Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Systemanalyse af det neuroinflammatoriske og hæmodynamiske respons på traumatisk hjerneskade

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/61504
Automatic Translation
*1, *2,3, 1,3, *1,2,3, *1,4,5
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol præsenterer metoder til at karakterisere det neuroinflammatoriske og hæmodynamiske respons på mild traumatisk hjerneskade og til at integrere disse data som en del af en multivariat systemanalyse ved hjælp af delvis mindste kvadratisk regression.

Abstract

Milde traumatiske hjerneskader (mTBIs) er et væsentligt folkesundhedsproblem. Gentagen eksponering for mTBI kan føre til kumulative, langvarige funktionelle underskud. Talrige undersøgelser fra vores gruppe og andre har vist, at mTBI stimulerer cytokinekspression og aktiverer microglia, nedsætter cerebral blodgennemstrømning og metabolisme og forringer cerebrovaskulær reaktivitet. Desuden har flere værker rapporteret en sammenhæng mellem forstyrrelser i disse neuroinflammatoriske og hæmodynamiske markører og kognitive svækkelser. Heri beskriver vi metoder til at karakterisere det neuroinflammatoriske og hæmodynamiske vævsrespons på mTBI hos mus. Specifikt beskriver vi, hvordan man udfører en vægtfaldsmodel af mTBI, hvordan man i længderetningen måler cerebral blodgennemstrømning ved hjælp af en ikke-invasiv optisk teknik kaldet diffus korrelationsspektroskopi, og hvordan man udfører et Luminex multiplexet immunassay på hjernevævsprøver for at kvantificere cytokiner og immunmodulerende phospho-proteiner (f.eks. Inden for MAPK- og NFκB-vejene), der reagerer på og regulerer aktiviteten af mikroglia og andre neurale immunceller. Endelig beskriver vi, hvordan man integrerer disse data ved hjælp af en multivariat systemanalysemetode for at forstå forholdet mellem alle disse variabler. At forstå forholdet mellem disse fysiologiske og molekylære variabler vil i sidste ende gøre det muligt for os at identificere mekanismer, der er ansvarlige for mTBI.

Introduction

Overblik
Milde traumatiske hjerneskader (mTBI'er) påvirker ~ 1,6-3,8 millioner atleter årligt1. Disse skader, herunder sub-hjernerystelse og hjernerystelse, kan efterlade patienter med forbigående fysiske, følelsesmæssige, psykologiske og kognitive symptomer2. Desuden kan gentagen mTBI (rmTBI), der opretholdes inden for et "sårbarhedsvindue", føre til kumulativ sværhedsgrad og varighed af kognitive konsekvenser, der varer længere end virkningerne af en enkelt mTBI alene3, og i sidste ende endda til permanent tab af funktion 4,5,6. Selvom mange patienter kommer sig inden for en relativt kort tidsramme (<1 uge), lider 10-40% af patienterne længerevarende virkninger af mTBI i > 1 måned, hvor nogle varer op til 1 år 3,7,8,9. På trods af den høje forekomst og varige konsekvenser af disse skader er skadesmekanismer dårligt forstået, og der findes ingen effektive behandlingsstrategier.

I betragtning af den store variation i resultaterne efter mTBI/rmTBI er en udfordring ved at identificere molekylære udløsere fra væv opnået i terminale mTBI/rmTBI-undersøgelser manglen på langsgående data, der viser endelige "akutte molekylære forbindelser" af disse molekylære udløsere til langsigtede resultater. For at overvinde denne udfordring har vores gruppe opdaget, at akut reduceret cerebral blodgennemstrømning målt akut ved hjælp af et optisk værktøj kaldet diffus korrelationsspektroskopi (DCS) stærkt korrelerer med langsigtet kognitivt resultat i en musemodel af rmTBI10. Ved hjælp af denne hæmodynamiske biomarkør viste vi, at mus med akut lav cerebral blodgennemstrømning (og i forlængelse heraf dårligere forudsagt langsigtet resultat) har samtidige akutte stigninger i neuronal phospho-signalering inden for både MAPK- og NFκB-veje, stigninger i neuronal ekspression af proinflammatoriske cytokiner og stigninger i ekspression af fagocyt/mikroglialmarkøren Iba111 . Disse data tyder på en mulig rolle for neuronal phospho-signalering, cytokinekspression og mikroglial aktivering i både den akutte regulering af cerebral blodgennemstrømning efter skade såvel som i at udløse en signalkaskade, der fører til neuronal dysfunktion og værre kognitivt resultat. Heri beskriver vi vores tilgang til samtidig at undersøge både det hæmodynamiske og neuroinflammatoriske miljø efter rmTBI, og hvordan man integrerer disse komplekse datasæt. Specifikt skitserer vi procedurer for fire vigtige trin til denne omfattende tilgang: (1) en vægtfaldsmodel for mild traumatisk hjerneskade, (2) vurdering af cerebral blodgennemstrømning med diffus korrelationsspektroskopi, (3) kvantificering af det neuroinflammatoriske miljø og (4) dataintegration (figur 1). Nedenfor giver vi en kort introduktion til hvert af disse vigtige trin for at hjælpe med at guide læserne gennem rationalet bag vores metoder. Resten af manuskriptet indeholder en detaljeret protokol for hvert af disse nøgletrin.

Vægtfaldsmodel af mild traumatisk hjerneskade
Selvom der findes mange fremragende prækliniske modeller af gentagen mild TBI 12,13,14,15,16,17,18, anvender vi en veletableret og klinisk relevant vægtfaldsmodel med lukket hovedskade. Nøglefunktioner i denne model omfatter (1) stump påvirkning af det intakte kranium / hovedbund efterfulgt af ubegrænset rotation af hovedet om halsen, (2) ingen åbenlys strukturel hjerneskade, ødem, blod-hjernebarriereskade, akut celledød eller kronisk hjernevævstab og (3) vedvarende (op til 1 år) kognitive underskud, der først opstår efter flere hits19 (figur 2).

Vurdering af cerebral blodgennemstrømning med diffus korrelationsspektroskopi
Diffus korrelationsspektroskopi (DCS) er en ikke-invasiv optisk teknik, der målerblodgennemstrømningen 5,20,21. I DCS placeres en nær-infrarød lyskilde på vævsoverfladen. En detektor placeres i en fast afstand fra kilden på vævsoverfladen for at detektere lys, der har formeret sig spredt gennem vævet (figur 3). Spredning af bevægelige røde blodlegemer får den detekterede lysintensitet til at svinge med tiden. En simpel analytisk model kendt som korrelationsdiffusionsteori bruges til at relatere disse intensitetsudsving til et indeks for blodgennemstrømning (CBFi, figur 4). Selvom enhederneCBF i (cm2/s) ikke er de traditionelle strømningsenheder (ml/min/100 g), har en tidligere undersøgelse på mus vist, at CBFi stærkt korrelerer med cerebral blodgennemstrømning målt ved arteriel spin mærket MR21.

Til reference blev DCS-instrumentet, der anvendes her, bygget internt og består af en 852 nm lang kohærenslængdelaser, en række 4 fotontællende lavinefotodioder og et hardware-autokorrelatorkort (enkelt tau, 8 kanal, 100 ns minimum prøvetid)21,22. Data erhverves med hjemmelavet software skrevet i LabView. Dyregrænsefladen til enheden består af en 400 μm multimode kildefiber (400-2200 nm bølgelængdeområde, ren silicakerne, TECS Hard Cladding) og en 780 nm single mode detektorfiber (780-970 nm bølgelængdeområde, ren silicakerne, TECS Hard Cladding, 730 ± 30 nm anden tilstand afskæring) med en afstand på 6 mm fra hinanden og indlejret i en sort 3D-trykt sensor (4 mm x 8 mm, Figur 3).

Kvantificering af det neuroinflammatoriske miljø
Selvom neuroinflammation reguleres af forskellige cellulære processer, er to vigtige relevante mekanismer ekstracellulær signalering af cytokiner / kemokiner og intracellulær signalering af phosphoproteiner. For at undersøge det neuroinflammatoriske miljø i hjernen efter skaden ekstraheres hjerner fra mus, mikrodissekteret, og cytokiner / kemokiner og phosphoproteiner kvantificeres ved hjælp af Luminex (figur 5, figur 6, figur 7). Luminex multiplexerede immunassays muliggør samtidig kvantificering af en forskelligartet samling af disse proteiner ved at koble enzymbundne immunosorbentassays (ELISA'er) til fluorescerende mærkede magnetiske perler. Forskellige fluorescerende tags anvendes til hvert protein af interesse, og perler af hvert mærke funktionaliseres med et fangstantistof mod det pågældende protein. Hundredvis af perler til indfangning af hvert protein blandes sammen, placeres i en 96 brøndplade og inkuberes med prøve. Efter prøveinkubation bruges en magnet til at fange perlerne i brønden, mens prøven vaskes ud. Dernæst binder biotinyleret detektionsantistof sig til den analyt, der er af interesse, for at danne en antistof-antigensandwich svarende til en traditionel ELISA, men med ELISA for hvert protein, der forekommer på en anden fluorescerende mærket perle. Tilsætning af phycoerythrin-konjugeret streptavidin (SAPE) fuldender hver reaktion. Luminex-instrumentet læser derefter perlerne og adskiller signalet i henhold til hvert fluorescerende mærke / protein.

Integration af data
På grund af det store antal analytter (f.eks. cytokiner), der måles i Luminex-analysen, kan dataanalyse være vanskelig at fortolke, hvis hvert kvantificeret protein analyseres individuelt. For at forenkle analysen og fange tendenser observeret blandt analytter bruger vi en multivariat analysemetode kaldet delvis mindste kvadratisk regression (PLSR, figur 8)23. PLSR virker ved at identificere en vægtakse svarende til hvert målt protein (dvs. cytokiner eller phospho-proteiner, kaldet "prædiktorvariabler"), der tilsammen optimalt forklarer co-varians af de målte proteiner med en responsvariabel (f.eks. Cerebral blodgennemstrømning). Vægtene kaldes "belastninger" og samles i en vektor kendt som en latent variabel (LV). Ved at projicere (kaldet "scoring") de målte proteindata på hver af to GV'er, kan dataene omplottes med hensyn til disse IV'er. Efter beregning af PLSR bruger vi en varimax-rotation til at identificere en ny LV, der maksimerer kovariansen mellem prøvefremskrivningerne på LV og prædiktorvariablen24. Denne tilgang giver os mulighed for at definere LV1 som den akse, for hvilken variansen af responsvariablen bedst forklares. LV2 maksimerer samevariansen mellem responsvariablen og LV1-restdata, som kan være forbundet med biologisk eller teknisk variabilitet mellem prøver. Endelig gennemfører vi en Leave One Out Cross Validation (LOOCV) for at sikre, at PLSR-modellen ikke er stærkt afhængig af en enkelt prøve23.

I denne protokol beskriver vi metoder til at karakterisere det neuroinflammatoriske og hæmodynamiske vævsrespons på mTBI. Den generelle arbejdsgang er skitseret i figur 1. I denne protokol er mus underlagt en eller flere mTBI'er ved hjælp af en vægt-drop lukket hovedskademodel. Cerebral blodgennemstrømning måles i længderetningen før og på flere tidspunkter efter skade. På tidspunktet for interesse for forhør af neuroinflammatoriske ændringer aflives dyret, og hjernen ekstraheres. Hjerneområder af interesse isoleres via mikrodissektion og lyses derefter for at ekstrahere protein. Lysater anvendes derefter til både Luminex multiplexerede immunassays af cytokin og phospho-protein ekspression samt Western blot. Endelig integreres dette holistiske datasæt ved hjælp af en delvis regressionsanalyse af mindst kvadrater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg er godkendt af Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og fulgte NIH-retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr.

1. Vægt-drop model af mild traumatisk hjerneskade

  1. Forbered vægtfaldsopsætningen. Monter en skruestik på en plan overflade med et styrerør på 1 m (2,54 cm indvendig diameter) justeret lodret (kontroller ved hjælp af et niveau). Brug en 54 g bolt (0,95 cm grundlæggende kropsdiameter, 2 cm hoveddiameter, 10,2 cm længde) til stød.
  2. Kort anæstesi mus. Fremkald musen med 4,5% isofluran i 100% ilt i 45 sekunder. Bekræft tilstrækkelig dybde af anæstesi ved manglen på en tåklemmerespons.
  3. Fremkalde skade.
    1. Fjern hurtigt musen fra anæstesi og læg musen tilbøjelig til midten af en tynd membran (11,2 cm x 21,3 cm væv).
    2. Brug begge hænder til at holde vævet stramt med musen tilbøjelig til midten. Fastgør musens hale under en tommelfinger. Placer musehovedet under styrerøret (figur 2).
    3. Slip bolten fra toppen af styrerøret på det dorsale aspekt af musens hoved, og sigt mod stød mellem bagsiden af øjnene og forsiden af ørerne. Ved stød vil musen trænge ind i vævet, hvilket giver mulighed for hurtig acceleration af hovedet omkring nakken (figur 2).
  4. Opsving
    1. Efter stød skal du placere musens liggende på en 37 °C varmepude i rumluften. Overvåg restitution i 1 time efter skaden. Inden for 1 time skal mus være i stand til at ambulere normalt, finde mad og vand og ikke udvise grovmotoriske underskud.
      BEMÆRK: Analgesi anvendes ikke efter godkendelse fra Institutional Animal Care and Use Committee, hvilket er berettiget på grund af analgesiens forvirrende indflydelse på parametrene af interesse (dvs. cerebral blodgennemstrømning, markører for inflammation). Bevidsthedstab, defineret som tiden fra fjernelse fra anæstesi til tiden til at genvinde retrefleks, forventes og varer typisk fra 20 s til 3 minutter (supplerende tabel 1). Korte (<30 s) episoder af apnø og / eller anfaldslignende aktivitet kan observeres, især efter gentagne hovedskader fordelt en gang dagligt.
  5. Gentag efter behov. Denne skade kan gentages en gang dagligt, ugentligt eller månedligt. Antallet og afstanden mellem skader afhænger af den ønskede skades sværhedsgrad. Typisk anvender vi fem hits fordelt en gang dagligt for at fremkalde robuste underskud i rumlig læring og hukommelse.
    BEMÆRK: Tidligere undersøgelser har vist, at fem hits med mellemrum en gang dagligt er tilstrækkelige til at fremkalde underskud i rumlig læring og hukommelse, der varer over 1 år efter skade uden ødem, blødning eller åbenlys strukturel skade på hjernen19. Mus vejes dagligt og overvåges nøje for tegn på dehydrering, motoriske underskud og tab af appetit. Hvis dehydreres, får mus fugtig chow og en subkutan injektion på 1 ml saltvand en gang dagligt. For at forhindre unødvendig lidelse og for at sikre et humant endepunkt aflives mus, hvis: dehydrering vedvarer eller forværres >24 timer efter subkutan saltvandsbehandling, kropsvægten falder med mere end 20% fra baseline før skade, motoriske underskud såsom cirkling eller potetrækning vises og vedvarer >1 time efter skade.

2. Vurdering af cerebral blodgennemstrømning med diffus korrelationsspektroskopi

  1. DATAINDSAMLING af DCS-data
    1. Fjern hår i hovedbunden. Fordi DCS fungerer bedst i mangel af hår, er det nødvendigt at fjerne pels på hovedet inden forsøgets start. Typisk udføres hårfjerning 1-3 dage før undersøgelsens start.
      1. Inducer mus med 4,5% isofluran i 100% ilt i 45 sekunder og oprethold med 1-2% isofluran i 100% ilt.
      2. Barber hovedet mellem øjnene og ørerne. Brug derefter hårfjerningscreme til at fjerne pels på hovedet som i figur 3.
      3. Lad dyret komme sig efter anæstesi på en opvarmningspude og derefter vende tilbage til buret.
    2. Mål cerebral blodgennemstrømning med DCS. For at minimere bevægelsesartefakter under måling skal du studere mus under kort isofluranbedøvelse.
      BEMÆRK: Overvåg visuelt åndedræt og tåklemmerespons gennem målinger, og juster isoflurankoncentrationen efter behov for at sikre ensartet dybde af anæstesi. Signifikante variationer i dybden af anæstesi kan ændre blodgennemstrømningen i betragtning af de kendte vasomodulerende virkninger af isofluran25.
      1. Inducer med 4,5% isofluran i 100% ilt i 45 sekunder, og oprethold derefter med 1,0-1,75% isofluran i 100% ilt. Bekræft tilstrækkelig dybde af anæstesi ved fravær af en tåklemmerespons og normal åndedræt (mellem ~ 60-80 vejrtrækninger pr. Minut).
      2. Efter en stabiliseringsperiode på 2 minutter skal DCS-sensoren forsigtigt hviles over højre halvkugle, således at den optiske sensors øverste kant står på linje med bagsiden af øjet, og sensorens side står op langs midterlinjen (figur 3). Kop en hånd over sensoren for at beskytte mod rumlys. Erhverv 5 sekunders data (1 Hz erhvervelse).
      3. Flyt sensoren over venstre halvkugle, og hent 5 sekunders data.
      4. Gentag 3 gange / halvkugle for at tage højde for lokale heterogeniteter under vævsoverfladen.
    3. Opsving
      1. Fjern musen fra anæstesi og læg den på en varmepude.
      2. Når musen har genvundet sin rette refleks, skal du returnere den til buret.
  2. DCS-dataanalyse
    1. Udfør indledende kvalitetskontrol. Hver ramme af DCS-data består af en målt normaliseret intensitetsautokorrelationsfunktion Equation 110 (figur 4A) og fotontællingshastighed (kHz).
      1. Hvis du vil fjerne datarammer med signifikant bevægelsesartefakt, skal du kassere datarammer, Equation 111for hvilke middelværdien af Equation 110 kurvens hale (dvs. ) er > 1.005.
      2. Hvis du vil fjerne datarammer med dårligt signal-støj-forhold, skal du kassere datarammer, hvis den registrerede fotontællingshastighed er < 20 kHz.
    2. Uddrag cerebral blodgennemstrømningsindeks. Brug fminsearch i Matlab til at tilpasse hver ith målte dataramme Equation 112 til CBFi (i). Begræns tilpasninger til Equation 113, og find værdien af CBFi , der minimerer følgende omkostningsfunktion:
      Equation 114
      Hvor summen er over alle målte forsinkelsestiderEquation 115 og Equation 116 er den halvfatlsende homogene opløsning af korrelationsdiffusionsligningen (figur 4B):
      Equation 117
      Her er β en kohærensfaktor bestemt af forsøgsopsætningen, Equation 7, Equation 8Equation 9Equation 10, , , Equation11Reff = 0,493 for et antaget vævsindeks for brydning på 1,4, ρ er 6 mm, og μa og μ er vævets absorptions- og reducerede spredningskoefficient (antages at være henholdsvis 0,25 og 9,4 / cm10,26,27).
      BEMÆRK: Fordi β kan variere ~ 10% over tid, skal du passe hver dataramme til β og CBFi samtidigt.
    3. Udfør sekundær kvalitetskontrol. Inden for hver gentagelse (som består af 5 datarammer) skal du kassere outliers. Outliers defineres som de CBFi-værdier , der falder uden for 1,5 standardafvigelser fra den gennemsnitlige CBFi for den pågældende gentagelse. Hvis mere end 1 datapunkt identificeres som en outlier, skal du kassere hele gentagelsen.
    4. Estimer gennemsnitligt cerebralt blodgennemstrømningsindeks: Anslå et gennemsnitligt CBFi pr. Halvkugle ved at tage gennemsnittet på tværs af alle datarammer for alle gentagelser (figur 4C). Hvis der ikke observeres signifikante halvkugleformede forskelle, gennemsnit på tværs af halvkugler for at opnå et skøn over den gennemsnitlige globale CBFi.

3. Multiplexeret kvantificering af cytokiner og phosphoproteiner ved hjælp af luminexassays

  1. Vævsekstraktion
    BEMÆRK: Kvantificering af hjernecytokinter og phospho-signalproteiner ved hjælp af Luminex kræver vævsekstraktion.
    1. Anæstesi mus ved hjælp af 4,5% isofluran i 100% ilt i 1-2 min. Kontroller for dybt plan af anæstesi via manglen på en tåklemmerespons. Aflivning via halshugning.
    2. Høst vævet.
      1. Fjern hjernen. Typisk skal du rette venstre halvkugle til histologi og mikrodissektere flere regioner fra højre halvkugle inden for cortex og hippocampus (figur 5).
      2. Anbring dissekerede prøver i mikrocentrifugerør, flashfrys i flydende nitrogen. Til analyse af frysefølsomme proteiner er det optimalt at opdele vævssektioner inden flashfrysning for at undgå senere fryse-optøning.
        BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause, og vævsprøver kan opbevares ved -80 °C, indtil de er klar til at lyse prøver. Alternativt kan prøverne lyseres og derefter opbevares ved -80 °C.
    3. Lyse prøver.
      1. Forbered lysisbufferen ved at tilsætte proteasehæmmer og 2 mM phenylmethylsulfonylfluorid til lysisbufferen.
      2. Der tilsættes 150 μL af den blandede lysisbuffer pr. ca. 3 μg animalsk væv. Til reference er musevisulige cortexvævsprøver ca. 3 μg.
      3. For at homogenisere vævet skal du mekanisk triturere vævet ved at pipettere op og ned ~ 15-20 gange ved hjælp af en 1000 μL pipette. For optimal prøvetrituration kan en homogenisatorpest anvendes.
      4. Prøverørene anbrings på en rotator i 30 minutter ved 4 °C.
      5. Centrifugering af prøverne ved 4 °C i 10 minutter ved ca. 15.000 x g og opsaml supernatanten. Prøverne kan behandles straks eller opbevares ved -80 °C med henblik på yderligere analyse.
        BEMÆRK: Prøvelysater fremstillet ved hjælp af denne protokol er kompatible med Western blot, hvorfra fagocyt/mikroglialmarkøren Iba1 og/eller astrocytaktiveringsmarkøren GFAP kan analyseres for at supplere cytokin- og phosphoproteinanalyse til neuroinflammationsundersøgelser11.
  2. Multiplex immuno-assay protokol for cytokiner og phospho-proteiner
    BEMÆRK: Selvom det generelt ligner hinanden, er der nogle mindre forskelle i protokollerne for cytokin- og phospho-proteinsæt. Forskelle bemærkes i hvert trin. Trinnene til forberedelse af prøver til Luminex-analysen er beskrevet nedenfor.
    1. Fremstilling af reagenser (dag 1, samme for cytokiner og phosphoproteiner)
      1. Lad reagenser varme op til stuetemperatur (~ 30 min).
      2. Sonicate multiplex magnetiske perler flaske i 30 sekunder efterfulgt af 1 minuts hvirvel. Sørg for, at multiplex magnetiske perler er afskærmet fra lys med aluminiumsfolie eller brug medfølgende lette beskyttelsesflasker.
      3. Forbered vaskebufferen ved at blande 0,1% Tween20 i 1xPBS eller alternativt bruge vaskebufferen, der er angivet i sættet.
    2. Fremstilling af lyserede vævsprøver (dag 1, samme for cytokiner og phosphoproteiner)
      1. Hvis de tidligere er frosset, skal du fjerne lyserede vævsprøver fra fryseren og lade dem tø op på is (~ 20 minutter). Centrifugeprøver i 10 minutter ved 9.167 x g for at fjerne bundfald.
      2. Der fremstilles 25 μL prøve ved den optimale proteinkoncentration bestemt ved den lineære intervalanalyse (se pkt. 3.3). For at normalisere det samlede volumen for alle prøver skal du fortynde prøverne i den assaybuffer, der er angivet i sættet.
    3. Fremstilling af 96 brøndplade (dag 1, samme for cytokiner og phosphoproteiner)
      1. Brug den 96 brøndplade, der følger med i sættet, eller en med en tynd bund (f.eks. Brand Tech).
      2. Tilsæt 200 μL vaskebuffer (eller 1x PBS, 0,1% Tween) i hver brønd og bland på pladeryster i 10 minutter ved 750 o / min.
      3. Dekanter vaskebuffer og tryk pladen på et papirhåndklæde for at fjerne rester.
    4. Immunoassay procedure for cytokiner (dag 1)
      1. Tilføj følgende til hver brønd i rækkefølge.
        1. Tilsæt 25 μL assaybuffer til alle brønde.
          1. Tilsæt KUN 25 μL ekstra assaybuffer til baggrundsbrønde. For hver eksperimentel kørsel skal du have mindst to baggrundsbrønde. Baggrundsbrønde har ingen prøve indlæst og definerer den fluorescerende intensitet, der læses af instrumentet uden prøve.
          2. Der tilsættes 25 μL af hver fortyndet prøve til tilsvarende prøvebrønde.
          3. Tilsæt 25 μL 1x multiplex magnetiske perler til alle brønde (figur 6). Sørg for at hvirvelperler i 1 minut, før du tilføjer til brønde.
      2. Forsegl pladen med pladeforsegler og dæk pladen med aluminiumsfolie. Inkuber natten over (12-16 timer) ved 2-8 °C.
    5. Immunoassay procedure for cytokiner (dag 2)
      1. Placer 96 brøndplade på magnetisk separator, og sørg for, at brøndene er justeret med magneterne. Lad sidde i 2 minutter. Dekanter brøndens indhold, mens pladen stadig er fastgjort til den magnetiske separator.
      2. Vask pladen 2 gange ved hjælp af følgende trin.
        1. Tilsæt 200 μL vaskebuffer til hver brønd og læg den på rysteren i 2 minutter ved stuetemperatur.
