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Neuroscience

दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के लिए Neuroinflammatory और हेमोडायनामिक प्रतिक्रिया के सिस्टम विश्लेषण

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/61504
Automatic Translation
*1, *2,3, 1,3, *1,2,3, *1,4,5
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के लिए न्यूरोइंफ्लेमेटरी और हेमोडायनामिक प्रतिक्रिया को चिह्नित करने और आंशिक कम से कम वर्ग प्रतिगमन का उपयोग करके एक बहुचर प्रणाली विश्लेषण के हिस्से के रूप में इन आंकड़ों को एकीकृत करने के तरीकों को प्रस्तुत करता है।

Abstract

हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोटें (एमटीबीआई) एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या हैं। एमटीबीआई के बार-बार संपर्क में आने से संचयी, लंबे समय तक चलने वाले कार्यात्मक घाटे हो सकते हैं। हमारे समूह और अन्य लोगों के कई अध्ययनों से पता चला है कि एमटीबीआई साइटोकाइन अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है और माइक्रोग्लिया को सक्रिय करता है, सेरेब्रल रक्त प्रवाह और चयापचय को कम करता है, और सेरेब्रोवास्कुलर प्रतिक्रियाशीलता को खराब करता है। इसके अलावा, कई कार्यों ने इन neuroinflammatory और हेमोडायनामिक मार्करों और संज्ञानात्मक हानि में derangements के बीच एक संबंध की सूचना दी है। इसमें हम चूहों में एमटीबीआई के लिए न्यूरोइंफ्लेमेटरी और हेमोडायनामिक ऊतक प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के तरीकों का विस्तार करते हैं। विशेष रूप से, हम वर्णन करते हैं कि एमटीबीआई के वजन-ड्रॉप मॉडल को कैसे किया जाए, एक गैर-इनवेसिव ऑप्टिकल तकनीक का उपयोग करके सेरेब्रल रक्त प्रवाह को अनुदैर्ध्य रूप से कैसे मापा जाए, जिसे फैलाना सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी कहा जाता है, और साइटोकिन्स और इम्युनोमोड्यूलेटरी फॉस्फो-प्रोटीन (उदाहरण के लिए, एमएपीके और एनएफबी मार्गों के भीतर) को मापने के लिए मस्तिष्क के ऊतकों पर ल्यूमिनेक्स मल्टीप्लेक्स डे इम्यूनोसे कैसे किया जाए जो माइक्रोग्लिया और अन्य तंत्रिका प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिविधि का जवाब और विनियमित करते हैं। अंत में, हम इन सभी चरों के बीच संबंधों को समझने के लिए एक बहुचर सिस्टम विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग करके इन डेटा को एकीकृत करने के तरीके का विवरण देते हैं। इन शारीरिक और आणविक चर के बीच संबंधों को समझना अंततः हमें एमटीबीआई के लिए जिम्मेदार तंत्र की पहचान करने में सक्षम करेगा।

Introduction

सिंहावलोकन
हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोटों (एमटीबीआई) का प्रभाव ~ 1.6-3.8 मिलियन एथलीटों को सालाना1। ये चोटें, जिनमें उप-concussive और concussive चोटें शामिल हैं, रोगियों को क्षणिक शारीरिक, भावनात्मक, मनोवैज्ञानिक और संज्ञानात्मक लक्षणों के साथ छोड़ सकतीहैं। इसके अलावा, दोहराए जाने वाले एमटीबीआई (आरएमटीबीआई) "भेद्यता की खिड़की" के भीतर निरंतर संचयी गंभीरता और संज्ञानात्मक परिणामों की अवधि का कारण बन सकते हैं जो अकेले3 एकल एमटीबीआई के प्रभावों की तुलना में लंबे समय तक रहते हैं, और अंततः फ़ंक्शन 4,5,6 के स्थायी नुकसान के लिए भी। यद्यपि कई रोगी अपेक्षाकृत कम समय सीमा (<1 सप्ताह) के भीतर ठीक हो जाते हैं, 10-40% रोगियों को > 1 महीने के लिए एमटीबीआई के लंबे समय तक चलने वाले प्रभावों का सामना करना पड़ता है, कुछ 1 वर्ष 3,7,8,9 तक रहते हैं। इन चोटों के उच्च प्रसार और स्थायी परिणामों के बावजूद, चोट तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है और कोई प्रभावी उपचार रणनीति मौजूद नहीं है।

एमटीबीआई / आरएमटीबीआई के बाद परिणामों में उच्च परिवर्तनशीलता को देखते हुए, टर्मिनल एमटीबीआई / आरएमटीबीआई अध्ययनों में प्राप्त ऊतक से प्रारंभिक चरण के आणविक ट्रिगर्स की पहचान करने में एक चुनौती अनुदैर्ध्य डेटा की कमी है जो इन आणविक ट्रिगर्स के निश्चित "तीव्र आणविक लिंक" को लंबे समय तक परिणामों के लिए प्रदर्शित करती है। इस चुनौती को दूर करने के लिए, हमारे समूह ने पाया है कि तीव्र रूप से कम सेरेब्रल रक्त प्रवाह को एक ऑप्टिकल उपकरण का उपयोग करके मापा जाता है जिसे फैलाना सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (डीसीएस) कहा जाता है, आरएमटीबीआई10 के माउस मॉडल में दीर्घकालिक संज्ञानात्मक परिणाम के साथ दृढ़ता से सहसंबंधित है। इस हेमोडायनामिक बायोमार्कर का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया कि तीव्र रूप से कम सेरेब्रल रक्त प्रवाह वाले चूहों (और, विस्तार से, बदतर भविष्यवाणी की गई दीर्घकालिक परिणाम) के साथ चूहों में एमएपीके और एनएफबी दोनों मार्गों के भीतर न्यूरोनल फॉस्फो-सिग्नलिंग में सहवर्ती तीव्र वृद्धि होती है, प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स की न्यूरोनल अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है, और फागोसाइट / माइक्रोग्लियल मार्कर Iba1 11 की अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है। . ये डेटा न्यूरोनल फॉस्फो-सिग्नलिंग, साइटोकाइन अभिव्यक्ति और माइक्रोग्लियल सक्रियण के लिए एक संभावित भूमिका का सुझाव देते हैं, दोनों सेरेब्रल रक्त प्रवाह के बाद चोट के तीव्र विनियमन के साथ-साथ एक सिग्नलिंग कैस्केड को ट्रिगर करने में जो न्यूरोनल डिसफंक्शन और बदतर संज्ञानात्मक परिणाम की ओर जाता है। इसमें, हम आरएमटीबीआई के बाद हेमोडायनामिक और न्यूरोइंफ्लेमेटरी पर्यावरण दोनों की एक साथ जांच करने के लिए अपने दृष्टिकोण का विस्तार करते हैं और इन जटिल डेटासेट को कैसे एकीकृत करते हैं। विशेष रूप से, हम इस व्यापक दृष्टिकोण के लिए चार प्रमुख चरणों के लिए प्रक्रियाओं को रेखांकित करते हैं: (1) हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट का एक वजन-ड्रॉप मॉडल, (2) फैलाव सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ सेरेब्रल रक्त प्रवाह का आकलन, (3) न्यूरोइन्फ्लेमेटरी वातावरण का परिमाणीकरण, और (4) डेटा एकीकरण (चित्रा 1)। नीचे, हम अपने तरीकों के पीछे तर्क के माध्यम से पाठकों को मार्गदर्शन करने में मदद करने के लिए इन प्रमुख चरणों में से प्रत्येक के लिए एक संक्षिप्त परिचय प्रदान करते हैं। पांडुलिपि के शेष इन प्रमुख चरणों में से प्रत्येक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के वजन-ड्रॉप मॉडल
यद्यपि दोहराए जाने वाले हल्के टीबीआई के कई उत्कृष्ट प्रीक्लिनिकल मॉडल 12,13,14,15,16,17,18 मौजूद हैं, हम एक अच्छी तरह से स्थापित और नैदानिक रूप से प्रासंगिक वजन-ड्रॉप बंद सिर की चोट मॉडल को नियोजित करते हैं। इस मॉडल की प्रमुख विशेषताओं में शामिल हैं (1) अक्षत खोपड़ी / खोपड़ी का कुंद प्रभाव गर्दन के बारे में सिर के अप्रतिबंधित रोटेशन के बाद, (2) कोई अतिरंजित संरचनात्मक मस्तिष्क की चोट, एडिमा, रक्त-मस्तिष्क बाधा क्षति, तीव्र कोशिका मृत्यु, या क्रोनिक मस्तिष्क ऊतक हानि, और (3) लगातार (1 वर्ष तक) संज्ञानात्मक घाटे जो केवल कई हिट19 (चित्रा 2) के बाद उभरते हैं।

विसरित सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ सेरेब्रल रक्त प्रवाह का आकलन
फैलाना सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (डीसीएस) एक गैर-इनवेसिव ऑप्टिकल तकनीक है जो रक्त प्रवाहको 5,20,21 मापता है। डीसीएस में, ऊतक की सतह पर एक निकट-अवरक्त प्रकाश स्रोत रखा जाता है। एक डिटेक्टर को ऊतक की सतह पर स्रोत से एक निश्चित दूरी पर रखा जाता है ताकि प्रकाश का पता लगाया जा सके जो ऊतक के माध्यम से बिखरे हुए गुणा हो गया है (चित्र3)। चलती लाल रक्त कोशिकाओं को बंद करने से प्रकीर्णन समय के साथ पता लगाया प्रकाश तीव्रता उतार-चढ़ाव का कारण बनता है। सहसंबंध प्रसार सिद्धांत के रूप में जाना जाने वाला एक सरल विश्लेषणात्मक मॉडल इन तीव्रता के उतार-चढ़ाव को रक्त प्रवाह के सूचकांक से संबंधित करने के लिए उपयोग किया जाता है (सीबीएफआई, चित्रा 4)। यद्यपि सीबीएफआई (सेमी2 / एस) की इकाइयां प्रवाह की पारंपरिक इकाइयां नहीं हैं (एमएल / मिनट / 100 ग्राम), चूहों में एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि सीबीएफमैं एमआरआई21 लेबल वाले धमनी स्पिन द्वारा मापा गया सेरेब्रल रक्त प्रवाह के साथ दृढ़ता से संबंधित है।

