Summary
이 프로토콜은 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 신경 염증 및 혈역학 반응을 특성화하고 부분 최소 제곱 회귀를 사용하는 다변량 시스템 분석의 일부로 이러한 데이터를 통합하는 방법을 제시합니다.
Abstract
경미한 외상성 뇌 손상 (mTBIs)은 중요한 공중 보건 문제입니다. mTBI에 반복적으로 노출되면 누적적이고 오래 지속되는 기능 결핍이 발생할 수 있습니다. 우리 그룹과 다른 사람들의 수많은 연구에 따르면 mTBI는 사이토 카인 발현을 자극하고 미세 아교세포를 활성화시키고 뇌 혈류와 신진 대사를 감소시키고 뇌 혈관 반응성을 손상시킵니다. 또한, 몇몇 연구는 이러한 신경 염증 및 혈역학 마커의인지 장애의 혼란과 연관성을보고했습니다. 본원에서 우리는 마우스에서 mTBI에 대한 신경염증 및 혈역학적 조직 반응을 특성화하는 방법을 상세히 설명한다. 구체적으로, 우리는 mTBI의 중량 감소 모델을 수행하는 방법, 확산 상관 분광법이라고 불리는 비침습적 광학 기술을 사용하여 뇌 혈류를 종방향으로 측정하는 방법, 그리고 미세아교세포 및 기타 신경 면역 세포의 활성에 반응하고 조절하는 사이토카인 및 면역조절 포스포 단백질(예를 들어, MAPK 및 NFκB 경로 내)을 정량화하기 위해 뇌 조직 샘플에 대해 루미넥스 다중화 면역검정을 수행하는 방법을 설명한다. 마지막으로 다변량 시스템 분석 접근 방식을 사용하여 이러한 데이터를 통합하여 이러한 모든 변수 간의 관계를 이해하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 생리 변수와 분자 변수 간의 관계를 이해하면 궁극적으로 mTBI를 담당하는 메커니즘을 식별 할 수 있습니다.
Introduction
개요
경미한 외상성 뇌 손상 (mTBIs)은 ~ 1.6-3.8 백만 운동 선수에게 매년 영향을 미칩니다1. 뇌진탕 하 및 뇌진탕 부상을 포함한 이러한 부상은 일시적인 신체적, 정서적, 심리적 및인지 적 증상을 가진 환자를 떠날 수 있습니다2. 더욱이, "취약성의 창" 내에서 지속되는 반복적인 mTBI(rmTBI)는 단일 mTBI 단독의 효과보다 더 오래 지속되는 인지적 결과의 누적된 심각도 및 지속기간을 야기할 수 있고, 궁극적으로는 기능(4,5,6)의 영구적인 손실로 이어질 수 있다. 많은 환자들이 비교적 짧은 기간 (<1 주) 내에 회복되지만, 환자의 10-40 %는 > 1 개월 동안 mTBI의 더 오래 지속되는 효과를 겪으며 일부는 1 년까지 지속됩니다 3,7,8,9. 이러한 부상의 높은 유병률과 지속적인 결과에도 불구하고 부상 메커니즘은 제대로 이해되지 않으며 효과적인 치료 전략이 존재하지 않습니다.
mTBI / rmTBI 이후의 결과의 높은 변동성을 감안할 때, 말단 mTBI / rmTBI 연구에서 얻은 조직으로부터 초기 단계 분자 트리거를 식별하는 데있어 한 가지 과제는 이러한 분자 트리거의 결정적인 "급성 분자 연결"을 보여주는 종단 데이터가 부족하다는 것입니다. 이 도전을 극복하기 위해 우리 그룹은 확산 상관 분광법 (DCS)이라는 광학 도구를 사용하여 급격하게 측정 된 급격하게 감소 된 뇌 혈류가 rmTBI10의 마우스 모델에서 장기적인인지 결과와 강하게 관련이 있음을 발견했습니다. 이 혈역학적 바이오마커를 사용하여, 우리는 뇌혈류가 급격히 낮은 마우스(그리고 확장에 의해, 더 나쁜 예측된 장기적 결과)를 가진 마우스가 MAPK 및 NFκB 경로 둘 다에서 뉴런 포스포-신호전달의 수반되는 급성 증가, 전염증성 사이토카인의 뉴런 발현의 증가, 식세포/미세아교세포 마커 Iba111의 발현 증가를 나타냈다. . 이러한 데이터는 신경 포스포 신호전달, 사이토카인 발현 및 미세아교세포 활성화에 대한 가능한 역할을 시사하며, 손상 후 뇌혈류의 급성 조절뿐만 아니라 뉴런 기능 장애 및 더 나쁜인지 결과를 초래하는 신호전달 캐스케이드를 촉발시키는 데 있다. 여기에서는 rmTBI 후 혈역학적 및 신경 염증 환경을 동시에 조사하는 방법과 이러한 복잡한 데이터 세트를 통합하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 구체적으로, 우리는이 포괄적 인 접근법에 대한 네 가지 주요 단계에 대한 절차를 간략하게 설명합니다 : (1) 경미한 외상성 뇌 손상의 체중 감소 모델, (2) 확산 상관 분광법을 통한 뇌 혈류 평가, (3) 신경 염증 환경의 정량화 및 (4) 데이터 통합 (그림 1). 아래에서는 이러한 주요 단계 각각에 대한 간략한 소개를 제공하여 독자가 우리의 방법의 근거를 안내하는 데 도움을줍니다. 원고의 나머지 부분은 이러한 각 주요 단계에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
가벼운 외상성 뇌 손상의 체중 감소 모델
반복적 인 경증 TBI의 많은 우수한 전임상 모델이 존재하지만 12,13,14,15,16,17,18, 우리는 잘 정립되고 임상 적으로 관련된 체중 감소 폐쇄 두부 손상 모델을 사용합니다. 이 모델의 주요 특징은 (1) 손상되지 않은 두개골 / 두피의 둔한 충격과 목에 대한 머리의 무제한 회전, (2) 명백한 구조적 뇌 손상, 부종, 혈액 - 뇌 장벽 손상, 급성 세포 사멸 또는 만성 뇌 조직 손실 없음, (3) 여러 번 히트 한 후에 만 나타나는 지속적인(최대 1 년의) 인지 결핍(그림 2)을 포함합니다.
확산 상관 분광법을 통한 뇌 혈류 평가
확산 상관 분광법 (DCS)은 혈류 5,20,21을 측정하는 비 침습적 광학 기술입니다. DCS에서는 근적외선 광원이 조직 표면에 배치됩니다. 검출기는 조직 표면의 소스로부터 고정된 거리에 배치되어 조직을 통해 흩어져있는 빛을 감지합니다 (그림 3). 움직이는 적혈구를 산란하면 감지 된 빛의 세기가 시간에 따라 변동합니다. 상관 확산 이론으로 알려진 간단한 분석 모델은 이러한 강도 변동을 혈류 지수와 관련시키는 데 사용됩니다 (CBFi, 그림 4). CBF i (cm2/s)의 단위가 전통적인 유동 단위 (mL/min/100 g)는 아니지만, 마우스에 대한 이전의 연구는 CBFi가 MRI21로 표지된 동맥 스핀에 의해 측정된 뇌 혈류와 강하게 상관관계가 있음을 보여주었다.
참고로, 여기에 사용된 DCS 계측기는 사내에 제작되었으며 852nm 길이의 일관성 길이 레이저, 4개의 광자 계수 애벌런치 광 다이오드 어레이 및 하드웨어 자동 상관기 기판(단일 타우, 8채널, 100ns 최소 샘플 시간)21,22개로 구성됩니다. 데이터는 LabView로 작성된 수제 소프트웨어로 수집됩니다. 이 장치의 동물 인터페이스는 400 μm 다중 모드 소스 섬유 (400-2200 nm 파장 범위, 순수 실리카 코어, TECS 하드 클래딩) 및 780 nm 단일 모드 검출기 섬유 (780-970 nm 파장 범위, 순수 실리카 코어, TECS 하드 클래딩, 730 ± 30 nm 초 모드 컷오프)로 구성되며 6 mm 간격으로 이격되어 검은 색 3D 인쇄 센서 (4 mm x 8 mm, 그림 3).
신경 염증 환경의 정량화
신경 염증은 다양한 세포 과정에 의해 조절되지만, 두 가지 주요 관련 메커니즘은 사이토 카인 / 케모카인에 의한 세포 외 신호 전달과 포스포 단백질에 의한 세포 내 신호입니다. 손상 후 뇌의 신경 염증 환경을 조사하기 위해 뇌는 생쥐에서 추출되고 미세 해부되며 Luminex를 사용하여 사이토 카인 / 케모카인 및 포스포 단백질이 정량화됩니다 (그림 5, 그림 6, 그림 7). Luminex 다중화 면역검정은 형광 태그가 지정된 자기 비드에 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISAs)을 결합시킴으로써 이러한 단백질의 다양한 수집을 동시에 정량화할 수 있게 합니다. 별개의 형광 태그가 관심있는 각 단백질에 대해 사용되고, 각 태그의 비드는 특정 단백질에 대한 포획 항체로 기능화된다. 각 단백질을 포획하기 위한 수백 개의 비드를 함께 혼합하고, 96 웰 플레이트에 넣고, 샘플과 함께 인큐베이션한다. 샘플 인큐베이션 후, 자석을 사용하여 샘플을 세척하는 동안 웰에 비드를 트랩합니다. 다음으로, 비오티닐화 검출 항체는 관심있는 분석물에 결합하여 전통적인 ELISA와 유사한 항체-항원 샌드위치를 형성하지만, 각각의 단백질에 대한 ELISA와 함께 상이한 형광 태깅된 비드 상에서 발생한다. 피코에리트린-컨쥬게이션된 스트렙타비딘(SAPE)을 첨가하면 각 반응이 완료된다. 그런 다음 Luminex 기기는 비드를 읽고 각 형광 태그/단백질에 따라 신호를 분리합니다.
데이터 통합
Luminex 분석에서 측정된 많은 수의 분석물(예를 들어, 사이토카인)으로 인해, 각각의 정량화된 단백질이 개별적으로 분석된다면 데이터 분석은 해석하기 어려울 수 있다. 분석을 단순화하고 분석물 사이에서 관찰된 경향을 포착하기 위해, 우리는 부분 최소 제곱 회귀(PLSR, 그림 8)23이라는 다변량 분석 방법을 사용합니다. PLSR은 각각의 측정된 단백질(즉, 사이토카인 또는 포스포-단백질, "예측인자 변수"로 지칭됨)에 상응하는 가중치의 축을 확인함으로써 작동하며, 이는 함께 측정된 단백질과 반응 변수(예를 들어, 대뇌 혈류)의 공분산을 최적으로 설명한다. 가중치는 "로딩"이라고 하며 잠복 변수(LV)로 알려진 벡터로 조립됩니다. 측정된 단백질 데이터를 두 LV 각각에 투사("스코어링"으로 지칭됨)함으로써, 데이터는 이들 LV의 관점에서 재플롯팅될 수 있다. PLSR을 계산한 후, 우리는 변량체 회전을 사용하여 LV에 대한 샘플 프로젝션과 예측 변수24 사이의 공분산을 최대화하는 새로운 LV를 식별한다. 이 접근 방식을 사용하면 LV1을 반응 변수의 분산이 가장 잘 설명되는 축으로 정의 할 수 있습니다. LV2는 반응 변수와 LV1 잔류 데이터 사이의 공분산을 최대화하며, 이는 샘플 간의 생물학적 또는 기술적 변동성과 연관될 수 있다. 마지막으로, 우리는 PLSR 모델이 어느 하나의 샘플(23)에 크게 의존하지 않도록 하기 위해 LOOCV(Leave One Out Cross Validation)를 실시한다.
이 프로토콜에서, 우리는 mTBI에 대한 신경염증 및 혈역학적 조직 반응을 특성화하는 방법을 상세히 설명한다. 일반적인 워크플로는 그림 1에 요약되어 있습니다. 이 프로토콜에서, 마우스는 체중 감소 폐쇄 두부 손상 모델을 사용하여 하나 이상의 mTBI를 받는다. 대뇌 혈류는 부상 전과 부상 후 여러 시점에서 종으로 측정됩니다. 신경 염증 변화의 심문에 대한 관심의 시점에서, 동물은 안락사되고, 뇌는 추출된다. 관심있는 뇌 영역은 미세 해부를 통해 분리 된 다음 용해되어 단백질을 추출합니다. 용해물은 이어서 사이토카인 및 포스포-단백질 발현의 루미넥스 다중화 면역검정 및 웨스턴 블롯 둘 다에 사용된다. 마지막으로, 이 전체 론적 데이터 세트는 부분 최소 제곱 회귀 분석을 사용하여 통합됩니다.
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Protocol
모든 동물 절차는 Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침을 준수합니다.
1. 가벼운 외상성 뇌 손상의 체중 감소 모델
- 중량 감소 설정을 준비합니다. 수직으로 정렬된 1m 가이드 튜브(내경 2.54cm)가 있는 평평한 표면에 바이스를 장착합니다(레벨을 사용하여 확인). 충격을 위해 54g 볼트(기본 본체 직경 0.95cm, 헤드 직경 2cm, 길이 10.2cm)를 사용합니다.
- 마우스를 간단히 마취하십시오. 마우스를 45초 동안 100% 산소 중의 4.5% 이소플루란으로 유도하였다. 발가락 꼬집음 반응의 부족으로 마취의 충분한 깊이를 확인하십시오.
- 부상을 유발하십시오.
- 마우스를 마취에서 빠르게 제거하고 마우스를 얇은 막 (11.2 cm x 21.3 cm 조직)의 중앙에 놓습니다.
- 양손을 사용하여 중앙에 있는 마우스와 함께 조직 타우트를 잡으십시오. 엄지 손가락 아래 마우스의 꼬리를 고정하십시오. 마우스 헤드를 가이드 튜브 아래에 놓습니다(그림 2).
- 가이드 튜브 상단의 볼트를 마우스 머리의 등쪽 측면에 떨어 뜨려 눈 뒤쪽과 귀 앞쪽 사이의 충격을 목표로합니다. 충격을 받으면 마우스가 조직에 침투하여 목 주위의 머리를 빠르게 가속시킵니다 (그림 2).
- 복구
- 충격 후, 마우스 수핀을 실내 공기 중의 37°C 온열 패드 상에 놓는다. 부상 후 1 시간 동안 회복을 모니터링하십시오. 1 시간 이내에 생쥐는 정상적으로 외출하고 음식과 물을 찾을 수 있어야하며 총 운동 결핍을 나타내지 않아야합니다.