        2. Anbring brøndpladen på magnetseparatoren i 2 minutter ved stuetemperatur.
        3. Dekanter brøndens indhold, mens brøndpladen stadig er fastgjort til magnetisk separator.
      3. Tilsæt 25 μL detektionsantistof pr. brønd (figur 6). Dæk med folie. Inkuber i 1 time på en pladeryster (750 o / min) ved stuetemperatur.
      4. Lad detektionsantistoffet være i, og tilsæt 25 μL streptavidin-phycoerythrin (SAPE) til hver brønd (figur 6). Dæk med folie. Inkuber i 30 minutter på pladeryster (750 o / min) ved stuetemperatur.
      5. Anbring brøndpladen på en magnetisk separator og lad den sidde i 2 min. Dekanter godt indhold og løsn fra magnetisk separator.
      6. Vask brøndpladen to gange (se trin 3.2.5.2).
      7. Tilsæt 75 μL Luminex Drive Fluid (hvis der anvendes MAGPIX-instrument) til hver brønd- eller analysebuffer (hvis der anvendes 200- eller FlexMap 3D-instrument). Ophæng perler igen på pladeryster i 5 minutter ved stuetemperatur.
      8. Læs på Luminex Instrument (MAGPIX, 200 eller FlexMap 3D) under brugervejledningen for korrekt betjening (figur 6).
    6. Immunoassay procedure for phospho-proteiner (dag 1)
      1. Tilføj følgende til hver brønd i rækkefølge.
        1. Tilsæt 25 μL assaybuffer til alle brønde.
          1. Tilsæt KUN 25 μL ekstra assaybuffer til baggrundsbrønde. For hver eksperimentel kørsel anbefales det at have mindst to baggrundsbrønde. Baggrundsbrønde har ingen prøve indlæst og definerer den fluorescerende intensitet, der læses af instrumentet uden prøve.
          2. Der tilsættes 25 μL af hver fortyndet prøve til hver prøvebrønd.
          3. Tilsæt 25 μL 1x multiplex magnetiske perler til alle brønde (figur 6).
            BEMÆRK: Luminex-analysesættet giver multiplex magnetisk perle i 20x lageropløsning. Sørg for at hvirvle 20x lager multiplex magnetisk perleopløsning i 2 minutter, og fortynd den derefter i assaybuffer til 1x opløsning. Vortex 1x multiplex magnetisk perleophæng i 1 min, før der tilsættes brønde.
        2. Forsegl pladen med pladeforsegler og dæk pladen med aluminiumsfolie. Inkuber natten over (12-16 timer) ved 2-8 °C.
    7. Immunoassay procedure for phospho-proteiner (dag 2)
      1. Placer brøndpladen på en magnetisk separator, og sørg for, at brøndpladen er helt justeret med den magnetiske separator. Lad sidde i 2 minutter. Dekanter brøndens indhold, mens brøndpladen stadig er fastgjort til den magnetiske separator.
      2. Vaskepladen 2 gange (se trin b i cytokinets immunassayprocedure dag 2).
      3. Fortynd 20x lagerdetekteringsantistoffet til 1x opløsning i assaybuffer. Tilsæt 25 μL 1x detektionsantistof pr. brønd (figur 6). Dæk med folie. Inkuber i 1 time på pladeryster (750 o / min) ved stuetemperatur.
      4. Placer 96 brøndpladen på magnetisk separator, og lad den sidde i 2 min. Dekanter godt indhold, løsn fra den magnetiske separator.
      5. Fortynd 25x lager SAPE i assaybuffer til 1x buffer. Tilsæt 25 μL 1x SAPE (figur 6). Dæk med folie og inkuber i 15 minutter på pladeryster (750 o / min) ved stuetemperatur.
      6. Lad SAPE stå i brønde, og tilsæt 25 μL forstærkningsbuffer til hver brønd. Dæk med folie.
      7. Inkuber i 15 minutter på pladeryster (750 o / min) ved stuetemperatur.
      8. Anbring brøndpladen på magnetseparatoren i 2 min. Dekanter godt indhold og løsn fra den magnetiske separator.
      9. Tilsæt 75 μL Luminex Drive Fluid (hvis der anvendes MAGPIX-instrument) eller analysebuffer (hvis der anvendes 200- eller FlexMap 3D-instrument). Ophæng perler igen på en pladeryster i 5 minutter ved stuetemperatur.
      10. Læs om Luminex-instrumentet (MAGPIX, 200 eller FlexMap 3D) under brugervejledningen for korrekt betjening (figur 6).
  3. Linearitet af prøvefortyndingskurven
    1. Fremstilling af prøver: Serielt fortyndede testprøver med forskellig koncentration af totalt protein. For bulk hjernevæv, belastning serielle fortyndinger fra 0-25 μg for cytokiner og 0-12 μg for phospho-proteiner. Den samlede proteinkoncentration kan måles ved hjælp af bicinchoninsyre (BCA) assay.
    2. Multiplex immunassay: Udfør Luminex-assayet (se pkt. 3.2) på udvalgte prøver.
    3. Analyse af data
      1. Plot fluorescerende intensitet for hvert protein vs. mængde protein indlæst (figur 7).
      2. For hver analyt identificeres et interval af totalt proteinindlæst, for hvilket forholdet mellem totalt protein og fluorescerende intensitetsaflæsning er lineært (figur 7).
      3. For at bestemme mængden af totalt protein, der skal indlæses til den fulde assaykørsel, skal du identificere den lineære del af kurven for hver analyt og derefter vælge en proteinkoncentration, der falder inden for det lineære interval for de fleste analytter.
        BEMÆRK: Selvom de fleste proteiner deler et lignende lineært område, overlapper de lineære områder muligvis ikke for alle proteiner. Hvis dette er tilfældet, kan det være nødvendigt at køre hver prøve flere gange med forskellige mængder af det samlede protein, der er indlæst. Alternativt kan ikke-lineære prøver udelades af analysen. Derudover har nogle proteiner muligvis ikke et lineært område overhovedet.