संदर्भ के लिए, यहां उपयोग किए जाने वाले डीसीएस उपकरण को इन-हाउस बनाया गया था और इसमें 852 एनएम लंबी सुसंगतता-लंबाई लेजर, 4 फोटॉन गिनती हिमस्खलन फोटोडायोड की एक सरणी, और एक हार्डवेयर ऑटोकोरिलेटर बोर्ड (एकल ताऊ, 8 चैनल, 100 एनएस न्यूनतम नमूना समय) 21,22 शामिल है। डेटा LabView में लिखे गए होममेड सॉफ़्टवेयर के साथ अधिग्रहित किया जाता है। डिवाइस के लिए पशु इंटरफ़ेस में 400 μm मल्टीमोड स्रोत फाइबर (400-2200 एनएम तरंग दैर्ध्य रेंज, शुद्ध सिलिका कोर, TECS हार्ड क्लैडिंग) और 780 एनएम सिंगल मोड डिटेक्टर फाइबर (780-970 एनएम तरंग दैर्ध्य रेंज, शुद्ध सिलिका कोर, TECS हार्ड क्लैडिंग, 730 ± 30 एनएम सेकंड मोड कट-ऑफ) शामिल हैं, जो 6 मिमी के अलावा और एक काले 3 डी-मुद्रित सेंसर (4 मिमी x 8 मिमी) में एम्बेडेड है। चित्रा 3)।

तंत्रिका-ज्वलनशील वातावरण का परिमाणीकरण
यद्यपि न्यूरोइन्फ्लेमेशन को विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं द्वारा विनियमित किया जाता है, दो प्रमुख प्रासंगिक तंत्र साइटोकिन्स / केमोकाइन्स द्वारा बाह्य कोशिकीय सिग्नलिंग और फॉस्फो-प्रोटीन द्वारा इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग हैं। चोट के बाद मस्तिष्क के न्यूरोइंफ्लेमेटरी वातावरण की जांच करने के लिए, मस्तिष्क को चूहों, माइक्रोडिस्केटेड से निकाला जाता है, और साइटोकिन्स / केमोकाइन्स और फॉस्फो-प्रोटीन को ल्यूमिनेक्स (चित्रा 5, चित्रा 6, चित्रा 7) का उपयोग करके परिमाणित किया जाता है। Luminex multiplexed immunoassays एंजाइम से जुड़े immunosorbent assays (ELISAs) को फ्लोरोसेंटली टैग किए गए चुंबकीय मोतियों के युग्मन द्वारा इन प्रोटीनों के एक विविध संग्रह के एक साथ परिमाणीकरण को सक्षम करते हैं। ब्याज के प्रत्येक प्रोटीन के लिए अलग-अलग फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग किया जाता है, और प्रत्येक टैग के मोतियों को उस विशेष प्रोटीन के खिलाफ कैप्चर एंटीबॉडी के साथ कार्यात्मक किया जाता है। प्रत्येक प्रोटीन को कैप्चर करने के लिए सैकड़ों मोतियों को एक साथ मिलाया जाता है, 96 अच्छी तरह से प्लेट में रखा जाता है, और नमूने के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। नमूना इनक्यूबेशन के बाद, एक चुंबक का उपयोग मोतियों को कुएं में फंसाने के लिए किया जाता है जबकि नमूने को धोया जाता है। इसके बाद, बायोटिनिलेटेड डिटेक्शन एंटीबॉडी पारंपरिक एलिसा के समान एंटीबॉडी-एंटीजन सैंडविच बनाने के लिए ब्याज के विश्लेषक को बांधता है, लेकिन प्रत्येक प्रोटीन के लिए एलिसा के साथ एक अलग फ्लोरोसेंटली टैग किए गए मनका पर होता है। phycoerythrin-संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन (SAPE) जोड़ने से प्रत्येक प्रतिक्रिया पूरी होती है। Luminex उपकरण तब मोतियों को पढ़ता है और प्रत्येक फ्लोरोसेंट टैग / प्रोटीन के अनुसार संकेत को अलग करता है।

डेटा एकीकरण
ल्यूमिनेक्स परख में मापा गया बड़ी संख्या में एनालिट्स (जैसे, साइटोकिन्स) के कारण, डेटा विश्लेषण की व्याख्या करना मुश्किल हो सकता है यदि प्रत्येक मात्रा प्रोटीन का व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया जाता है। विश्लेषण को सरल बनाने और analytes के बीच देखे गए रुझानों को कैप्चर करने के लिए, हम आंशिक कम से कम वर्ग प्रतिगमन (PLSR, चित्रा 8) 23 नामक एक बहुचर विश्लेषण विधि का उपयोग करते हैं। PLSR प्रत्येक मापा प्रोटीन (यानी, साइटोकिन्स या फॉस्फो-प्रोटीन, जिसे "भविष्यवक्ता चर" के रूप में जाना जाता है) के अनुरूप वजन की एक धुरी की पहचान करके काम करता है, जो एक साथ एक प्रतिक्रिया चर (जैसे, सेरेब्रल रक्त प्रवाह) के साथ मापा प्रोटीन के सह-विचरण की बेहतर व्याख्या करता है। वजन को "लोडिंग" के रूप में संदर्भित किया जाता है और एक वेक्टर में इकट्ठा किया जाता है जिसे अव्यक्त चर (एलवी) के रूप में जाना जाता है। दो एलवी में से प्रत्येक पर मापा गया प्रोटीन डेटा प्रोजेक्ट करके (जिसे "स्कोरिंग" के रूप में संदर्भित किया जाता है), डेटा को इन एलवी के संदर्भ में फिर से प्लॉट किया जा सकता है। PLSR की गणना करने के बाद, हम एक नए LV की पहचान करने के लिए एक varimax रोटेशन का उपयोग करते हैं जो LV और predictor variable24 पर नमूना अनुमानों के बीच सहप्रसरण को अधिकतम करता है। यह दृष्टिकोण हमें LV1 को अक्ष के रूप में परिभाषित करने की अनुमति देता है जिसके लिए प्रतिक्रिया चर के विचरण को सबसे अच्छा समझाया गया है। एलवी 2 प्रतिक्रिया चर और एलवी 1 अवशिष्ट डेटा के बीच सह-विचरण को अधिकतम करता है, जो नमूनों के बीच जैविक या तकनीकी परिवर्तनशीलता से जुड़ा हो सकता है। अंत में, हम यह सुनिश्चित करने के लिए एक लीव वन आउट क्रॉस सत्यापन (LOOCV) का संचालन करते हैं कि PLSR मॉडल किसी भी एक नमूने23 पर बहुत अधिक निर्भर नहीं है।

इस प्रोटोकॉल में, हम एमटीबीआई के लिए न्यूरोइंफ्लेमेटरी और हेमोडायनामिक ऊतक प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के तरीकों का विस्तार करते हैं। सामान्य वर्कफ़्लो चित्र 1 में उल्लिखित है. इस प्रोटोकॉल में, चूहों को वजन-ड्रॉप बंद सिर की चोट मॉडल का उपयोग करके एक या अधिक एमटीबीआई के अधीन किया जाता है। सेरेब्रल रक्त प्रवाह को चोट से पहले और कई समय बिंदुओं पर अनुदैर्ध्य रूप से मापा जाता है। न्यूरोइंफ्लेमेटरी परिवर्तनों की पूछताछ के लिए ब्याज के समय, जानवर को euthanized है, और मस्तिष्क निकाला जाता है। ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्रों को माइक्रोडिसेक्शन के माध्यम से अलग किया जाता है और फिर प्रोटीन निकालने के लिए झूठ बोला जाता है। लिसेट का उपयोग तब साइटोकाइन और फॉस्फो-प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ-साथ पश्चिमी धब्बा के ल्यूमिनेक्स मल्टीप्लेक्स किए गए इम्युनोएसेस दोनों के लिए किया जाता है। अंत में, इस समग्र डेटासेट को आंशिक रूप से कम से कम वर्ग प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करके एकीकृत किया जाता है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) द्वारा अनुमोदित हैं और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए NIH दिशानिर्देशों का पालन किया जाता है।

1. हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के वजन ड्रॉप मॉडल

  1. वजन-ड्रॉप सेटअप तैयार करें। एक 1 मीटर गाइड ट्यूब (2.54 सेमी आंतरिक व्यास) लंबवत रूप से संरेखित (एक स्तर का उपयोग करके जांच) के साथ एक सपाट सतह पर एक विज़ माउंट करें। प्रभाव के लिए 54 ग्राम बोल्ट (0.95 सेमी मूल शरीर व्यास, 2 सेमी सिर व्यास, 10.2 सेमी लंबाई) का उपयोग करें।
  2. संक्षेप में माउस anesthetize. 45 सेकंड के लिए 100% ऑक्सीजन में 4.5% आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को प्रेरित करें। एक पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई की पुष्टि करें।
  3. चोट को प्रेरित करना।
    1. तेजी से संज्ञाहरण से माउस को हटा दें और माउस को एक पतली झिल्ली (11.2 सेमी x 21.3 सेमी ऊतक) के केंद्र पर रखें।
    2. केंद्र पर माउस प्रवण के साथ ऊतक को तना हुआ रखने के लिए दोनों हाथों का उपयोग करें। माउस की पूंछ को अंगूठे के नीचे सुरक्षित करें। गाइड ट्यूब (चित्रा 2) के नीचे माउस सिर की स्थिति।
    3. माउस के सिर के पृष्ठीय पहलू पर गाइड ट्यूब के शीर्ष से बोल्ट को छोड़ दें, आंखों के पीछे और कानों के सामने के बीच प्रभाव के लिए लक्ष्य। प्रभाव पर, माउस ऊतक में प्रवेश करेगा, जिससे गर्दन के बारे में सिर के तेजी से त्वरण की अनुमति मिलती है (चित्रा 2)।
  4. वसूली
    1. प्रभाव के बाद, माउस को कमरे की हवा में 37 डिग्री सेल्सियस वार्मिंग पैड पर रखें। 1 ज पोस्ट-चोट के लिए वसूली की निगरानी करें। 1 घंटे के भीतर, चूहों को सामान्य रूप से एम्बुलेट करने, भोजन और पानी खोजने में सक्षम होना चाहिए, और सकल मोटर घाटे को प्रदर्शित नहीं करना चाहिए।
      नोट: एनाल्जेसिया का उपयोग संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के अनुसार नहीं किया जाता है, जो ब्याज के मापदंडों (यानी, सेरेब्रल रक्त प्रवाह, सूजन के मार्करों) पर एनाल्जेसिया के भ्रमित प्रभाव के कारण उचित है। चेतना की हानि, एनेस्थीसिया से हटाने से लेकर राइटिंग रिफ्लेक्स को पुनः प्राप्त करने के समय के रूप में परिभाषित किया गया है, की उम्मीद की जाती है और आमतौर पर 20 सेकंड से 3 मिनट तक रहता है (पूरक तालिका 1)। एपनिया और / या जब्ती जैसी गतिविधि के संक्षिप्त (<30 एस) एपिसोड देखे जा सकते हैं, खासकर दोहराए जाने वाले सिर की चोटों के बाद एक बार-दैनिक।
  5. आवश्यकतानुसार दोहराएं। इस चोट को एक बार-दैनिक, साप्ताहिक या मासिक रूप से दोहराया जा सकता है। चोटों की संख्या और अंतराल वांछित चोट गंभीरता पर निर्भर करता है। आमतौर पर, हम स्थानिक सीखने और स्मृति में मजबूत घाटे को प्रेरित करने के लिए दैनिक रूप से एक बार पांच हिट को नियोजित करते हैं।
    नोट: पूर्व अध्ययनों से पता चला है कि पांच हिट एक बार-दैनिक स्थान पर स्थानिक सीखने और स्मृति में घाटे को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है जो 1 वर्ष से अधिक समय तक चलने वाली चोट के बाद बिना एडिमा, रक्तस्राव, या मस्तिष्क को संरचनात्मक चोटके बिना 19। चूहों को निर्जलीकरण, मोटर घाटे और भूख की हानि के संकेतों के लिए दैनिक रूप से तौला जाता है और बारीकी से निगरानी की जाती है। यदि निर्जलित किया जाता है, तो चूहों को नम चाउ और दैनिक रूप से एक बार खारा के 1 एमएल का चमड़े के नीचे इंजेक्शन दिया जाता है। अनावश्यक पीड़ा को रोकने और एक मानवीय समापन बिंदु सुनिश्चित करने के लिए, चूहों को euthanized किया जाता है यदि: निर्जलीकरण बनी रहती है या खराब हो जाती है >24 ज पोस्ट-चमड़े के नीचे खारा उपचार, शरीर का वजन पूर्व-चोट बेसलाइन से 20% से अधिक कम हो जाता है, मोटर घाटे जैसे चक्कर या पंजा-खींचना दिखाई देते हैं और चोट के बाद >1 घंटे तक बने रहते हैं।

2. फैलाना सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ सेरेब्रल रक्त प्रवाह का आकलन

  1. DCS डेटा अधिग्रहण
    1. खोपड़ी पर बालों को हटा दें। क्योंकि डीसीएस बालों की अनुपस्थिति में सबसे अच्छा काम करता है, प्रयोगों की शुरुआत से पहले सिर पर फर को हटाना आवश्यक है। आमतौर पर, अध्ययन की शुरुआत से 1-3 दिन पहले बालों को हटाने का काम किया जाता है।
      1. 45 सेकंड के लिए 100% ऑक्सीजन में 4.5% आइसोफ्लुरेन के साथ चूहों को प्रेरित करें और 100% ऑक्सीजन में 1-2% आइसोफ्लुरेन के साथ बनाए रखें।
      2. आंखों और कानों के बीच सिर को शेव करें। फिर, सिर पर फर को हटाने के लिए डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग करें जैसा कि चित्र 3 में है।
      3. जानवर को वार्मिंग पैड पर संज्ञाहरण से ठीक होने की अनुमति दें और फिर पिंजरे में लौटें।
    2. DCS के साथ सेरेब्रल रक्त प्रवाह को मापें। माप के दौरान गति कलाकृतियों को कम करने के लिए, संक्षिप्त आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण के तहत चूहों का अध्ययन करें।
      नोट: नेत्रहीन निगरानी श्वसन और पैर की अंगुली माप भर में चुटकी प्रतिक्रिया और isoflurane एकाग्रता समायोजित के रूप में संज्ञाहरण की लगातार गहराई सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है. संज्ञाहरण की गहराई में महत्वपूर्ण भिन्नताएं रक्त प्रवाह को बदल सकती हैं, जो आइसोफ्लुरेन25 के ज्ञात वासोमोड्यूलेटरी प्रभावों को देखते हुए होती हैं।
      1. 45 सेकंड के लिए 100% ऑक्सीजन में 4.5% आइसोफ्लुरेन के साथ प्रेरित करें, और फिर 100% ऑक्सीजन में 1.0-1.75% आइसोफ्लुरेन के साथ बनाए रखें। पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया और सामान्य श्वसन (प्रति मिनट ~ 60-80 सांस के बीच) की अनुपस्थिति से संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई की पुष्टि करें।
      2. स्थिरीकरण की 2 मिनट की अवधि के बाद, धीरे से डीसीएस सेंसर को दाएं गोलार्ध पर आराम दें जैसे कि ऑप्टिकल सेंसर का शीर्ष किनारा आंख के पीछे और सेंसर के किनारे के साथ लाइनों को मध्यरेखा (चित्रा 3) के साथ लाइनों के साथ लाइनों। कमरे की रोशनी से ढालने के लिए सेंसर पर एक हाथ कप। डेटा के 5 सेकंड प्राप्त करें (1 हर्ट्ज अधिग्रहण)।
      3. बाएं गोलार्ध पर सेंसर को पुनर्स्थापित करें, और 5 सेकंड का डेटा प्राप्त करें।
      4. ऊतक सतह के नीचे स्थानीय विषमताओं के लिए खाते के लिए 3 बार / गोलार्ध को दोहराएं।
    3. वसूली
      1. संज्ञाहरण से माउस निकालें और एक वार्मिंग पैड पर जगह।
      2. माउस अपने राइटिंग रिफ्लेक्स को फिर से हासिल करने के बाद इसे पिंजरे में वापस कर देता है।
  2. DCS डेटा विश्लेषण
    1. प्रारंभिक गुणवत्ता नियंत्रण निष्पादित करें। डीसीएस डेटा के प्रत्येक फ्रेम में एक मापा सामान्यीकृत तीव्रता ऑटोकोरिलेशन फ़ंक्शन, Equation 110 (चित्रा 4 ए), और फोटॉन गिनती दर (kHz) शामिल है।
      1. महत्वपूर्ण गति विरूपण साक्ष्य के साथ डेटा फ्रेम को हटाने के लिए, डेटा फ़्रेम को छोड़ दें जिसके लिए वक्र की पूंछ का Equation 110 औसत मान (यानी, Equation 111) 1.005 > है।
      2. खराब सिग्नल-टू-शोर अनुपात वाले डेटा फ़्रेम को हटाने के लिए, यदि पता लगाया गया फोटॉन गणना दर 20 kHz < है, तो डेटा फ़्रेम को छोड़ दें.
    2. सेरेब्रल रक्त प्रवाह सूचकांक निकालें। Matlab में fminsearch का उपयोग कर,प्रत्येक मैं CBFi (i) के लिए मापा डेटा फ्रेम Equation 112 फिट. के लिए Equation 113फिट बैठता है, और CBFi का मान ढूँढें जो निम्न लागत फ़ंक्शन को कम करता है:
      Equation 114
      जहां योग सभी मापा देरी समयEquation 115 से अधिक है, और Equation 116 सहसंबंध प्रसार समीकरण (चित्रा 4 बी) का अर्ध-अनंत सजातीय समाधान है:
      Equation 117
      यहाँ β एक सुसंगतता कारक है जो प्रयोगात्मक सेट अप द्वारा निर्धारित किया जाता है, Equation 7, Equation 8, Equation 9Equation 10, , Equation111.4 के अपवर्तन के एक ग्रहण किए गए ऊतक सूचकांक के लिए आरएफएफ = 0.493, π 6 मिमी है, और μए और μ ऊतक के अवशोषण और कम प्रकीर्णन गुणांक हैं (क्रमशः 0.25 और 9.4 / सेमी माना जाता है, क्रमशः10,26,27)।
      नोट: क्योंकि β समय के साथ ~ 10% भिन्न हो सकते हैं, β और CBFi के लिए प्रत्येक डेटा फ्रेम को एक साथ फिट करें।
    3. द्वितीयक गुणवत्ता नियंत्रण निष्पादित करें. प्रत्येक पुनरावृत्ति के भीतर (जिसमें 5 डेटा फ्रेम होते हैं), बाहरी लोगों को छोड़ दें। Outliers उन CBFi मानों के रूप में परिभाषित कर रहे हैं कि उस पुनरावृत्ति के लिए मतलब CBFi के 1.5 मानक विचलन के बाहर गिर जाते हैं. यदि 1 से अधिक डेटा बिंदु को एक बाहरी के रूप में पहचाना जाता है, तो संपूर्ण पुनरावृत्ति को छोड़ दें।
    4. औसत सेरेब्रल रक्त प्रवाह सूचकांक का अनुमान लगाएं: सभी पुनरावृत्तियों के लिए सभी डेटा फ्रेम में माध्य लेकर प्रति गोलार्ध औसत सीबीएफi का अनुमान लगाएं (चित्रा 4 सी)। यदि कोई महत्वपूर्ण अर्धगोलाकार अंतर नहीं देखा जाता है, तो औसत वैश्विक सीबीएफi का अनुमान प्राप्त करने के लिए गोलार्धों में औसत।

3. luminex assays का उपयोग कर साइटोकिन्स और फॉस्फो-प्रोटीन के मल्टीप्लेक्स परिमाणीकरण

  1. ऊतक निष्कर्षण
    नोट: ल्यूमिनेक्स का उपयोग करके मस्तिष्क साइटोकिन्स और फॉस्फो-सिग्नलिंग प्रोटीन के परिमाणीकरण के लिए ऊतक निष्कर्षण की आवश्यकता होती है।
    1. 1-2 मिनट के लिए 100% ऑक्सीजन में 4.5% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके माउस को बेहोश करें। एक पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया की कमी के माध्यम से संज्ञाहरण के गहरे विमान के लिए जाँच करें। decapitation के माध्यम से Euthanize.
    2. ऊतक की कटाई करें।
      1. मस्तिष्क को हटा दें। आमतौर पर, हिस्टोलॉजी के लिए बाएं गोलार्ध को ठीक करें और कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस के भीतर दाएं गोलार्ध से कई क्षेत्रों को माइक्रोडिस्केक्ट करें (चित्रा 5)।
      2. माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में विच्छेदित नमूने रखें, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज। फ्रीज-संवेदनशील प्रोटीन के विश्लेषण के लिए, बाद में फ्रीज-पिघलने से बचने के लिए फ्लैश फ्रीजिंग से पहले ऊतक वर्गों को उप-विभाजित करना इष्टतम है।
        नोट: प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है, और ऊतक के नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि नमूने को लाइस करने के लिए तैयार न हो। वैकल्पिक रूप से, नमूनों को झूठ बोला जा सकता है, और फिर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. Lyse नमूने.
      1. lysis बफर के लिए प्रोटीज अवरोधक और 2 mM phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड जोड़कर लाइसिस बफर तैयार करें।
      2. पशु ऊतक के लगभग 3 μg प्रति मिश्रित lysis बफर के 150 μL जोड़ें। संदर्भ के लिए, माउस दृश्य प्रांतस्था ऊतक के नमूने लगभग 3 μg हैं।
      3. ऊतक homogenize करने के लिए, यंत्रवत् ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ऊतक triturate ~ 15-20 बार एक 1000 μL पिपेट का उपयोग कर. इष्टतम नमूना trituration के लिए, एक homogenizer pestle का उपयोग किया जा सकता है।
      4. नमूना ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक रोटेटर पर रखें।
      5. लगभग 15,000 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें, और supernatant इकट्ठा करें। नमूनों को तुरंत संसाधित किया जा सकता है या आगे के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
        नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए नमूना लिसेट पश्चिमी धब्बा के साथ संगत हैं, जिसमें से फागोसाइट / माइक्रोग्लियल मार्कर Iba1 और / या एस्ट्रोसाइट सक्रियण मार्कर GFAP का विश्लेषण न्यूरोइंफ्लेमेशन अध्ययनों के लिए साइटोकाइन और फॉस्फो-प्रोटीन विश्लेषण के पूरक के लिए किया जा सकता है।
  2. साइटोकिन्स और फॉस्फो-प्रोटीन के लिए मल्टीप्लेक्स इम्यूनो-परख प्रोटोकॉल
    नोट: हालांकि समग्र रूप से समान, साइटोकाइन और फॉस्फो-प्रोटीन किट के लिए प्रोटोकॉल में कुछ मामूली अंतर हैं। प्रत्येक चरण में अंतर नोट किए जाते हैं। Luminex परख के लिए नमूने तैयार करने के लिए कदम नीचे उल्लिखित हैं.
    1. अभिकर्मकों की तैयारी (दिन 1, साइटोकिन्स और फॉस्फो-प्रोटीन के लिए समान)
      1. अभिकर्मकों को कमरे के तापमान (~ 30 मिनट) पर गर्म करने की अनुमति दें।
      2. Sonicate मल्टीप्लेक्स चुंबकीय मोतियों की बोतल 30 सेकंड के लिए भंवर के 1 मिनट के बाद. सुनिश्चित करें कि मल्टीप्लेक्स चुंबकीय मोतियों को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से संरक्षित किया जाता है या प्रदान की गई हल्की सुरक्षात्मक बोतलों का उपयोग किया जाता है।
      3. 1xPBS में 0.1% Tween20 मिश्रण द्वारा धोने बफर तैयार करें या वैकल्पिक रूप से किट में प्रदान किए गए वॉश बफर का उपयोग करें।
    2. lysed ऊतक के नमूनों की तैयारी (दिन 1, साइटोकिन्स और फॉस्फो-प्रोटीन के लिए समान)
      1. यदि पहले जमे हुए हैं, तो फ्रीजर से लिस किए गए ऊतकों के नमूनों को हटा दें और बर्फ (~ 20 मिनट) पर पिघलने की अनुमति दें। अवक्षेप को हटाने के लिए 9,167 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज नमूने।
      2. रैखिक सीमा विश्लेषण द्वारा निर्धारित इष्टतम प्रोटीन एकाग्रता पर नमूने के 25 μL तैयार करें (अनुभाग 3.3 देखें)। सभी नमूनों के लिए कुल मात्रा को सामान्य करने के लिए, किट में प्रदान की गई परख बफर में पतला नमूने।
    3. 96 अच्छी तरह से प्लेट की तैयारी (दिन 1, साइटोकिन्स और फॉस्फो-प्रोटीन के लिए समान)
      1. किट में शामिल 96 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करें या एक पतली तल (जैसे, ब्रांड टेक) के साथ एक।
      2. प्रत्येक अच्छी तरह से धोने बफर (या 1x PBS, 0.1% Tween) के 200 μL जोड़ें और 750 rpm पर 10 मिनट के लिए प्लेट शेकर पर मिश्रण।
      3. Decant बफर धोने और अवशेषों को हटाने के लिए एक कागज तौलिया पर प्लेट नल.
    4. साइटोकिन्स के लिए Immunoassay प्रक्रिया (दिन 1)
      1. क्रम में प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए निम्नलिखित जोड़ें।
        1. सभी कुओं के लिए परख बफर के 25 μL जोड़ें.
          1. अतिरिक्त परख बफर के 25 μL जोड़ें केवल पृष्ठभूमि कुओं के लिए. प्रत्येक प्रयोगात्मक रन के लिए, कम से कम दो पृष्ठभूमि कुओं है। पृष्ठभूमि कुओं में कोई नमूना लोड नहीं है और नमूने के बिना उपकरण द्वारा पढ़ी गई फ्लोरोसेंट तीव्रता को परिभाषित करता है।
          2. इसी नमूना कुओं के लिए प्रत्येक पतला नमूना के 25 μL जोड़ें।
          3. सभी कुओं में 1x मल्टीप्लेक्स चुंबकीय मोतियों के 25 μL जोड़ें (चित्र6)। कुओं में जोड़ने से पहले 1 मिनट के लिए भंवर मोती सुनिश्चित करें।
      2. प्लेट सीलर के साथ प्लेट सील और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट को कवर। 2-8 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (12-16 ज) इनक्यूबेट करें।
    5. साइटोकिन्स के लिए immunoassay प्रक्रिया (दिन 2)
      1. चुंबकीय विभाजक पर 96 अच्छी तरह से प्लेट रखें, यह सुनिश्चित करें कि कुओं को मैग्नेट के साथ संरेखित किया गया है। 2 मिनट के लिए बैठते हैं। अच्छी तरह से सामग्री decant जबकि प्लेट अभी भी चुंबकीय विभाजक से जुड़ा हुआ है.
      2. निम्नलिखित चरणों का उपयोग करके प्लेट को 2 बार धोएं।
        1. प्रत्येक अच्छी तरह से धोने बफर के 200 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए शेकर पर जगह।
        2. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक पर अच्छी तरह से प्लेट रखें।
        3. अच्छी तरह से सामग्री decant जबकि अच्छी तरह से प्लेट अभी भी चुंबकीय विभाजक से जुड़ा हुआ है.
      3. अच्छी तरह से प्रति पता लगाने एंटीबॉडी के 25 μL जोड़ें (चित्रा 6). पन्नी के साथ कवर. कमरे के तापमान पर एक प्लेट शेकर (750 आरपीएम) पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      4. में पता लगाने एंटीबॉडी छोड़ दो और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-phycoerythrin (SAPE) के 25 μL जोड़ें (चित्रा 6). पन्नी के साथ कवर. कमरे के तापमान पर प्लेट शेकर (750 आरपीएम) पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      5. एक चुंबकीय विभाजक पर अच्छी तरह से प्लेट रखें और 2 मिनट के लिए बैठने दें। Decant अच्छी तरह से सामग्री और चुंबकीय विभाजक से अलग.
      6. दो बार अच्छी तरह से प्लेट धोएं (चरण 3.2.5.2 देखें)।
      7. Luminex ड्राइव तरल पदार्थ के 75 μL जोड़ें (यदि MAGPIX साधन का उपयोग कर) प्रत्येक अच्छी तरह से या परख बफर के लिए (यदि 200 या FlexMap 3 डी साधन का उपयोग कर). कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए प्लेट शेकर पर मोतियों को फिर से निलंबित करें।
      8. Luminex साधन (MAGPIX, 200, या FlexMap 3D) पर पढ़ें, उचित संचालन के लिए उपयोगकर्ता के मैनुअल का उल्लेख करते हुए (चित्रा 6)।
    6. फॉस्फो-प्रोटीन के लिए immunoassay प्रक्रिया (दिन 1)
      1. क्रम में प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए निम्नलिखित जोड़ें।
        1. सभी कुओं के लिए परख बफर के 25 μL जोड़ें.
          1. अतिरिक्त परख बफर के 25 μL जोड़ें केवल पृष्ठभूमि कुओं के लिए. प्रत्येक प्रयोगात्मक रन के लिए, कम से कम दो पृष्ठभूमि कुओं की सिफारिश की जाती है। पृष्ठभूमि कुओं में कोई नमूना लोड नहीं है और नमूने के बिना उपकरण द्वारा पढ़ी गई फ्लोरोसेंट तीव्रता को परिभाषित करता है।
          2. प्रत्येक नमूने को अच्छी तरह से प्रत्येक पतला नमूने के 25 μL जोड़ें।
          3. सभी कुओं में 1x मल्टीप्लेक्स चुंबकीय मोतियों के 25 μL जोड़ें (चित्र6)।
            नोट: Luminex परख किट 20x स्टॉक समाधान में मल्टीप्लेक्स चुंबकीय मनका प्रदान करता है. 2 मिनट के लिए 20x स्टॉक मल्टीप्लेक्स चुंबकीय मनका समाधान भंवर करने के लिए सुनिश्चित करें, और फिर इसे 1x समाधान के लिए परख बफर में पतला। भंवर 1x मल्टीप्लेक्स चुंबकीय मनका निलंबन कुओं में जोड़ने से पहले 1 मिनट के लिए।
        2. प्लेट सीलर के साथ प्लेट सील और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट को कवर। 2-8 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (12-16 घंटे) इनक्यूबेट करें।
    7. फॉस्फो-प्रोटीन के लिए इम्यूनोएसे प्रक्रिया (दिन 2)
      1. एक चुंबकीय विभाजक पर अच्छी तरह से प्लेट रखें, यह सुनिश्चित करें कि अच्छी तरह से प्लेट पूरी तरह से चुंबकीय विभाजक के साथ संरेखित है। 2 मिनट के लिए बैठते हैं। अच्छी तरह से सामग्री decant जबकि अच्छी तरह से प्लेट अभी भी चुंबकीय विभाजक से जुड़ा हुआ है.
      2. प्लेट को 2 बार धोएं (साइटोकाइन के इम्यूनोएसे प्रक्रिया दिन 2 में चरण बी देखें)।
      3. परख बफर में 1x समाधान के लिए 20x स्टॉक का पता लगाने एंटीबॉडी पतला. अच्छी तरह से प्रति 1x का पता लगाने एंटीबॉडी के 25 μL जोड़ें (चित्रा 6). पन्नी के साथ कवर. कमरे के तापमान पर प्लेट शेकर (750 आरपीएम) पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      4. चुंबकीय विभाजक पर 96 अच्छी तरह से प्लेट रखें, और 2 मिनट के लिए बैठने दें। Decant अच्छी तरह से सामग्री, चुंबकीय विभाजक से अलग.
      5. 1x बफर करने के लिए परख बफर में 25x स्टॉक SAPE पतला. 1x SAPE (चित्र6) के 25 μL जोड़ें। पन्नी के साथ कवर और कमरे के तापमान पर प्लेट शेकर (750 आरपीएम) पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      6. SAPE को कुओं में छोड़ दें, और प्रत्येक अच्छी तरह से प्रवर्धन बफर के 25 μL जोड़ें। पन्नी के साथ कवर.
      7. कमरे के तापमान पर प्लेट शेकर (750 आरपीएम) पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      8. 2 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक पर अच्छी तरह से प्लेट रखें। Decant अच्छी तरह से सामग्री और चुंबकीय विभाजक से अलग.
      9. Luminex ड्राइव तरल पदार्थ के 75 μL जोड़ें (यदि MAGPIX साधन का उपयोग कर) या परख बफर (यदि 200 या FlexMap 3 डी साधन का उपयोग कर). कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक प्लेट शेकर पर मोतियों को फिर से निलंबित करें।
      10. Luminex साधन (MAGPIX, 200, या FlexMap 3D) पर पढ़ें, उचित संचालन के लिए उपयोगकर्ता के मैनुअल का उल्लेख करते हुए (चित्रा 6)।
  3. नमूना तनुकरण वक्र की रैखिकता
    1. नमूनों की तैयारी: कुल प्रोटीन की विभिन्न एकाग्रता के साथ क्रमिक रूप से पतला परीक्षण नमूने। थोक मस्तिष्क के ऊतकों के लिए, साइटोकिन्स के लिए 0-25 μg और फॉस्फो-प्रोटीन के लिए 0-12 μg से लोड सीरियल dilutions। कुल प्रोटीन एकाग्रता bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख का उपयोग कर मापा जा सकता है.
    2. मल्टीप्लेक्स immunoassay: चयनित नमूनों पर Luminex परख (अनुभाग 3.2 देखें) प्रदर्शन.
    3. डेटा विश्लेषण
      1. प्रत्येक प्रोटीन बनाम लोड किए गए प्रोटीन की मात्रा के लिए प्लॉट फ्लोरोसेंट तीव्रता (चित्रा 7)।
      2. प्रत्येक विश्लेषक के लिए, लोड किए गए कुल प्रोटीन की सीमा की पहचान करें जिसके लिए कुल प्रोटीन और फ्लोरोसेंट तीव्रता रीडआउट के बीच संबंध रैखिक है (चित्रा 7)।
      3. कुल प्रोटीन की मात्रा है कि पूर्ण परख चलाने के लिए लोड किया जाना चाहिए निर्धारित करने के लिए, प्रत्येक विश्लेषक के लिए वक्र के रैखिक भाग की पहचान करें और फिर एक प्रोटीन एकाग्रता है कि analytes के बहुमत के लिए रैखिक सीमा के भीतर आता है का चयन करें.
        नोट:: यद्यपि अधिकांश प्रोटीन एक समान रैखिक श्रेणी साझा करते हैं, रैखिक श्रेणियाँ सभी प्रोटीनों के लिए ओवरलैप नहीं हो सकता है। यदि यह मामला है, तो प्रत्येक नमूने को कई बार कुल प्रोटीन लोड किए गए प्रोटीन की अलग-अलग मात्रा के साथ चलाने के लिए आवश्यक हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, nonlinear नमूनों को विश्लेषण से बाहर छोड़ दिया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, कुछ प्रोटीनों में रैखिक सीमा नहीं हो सकती है।