참고 : 진통제는 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인에 따라 사용되지 않으며, 이는 진통제가 관심 매개 변수 (즉, 뇌 혈류, 염증 마커)에 미치는 혼란스러운 영향으로 인해 정당화됩니다. 마취로부터의 제거로부터 우뢰 반사를 회복하는 시간까지의 시간으로 정의되는 의식 상실은 예상되며, 전형적으로 20 초에서 3 분까지 지속된다 (보충 표 1). 무호흡 및/또는 발작과 유사한 활동의 짧은 (<30초) 에피소드가 관찰될 수 있으며, 특히 반복적인 두부 부상 후 하루에 한 번 간격을 두고 관찰될 수 있다.
- 충격 후, 마우스 수핀을 실내 공기 중의 37°C 온열 패드 상에 놓는다. 부상 후 1 시간 동안 회복을 모니터링하십시오. 1 시간 이내에 생쥐는 정상적으로 외출하고 음식과 물을 찾을 수 있어야하며 총 운동 결핍을 나타내지 않아야합니다.
- 필요에 따라 반복하십시오. 이 부상은 매일 한 번, 매주 또는 매월 반복 될 수 있습니다. 부상의 수와 간격은 원하는 부상 심각도에 따라 다릅니다. 일반적으로 우리는 공간 학습과 기억의 강력한 결핍을 유도하기 위해 하루에 한 번 간격을 둔 다섯 개의 히트를 사용합니다.
참고 : 이전 연구에 따르면 하루에 한 번 간격을 둔 다섯 번의 히트는 부종, 출혈 또는 뇌에 대한 명백한 구조적 손상없이 부상 후 1 년 이상 지속되는 공간 학습 및 기억의 결핍을 유발하기에 충분합니다19. 마우스는 매일 체중을 측정하고 탈수, 운동 결핍 및 식욕 부진의 징후를 면밀히 모니터링합니다. 탈수되면 마우스에게 촉촉한 차우와 하루에 한 번 식염수 1mL를 피하 주사합니다. 불필요한 고통을 예방하고 인간적인 종점을 보장하기 위해, 탈수가 지속되거나 악화되면 마우스를 안락사시킵니다 : 탈수가 피하 식염수 치료 후 24 시간 > 지속되거나 악화되고, 체중이 부상 전 기준선에서 20 % 이상 감소하고, 순환 또는 발 끌기와 같은 운동 결핍이 나타나고 부상 후 >1 시간 지속됩니다.
2. 확산 상관 분광법을 통한 대뇌 혈류 평가
- DCS 데이터 수집
- 두피의 머리카락을 제거하십시오. DCS는 머리카락이없는 상태에서 가장 잘 작동하기 때문에 실험을 시작하기 전에 머리의 모피를 제거해야합니다. 일반적으로 제모는 연구 시작 1-3 일 전에 수행됩니다.
- 마우스를 45초 동안 100% 산소에서 4.5% 이소플루란으로 유도하고, 100% 산소 중의 1-2% 이소플루란으로 유지한다.
- 눈과 귀 사이에 머리를 면도하십시오. 그런 다음 제모 크림을 사용하여 그림 3과 같이 머리의 모피를 제거하십시오.
- 동물이 온난화 패드에서 마취에서 회복 한 다음 새장으로 돌아 오도록하십시오.
- DCS로 뇌 혈류를 측정하십시오. 측정 중 모션 아티팩트를 최소화하기 위해, 간단한 이소플루란 마취하에 마우스를 연구하십시오.
참고: 측정 전반에 걸쳐 호흡 및 발가락 꼬집음 반응을 시각적으로 모니터링하고 필요에 따라 이소플루란 농도를 조정하여 일관된 마취 깊이를 보장합니다. 마취 깊이의 현저한 변화는 이소플루란25의 알려진 혈관 조절 효과를 감안할 때 혈류를 변화시킬 수 있습니다.- 45초 동안 100% 산소에서 4.5% 이소플루란으로 유도한 다음, 100% 산소 중의 1.0-1.75% 이소플루란으로 유지한다. 발가락 꼬집음 반응과 정상적인 호흡 (분당 ~ 60-80 회 호흡)이없는 것으로 충분한 마취 깊이를 확인하십시오.
- 2분 동안 안정화한 후 DCS 센서를 오른쪽 반구 위에 부드럽게 올려 놓으면 광학 센서의 위쪽 가장자리가 눈 뒤쪽과 위쪽으로 정렬되고 센서 측면이 중간선을 따라 정렬됩니다(그림 3). 실내 조명으로부터 보호하기 위해 센서에 손을 얹으십시오. 5초의 데이터를 수집합니다(1Hz 수집).
- 센서를 왼쪽 반구 위로 재배치하고 5초의 데이터를 수집합니다.
- 조직 표면 아래의 국소 이질성을 설명하기 위해 3 번 / 반구를 반복하십시오.
- 복구
- 마취에서 마우스를 제거하고 온난화 패드에 놓습니다.
- 마우스가 오른쪽 반사를 회복 한 후 케이지로 되돌립니다.
- 두피의 머리카락을 제거하십시오. DCS는 머리카락이없는 상태에서 가장 잘 작동하기 때문에 실험을 시작하기 전에 머리의 모피를 제거해야합니다. 일반적으로 제모는 연구 시작 1-3 일 전에 수행됩니다.
- DCS 데이터 분석
- 초기 품질 관리를 수행합니다. DCS 데이터의 각 프레임은 측정된 정규화된 강도 자기상관 함수
(그림 4A) 및 광자 계수율(kHz)로 구성됩니다.- 상당한 모션 아티팩트를 갖는 데이터 프레임을 제거하기 위해, 곡선의 꼬리의 평균값(즉,
)이 1.005>는 데이터 프레임을 폐기한다. - 신호 대 잡음비가 낮은 데이터 프레임을 제거하려면 감지된 광자 수 비율이 20kHz 이<인 경우 데이터 프레임을 삭제합니다.
- 상당한 모션 아티팩트를 갖는 데이터 프레임을 제거하기 위해, 곡선의 꼬리의 평균값(즉,
- 추출 뇌 혈류 지수. Matlab에서 fminsearch를 사용하여 CBF i(i)에 대해 각i 번째 측정 데이터 프레임
을 맞춥니다. 적합을 로 
제한하고 다음 비용 함수를 최소화하는 CBFi 값을 찾습니다.
여기서 합은 모든 측정된 지연 시간에
걸쳐, 상관 
확산 방정식의 반무한 균질 해입니다(그림 4B):
여기서 β는 실험 설정에 의해 결정된 응집 인자이며, , , 1.4의 추정된 조직 굴절률에 대해,Reff=0.493이고, ρ는 6 mm이고, μa 및 μ은 조직의 흡수 및 감소된 산란 계수이다(각각 0.25 및 9.4/cm, 각각 10,26,27
로 가정).
참고: β은 시간이 지남에 따라 ~10% 달라질 수 있으므로 β 및 CBF i에 대해 각 데이터 프레임을 동시에 맞춥니다. - 보조 품질 관리를 수행합니다. 각 반복(5개의 데이터 프레임으로 구성됨) 내에서 이상값을 버립니다. 이상값은 해당 반복에 대한 평균 CBF i의 1.5 표준 편차를 벗어나는 CBFi 값으로 정의됩니다. 1개 이상의 데이터 요소가 이상값으로 식별되면 전체 반복을 버립니다.