4. Delvis mindste kvadratisk regression

BEMÆRK: Eksempel R-kode og et eksempeldataregneark leveres til at udføre analysen af delvise mindste kvadrater.

  1. Dataforberedelse: Formatér dataene som vist i det medfølgende regneark med eksempeldata, "MyData". Medtag variabelnavne i rækken 1, eksempelnavne i kolonne A, svarvariablen i kolonne B og alle prædiktorvariabler i kolonne C+. Udfyld de sidste to rækker med baggrundsdataene, og indstil begge eksempelnavne til "Baggrund".
  2. Delvis mindste kvadratisk regression i RStudio
    1. Installer R fra www.r-project.org (gratis, open source).
    2. Installer RStudio Desktop fra www.rstudio.com (gratis, open source-licens).
    3. Download eksemplet på R-koden, der fulgte med denne publikation, "PLSR_Sample_Code.R", og gem den i den samme mappe, der indeholder dataregnearket. Åbn kodefilen i RStudio.
    4. I afsnittet Brugerinput skal du ændre "dataFileName" til navnet på dataregnearket.
    5. Udfør følgende trin ved at fremhæve det afsnit af koden, der skal køres, og klikke på Kør i øverste højre hjørne af scriptet.
      1. Indlæs nødvendige R-pakker, funktioner, arbejdsmappeadressen og brugerinputværdier i RStudio (underafsnit "Foreløbige").
      2. Indlæs dataene i RStudio, og forbered rådata til behandling ved at trække gennemsnitligt baggrundssignal fra alle målinger og z-score hver analyt (underafsnit "Læs data og træk baggrund")(Figur 8A).
      3. Udfør delvis regression af de mindste kvadrater i RStudio ved hjælp af plsRglm-pakken v1.2.528 , der er tilgængelig på Comprehensive R Archive Network (CRAN). Udfør en varimax-rotation (statistikpakke v3.6.2)23 i LV1-LV2-planet for at identificere en ny vandret akse, der bedst adskiller prøver efter responsvariablen (underafsnit "PLS")(figur 8B).
      4. Udfør en Leave One Out Cross Validation (LOOCV), hvor en prøve iterativt udelades af dataene, og PLSR-modellen genberegnes. Beregn standardafvigelse for analytbelastninger på tværs af alle LOOCV-kørsler (underafsnit "LOOCV").
  3. Opret repræsentative afbildninger: Kør den angivne eksempelkode som beskrevet ovenfor for at oprette repræsentative plots, der automatisk eksporteres som pdf-filer til arbejdsmappen (den mappe, der indeholder data- og kodefilerne).
    1. Opret et varmekort over de behandlede data som vist i figur 8A (underafsnit "PLS"). Farve hver post langs et spektrum defineret af z-score. Sorter analytter efter den rækkefølge, der er beregnet i den latente variabel af interesse.
    2. Opret et scoreplot med LV1-scorer afbildet langs den vandrette akse og LV2-scorer afbildet langs den lodrette akse, som vist i figur 8B (underafsnit "PLS"). Farve hvert datapunkt i henhold til dets måling af responsvariabel for at visualisere forholdet mellem hver latent variabel og responsvariablen.
    3. Opret et søjlediagram, der viser indlæsninger for hver af dine prædiktorvariabler for at visualisere, hvordan hver analyt bidrager til de latente variabler, som vist i figur 8C (underafsnit "LOOCV").
    4. Opret et plot, der regresserer LV1-scorer i forhold til din svarvariabel for at visualisere, hvor godt PLSR-modellen adskiller prøverne, som vist i figur 8D (underafsnit "PLS").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidligere indsamlede data blev taget fra tidligere arbejde, hvor en gruppe på otte C57BL/6-mus blev udsat for tre skader med lukket hoved (figur 2) fordelt en gang dagligt11. I dette arbejde blev cerebral blodgennemstrømning målt med diffus korrelationsspektroskopi 4 timer efter den sidste skade (figur 3, figur 4). Efter CBF-vurdering efter skaden blev dyrene aflivet, og hjernevæv blev ekstraheret til kvantificering af cytokiner og phosphoproteiner via immunassay (figur 5). Vi kvantificerede også fagocyt/mikroglial aktiveringsmarkøren Iba1 via Western blot (metoder beskrevet i11). Hjernevæv fra hver mus blev lyseret, og den samlede proteinkoncentration blev målt ved hjælp af et BCA-assay. Multiplexeret cytokinkvantificering blev udført under anvendelse af Milliplex MAP Mouse Cytokin/Chemokine 32-Plex, som blev aflæst ved hjælp af et Luminex MAGPIX-system (figur 6). En lineær intervalanalyse blev udført for at bestemme en passende proteinbelastning (12 μg protein pr. 12,5 μL lysat) (figur 7) inden indsamling af data fra alle prøver.

Cytokindata blev udarbejdet til analyse ved at trække baggrundsmålinger fra prøvedata og derefter z-scoringsdata for hver analyt (figur 8A). Et heatmap blev genereret fra z-scorede data for at visualisere forskelle i cytokinekspression blandt dyr. Partial Least Squares Regression (PLSR) blev udført ved anvendelse af fagocyt/mikroglial aktiveringsmarkør Iba1 som responsvariabel og cytokinmålinger som prædiktorvariabler (figur 8B). En varimax rotation blev udført for at maksimere co-variansen af dataene på LV1 med Iba1 målingerne (figur 8D). Høje belastningsvægte i LV1 (figur 8C) svarer til cytokinekspressionen, der er mest forbundet med høj ekspression af Iba1. Lineære regressioner mellem Iba1 og cytokiner viser, at de cytokiner med de største belastningsvægte i LV1 også var statistisk signifikante (figur 8E).