4. आंशिक कम से कम वर्गों प्रतिगमन

नोट:: नमूना R कोड और एक नमूना डेटा स्प्रेडशीट आंशिक कम से कम वर्ग विश्लेषण करने के लिए प्रदान किए जाते हैं।

  1. डेटा तैयारी: प्रदान किए गए नमूना डेटा स्प्रेडशीट, "MyData" में दिखाए गए अनुसार डेटा स्वरूपित करें. पंक्ति 1 में चर नाम, स्तंभ A में नमूना नाम, स्तंभ B में प्रतिक्रिया चर, और स्तंभ C+ में सभी भविष्यवक्ता चर शामिल करें. पृष्ठभूमि डेटा के साथ अंतिम दो पंक्तियों को भरें, और दोनों नमूना नामों को "पृष्ठभूमि" पर सेट करें.
  2. आंशिक कम से कम वर्गों RStudio में प्रतिगमन
    1. www.r-project.org (मुक्त, खुला स्रोत) से आर स्थापित करें।
    2. www.rstudio.com (मुक्त, खुला स्रोत लाइसेंस) से RStudio डेस्कटॉप स्थापित करें।
    3. इस प्रकाशन के साथ प्रदान किए गए नमूना R कोड को डाउनलोड करें, "PLSR_Sample_Code.R" और इसे उसी फ़ोल्डर में सहेजें जिसमें डेटा स्प्रेडशीट है। RStudio में कोड फ़ाइल खोलें।
    4. उपयोगकर्ता इनपुट अनुभाग में, डेटा स्प्रेडशीट के नाम के लिए "dataFileName" परिवर्तित करें।
    5. चलाने के लिए कोड के अनुभाग को हाइलाइट करके और स्क्रिप्ट के ऊपरी दाएँ कोने में चलाएँ क्लिक करके निम्न चरणों को पूरा करें।
      1. आवश्यक R पैकेज, फ़ंक्शंस, कार्यशील निर्देशिका पता, और RStudio में उपयोगकर्ता इनपुट मान लोड करें (उपखंड "प्रारंभिक").
      2. RStudio में डेटा लोड करें और सभी मापों से माध्य पृष्ठभूमि संकेत को घटाकर प्रसंस्करण के लिए कच्चा डेटा तैयार करें और प्रत्येक विश्लेषक को जेड-स्कोरिंग करें (उपधारा "डेटा पढ़ें और पृष्ठभूमि घटाएं") (चित्रा 8 ए)।
      3. PlsRglm पैकेज v1.2.528 व्यापक R संग्रह नेटवर्क (CRAN) पर उपलब्ध का उपयोग कर RStudio में आंशिक कम से कम वर्ग प्रतिगमन निष्पादित करें। एक varimax रोटेशन (आँकड़े पैकेज v3.6.2)23 LV1-LV2 विमान में एक नया क्षैतिज अक्ष है कि सबसे अच्छा प्रतिक्रिया चर (उपखंड "PLS") (चित्रा 8B) द्वारा नमूने अलग की पहचान करने के लिए प्रदर्शन करें।
      4. एक Leave One Out Cross Validation (LOOCV) का संचालन करें जिसमें एक नमूना पुनरावर्ती रूप से डेटा से बाहर छोड़ दिया जाता है और PLSR मॉडल को फिर से परिकलित किया जाता है। सभी LOOCV रन (उपधारा "LOOCV") में विश्लेषक लोडिंग के लिए मानक विचलन की गणना करें।
  3. प्रतिनिधि भूखंड बनाएँ: प्रतिनिधि भूखंडों को बनाने के लिए ऊपर विस्तृत के रूप में प्रदान किए गए नमूना कोड को चलाएं जो स्वचालित रूप से काम करने वाली निर्देशिका (डेटा और कोड फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर) को पीडीएफ फाइलों के रूप में निर्यात करते हैं।
    1. संसाधित डेटा का एक हीट मैप बनाएँ जैसा कि चित्र 8A (उपधारा "PLS") में दिखाया गया है। रंग z-स्कोर द्वारा परिभाषित एक स्पेक्ट्रम के साथ प्रत्येक प्रविष्टि. ब्याज के अव्यक्त चर में परिकलित क्रम के अनुसार analytes सॉर्ट करें।
    2. क्षैतिज अक्ष के साथ प्लॉट किए गए LV1 स्कोर और ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ प्लॉट किए गए LV2 स्कोर के साथ एक स्कोर प्लॉट बनाएं, जैसा कि चित्र 8B (उपखंड "PLS") में दिखाया गया है। प्रत्येक अव्यक्त चर और प्रतिक्रिया चर के बीच संबंधों की कल्पना करने के लिए प्रत्येक डेटा बिंदु को इसकी प्रतिक्रिया चर माप के अनुसार रंग दें।
    3. अपने भविष्यवक्ता चर में से प्रत्येक के लिए लोडिंग प्रदर्शित करने वाला एक बार प्लॉट बनाएँ ताकि यह कल्पना की जा सके कि प्रत्येक विश्लेषक अव्यक्त चर में कैसे योगदान देता है, जैसा कि चित्र 8 C (उपधारा "LOOCV") में दिखाया गया है।
    4. अपने प्रतिक्रिया चर के खिलाफ LV1 स्कोर को वापस करने वाला एक प्लॉट बनाएँ ताकि यह कल्पना की जा सके कि PLSR मॉडल नमूनों को कितनी अच्छी तरह से अलग करता है, जैसा कि चित्रा 8D (उपधारा "PLS") में दिखाया गया है।

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Representative Results

पहले एकत्र किए गए डेटा को पहले के काम से लिया गया था जिसमें आठ C57BL / 6 चूहों के एक समूह को तीन बंद सिर की चोटों (चित्रा 2) के अधीन किया गया था, जो एक बार दैनिक11 में थे। इस काम में, सेरेब्रल रक्त प्रवाह को अंतिम चोट के बाद 4 घंटे के सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ मापा गया था (चित्रा 3, चित्रा 4)। चोट के बाद सीबीएफ मूल्यांकन के बाद, जानवरों को euthanized किया गया था, और मस्तिष्क के ऊतकों को साइटोकिन्स और फॉस्फो-प्रोटीन के परिमाणीकरण के लिए निकाला गया था immunoassay (चित्रा 5)। हमने पश्चिमी धब्बा (11 में वर्णित तरीकों) के माध्यम से फागोसाइट / माइक्रोग्लियल सक्रियण मार्करIba1 को भी परिमाणित किया। प्रत्येक माउस से मस्तिष्क के ऊतकों को झूठ बोला गया था, और कुल प्रोटीन एकाग्रता को बीसीए परख का उपयोग करके मापा गया था। मल्टीप्लेक्स साइटोकाइन परिमाणीकरण को मिलीप्लेक्स एमएपी माउस साइटोकाइन / केमोकाइन 32-प्लेक्स का उपयोग करके आयोजित किया गया था, जिसे ल्यूमिनेक्स मैगपिक्स सिस्टम (चित्रा 6) का उपयोग करके पढ़ा गया था। सभी नमूनों से डेटा एकत्र करने से पहले एक उपयुक्त प्रोटीन लोडिंग (12.5 μL प्रति 12.5 μL lysate) (चित्रा 7) निर्धारित करने के लिए एक रैखिक रेंज विश्लेषण आयोजित किया गया था।

साइटोकाइन डेटा को नमूना डेटा से पृष्ठभूमि माप को घटाकर विश्लेषण के लिए तैयार किया गया था, और फिर प्रत्येक विश्लेषक (चित्रा 8 ए) के लिए जेड-स्कोरिंग डेटा। जानवरों के बीच साइटोकाइन अभिव्यक्ति में अंतर की कल्पना करने के लिए जेड-स्कोर किए गए डेटा से एक हीटमैप उत्पन्न किया गया था। आंशिक कम से कम वर्ग प्रतिगमन (PLSR) phagocyte / microglial सक्रियण मार्कर Iba1 प्रतिक्रिया चर और predictor चर (चित्रा 8B) के रूप में साइटोकाइन माप के रूप में का उपयोग कर आयोजित किया गया था। Iba1 माप (चित्रा 8D) के साथ LV1 पर डेटा के सह-प्रसरण को अधिकतम करने के लिए एक varimax रोटेशन किया गया था। LV1 (चित्रा 8C) में उच्च लोडिंग वजन Iba1 की उच्च अभिव्यक्ति के साथ जुड़े साइटोकाइन अभिव्यक्ति के साथ मेल खाता है। Iba1 और साइटोकिन्स के बीच रैखिक प्रतिगमन से पता चलता है कि LV1 में सबसे बड़ी लोडिंग वजन वाले उन साइटोकिन्स भी सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थे (चित्रा 8E)।