- 평균 뇌 혈류 지수 추정: 모든 반복에 대한 모든 데이터 프레임에서 평균을 취하여 반구당 평균 CBFi 를 추정합니다(그림 4C). 유의한 반구형 차이가 관찰되지 않으면, 반구에 걸친 평균은 평균 글로벌 CBFi의 추정치를 얻는다.
- 초기 품질 관리를 수행합니다. DCS 데이터의 각 프레임은 측정된 정규화된 강도 자기상관 함수
(그림 4A) 및 광자 계수율(kHz)로 구성됩니다.
)이 1.005>는 데이터 프레임을 폐기한다
을 맞춥니다. 적합을 로 
제한하고 다음 비용 함수를 최소화하는 CBFi 값을 찾습니다.
걸쳐, 상관 
확산 방정식의 반무한 균질 해입니다(그림 4B):
로 가정).3. 루미넥스 분석을 이용한 사이토카인 및 포스포-단백질의 다중화 정량화
- 조직 추출
참고: Luminex를 사용하여 뇌 사이토카인 및 포스포 신호전달 단백질의 정량화에는 조직 추출이 필요합니다.- 마우스를 1-2분 동안 100% 산소에서 4.5% 이소플루란을 사용하여 마취시킨다. 발가락 꼬집음 반응의 부족을 통해 마취의 깊은 평면을 확인하십시오. 감금으로 안락사하십시오.
- 조직을 수확하십시오.
- 뇌를 제거하십시오. 일반적으로 조직학을 위해 왼쪽 반구를 고정하고 피질과 해마 내의 오른쪽 반구에서 여러 영역을 미세 해부합니다 (그림 5).
- 해부 된 샘플을 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣고 액체 질소에서 플래시 동결하십시오. 동결에 민감한 단백질의 분석을 위해, 나중에 동결 해동을 피하기 위해 플래시 동결 전에 조직 절편을 세분화하는 것이 가장 좋습니다.
참고: 프로토콜은 일시 중지될 수 있으며, 조직 샘플은 샘플을 용해시킬 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 대안적으로, 샘플은 용해될 수 있고, 이어서 -80°C에서 저장될 수 있다.
- 용해 샘플.
- 용해 완충액에 프로테아제 억제제 및 2 mM 페닐메틸술포닐플루오라이드를 첨가하여 용해 완충액을 준비한다.
- 약 3 μg의 동물 조직 당 150 μL의 혼합 용해 완충액을 첨가한다. 참고로, 마우스 시각 피질 조직 샘플은 대략 3 μg이다.
- 조직을 균질화하기 위해, 1000 μL 피펫을 사용하여 ∼15-20회 상하로 피펫팅하여 조직을 기계적으로 트리트레이트한다. 최적의 샘플 분쇄를 위해, 호모게나이저 유모차를 사용할 수 있다.
- 샘플 튜브를 4°C에서 30분 동안 회전기에 놓습니다.
- 샘플을 대략 15,000 x g에서 10분 동안 4°C에서 원심분리하고, 상청액을 수집한다. 샘플은 즉시 처리되거나 추가 분석을 위해 -80°C에서 저장될 수 있습니다.
참고: 이 프로토콜을 사용하여 제조된 샘플 용해물은 웨스턴 블롯과 호환되며, 여기서 식세포/미세아교세포 마커 Iba1 및/또는 성상세포 활성화 마커 GFAP를 분석하여 신경염증 연구를 위한 사이토카인 및 포스포-단백질 분석을 보완할 수 있습니다(11).
- 사이토카인 및 포스포-단백질에 대한 멀티플렉스 면역-분석 프로토콜
참고 : 전반적으로 유사하지만 사이토 카인 및 포스포 단백질 키트에 대한 프로토콜에는 약간의 차이가 있습니다. 각 단계마다 차이점이 있습니다. 루미넥스 분석을 위한 샘플을 준비하는 단계는 아래에 요약되어 있습니다.- 시약 제조 (1일째, 사이토카인 및 포스포 단백질에 대해 동일)
- 시약을 실온 (~ 30 분)으로 따뜻하게하십시오.
- 초음파 멀티플렉스 마그네틱 비드 병을 30초 동안 병에 담은 후 1분간 볼텍싱을 한다. 멀티플렉스 마그네틱 비드가 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호되거나 가벼운 보호 병을 사용하여 보호되는지 확인하십시오.
- 1xPBS에 0.1% Tween20을 혼합하여 세척 완충액을 준비하거나 대안적으로 키트에 제공된 세척 완충액을 사용한다.
- 용해된 조직 샘플의 제조 (1일째, 사이토카인 및 포스포-단백질에 대해 동일)
- 이전에 냉동 한 경우 용해 된 조직 샘플을 냉동실에서 제거하고 얼음 (~ 20 분)에서 해동되도록하십시오. 샘플을 9,167 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하였다.
- 선형 범위 분석에 의해 결정된 최적의 단백질 농도로 25 μL의 샘플을 준비한다(섹션 3.3 참조). 모든 샘플에 대한 총 부피를 정규화하기 위해, 키트에 제공된 분석 완충액에서 샘플을 희석한다.
- 96 웰 플레이트의 제조 (1일째, 사이토카인 및 포스포-단백질에 대해 동일)
- 키트에 포함된 96웰 플레이트 또는 얇은 바닥이 있는 플레이트(예: Brand Tech)를 사용하십시오.
- 200 μL의 세척 완충액 (또는 1x PBS, 0.1% 트윈)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트 진탕기 상에서 750 rpm에서 10분 동안 혼합한다.
- 데칸트 세척 완충액을 세척하고 접시를 종이 타월에 두드려 잔류 물을 제거하십시오.
- 사이토카인에 대한 면역분석 절차 (1일차)
- 각 웰에 다음을 순서대로 추가합니다.
- 25 μL의 분석 완충액을 모든 웰에 첨가한다.
- 25 μL의 추가 분석 완충액을 배경 웰에만 첨가하십시오. 모든 실험 실행에 대해 적어도 두 개의 배경 우물이 있어야합니다. 배경 웰에는 로딩된 샘플이 없으며 샘플 없이 계측기에서 판독한 형광 강도를 정의합니다.
- 희석된 각 샘플 25μL를 해당 샘플 웰에 첨가한다.
- 25μL의 1x 멀티플렉스 마그네틱 비드를 모든 웰에 추가합니다(그림 6). 웰에 추가하기 전에 1 분 동안 구슬을 와류하십시오.
- 25 μL의 분석 완충액을 모든 웰에 첨가한다.
- 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 2-8°C에서 밤새도록(12-16 h) 인큐베이션한다.
- 각 웰에 다음을 순서대로 추가합니다.
- 사이토카인에 대한 면역 분석 절차 (2 일째)
- 자기 분리기에 96 웰 플레이트를 놓고 웰이 자석과 정렬되어 있는지 확인하십시오. 2 분 동안 그대로 두십시오. 판이 여전히 자기 분리기에 부착되어있는 동안 데칸트 우물 내용물.
- 다음 단계를 이용하여 플레이트를 2회 세척한다.
- 200 μL의 세척 완충액을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 2분 동안 쉐이커에 놓는다.
- 웰 플레이트를 실온에서 2분 동안 자기 분리기 위에 놓는다.
- 우물 플레이트가 여전히 자기 분리기에 부착되어있는 동안 Decant 우물 내용물.
- 웰당 25μL의 검출 항체를 첨가한다(도 6). 호일로 덮으십시오. 플레이트 진탕기(750 rpm) 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 검출 항체를 25 μL의 스트렙타비딘-피코에리트린(SAPE)을 각 웰에 첨가하고 첨가한다(도 6). 호일로 덮으십시오. 플레이트 진탕기(750 rpm) 상에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 자기 분리기에 우물 플레이트를 놓고 2 분 동안 그대로 두십시오. 내용물을 잘 데칸트하고 자기 분리기에서 분리하십시오.
- 플레이트를 두 번 잘 씻으십시오 (단계 3.2.5.2 참조).
- 75μL의 Luminex 드라이브 유체(MAGPIX 기기를 사용하는 경우)를 각 웰 또는 분석 버퍼(200 또는 FlexMap 3D 기기를 사용하는 경우)에 추가합니다. 실온에서 5분 동안 플레이트 쉐이커에 비드를 재현탁한다.
- Luminex Instruments(MAGPIX, 200 또는 FlexMap 3D)에서 올바른 작동을 위해 사용자 설명서를 참조하십시오(그림 6).
- 포스포 단백질에 대한 면역 분석 절차 (1 일째)
- 각 웰에 다음을 순서대로 추가합니다.
- 25 μL의 분석 완충액을 모든 웰에 첨가한다.
- 25 μL의 추가 분석 완충액을 배경 웰에만 첨가하십시오. 모든 실험 실행에 대해 적어도 두 개의 배경 웰을 갖는 것이 좋습니다. 배경 웰에는 로딩된 샘플이 없으며 샘플 없이 계측기에서 판독한 형광 강도를 정의합니다.
- 희석된 각 샘플 25 μL를 각 샘플 웰에 첨가한다.
- 25μL의 1x 멀티플렉스 마그네틱 비드를 모든 웰에 추가합니다(그림 6).
참고: Luminex 분석 키트는 20x 원액에 멀티플렉스 마그네틱 비드를 제공합니다. 20x 스톡 멀티플렉스 마그네틱 비드 용액을 2분 동안 와류시킨 다음, 분석 완충액에서 1x 용액으로 희석한다. 웰에 추가하기 전에 1 분 동안 1x 멀티플렉스 마그네틱 비드 현탁액을 소용돌이.
- 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 2-8°C에서 밤새도록(12-16시간) 인큐베이션한다.
- 25 μL의 분석 완충액을 모든 웰에 첨가한다.
- 각 웰에 다음을 순서대로 추가합니다.
- 포스포 단백질에 대한 면역 분석 절차 (2 일째)
- 우물 플레이트를 자기 분리기 위에 놓고 웰 플레이트가 자기 분리기와 완전히 정렬되어 있는지 확인하십시오. 2 분 동안 그대로 두십시오. 우물 플레이트가 여전히 자기 분리기에 부착되어있는 동안 데칸트 우물 내용물.
- 플레이트를 2회 세척한다(사이토카인의 면역검정 절차 2일째의 단계 b 참조).
- 20x 스톡 검출 항체를 분석 완충액의 1x 용액에 희석한다. 웰당 25μL의 1x 검출 항체를 첨가한다(도 6). 호일로 덮으십시오. 플레이트 진탕기 (750 rpm) 상에서 실온에서 1 h 동안 인큐베이션한다.
- 자기 분리기에 96 웰 플레이트를 놓고 2 분 동안 그대로 두십시오. 데칸트 우물 내용물, 자기 분리기에서 분리.
- 분석 완충액의 25x 스톡 SAPE를 1x 버퍼로 희석하십시오. 25μL의 1x SAPE를 추가합니다(그림 6). 호일로 덮고 실온에서 플레이트 진탕기 (750 rpm) 상에서 15 분 동안 인큐베이션한다.
- SAPE를 웰에 남겨두고 25 μL의 증폭 완충액을 각 웰에 첨가한다. 호일로 덮으십시오.
- 플레이트 진탕기(750 rpm) 상에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 웰 플레이트를 자기 분리기 위에 2 분 동안 놓습니다. 내용물을 잘 데칸트하고 자기 분리기에서 분리합니다.
- 75μL의 Luminex 드라이브 유체(MAGPIX 기기를 사용하는 경우) 또는 분석 버퍼(200 또는 FlexMap 3D 기기를 사용하는 경우)를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 플레이트 쉐이커에 비드를 재현탁한다.
- Luminex 기기(MAGPIX, 200 또는 FlexMap 3D)에서 올바른 작동을 위해 사용자 설명서를 참조하여 읽어보십시오(그림 6).
- 시약 제조 (1일째, 사이토카인 및 포스포 단백질에 대해 동일)
- 시료 희석 곡선의 선형성
- 샘플 준비 : 총 단백질의 농도가 다른 시험 샘플을 연속적으로 희석합니다. 벌크 뇌 조직의 경우, 사이토카인의 경우 0-25 μg, 포스포 단백질의 경우 0-12 μg의 연속 희석액을 로드합니다. 총 단백질 농도는 비신코닌산(BCA) 검정을 사용하여 측정할 수 있다.
- 멀티플렉스 면역분석: 선택된 샘플에 대해 루미넥스 분석(섹션 3.2 참조)을 수행한다.
- 데이터 분석
- 각 단백질에 대한 형광 강도 대 로딩된 단백질의 양을 플롯한다(도 7).
- 각 분석물에 대해, 전체 단백질과 형광 강도 판독값 사이의 관계가 선형인 로딩된 전체 단백질의 범위를 확인한다(도 7).
- 전체 분석 실행을 위해 로드되어야 하는 총 단백질의 양을 결정하려면 각 분석물에 대한 곡선의 선형 부분을 확인한 다음 대부분의 분석물에 대해 선형 범위에 속하는 단백질 농도를 선택합니다.
참고: 대부분의 단백질은 유사한 선형 범위를 공유하지만 선형 범위는 모든 단백질에 대해 겹치지 않을 수 있습니다. 이 경우, 서로 다른 양의 총 단백질이 로딩된 상태에서 각 샘플을 여러 번 실행해야 할 수도 있습니다. 대안적으로, 비선형 샘플은 분석에서 생략될 수 있다. 또한, 일부 단백질은 선형 범위를 전혀 갖지 않을 수 있습니다.
4. 부분 최소 제곱 회귀 분석
참고: 샘플 R 코드와 샘플 데이터 스프레드시트는 부분 최소 제곱 분석을 수행하기 위해 제공됩니다.
- 데이터 준비: 제공된 샘플 데이터 스프레드시트 "MyData"에 표시된 대로 데이터의 서식을 지정합니다. 행 1에 변수 이름, A 열의 샘플 이름, B 열의 반응 변수 및 C+ 열의 모든 예측 변수를 포함합니다. 마지막 두 행을 배경 데이터로 채우고 두 샘플 이름을 모두 "배경"으로 설정합니다.
- RStudio의 부분 최소 제곱 회귀
- www.r-project.org 에서 R을 설치합니다(무료, 오픈 소스).
- www.rstudio.com 에서 RStudio 데스크톱을 설치합니다 (무료, 오픈 소스 라이센스).
- 이 발행물과 함께 제공된 샘플 R 코드 "PLSR_Sample_Code.R"을 다운로드하여 데이터 스프레드시트가 포함된 동일한 폴더에 저장합니다. RStudio에서 코드 파일을 엽니다.
- 사용자 입력 섹션에서 "dataFileName"을 데이터 스프레드시트의 이름으로 변경합니다.
- 실행할 코드 섹션을 강조 표시하고 스크립트의 오른쪽 위 모서리에 있는 실행 을 클릭하여 다음 단계를 수행합니다.