Figure 1
Figur 1: Typisk arbejdsgang. Først gennemgår mus en vægttab lukket hovedskade, og derefter måles cerebral blodgennemstrømning (CBF) ved hjælp af diffus korrelationsspektroskopi. Dernæst indsamles hjerner, områder af interesse mikrodissekeres og snapfryses ved hjælp af flydende nitrogen. Som forberedelse til Luminex-immunassay lyseres proteiner, og den samlede proteinkoncentration måles ved bicinchoninsyreassay. Lysater anvendes til Western blot af proteiner af interesse og Luminex assays for cytokiner og phospho-proteiner. Data fra CBF, Western blot og Luminex er integreret ved hjælp af delvis mindste kvadratisk regression (PLSR). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Vægtfaldsmodel med lukket hoved for mild traumatisk hjerneskade. (A) Den abestede mus gribes af halen og placeres på en stram offermembran under et styrerør. En vægt på 54 g falder fra 1 m på det dorsale aspekt af hovedet. (B) Inden for ~ 1 ms efter kollisionen har musens hoved hurtigt roteret om halsen, da det bryder gennem offermembranen. (C) Inden for ~ 5 ms efter kollisionen er hele musen faldet og hænger ved sin grebne hale. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Måling af cerebral blodgennemstrømning ved diffus korrelationsspektroskopi. (A) En optisk sensor holdes forsigtigt manuelt over højre halvkugle for at måle blodgennemstrømningen i en bedøvende mus. (B) Repræsentativ sensorplacering på højre halvkugle. Sensorens omrids er repræsenteret som et stiplet sort rektangel, og placeringen af kilden og detektorfibrene er i henholdsvis røde og blå cirkler. Sensoren er placeret således, at sensorens korte kant flugter med bagsiden af øjet, og sensorens lange kant flugter med midterlinjen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Diffus korrelationsspektroskopi dataanalyse. A) Repræsentative autokorrelationskurver for målt intensitet, g2(τ), ved baseline, baseline før skade (grøn) og 4 timer efter 5 lukkede hovedskader med mellemrum en gang dagligt (lilla). Det højre skift i kurven fra før til efter skade afspejler et fald i blodgennemstrømningen. B) gEquation(τ)-data indsamles ved 1 Hz for 5 s pr. halvkugle og gentages 3x/halvkugle. Hver målt gEquation(τ)-kurve passer til den halvfattelige opløsning af korrelationsdiffusionsligningen for et cerebralt blodgennemstrømningsindeks (CBFi). (C) CBFi-værdier på tværs af alle rammer og gentagelser er gennemsnitlige for at opnå gennemsnitligt cerebralt blodgennemstrømningsindeks for hver halvkugle (betegnet med vandret sort bjælke). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Musens hjerne mikrodissektion. (A) Efter at hjernen er ekstraheret fra musen, gennemskæres den langs den stiplede linje. Den venstre halvkugle er fastgjort til histologi, og den højre halvkugle er mikrodissekteret for patologi. (B) Sagittal visning af cortex på højre halvkugle. Den højre halvkugle mikrodissekteres i tilsvarende farvekodede regioner. Til analyse af frysefølsomme proteiner er det optimalt at opdele vævssektioner inden flashfrysning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Illustration af Luminex-proceduren. (A) Tilsæt prøver til fluorescerende mærkede perler. Perler er forbelagt med et specifikt fangstantistof for hvert protein af interesse. (B) Tilsæt biotinylerede detektionsantistoffer. Biotindetektionsantistoffer binder sig til de analytter, der er af interesse, og danner en antistof-antigensandwich. (C) Tilsæt phycoerythrin (PE)-konjugeret streptavidin (SAPE). SAPE binder sig til de biotinylerede detektionsantistoffer og fuldender reaktionen. For phospho-proteiner tilsættes en amplifikationsbuffer (kun til phospho-proteinassays) efter tilsætningen til SAPE for at forbedre assaysignalet. (D) Luminex-instrumentet (MAGPIX, 200 eller FlexMap 3D) læser reaktionen på hver fluorescerende mærket perle via en kombination af rød/grøn belysning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 7: Illustration af prøvefortyndingskurven for at identificere det lineære område. Proteinkoncentration af serielt fortyndede prøver versus fluorescerende intensitet målt fra Luminex-analysen. Det lineære interval defineres som proteinkoncentrationsintervallet, for hvilket forholdet mellem proteinkoncentrationen og fluorescerende intensitet er lineært (pil). I nogle analytter kan forøgelse af proteinkoncentrationen ud over en vis grænse reducere antistofbindingen, således at fortyndingskurven bliver ikke-lineær eller inverteret (Hook-effekt). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 8: Repræsentativ DELVIS Mindste Kvadrater Regression (PLSR) Analyse. (A) Panelcytokinproteinekspression (venstre kolonne) sammen med Iba1-ekspression (højre kolonne) i 3xCHI-mus (n = 8, z-scoret). (B) PLSR tildeler vægte (belastninger) til målte cytokiner for hver latent variabel. Vægte anvendes på målte data til beregning af scorer for hver prøve på hver latent variabel. (C) PLSR af 3xCHI-prøver mod Iba1 identificerede en vægtet profil af cytokiner, LV1, som adskilte prøver ved Iba1. Cytokiner med negativ vægt blev opreguleret i prøver med lav Iba1, mens cytokiner med positiv vægt blev opreguleret i prøver med høj Iba1 (gennemsnitlig ± SD ved anvendelse af en LOOCV). D) Lineær regression af LV1-score for hver prøve i forhold til Iba1. R2PLS måler pasformens godhed mellem Iba1 og LV1. (E) Individuelle regressioner af Iba1 mod hvert af cytokinerne med de største vægte i LV1 i C. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heri beskriver vi metoder til vurdering af den hæmodynamiske og neuroinflammatoriske reaktion på gentagen mild traumatisk hjerneskade. Desuden har vi vist, hvordan man integrerer disse data som en del af en multivariat systemanalyse ved hjælp af delvis mindste kvadratisk regression. I teksten nedenfor vil vi diskutere nogle af de vigtigste trin og begrænsninger forbundet med protokollen samt fordele / ulemper ved metoderne i forhold til eksisterende metoder.

Vægt-drop model af mild traumatisk hjerneskade. Denne metode til traumatisk hjerneskadeinduktion er fordelagtig, fordi den har stump påvirkning efterfulgt af hurtig forreste-bageste rotationsacceleration, der almindeligvis ses ved sportsrelaterede hovedskader10,19. Bestemt rekapitulerer den lissencephaliske musehjerne ikke fuldt ud kompleksiteten af den gyrocephaliske menneskelige hjerne; Ikke desto mindre inducerer denne model mange af de samme kliniske og adfærdsmæssige følgevirkninger af human mTBI, herunder vedvarende underskud i rumlig læring og hukommelse med gentagne skader. Derudover, mens virkningen er mild i naturen (ingen strukturel / neuronal skade, ingen blodhjernebarrierepermeabilitet, kognitive underskud, der først opstår efter flere hits osv.19), inducerer det betydeligt tab af bevidsthed i modsætning til mennesker, hvor bevidsthedstab er mindre almindeligt. Dette øgede bevidsthedstab kan skyldes en interaktion med den anæstesi, der gives umiddelbart før virkningen, selvom den nøjagtige årsag ikke er godt forstået. Endelig bemærker vi, at justering af styrerøret, således at bolten påvirker mellem koronale og lamdoid suturer, er kritisk. Vi har observeret, at påvirkninger, der er mere bagud, kan forårsage betydelige motoriske underskud, der kræver eutanasi.

Vurdering af cerebral blodgennemstrømning med diffus korrelationsspektroskopi. Ikke-invasive, langsgående målinger af cerebral blodgennemstrømning (CBF) med traditionelle modaliteter, der anvendes i humane / store dyreforsøg, såsom perfusion magnetisk resonansbilleddannelse eller transkraniel Doppler ultralyd, er udfordrende hos mus af forskellige årsager, herunder lille hjernestørrelse og total blodvolumen29. Diffus korrelationsspektroskopi er velegnet til mus og giver de ekstra fordele ved at være ikke-invasiv og relativt billig sammenlignet med andre modaliteter20,30. Fordi DCS er følsom over for bevægelsesartefakter, skal mus kortvarigt anæstesi eller fastholdes31 til vurdering. Vi bruger typisk isofluranbedøvelse på grund af dets hurtige induktion og genopretning; isofluran er imidlertid en cerebral vasodilator, og blodgennemstrømningsestimater under isofluran bør fortolkes med forsigtighed. Fald i blodgennemstrømningen set efter skade sammenlignet med sham-skadede dyr kan forvirres af en manglende skadet cerebral vaskulatur til vasodilat som reaktion på isofluran. Endelig har vi tidligere påvist fremragende repeterbarhed inden for brugeren af blodgennemstrømningsmålinger med DCS hos mus, men kun rimelig repeterbarhed inden for brugeren21. Af denne grund anbefaler vi, at den samme operatør erhverver DCS-målinger til forsøg, der kræver langsgående vurdering af cerebral blodgennemstrømning.

Multiplexeret kvantificering af cytokiner og phospho-proteiner ved hjælp af Luminex-assays. En central udfordring med enhver ELISA er Hook-effekten, hvorved øget proteinkoncentration kan reducere antistofaffinitet for målproteinet og dermed føre til nedsat assaysignal som reaktion på øget protein32 (figur 7). Denne effekt kan forværres ved analyse af hele væv, hvor bulkproteiner på samme måde kan forstyrre. Således er det første skridt i brugen af Luminex-assays at afgøre, om der er en række proteinkoncentrationer indlæst, for hvilke assayet, der læses lineært, varierer med mængden af protein, der er indlæst. Analytter, der ikke har et sådant lineært interval (figur 7), bør udelukkes fra analysen. Vi bemærker også, at cytokinniveauer i hjernen typisk er meget lave og forekommer nær den nedre detektionsgrænse, der vurderes via standardkurver, der leveres med Luminex-sættet. Af denne grund er det vigtigt at foretage lineær rækkeviddeanalyse for at afgøre, om instrumentudlæsningen virkelig afspejler mængden af indlæst prøve. For vigtige proteiner af interesse kan denne lineære områdeanalyse suppleres med et spike-genoprettelsesassay, hvor rekombinant protein spikes i en prøve, og linearitet i instrumentaflæsningen evalueres33.