Figure 1
चित्र 1: विशिष्ट वर्कफ़्लो. सबसे पहले, चूहों को एक वजन ड्रॉप बंद सिर की चोट से गुजरना पड़ता है, और फिर सेरेब्रल रक्त प्रवाह (सीबीएफ) को फैलाना सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके मापा जाता है। इसके बाद, दिमाग एकत्र किए जाते हैं, ब्याज के क्षेत्रों को सूक्ष्म-विच्छेदित किया जाता है और तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके स्नैप जमे हुए होते हैं। Luminex immunoassay के लिए तैयारी में, प्रोटीन lysed हैं, और कुल प्रोटीन एकाग्रता bicinchoninic एसिड परख द्वारा मापा जाता है। Lysates ब्याज के प्रोटीन के पश्चिमी धब्बे और साइटोकिन्स और फॉस्फो-प्रोटीन के लिए Luminex assays के लिए प्रयोग किया जाता है। CBF, पश्चिमी धब्बा, और Luminex से डेटा आंशिक कम से कम वर्ग प्रतिगमन (PLSR) का उपयोग कर एकीकृत कर रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के बंद सिर वजन ड्रॉप मॉडल। (ए) एनेस्थेटिक माउस को पूंछ द्वारा पकड़ा जाता है और एक गाइड ट्यूब के नीचे एक तना हुआ बलिदान झिल्ली पर रखा जाता है। एक 54 ग्राम वजन सिर के पृष्ठीय पहलू पर 1 मीटर से गिरा दिया जाता है। (बी) ~ 1 एमएस पोस्ट-प्रभाव के भीतर, माउस के सिर ने गर्दन के बारे में तेजी से घुमाया है क्योंकि यह बलिदान झिल्ली के माध्यम से टूट जाता है। (सी) ~ 5 एमएस पोस्ट-प्रभाव के भीतर, पूरा माउस गिर गया है और इसकी समझ पूंछ से लटक रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: फैलाना सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा सेरेब्रल रक्त प्रवाह का मापन. (ए) एक ऑप्टिकल सेंसर को धीरे-धीरे मैन्युअल रूप से सही गोलार्ध पर मैन्युअल रूप से आयोजित किया जाता है ताकि एक एनेस्थेटिक माउस में रक्त प्रवाह को मापा जा सके। (बी) दाएं गोलार्ध पर प्रतिनिधि सेंसर प्लेसमेंट। सेंसर की रूपरेखा को एक धराशायी काले आयत के रूप में दर्शाया गया है, और स्रोत और डिटेक्टर फाइबर का स्थान क्रमशः लाल और नीले हलकों में है। सेंसर को इस तरह रखा गया है कि सेंसर का छोटा किनारा आंख के पीछे के साथ लाइनों और सेंसर के लंबे किनारे को मिडलाइन के साथ संरेखित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: फैलाना सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा विश्लेषण. (ए) प्रतिनिधि मापा तीव्रता autocorrelation घटता, जी2 (π), बेसलाइन पर, पूर्व चोट बेसलाइन (हरा) और 5 बंद सिर की चोटों के बाद 4 घंटे दैनिक (बैंगनी) एक बार जगह पर. पूर्व से पोस्ट-चोट तक वक्र में सही बदलाव रक्त प्रवाह में कमी को दर्शाता है। (बी) जीEquation (π) डेटा प्रति गोलार्ध 5 सेकंड के लिए 1 हर्ट्ज पर प्राप्त किया जाता है और 3x / गोलार्ध दोहराया जाता है। प्रत्येक मापा जीEquation (π) वक्र एक सेरेब्रल रक्त प्रवाह सूचकांक (CBFi) के लिए सहसंबंध प्रसार समीकरण के लिए अर्ध-अनंत समाधान के लिए फिट है। (सी) सीबीएफआई सभी फ्रेम और पुनरावृत्ति में मानों को प्रत्येक गोलार्ध के लिए माध्य सेरेब्रल रक्त प्रवाह सूचकांक प्राप्त करने के लिए औसत किया जाता है (क्षैतिज काली पट्टी द्वारा दर्शाया जाता है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: माउस मस्तिष्क microdissection. (ए) माउस से मस्तिष्क निकालने के बाद, इसे धराशायी रेखा के साथ विभाजित किया जाता है। बाएं गोलार्ध को हिस्टोलॉजी के लिए तय किया गया है, और दाएं गोलार्ध को पैथोलॉजी के लिए माइक्रोडिस्केटेड किया गया है। (बी) दाएं गोलार्ध के प्रांतस्था का सैगिटल दृश्य। दाएँ गोलार्ध को इसी रंग-कोडित क्षेत्रों में माइक्रोडिस्केक्टेड किया जाता है। फ्रीज-संवेदनशील प्रोटीन के विश्लेषण के लिए, फ्लैश फ्रीजिंग से पहले ऊतक वर्गों को उप-विभाजित करना इष्टतम है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: Luminex प्रक्रिया का चित्रण. (ए) फ्लोरोसेंटली टैग किए गए मोतियों में नमूने जोड़ें। मोती ब्याज के प्रत्येक प्रोटीन के लिए एक विशिष्ट कैप्चर एंटीबॉडी के साथ पूर्व-लेपित होते हैं। (बी) बायोटिनिलेटेड डिटेक्शन एंटीबॉडी जोड़ें। बायोटिन-डिटेक्शन एंटीबॉडी ब्याज के एनालिस्ट से बंधते हैं और एक एंटीबॉडी-एंटीजन सैंडविच बनाते हैं। (C) phycoerythrin (PE)- संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन (SAPE) जोड़ें। SAPE biotinylated पता लगाने एंटीबॉडी के लिए बांधता है, प्रतिक्रिया को पूरा. फॉस्फो-प्रोटीन के लिए, एक प्रवर्धन बफर (केवल फॉस्फो-प्रोटीन assays के लिए) परख संकेत को बढ़ाने के लिए SAPE के अलावा के बाद जोड़ा जाता है। (डी) Luminex उपकरण (MAGPIX, 200, या FlexMap 3D) लाल / हरी रोशनी के संयोजन के माध्यम से प्रत्येक फ्लोरोसेंटली टैग किए गए मनका पर प्रतिक्रिया पढ़ता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 7: रैखिक सीमा की पहचान करने के लिए नमूना कमजोर पड़ने वक्र का चित्रण। ल्यूमिनेक्स परख से मापा फ्लोरोसेंट तीव्रता बनाम क्रमिक रूप से पतला नमूनों की प्रोटीन एकाग्रता। रैखिक सीमा को प्रोटीन एकाग्रता सीमा के रूप में परिभाषित किया गया है जिसके लिए प्रोटीन एकाग्रता और फ्लोरोसेंट तीव्रता के बीच संबंध रैखिक (तीर) है। कुछ analytes में, एक निश्चित सीमा से परे प्रोटीन एकाग्रता बढ़ाने एंटीबॉडी बाध्यकारी को कम कर सकते हैं जैसे कि कमजोर पड़ने वक्र गैर रैखिक या उलटा हो जाता है (हुक प्रभाव). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 8: प्रतिनिधि आंशिक कम से कम वर्ग प्रतिगमन (PLSR) विश्लेषण. (ए) पैनल साइटोकाइन प्रोटीन अभिव्यक्ति (बाएं कॉलम) 3xCHI चूहों (एन = 8, जेड-स्कोर्ड) में Iba1 अभिव्यक्ति (दाएं हाथ के कॉलम) के साथ। (बी) PLSR प्रत्येक अव्यक्त चर के लिए मापा साइटोकिन्स के लिए वजन (लोडिंग) असाइन करता है। प्रत्येक अव्यक्त चर पर प्रत्येक नमूने के लिए स्कोर की गणना करने के लिए मापे गए डेटा पर वजन लागू किए जाते हैं। (सी) आईबीए 1 के खिलाफ 3xCHI नमूनों के PLSR ने साइटोकिन्स, LV1 के भारित प्रोफ़ाइल की पहचान की, जिसने Iba1 द्वारा नमूनों को प्रतिष्ठित किया। नकारात्मक वजन वाले साइटोकिन्स को कम Iba1 वाले नमूनों में upregulated किया गया था, जबकि सकारात्मक वजन वाले साइटोकिन्स को उच्च Iba1 (LOOCV का उपयोग करके एसडी ± मतलब) के साथ नमूनों में upregulated किया गया था। (डी) Iba1 के खिलाफ प्रत्येक नमूने के लिए LV1 स्कोर का रैखिक प्रतिगमन। आर2पीएलएस Iba1 और LV1 के बीच फिट की अच्छाई को मापता है। (ई) सी में एलवी 1 में सबसे बड़े वजन के साथ साइटोकिन्स में से प्रत्येक के खिलाफ Iba1 के व्यक्तिगत प्रतिगमन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां हम दोहराए जाने वाले हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के लिए हेमोडायनामिक और न्यूरोइंफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया के आकलन के लिए विधियों का विस्तार करते हैं। इसके अलावा, हमने दिखाया है कि आंशिक कम से कम वर्ग प्रतिगमन का उपयोग करके एक बहुचर सिस्टम विश्लेषण के हिस्से के रूप में इन डेटा को कैसे एकीकृत किया जाए। नीचे दिए गए पाठ में हम प्रोटोकॉल से जुड़े कुछ प्रमुख चरणों और सीमाओं के साथ-साथ मौजूदा तरीकों पर विधियों के फायदे / नुकसान पर चर्चा करेंगे।

हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट का वजन-ड्रॉप मॉडल। दर्दनाक मस्तिष्क की चोट प्रेरण की यह विधि लाभप्रद है कि इसमें कुंद-प्रभाव की सुविधा होती है, जिसके बाद तेजी से पूर्वकाल-पीछे घूर्णी त्वरण आमतौर पर खेल से संबंधित सिर की चोटों में देखा जाताहै 10,19। निश्चित रूप से, lissencephalic माउस मस्तिष्क gyrocephalic मानव मस्तिष्क की जटिलता को पूरी तरह से recapitulate नहीं करता है; फिर भी, यह मॉडल मानव एमटीबीआई के एक ही नैदानिक और व्यवहारिक अनुक्रम के कई लोगों को प्रेरित करता है, जिसमें बार-बार चोटों के साथ स्थानिक सीखने और स्मृति में निरंतर कमी शामिल है। इसके अतिरिक्त, जबकि प्रभाव प्रकृति में हल्का है (कोई संरचनात्मक / न्यूरोनल क्षति नहीं, कोई रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता नहीं, संज्ञानात्मक घाटे केवल कई हिट के बाद उभरते हैं, आदि 19), यह मनुष्यों के विपरीत चेतना के महत्वपूर्ण नुकसान को प्रेरित करता है, जहां चेतना का नुकसान कम आम है। चेतना का यह बढ़ा हुआ नुकसान प्रभाव से तुरंत पहले दिए गए संज्ञाहरण के साथ बातचीत के कारण हो सकता है, हालांकि सटीक कारण अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। अंत में, हम ध्यान देते हैं कि गाइड ट्यूब को इस तरह से संरेखित करना कि कोरोनल और लैमडोइड टांके के बीच बोल्ट प्रभाव महत्वपूर्ण है। हमने देखा है कि प्रभाव जो अधिक पीछे होते हैं, वे महत्वपूर्ण मोटर घाटे का कारण बन सकते हैं जिन्हें इच्छामृत्यु की आवश्यकता होती है।

विसरित सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ सेरेब्रल रक्त प्रवाह का आकलन। मानव / बड़े पशु अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक तौर-तरीकों के साथ सेरेब्रल रक्त प्रवाह (सीबीएफ) के गैर-आक्रामक, अनुदैर्ध्य माप, जैसे कि परफ्यूजन चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग या ट्रांसक्रैनियल डॉपलर अल्ट्रासाउंड, छोटे मस्तिष्क के आकार और कुल रक्त की मात्रा29 सहित विभिन्न कारणों से चूहों में चुनौतीपूर्ण हैं। फैलाना सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी चूहों में अच्छी तरह से अनुकूल है और20,30 अन्य तरीकों की तुलना में noninvasive और अपेक्षाकृत सस्ती होने के अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है। क्योंकि डीसीएस गति कलाकृतियों के प्रति संवेदनशील है, चूहों को मूल्यांकन के लिए संक्षेप में एनेस्थेटिक या संयमित31 होने की आवश्यकता होती है। हम आमतौर पर अपने तेजी से प्रेरण और वसूली के कारण isoflurane संज्ञाहरण का उपयोग करते हैं; हालांकि, isoflurane एक सेरेब्रल वासोडिलेटर है, और isoflurane के तहत रक्त प्रवाह अनुमानों को सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए। रक्त प्रवाह में कमी को शाम-घायल जानवरों की तुलना में चोट के बाद देखा जाता है, जो कि आइसोफ्लुरेन के जवाब में वासोडिलेट के लिए घायल सेरेब्रल वास्कुलचर की विफलता से चकित हो सकता है। अंत में, हमने पहले चूहों में डीसीएस के साथ रक्त प्रवाह माप की उत्कृष्ट इंट्रा-उपयोगकर्ता पुनरावृत्ति का प्रदर्शन किया है, लेकिन केवल उचित इंट्रा-उपयोगकर्ता पुनरावृत्ति21। इस कारण से, हम अनुशंसा करते हैं कि एक ही ऑपरेटर उन प्रयोगों के लिए डीसीएस माप प्राप्त करता है जिनके लिए सेरेब्रल रक्त प्रवाह के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन की आवश्यकता होती है।

Luminex assays का उपयोग कर साइटोकिन्स और फॉस्फो-प्रोटीन के multiplexed परिमाणीकरण. किसी भी एलिसा के साथ एक प्रमुख चुनौती हुक प्रभाव है, जिससे प्रोटीन एकाग्रता में वृद्धि लक्ष्य प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी आत्मीयता को कम कर सकती है, इस प्रकार प्रोटीन32 (चित्रा 7) में वृद्धि के जवाब में परख संकेत में कमी आ सकती है। पूरे ऊतकों का विश्लेषण करते समय इस प्रभाव को बढ़ाया जा सकता है, जिसमें थोक प्रोटीन इसी तरह हस्तक्षेप कर सकते हैं। इस प्रकार, Luminex assays का उपयोग करने में पहला कदम यह निर्धारित करने के लिए है कि क्या प्रोटीन सांद्रता की एक श्रृंखला लोड की गई है जिसके लिए परख को रैखिक रूप से पढ़ा जाता है, प्रोटीन लोड की मात्रा के साथ भिन्न होता है। Analytes है कि इस तरह के एक रैखिक रेंज (चित्रा 7) नहीं है विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। हम यह भी ध्यान देते हैं कि मस्तिष्क में साइटोकाइन का स्तर आमतौर पर बहुत कम होता है और ल्यूमिनेक्स किट के साथ आपूर्ति किए गए मानक वक्रों के माध्यम से मूल्यांकन की गई निचली पहचान सीमा के पास दिखाई देता है। इस कारण से, यह निर्धारित करने के लिए रैखिक रेंजिंग विश्लेषण का संचालन करना आवश्यक है कि क्या साधन रीडआउट वास्तव में लोड किए गए नमूने की मात्रा को दर्शाता है। ब्याज के प्रमुख प्रोटीन के लिए, इस रैखिक रेंज विश्लेषण एक स्पाइक वसूली परख जिसमें पुनः संयोजक प्रोटीन एक नमूना में spiked है के साथ पूरक किया जा सकता है, और साधन पढ़ने में रैखिकता33 मूल्यांकन किया जाता है.

क्योंकि न्यूरोइन्फ्लेमेशन को विविध इंट्रासेल्युलर फॉस्फो-प्रोटीन और एक्स्ट्रासेल्युलर साइटोकिन्स द्वारा विनियमित किया जाता है, इसलिए एमटीबीआई के लिए मस्तिष्क की तंत्रिका प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने के लिए इन प्रोटीनों की एक विस्तृत सरणी को एक साथ मापना महत्वपूर्ण है। Luminex multiplexed immunoassays एक ही नमूने से साइटोकिन्स और फॉस्फो-प्रोटीन के दर्जनों के एक साथ परिमाणीकरण को सक्षम करते हैं, जो चोट के बाद ऊतक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक समग्र दृश्य प्रदान करते हैं। यद्यपि ये विश्लेषण साइटोकिन्स / केमोकाइन्स के साथ-साथ फॉस्फो-प्रोटीन का एक व्यापक दृश्य प्रदान करते हैं, परख ऊतक होमोजेनेट से प्रत्येक प्रोटीन की कुल मात्रा को निर्धारित करता है। इस प्रकार, यह सेल-प्रकार के विशिष्ट डेटा को उत्पन्न नहीं करता है। सेल-प्रकार की विशिष्टता को सेल प्रकारों के लिए मार्करों के साथ ब्याज के शीर्ष प्रोटीन के स्थानीयकरण की पहचान करने के लिए अनुवर्ती इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा निर्धारित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स, माइक्रोग्लिया, एस्ट्रोसाइट्स, आदि) ११ ।

डेटा एकीकरण के लिए आंशिक कम से कम वर्ग प्रतिगमन विश्लेषण। एमटीबीआई के लिए ऊतक प्रतिक्रिया मल्टीफैक्टोरियल है, जिसमें फागोसाइट / माइक्रोग्लियल सक्रियण मार्कर आईबीए 1, विविध साइटोकिन्स और फॉस्फो-प्रोटीन में परिवर्तन के साथ रक्त प्रवाह में शारीरिक परिवर्तन शामिल हैं, दूसरोंके बीच 11। एकत्र किए गए डेटा की बहुसंकेतित प्रकृति के कारण, विभिन्न भविष्यवक्ता चरों के बीच संबंधों की बहुआयामीता के लिए एक व्यवस्थित विधि की आवश्यकता होती है। PLSR LVs की पहचान करके इस समस्या का एक उपयुक्त समाधान प्रदान करता है जो अधिकतम रूप से भविष्यवक्ता चर और परिणाम चर (उदाहरण के लिए, चित्रा 8 में Iba1) के बीच सह-विचरण की पहचान करता है। महत्वपूर्ण रूप से, उन प्रोटीनों को भविष्यवक्ता चर (यानी, एलवी 1 पर उच्च लोडिंग वाले) के साथ दृढ़ता से सहसंबंधित पाया जाता है, जो अक्सर univariate प्रतिगमन विश्लेषण में भी सहसंबंधित होते हैं (चित्रा 8E)। क्योंकि PLSR का उपयोग अक्सर बड़ी संख्या में भविष्यवक्ता चर को चित्र8 के रूप में नमूनों की एक छोटी संख्या में फिट करने के लिए किया जाता है, इसलिए व्यक्तिगत नमूनों के लिए LV1 पर वजन की संवेदनशीलता की समझ हासिल करना महत्वपूर्ण है। नमूनों की एक छोटी संख्या के लिए (<10) LOOCV वजन की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए उपयोगी है ( चित्रा 8 C में एसडी त्रुटि सलाखों के माध्यम से इंगित)। नमूनों की एक बड़ी संख्या के लिए, मोंटे कार्लो उप-नमूना दृष्टिकोण34 का उपयोग करके एक समय में कई नमूनों को छोड़कर संवेदनशीलता का आकलन करना महत्वपूर्ण होगा। हम PLSR दृष्टिकोण और उपयोगों की गहराई से चर्चा के लिए मल्टी और Megavariate डेटा विश्लेषण24 के लिए पाठक का उल्लेख करते हैं। अंत में, हम ध्यान दें कि इस प्रकार के विश्लेषण की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि यह विशुद्ध रूप से correlative है। PLSR भविष्यवक्ता चर और परिणाम चर के बीच एक यांत्रिक संबंध साबित नहीं करता है। हम PLSR को एक मूल्यवान परिकल्पना उत्पन्न करने वाले दृष्टिकोण के रूप में देखते हैं जिसका उपयोग भविष्य के प्रयोगों में संशोधित करने के लिए सभ्य लक्ष्यों का सुझाव देने के लिए किया जाता है जो कारण संबंधों को स्थापित करते हैं।

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Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

इस परियोजना को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान R21 NS104801 (EMB) और R01 NS115994 (LBW / EB) और अटलांटा जूनियर फैकल्टी फोकस्ड अवार्ड (EMB) के बच्चों की हेल्थकेयर द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को अमेरिकी रक्षा विभाग द्वारा कांग्रेस के निर्देशित चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रमों के माध्यम से पुरस्कार संख्या के तहत भी समर्थित किया गया था। W81XWH-18-1-0669 (LBW/ राय, व्याख्याएं, निष्कर्ष और सिफारिशें लेखक की हैं और जरूरी नहीं कि रक्षा विभाग द्वारा समर्थित हों। यह सामग्री अनुदान संख्या 1937971 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप कार्यक्रम द्वारा समर्थित काम पर आधारित है। इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, और निष्कर्ष या सिफारिशें लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के विचारों को प्रतिबिंबित करें।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adjustable pipettes any adjustable pipette
Aluminum foil VWR 89107-726
Bio-Plex cell lysis kit C Bio-Rad 171304012
BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile BrandTech 781602 96
Complete mini protease inhibitor tablet Sigma-Aldrich 11836153001
Depilatory cream Amazon Nair
DiH2O VWR VWRL0200-1000
Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates Millipore Sigma Catalogue 40-285
Hardware Autocorrelator Board www.correlator.com Flex05-8ch
Isoflurane 250 mL MED-VET INTERNATIONAL RXISO-250
Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) VWR 21905-026
Laboratory vortex mixer VWR 10153-838
LabView National Instruments LabVIEW
Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software Luminex Corporation
Luminex Drive Fluid Luminex MPXDF-4PK
Luminex sheath fluid EMD Millipore SHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay Millipore Sigma MCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay Millipore Sigma 48-660MAG
Mini LabRoller rotator VWR 10136-084
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
Phosphate-buffered Saline (PBS) VWR 97064-158
Plate Sealer VWR 82050-992
Polypropylene microfuge tubes VWR 20901-547
Mini LabRoller Millipore Sigma Z674591
Reagent Reservoirs VWR 89094-668
R Programming Language
RStudio www.rstudio.com
Sonicator
Titer plate shaker VWR 12620-926
Tween20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
1 m acrylic guide tube McMaster-Carr 49035K85
4 photon counting avalanche photodiode Perkin-Elmer SPCM-AQ4C-IO
400 um multimode source fiber Thorlabs Inc. FT-400-EMT
54 g bolt Ace Hardware 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length
780 nm single mode detector fiber Thorlabs Inc. 780HP
852 nm long-coherence length laser TOPTICA Photonics iBeam smart

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References

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Brothers, R. O., Bitarafan, S., Pybus, A. F., Wood, L. B., Buckley, E. M. Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (183), e61504, doi:10.3791/61504 (2022).

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