- RStudio에서 필요한 R 패키지, 함수, 작업 디렉토리 주소 및 사용자 입력 값을로드하십시오 ( "Preliminaries"하위 섹션).
- 데이터를 RStudio에 로드하고 모든 측정에서 평균 배경 신호를 빼고 각 분석물을 z-점수화하여 처리할 원시 데이터를 준비합니다("데이터 읽기 및 배경 빼기" 하위 섹션)(그림 8A).
- 포괄적 인 R 아카이브 네트워크 (CRAN)에서 사용할 수있는 plsRglm 패키지 v1.2.528 을 사용하여 RStudio에서 부분 최소 제곱 회귀를 수행하십시오. LV1-LV2 평면에서 varimax 회전(통계 패키지 v3.6.2)23 을 수행하여 응답 변수("PLS" 서브섹션)에 의해 샘플을 가장 잘 분리하는 새로운 수평축을 식별합니다(그림 8B).
- 하나의 샘플이 반복적으로 데이터에서 생략되고 PLSR 모델이 다시 계산되는 LOOCV(Leave One Out Cross Validation)를 수행합니다. 모든 LOOCV 실행에서 분석물 로드에 대한 계산 표준 편차(하위 섹션 "LOOCV").
- 대표 플롯 만들기: 위에 설명된 대로 제공된 샘플 코드를 실행하여 pdf 파일로 작업 디렉터리(데이터 및 코드 파일이 포함된 폴더)로 자동으로 내보내는 대표 플롯을 만듭니다.
- 도 8A에 도시된 바와 같이 처리된 데이터의 히트 맵을 생성한다(서브섹션 "PLS"). z-점수로 정의된 스펙트럼을 따라 각 항목을 색칠합니다. 관심 잠복 변수에서 계산된 순서에 따라 분석물을 정렬합니다.
- 도 8B에 도시된 바와 같이, 수평축을 따라 플롯된 LV1 점수와 수직축을 따라 플롯된 LV2 스코어를 갖는 스코어 플롯을 생성한다(서브섹션 "PLS"). 반응 변수 측정에 따라 각 데이터 포인트를 색칠하여 각 잠복 변수와 반응 변수 간의 관계를 시각화합니다.
- 그림 8C와 같이 각 예측 변수에 대한 하중을 표시하는 막대 플롯을 만들어 각 분석물이 잠복 변수에 어떻게 기여하는지 시각화합니다("LOOCV" 하위 섹션).
- 그림 8D와 같이 PLSR 모델이 샘플을 얼마나 잘 분리하는지 시각화하기 위해 반응 변수에 대해 LV1 점수를 회귀하는 플롯을 생성합니다("PLS" 서브섹션).
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Representative Results
이전에 수집된 데이터는 C57BL/6 마우스 8마리로 구성된 그룹이 매일11일에 한 번 간격을 두고 3개의 폐쇄머리 부상(그림 2)을 입은 이전 작업에서 가져온 것입니다. 이 연구에서, 뇌 혈류는 마지막 손상 후 4 시간 후에 확산 상관 분광법으로 측정되었다 (그림 3, 그림 4). 손상 후 CBF 평가 후, 동물을 안락사시키고, 면역검정을 통해 사이토카인 및 포스포 단백질의 정량화를 위해 뇌 조직을 추출하였다(도 5). 우리는 또한 웨스턴 블롯을 통해 식세포 / 미세 아교세포 활성화 마커 Iba1을 정량화했습니다 (11에 설명 된 방법). 각 마우스로부터의 뇌 조직을 용해시키고, 총 단백질 농도를 BCA 검정을 사용하여 측정하였다. 다중화된 사이토카인 정량화는 Milliplex MAP 마우스 사이토카인/케모카인 32-Plex를 사용하여 수행되었으며, 이를 루미넥스 MAGPIX 시스템을 사용하여 판독하였다(도 6). 모든 샘플로부터 데이터를 수집하기 전에 적절한 단백질 로딩(용해물의 12.5μL 당 단백질 12μg)을 결정하기 위해 선형 범위 분석을 수행하였다(도 7).
사이토카인 데이터는 샘플 데이터로부터 배경 측정치를 뺀 다음, 각 분석물에 대한 z-스코어링 데이터에 의해 분석을 위해 준비되었다(도 8A). 동물간의 사이토카인 발현의 차이를 시각화하기 위해 z-스코어링된 데이터로부터 히트맵을 생성하였다. 부분 최소 제곱 회귀(PLSR)는 식세포/미세아교세포 활성화 마커 Iba1을 반응 변수로, 사이토카인 측정을 예측 변수로 사용하여 수행하였다(도 8B). Iba1 측정치와 함께 LV1 상의 데이터의 공분산을 최대화하기 위해 varimax 회전이 수행되었다(그림 8D). LV1에서의 높은 로딩 중량 (도 8C)은 Iba1의 높은 발현과 가장 관련된 사이토카인 발현과 상응한다. Iba1과 사이토카인 사이의 선형 회귀는 LV1에서 가장 큰 로딩 중량을 갖는 사이토카인이 또한 통계적으로 유의하다는 것을 보여준다(도 8E).
그림 1: 일반적인 워크플로 먼저, 마우스는 체중 감소 폐쇄 두부 손상을 겪은 다음, 대뇌 혈류(CBF)를 확산 상관 분광법을 사용하여 측정한다. 다음으로, 뇌가 수집되고, 관심 영역이 미세 해부되고 액체 질소를 사용하여 스냅 얼립니다. 루미넥스 면역 검정을 준비하기 위해, 단백질은 용해되고, 총 단백질 농도는 비친코닌산 분석에 의해 측정된다. 용해물은 관심있는 단백질의 웨스턴 블롯 및 사이토카인 및 포스포 단백질에 대한 루미넥스 검정에 사용됩니다. CBF, 웨스턴 블롯 및 루미넥스의 데이터는 부분 최소 제곱 회귀(PLSR)를 사용하여 통합됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 경미한 외상성 뇌 손상의 폐쇄 머리 체중 감소 모델. (A) 마취된 마우스는 꼬리에 의해 파악되고 가이드 튜브 아래의 타우트 희생 막 상에 놓인다. 54g의 무게가 1m에서 머리의 등쪽 측면으로 떨어집니다. (B) 충격 후 ~ 1ms 이내에, 마우스의 머리는 희생 막을 뚫을 때 목 주위로 빠르게 회전합니다. (C) 충격 후 ~ 5ms 이내에 전체 마우스가 떨어졌고 잡은 꼬리에 매달려 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 확산 상관 분광법에 의한 뇌 혈류 측정. (A) 광학 센서는 마취된 마우스의 혈류를 측정하기 위해 오른쪽 반구 위에 부드럽게 수동으로 고정됩니다. (B) 우반구에 대표적인 센서 배치. 센서의 윤곽선은 파선 검은색 사각형으로 표시되며 소스 및 검출기 섬유의 위치는 각각 빨간색과 파란색 원으로 표시됩니다. 센서는 센서의 짧은 가장자리가 눈 뒤쪽과 정렬되고 센서의 긴 가장자리가 중간 선과 정렬되도록 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 확산 상관 분광법 데이터 분석. (A) 대표적인 측정된 강도 자기상관성 곡선,g2(τ), 기준선에서, 손상 전 기준선(녹색) 및 4시간 후 5개의 폐쇄된 두부 손상 후 하루에 한 번 간격(보라색). 부상 전후로 곡선의 오른쪽 이동은 혈류의 감소를 반영합니다. (B) g
(τ) 데이터는 반구당 5초 동안 1Hz에서 수집되고 3x/반구를 반복한다. 각각의 측정된 g(τ) 곡선은 대뇌 혈류 지수(CBFi)에 대한 상관 확산 방정식에 대한 반무한 해법에 적합하다. (c) 모든 프레임 및 반복에 걸친 CBFi 값은 각 반구에 대한 평균 대뇌 혈류 지수(수평 검정 막대로 표시됨)를 얻기 위해 평균화된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 마우스 뇌 미세 해부. (A) 뇌가 마우스에서 추출된 후, 뇌는 점선을 따라 이분된다. 왼쪽 반구는 조직학을 위해 고정되고 오른쪽 반구는 병리학을 위해 미세 해부됩니다. (B) 우반구의 피질에 대한 궁수보기. 오른쪽 반구는 해당 색상 코드 영역으로 미세 해부됩니다. 동결에 민감한 단백질의 분석을 위해, 플래시 동결 전에 조직 절편을 세분화하는 것이 최적입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 루미넥스 절차 그림. (A) 형광 태그가 붙은 비드에 샘플을 추가합니다. 비드는 관심있는 각 단백질에 대해 특이적 포획 항체로 예비코팅된다. (b) 비오티닐화 검출 항체를 첨가한다. 비오틴-검출 항체는 관심있는 분석물에 결합하고 항체-항원 샌드위치를 형성한다. (c) 피코에리트린(PE)-공액 스트렙타비딘(SAPE)을 첨가한다. SAPE는 비오티닐화 검출 항체에 결합하여 반응을 완료한다. 포스포 단백질의 경우, 증폭 완충액 (포스포 단백질 분석에만 해당)이 SAPE에 첨가 된 후 첨가되어 분석 신호를 향상시킵니다. (D) Luminex 기기(MAGPIX, 200 또는 FlexMap 3D)는 적색/녹색 조명의 조합을 통해 형광으로 태그가 지정된 각 비드에 대한 반응을 읽습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 선형 범위를 식별하기 위한 샘플 희석 곡선의 그림. 연속 희석된 샘플의 단백질 농도 대 Luminex 분석으로부터 측정된 형광 강도. 선형 범위는 단백질 농도와 형광 강도 사이의 관계가 선형인 단백질 농도 범위(화살표)로 정의된다. 일부 분석물에서, 단백질 농도를 특정 한계를 초과하여 증가시키는 것은 희석 곡선이 비선형 또는 반전(Hook effect)되도록 항체 결합을 감소시킬 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 대표적인 부분 최소 제곱 회귀(PLSR) 분석. (a) 3xCHI 마우스에서 Iba1 발현(오른쪽 컬럼)과 함께 패널 사이토카인 단백질 발현(왼쪽 컬럼)(n=8, z-스코어링). (b) PLSR은 각각의 잠복 변수에 대해 측정된 사이토카인에 가중치(하중)를 할당한다. 가중치는 측정된 데이터에 적용되어 각 잠복 변수의 각 샘플에 대한 점수를 계산합니다. (c) Iba1에 대한 3xCHI 샘플의 PLSR은 Iba1에 의해 샘플을 구별하는 사이토카인, LV1의 가중 프로파일을 동정하였다. 음의 가중치를 갖는 사이토카인은 낮은 Iba1을 갖는 샘플에서 상향조절되었고, 양수 중량을 갖는 사이토카인은 높은 Iba1을 갖는 샘플에서 상향조절되었다(LOOCV를 사용한 평균 ± SD). (d) Iba1에 대한 각 샘플에 대한 LV1 점수의 선형 회귀. R2PLS는 Iba1과 LV1 사이의 적합성을 측정한다. (e) C에서 LV1에서 가장 큰 가중치를 갖는 각각의 사이토카인에 대한 Iba1의 개별적 회귀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 반복적 인 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 혈역학 및 신경 염증 반응의 평가를위한 방법을 자세히 설명합니다. 또한 부분 최소 제곱 회귀를 사용하여 이러한 데이터를 다변량 시스템 분석의 일부로 통합하는 방법을 보여 주었습니다. 아래 텍스트에서 우리는 프로토콜과 관련된 몇 가지 주요 단계 및 제한 사항뿐만 아니라 기존 방법에 비해 방법의 장점 / 단점에 대해 논의 할 것입니다.
가벼운 외상성 뇌 손상의 체중 감소 모델. 외상성 뇌 손상 유도의 이러한 방법은 스포츠 관련 두부 부상10,19에서 흔히 볼 수 있는 빠른 전후부 회전 가속에 뒤따르는 둔한 충격을 특징으로 한다는 점에서 유리하다. 확실히, lissencephalic 마우스 뇌는 gyrocephalic 인간 두뇌의 복잡성을 완전히 회복하지 못합니다. 그럼에도 불구하고,이 모델은 반복적 인 부상을 입은 공간 학습 및 기억의 지속적인 결핍을 포함하여 인간 mTBI의 많은 동일한 임상 및 행동 후유증을 유발합니다. 또한, 그 영향은 본질적으로 경미하지만 (구조 / 신경 손상 없음, 혈액 뇌 장벽 투과성 없음, 여러 번의 타격 후에 만 출현하는인지 적 결함 등.19), 의식 상실이 덜 흔한 인간과는 달리 의식의 상당한 손실을 유발합니다. 이러한 의식 상실의 증가는 정확한 원인이 잘 이해되지 않았지만 충격 직전에 주어진 마취와의 상호 작용 때문일 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 코로나 봉합사와 람도이드 봉합사 사이에 볼트가 충돌하도록 가이드 튜브를 정렬하는 것이 중요하다는 점에 유의합니다. 우리는 더 후방적 인 충격이 안락사를 필요로하는 심각한 운동 결핍을 일으킬 수 있음을 관찰했습니다.
확산 상관 분광법을 이용한 뇌 혈류 평가. 관류 자기 공명 영상 또는 경두개 도플러 초음파와 같은 인간 / 대형 동물 연구에 사용 된 전통적인 양식으로 뇌 혈류 (CBF)의 비 침습적 종방향 측정은 작은 뇌 크기와 총 혈액량29를 포함한 다양한 이유로 마우스에서 도전적입니다. 확산 상관 분광법은 마우스에 매우 적합하며 다른 양식20,30에 비해 비침습적이고 상대적으로 저렴하다는 추가 이점을 제공합니다. DCS는 모션 아티팩트에 민감하기 때문에, 마우스는 평가를 위해 간단히 마취되거나 억제될 필요가 있다(31). 우리는 일반적으로 빠른 유도 및 회복으로 인해 이소플루란 마취를 사용합니다. 그러나, 이소플루란은 대뇌 혈관 확장제이며, 이소플루란에서의 혈류 추정치는 주의해서 해석되어야 한다. 가짜 부상 동물과 비교하여 부상 후 보이는 혈류의 감소는 부상당한 대뇌 혈관구조가 이소플루란에 반응하여 혈관 확장되지 않음으로써 혼란 스러울 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 이전에 마우스에서 DCS를 사용한 혈류 측정의 우수한 사용자 내 반복성을 입증했지만 공정한 사용자 내 반복성만 입증했습니다 21. 이러한 이유로 동일한 작업자가 뇌 혈류의 종방향 평가가 필요한 실험에 대해 DCS 측정을 획득하는 것이 좋습니다.
Luminex 검정을 사용하여 사이토카인 및 포스포-단백질의 다중화 정량화. 모든 ELISA의 주요 과제는 후크 효과이며, 이에 따라 단백질 농도가 증가하면 표적 단백질에 대한 항체 친화도가 감소할 수 있으며, 따라서 증가된 단백질32에 대한 반응으로 분석 신호가 감소할 수 있습니다(그림 7). 이 효과는 전체 조직을 분석 할 때 악화 될 수 있으며, 벌크 단백질은 유사하게 간섭 할 수 있습니다. 따라서, 루미넥스 분석법을 활용하는 첫 번째 단계는 로딩된 단백질의 양에 따라 분석법이 선형적으로 판독되는 로딩된 단백질 농도의 범위가 존재하는지 확인하는 것이다. 이러한 선형 범위를 갖지 않는 분석물(그림 7)은 분석에서 제외되어야 합니다. 우리는 또한 뇌의 사이토 카인 수치가 일반적으로 매우 낮으며 Luminex 키트와 함께 제공되는 표준 곡선을 통해 평가 된 낮은 검출 한계 근처에서 나타난다는 점에 유의하십시오. 이러한 이유로 선형 범위 분석을 수행하여 계측기 판독값이 실제로 로드된 샘플의 양을 반영하는지 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 관심있는 주요 단백질의 경우, 이러한 선형 범위 분석은 스파이크 회수 분석으로 보완될 수 있으며, 여기서 재조합 단백질은 샘플로 스파이크되고, 계기 판독에서의 선형성은 평가된다(33).
신경 염증은 다양한 세포 내 포스포 단백질과 세포외 사이토카인에 의해 조절되기 때문에, mTBI에 대한 뇌의 신경 면역 반응을 이해하기 위해서는 이러한 단백질의 광범위한 배열을 동시에 측정하는 것이 중요하다. 루미넥스 다중화 면역검정은 단일 샘플로부터 수십 개의 사이토카인과 포스포 단백질의 동시 정량화를 가능하게 하여, 손상 후 조직 면역 반응의 전체론적 관점을 제공한다. 이러한 분석이 사이토카인/케모카인과 포스포-단백질에 대한 광범위한 시각을 제공하지만, 이 분석은 조직 균질물로부터 각 단백질의 총량을 정량화합니다. 따라서, 세포 유형 특정 데이터를 산출하지 않는다. 세포-유형 특이성은 세포 유형(예를 들어, 뉴런, 미세아교세포, 성상세포 등)에 대한 마커와 함께 관심있는 최고 단백질의 국소화를 확인하기 위한 후속 면역조직화학에 의해 결정될 수 있다. 11.
데이터 통합을 위한 부분 최소 제곱 회귀 분석입니다. mTBI에 대한 조직 반응은 식세포 / 미세 아교 활성화 마커 Iba1, 다양한 사이토카인 및 포스포 단백질의 변화와 함께 혈류의 생리적 변화로 구성된 다인자입니다11. 수집된 데이터의 다중화된 특성으로 인해, 다양한 예측 변수 간의 관계의 다차원성을 설명하기 위해서는 체계적인 방법이 필요하다. PLSR은 예측 변수와 결과 변수 사이의 공분산을 최대한으로 식별하는 LV를 식별함으로써 이러한 문제에 적합한 해결책을 제공한다(예를 들어, 도 8의 Iba1). 중요하게도, 예측 변수 (즉, LV1에서 높은 하중을 갖는 단백질)와 강하게 상관 관계가 있는 것으로 밝혀진 단백질들은 종종 단변량 회귀 분석에서도 상관관계가 있다(도 8E). PLSR은 그림 8에서와 같이 많은 수의 예측 변수를 더 적은 수의 샘플에 맞추기 위해 자주 사용되기 때문에 개별 샘플에 대한 LV1 상의 가중치의 민감도를 이해하는 것이 중요합니다. 적은 수의 샘플(<10)의 경우 LOOCV는 가중치의 민감도를 평가하는데 유용하다( 도 8C의 SD 에러 막대를 통해 표시됨). 더 많은 수의 샘플의 경우, 몬테카를로 서브샘플링 접근법(34)을 사용하여 한 번에 다수의 샘플을 남겨둠으로써 민감도를 평가하는 것이 중요할 것이다. 우리는 PLSR 접근법 및 용도에 대한 심층적 인 토론을 위해 독자를 Multi 및 Megavariate Data Analysis24 로 안내합니다. 마지막으로, 이러한 유형의 분석의 주요 한계는 순전히 상관 관계라는 것입니다. PLSR은 예측 변수와 결과 변수 사이의 기계론적 관계를 증명하지 않습니다. 우리는 PLSR을 인과 관계를 수립하는 미래의 실험에서 변조 할 수있는 견인 가능한 표적을 제안하는 데 사용되는 귀중한 가설 생성 접근법으로 간주합니다.
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
이 프로젝트는 National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) 및 R01 NS115994 (LBW / EB) 및 애틀랜타 주니어 교수진 집중 상 (EMB)의 어린이 건강 관리가 지원했습니다. 이 작업은 또한 미국 국방부가 상 번호 (Award No)에 따라 의회 감독 의료 연구 프로그램을 통해 지원했습니다. W81XWH-18-1-0669 (LBW / EMB). 의견, 해석, 결론 및 권고는 저자의 의견이며 반드시 국방부에서 보증하는 것은 아닙니다. 이 자료는 보조금 번호 1937971에 따라 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램에서 지원하는 작업을 기반으로합니다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과 및 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable pipettes | any adjustable pipette | ||
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Bio-Plex cell lysis kit | C Bio-Rad | 171304012 | |
| BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile | BrandTech | 781602 96 | |
| Complete mini protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
| Depilatory cream | Amazon | Nair | |
| DiH2O | VWR | VWRL0200-1000 | |
| Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates | Millipore Sigma Catalogue | 40-285 | |
| Hardware Autocorrelator Board | www.correlator.com | Flex05-8ch | |
| Isoflurane 250 mL | MED-VET INTERNATIONAL | RXISO-250 | |
| Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) | VWR | 21905-026 | |
| Laboratory vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| LabView | National Instruments | LabVIEW | |
| Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software | Luminex Corporation | ||
| Luminex Drive Fluid | Luminex | MPXDF-4PK | |
| Luminex sheath fluid | EMD Millipore | SHEATHFLUID | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay | Millipore Sigma | MCYTMAG-70K-PX32 | |
| MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay | Millipore Sigma | 48-660MAG | |
| Mini LabRoller rotator | VWR | 10136-084 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | VWR | 97064-158 | |
| Plate Sealer | VWR | 82050-992 | |
| Polypropylene microfuge tubes | VWR | 20901-547 | |
| Mini LabRoller | Millipore Sigma | Z674591 | |
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-668 | |
| R Programming Language | |||
| RStudio | www.rstudio.com | ||
| Sonicator | |||
| Titer plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 1 m acrylic guide tube | McMaster-Carr | 49035K85 | |
| 4 photon counting avalanche photodiode | Perkin-Elmer | SPCM-AQ4C-IO | |
| 400 um multimode source fiber | Thorlabs Inc. | FT-400-EMT | |
| 54 g bolt | Ace Hardware | 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length | |
| 780 nm single mode detector fiber | Thorlabs Inc. | 780HP | |
| 852 nm long-coherence length laser | TOPTICA Photonics | iBeam smart |
References
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