Fordi neuroinflammation reguleres af forskellige intracellulære phospho-proteiner og ekstracellulære cytokiner, er det afgørende at samtidig måle en bred vifte af disse proteiner for at forstå hjernens neurale immunrespons på mTBI. Luminex multiplexerede immunassays muliggør samtidig kvantificering af snesevis af cytokiner og phospho-proteiner fra en enkelt prøve, hvilket giver et holistisk billede af vævets immunrespons efter skade. Selvom disse analyser giver et bredt overblik over cytokiner/kemokiner samt phospho-proteiner, kvantificerer analysen den samlede mængde af hvert protein fra et vævshomogenat. Det giver således ikke celletypespecifikke data. Celletypeseksekularitet kan bestemmes ved opfølgning af immunhistokemi for at identificere lokalisering af topproteiner af interesse med markører for celletyper (f.eks. Neuroner, mikroglia, astrocytter osv.) 11.

Delvis regressionsanalyse af mindst kvadrater til dataintegration. Vævsresponset på mTBI er multifaktorielt og består af fysiologiske ændringer i blodgennemstrømningen sammen med ændringer i fagocyt/mikroglial aktiveringsmarkør Iba1, forskellige cytokiner og phospho-proteiner, blandt andre11. På grund af den multiplexerede karakter af de indsamlede data er der behov for en systematisk metode til at tage højde for multidimensionaliteten af forholdet mellem de forskellige prædiktorvariabler. PLSR giver en passende løsning på dette problem ved at identificere LER'er, der maksimalt identificerer co-variansen mellem prædiktorvariablerne og resultatvariablen (f.eks. Iba1 i figur 8). Det er vigtigt, at de proteiner, der viser sig at korrelere stærkt med prædiktorvariablen (dvs. dem med høje belastninger på LV1), ofte korrelerer også i den univariate regressionsanalyse (figur 8E). Da PLSR ofte bruges til at tilpasse et stort antal prædiktorvariabler til et mindre antal prøver som i figur 8, er det afgørende at få en forståelse af vægtenes følsomhed over for LV1 over for individuelle prøver. For et lille antal prøver (<10) er LOOCV nyttig til vurdering af vægtenes følsomhed (angivet via SD-fejlbjælker i figur 8C). For et større antal prøver vil det være vigtigt at vurdere følsomheden ved at udelade flere prøver ad gangen ved hjælp af en Monte Carlo-delprøveudtagningsmetode34. Vi henviser læseren til Multi and Megavariate Data Analysis24 for en grundig diskussion af PLSR-tilgange og anvendelser. Endelig bemærker vi, at en vigtig begrænsning af denne type analyse er, at den er rent korrelativ. PLSR beviser ikke et mekanistisk forhold mellem prædiktorvariabler og resultatvariablen. Vi ser PLSR som en værdifuld hypotesegenererende tilgang, der bruges til at foreslå trækbare mål til modulering i fremtidige eksperimenter, der etablerer årsagssammenhænge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Dette projekt blev støttet af National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) og R01 NS115994 (LBW / EB) og Children's Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Dette arbejde blev også støttet af det amerikanske forsvarsministerium gennem congressionally Directed Medical Research Programs under Award No. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Udtalelser, fortolkninger, konklusioner og anbefalinger er forfatterens og er ikke nødvendigvis godkendt af forsvarsministeriet. Dette materiale er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. 1937971. Eventuelle meninger, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette materiale, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundations synspunkter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adjustable pipettes any adjustable pipette
Aluminum foil VWR 89107-726
Bio-Plex cell lysis kit C Bio-Rad 171304012
BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile BrandTech 781602 96
Complete mini protease inhibitor tablet Sigma-Aldrich 11836153001
Depilatory cream Amazon Nair
DiH2O VWR VWRL0200-1000
Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates Millipore Sigma Catalogue 40-285
Hardware Autocorrelator Board www.correlator.com Flex05-8ch
Isoflurane 250 mL MED-VET INTERNATIONAL RXISO-250
Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) VWR 21905-026
Laboratory vortex mixer VWR 10153-838
LabView National Instruments LabVIEW
Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software Luminex Corporation
Luminex Drive Fluid Luminex MPXDF-4PK
Luminex sheath fluid EMD Millipore SHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay Millipore Sigma MCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay Millipore Sigma 48-660MAG
Mini LabRoller rotator VWR 10136-084
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
Phosphate-buffered Saline (PBS) VWR 97064-158
Plate Sealer VWR 82050-992
Polypropylene microfuge tubes VWR 20901-547
Mini LabRoller Millipore Sigma Z674591
Reagent Reservoirs VWR 89094-668
R Programming Language
RStudio www.rstudio.com
Sonicator
Titer plate shaker VWR 12620-926
Tween20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
1 m acrylic guide tube McMaster-Carr 49035K85
4 photon counting avalanche photodiode Perkin-Elmer SPCM-AQ4C-IO
400 um multimode source fiber Thorlabs Inc. FT-400-EMT
54 g bolt Ace Hardware 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length
780 nm single mode detector fiber Thorlabs Inc. 780HP
852 nm long-coherence length laser TOPTICA Photonics iBeam smart

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
  2. Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
  3. Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
  4. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  5. Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , National Academies Press (US). Washington (DC). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169016/ (2014).
  6. Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
  7. McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
  8. Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
  9. Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).
  10. Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
  11. Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
  12. Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
  13. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
  14. Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
  15. Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
  16. Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
  17. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury--part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
  18. Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
  19. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
  20. Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
  21. Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).
  22. Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).
  23. Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
  24. Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
  25. Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
  26. Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).
  27. Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
  28. Bertrand, F., Maumy-Bertrand, M. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019).
  29. White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322 (2011).
  30. Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).
  31. Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
  32. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
  33. Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
  34. Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).

Tags

Neurovidenskab udgave 183 Mild traumatisk hjerneskade cerebral blodgennemstrømning neuroinflammation multiplexeret ELISA delvis mindste kvadratisk regression cytokiner phospho-proteiner
Systemanalyse af det neuroinflammatoriske og hæmodynamiske respons på traumatisk hjerneskade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brothers, R. O., Bitarafan, S.,… More

Brothers, R. O., Bitarafan, S., Pybus, A. F., Wood, L. B., Buckley, E. M. Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (183), e61504, doi:10.3791/61504 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter