. Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
  7. McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
  8. Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
  9. Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).
  10. Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
  11. Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
  12. Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
  13. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
  14. Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
  15. Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
  16. Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
  17. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury--part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
  18. Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
  19. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
  20. Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
  21. Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).
  22. Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).
  23. Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
  24. Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
  25. Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
  26. Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).
  27. Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
  28. Bertrand, F., Maumy-Bertrand, M. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019).
  29. White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322 (2011).
  30. Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).
  31. Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
  32. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
  33. Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
  34. Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 183 ، إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة ، تدفق الدم الدماغي ، التهاب الأعصاب ، إليسا متعددة الإرسال ، انحدار جزئي للمربعات الصغرى ، السيتوكينات ، بروتينات الفوسفو
تحليل نظم الاستجابة العصبية الالتهابية والديناميكا الدموية لإصابات الدماغ الرضحية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brothers, R. O., Bitarafan, S.,… More

Brothers, R. O., Bitarafan, S., Pybus, A. F., Wood, L. B., Buckley, E. M. Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (183), e61504, doi:10.3791/61504 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter