Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Systeemanalyse van de neuro-inflammatoire en hemodynamische respons op traumatisch hersenletsel

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/61504
Automatic Translation
*1, *2,3, 1,3, *1,2,3, *1,4,5
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol presenteert methoden om de neuro-inflammatoire en hemodynamische respons op mild traumatisch hersenletsel te karakteriseren en om deze gegevens te integreren als onderdeel van een multivariate systeemanalyse met behulp van partiële kleinste kwadratenregressie.

Abstract

Licht traumatisch hersenletsel (mTBIs) is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid. Herhaalde blootstelling aan mTBI kan leiden tot cumulatieve, langdurige functionele tekorten. Talrijke studies door onze groep en anderen hebben aangetoond dat mTBI cytokine-expressie stimuleert en microglia activeert, de cerebrale bloedstroom en het metabolisme vermindert en de cerebrovasculaire reactiviteit schaadt. Bovendien hebben verschillende werken een verband gemeld tussen verstoringen in deze neuro-inflammatoire en hemodynamische markers en cognitieve stoornissen. Hierin beschrijven we methoden om de neuro-inflammatoire en hemodynamische weefselrespons op mTBI bij muizen te karakteriseren. In het bijzonder beschrijven we hoe we een gewichtsdruppelmodel van mTBI kunnen uitvoeren, hoe we de cerebrale bloedstroom longitudinaal kunnen meten met behulp van een niet-invasieve optische techniek die diffuse correlatiespectroscopie wordt genoemd, en hoe een Luminex multiplexed immunoassay op hersenweefselmonsters kan worden uitgevoerd om cytokines en immunomodulerende fosfo-eiwitten te kwantificeren (bijvoorbeeld binnen de MAPK- en NFκB-routes) die reageren op en reguleren van activiteit van microglia en andere neurale immuuncellen. Ten slotte beschrijven we hoe deze gegevens kunnen worden geïntegreerd met behulp van een multivariate systeemanalysebenadering om de relaties tussen al deze variabelen te begrijpen. Het begrijpen van de relaties tussen deze fysiologische en moleculaire variabelen zal ons uiteindelijk in staat stellen om mechanismen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor mTBI.

Introduction

Overzicht
Mild traumatisch hersenletsel (mTBIs) impact ~ 1,6-3,8 miljoen atleten per jaar1. Deze verwondingen, waaronder sub-hersenschudding en hersenschudding, kunnen patiënten achterlaten met voorbijgaande fysieke, emotionele, psychologische en cognitieve symptomen2. Bovendien kan repetitieve mTBI (rmTBI) binnen een "venster van kwetsbaarheid" leiden tot cumulatieve ernst en duur van cognitieve gevolgen die langer duren dan de effecten van een enkele mTBI alleen3, en uiteindelijk zelfs tot permanent verlies van functie 4,5,6. Hoewel veel patiënten binnen een relatief kort tijdsbestek (<1 week) herstellen, lijdt 10-40% van de patiënten aan langdurigere effecten van mTBI gedurende > 1 maand, waarvan sommige tot 1 jaarduren 3,7,8,9. Ondanks de hoge prevalentie en blijvende gevolgen van deze verwondingen, zijn letselmechanismen slecht begrepen en bestaan er geen effectieve behandelingsstrategieën.

Gezien de hoge variabiliteit in uitkomsten na mTBI/rmTBI, is een uitdaging bij het identificeren van moleculaire triggers in een vroeg stadium van weefsel verkregen in terminale mTBI/rmTBI-studies het gebrek aan longitudinale gegevens die definitieve "acute moleculaire verbanden" van deze moleculaire triggers met resultaten op langere termijn aantonen. Om deze uitdaging te overwinnen, heeft onze groep ontdekt dat een acuut verminderde cerebrale bloedstroom, acuut gemeten met behulp van een optisch hulpmiddel genaamd diffuse correlatiespectroscopie (DCS), sterk correleert met cognitieve resultaten op langere termijn in een muismodel van rmTBI10. Met behulp van deze hemodynamische biomarker toonden we aan dat muizen met een acuut lage cerebrale bloedstroom (en, bij uitbreiding, slechter voorspelde langetermijnresultaten) gelijktijdige acute toenames hebben in neuronale fosfo-signalering binnen zowel MAPK- als NFκB-routes, toename van neuronale expressie van pro-inflammatoire cytokines en toename van expressie van de fagocyt / microgliale marker Iba111 . Deze gegevens suggereren een mogelijke rol voor neuronale fosfo-signalering, cytokine-expressie en microgliale activering in zowel de acute regulatie van cerebrale bloedstroom na letsel als bij het activeren van een signaalcascade die leidt tot neuronale disfunctie en slechtere cognitieve resultaten. Hierin beschrijven we onze aanpak om tegelijkertijd zowel de hemodynamische als neuro-inflammatoire omgeving na rmTBI te onderzoeken en hoe deze complexe datasets te integreren. In het bijzonder schetsen we procedures voor vier belangrijke stappen in deze alomvattende aanpak: (1) een weight-drop model van mild traumatisch hersenletsel, (2) beoordeling van de cerebrale bloedstroom met diffuse correlatiespectroscopie, (3) kwantificering van de neuro-inflammatoire omgeving en (4) gegevensintegratie (figuur 1). Hieronder geven we een korte inleiding tot elk van deze belangrijke stappen om lezers te helpen bij het doorlopen van de redenering achter onze methoden. De rest van het manuscript biedt een gedetailleerd protocol voor elk van deze belangrijke stappen.

Weight-drop model van mild traumatisch hersenletsel
Hoewel er veel uitstekende preklinische modellen van repetitieve milde TBI bestaan 12,13,14,15,16,17,18, gebruiken we een goed ingeburgerd en klinisch relevant weight-drop gesloten hoofdletselmodel. Belangrijke kenmerken van dit model zijn (1) stompe impact van de intacte schedel / hoofdhuid gevolgd door onbeperkte rotatie van het hoofd rond de nek, (2) geen openlijk structureel hersenletsel, oedeem, schade aan de bloed-hersenbarrière, acute celdood of chronisch hersenweefselverlies, en (3) aanhoudende (tot 1 jaar) cognitieve tekorten die pas na meerdere treffers19 optreden (figuur 2).

Beoordeling van de cerebrale bloedstroom met diffuse correlatiespectroscopie
Diffuse correlatiespectroscopie (DCS) is een niet-invasieve optische techniek die de bloedstroommeet 5,20,21. Bij DCS wordt een nabij-infrarode lichtbron op het weefseloppervlak geplaatst. Een detector wordt op een vaste afstand van de bron op het weefseloppervlak geplaatst om licht te detecteren dat zich heeft vermenigvuldigd verspreid door het weefsel (figuur 3). Verstrooiing van bewegende rode bloedcellen zorgt ervoor dat de gedetecteerde lichtintensiteit met de tijd fluctueert. Een eenvoudig analytisch model dat bekend staat als correlatiediffusietheorie wordt gebruikt om deze intensiteitsfluctuaties te relateren aan een index van de bloedstroom (CBFi, figuur 4). Hoewel de eenheden van CBFi (cm2/s) niet de traditionele stroomeenheden zijn (ml/min/100 g), heeft een eerdere studie bij muizen aangetoond dat CBFi sterk correleert met de cerebrale bloedstroom gemeten door arteriële spin met het label MRI21.

Ter referentie, het DCS-instrument dat hier wordt gebruikt, is in eigen huis gebouwd en bestaat uit een 852 nm lange coherentie-lengtelaser, een array van 4 fotonen die lawinefotodiodes tellen en een hardware autocorrelatorbord (enkele tau, 8-kanaals, 100 ns minimale monstertijd)21,22. Gegevens worden verkregen met zelfgemaakte software geschreven in LabView. De dierlijke interface voor het apparaat bestaat uit een 400 μm multimode bronvezel (400-2200 nm golflengtebereik, pure silicakern, TECS Hard Cladding) en een 780 nm single mode detector fiber (780-970 nm golflengtebereik, pure silica core, TECS Hard Cladding, 730 ± 30 nm second mode cut-off) op 6 mm afstand van elkaar en ingebed in een zwarte 3D-geprinte sensor (4 mm x 8 mm, Figuur 3).

Kwantificering van de neuro-inflammatoire omgeving
Hoewel neuro-inflammatie wordt gereguleerd door diverse cellulaire processen, zijn twee belangrijke relevante mechanismen extracellulaire signalering door cytokines / chemokines en intracellulaire signalering door fosfo-eiwitten. Om de neuro-inflammatoire omgeving van de hersenen na het letsel te onderzoeken, worden hersenen geëxtraheerd uit muizen, gemicrodisseceerd en cytokines / chemokines en fosfo-eiwitten worden gekwantificeerd met behulp van Luminex (figuur 5, figuur 6, figuur 7). Luminex multiplexed immunoassays maken gelijktijdige kwantificering van een diverse verzameling van deze eiwitten mogelijk door enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's) te koppelen aan fluorescerend gelabelde magnetische kralen. Verschillende fluorescerende tags worden gebruikt voor elk eiwit van belang, en kralen van elke tag worden gefunctionaliseerd met een capture-antilichaam tegen dat specifieke eiwit. Honderden kralen voor het vangen van elk eiwit worden gemengd, in een 96-putplaat geplaatst en geïncubeerd met monster. Na monsterincubatie wordt een magneet gebruikt om de kralen in de put te vangen terwijl het monster wordt uitgewassen. Vervolgens bindt gebiotinyleerd detectieantilichaam zich aan de analyt van belang om een antilichaam-antigeensandwich te vormen dat vergelijkbaar is met een traditionele ELISA, maar met de ELISA voor elk eiwit dat op een andere fluorescerend gelabelde kraal voorkomt. Het toevoegen van fycoerythrin-geconjugeerde streptavidin (SAPE) voltooit elke reactie. Het Luminex-instrument leest vervolgens de kralen en scheidt het signaal volgens elke fluorescerende tag / eiwit.

Data-integratie
Vanwege het grote aantal analyten (bijvoorbeeld cytokines) gemeten in de Luminex-test, kan data-analyse moeilijk te interpreteren zijn als elk gekwantificeerd eiwit afzonderlijk wordt geanalyseerd. Om de analyse te vereenvoudigen en trends tussen analyten vast te leggen, gebruiken we een multivariate analysemethode genaamd partial least squares regression (PLSR, Figuur 8)23. PLSR werkt door het identificeren van een as van gewichten die overeenkomen met elk gemeten eiwit (d.w.z. cytokines of fosfo-eiwitten, aangeduid als "predictorvariabelen") die samen de co-variantie van de gemeten eiwitten met een responsvariabele (bijv. Cerebrale bloedstroom) optimaal verklaren. De gewichten worden "belastingen" genoemd en worden samengevoegd tot een vector die bekend staat als een latente variabele (LV). Door de gemeten eiwitgegevens op elk van de twee LP's te projecteren (aangeduid als "scoring"), kunnen de gegevens opnieuw worden uitgezet in termen van deze LVs. Na het berekenen van de PLSR gebruiken we een varimax-rotatie om een nieuwe LV te identificeren die de covariantie tussen de monsterprojecties op de LV en de predictorvariabele24 maximaliseert. Deze benadering stelt ons in staat om LV1 te definiëren als de as waarvoor de variantie van de responsvariabele het best kan worden verklaard. LV2 maximaliseert de co-variantie tussen de responsvariabele en LV1-restgegevens, die kunnen worden geassocieerd met biologische of technische variabiliteit tussen monsters. Ten slotte voeren we een Leave One Out Cross Validation (LOOCV) uit om ervoor te zorgen dat het PLSR-model niet sterk afhankelijk is van één monster23.

In dit protocol beschrijven we methoden om de neuro-inflammatoire en hemodynamische weefselrespons op mTBI te karakteriseren. De algemene workflow wordt beschreven in figuur 1. In dit protocol worden muizen onderworpen aan een of meer mTBIs met behulp van een gewichtsdruppel gesloten hoofdletselmodel. De cerebrale bloedstroom wordt in de lengterichting gemeten voor en op meerdere tijdstippen na het letsel. Op het moment van interesse voor ondervraging van neuro-inflammatoire veranderingen, wordt het dier geëuthanaseerd en worden de hersenen geëxtraheerd. Hersengebieden van belang worden geïsoleerd via microdissectie en vervolgens gelyseerd om eiwit te extraheren. Lysaten worden vervolgens gebruikt voor zowel Luminex multiplexed immunoassays van cytokine en fosfo-eiwit expressie als Western blot. Ten slotte wordt deze holistische dataset geïntegreerd met behulp van een partiële kleinste kwadratenregressieanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en volgen de NIH-richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. Weight-drop model van mild traumatisch hersenletsel

  1. Bereid de set-up voor het afvallen voor. Monteer een vizier op een vlak oppervlak met een geleidebuis van 1 m (2,54 cm binnendiameter) verticaal uitgelijnd (controleer met behulp van een waterpas). Gebruik een bout van 54 g (0,95 cm basisdiameter van het lichaam, 2 cm kopdiameter, 10,2 cm lengte) voor de impact.
  2. Verdoof de muis kort. Induceer de muis met 4,5% isofluraan in 100% zuurstof gedurende 45 seconden. Bevestig voldoende diepte van de anesthesie door het ontbreken van een teen knijpreactie.
  3. Letsel veroorzaken.
    1. Verwijder de muis snel uit de anesthesie en plaats de muis liggend op het midden van een dun membraan (11,2 cm x 21,3 cm weefsel).
    2. Gebruik beide handen om het weefsel strak te houden met de muis in het midden. Zet de staart van de muis vast onder een duim. Plaats de muizenkop onder de geleidebuis (figuur 2).
    3. Laat de bout van de bovenkant van de geleidebuis op het dorsale aspect van het hoofd van de muis vallen, gericht op impact tussen de achterkant van de ogen en de voorkant van de oren. Bij impact zal de muis het weefsel binnendringen, waardoor een snelle versnelling van het hoofd rond de nek mogelijk is (figuur 2).
  4. Terugwinning
    1. Plaats de muis na de botsing op een warmhoudkussen van 37 °C in de kamerlucht. Monitor het herstel gedurende 1 uur na het letsel. Binnen 1 uur moeten muizen normaal kunnen ambuleren, voedsel en water kunnen vinden en geen grove motorische tekorten vertonen.
      OPMERKING: Analgesie wordt niet gebruikt volgens de goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee, wat gerechtvaardigd is vanwege de verstorende invloed van analgesie op de parameters van belang (d.w.z. cerebrale bloedstroom, markers van ontsteking). Bewustzijnsverlies, gedefinieerd als de tijd tussen verwijdering van de anesthesie tot de tijd om de rechtzettingsreflex te herwinnen, wordt verwacht en duurt meestal van 20 s tot 3 minuten (aanvullende tabel 1). Korte (<30 s) episodes van apneu en/of epileptische activiteit kunnen worden waargenomen, vooral na repetitief hoofdletsel eenmaal daags verspreid.
  5. Herhaal indien nodig. Deze verwonding kan eenmaal daags, wekelijks of maandelijks worden herhaald. Het aantal en de afstand van verwondingen zijn afhankelijk van de gewenste ernst van het letsel. Meestal gebruiken we vijf treffers eenmaal daags om robuuste tekorten in ruimtelijk leren en geheugen te induceren.
    OPMERKING: Eerdere studies hebben aangetoond dat vijf treffers eenmaal daags verdeeld voldoende is om tekorten in ruimtelijk leren en geheugen te induceren die langer dan 1 jaar na letsel duren zonder oedeem, bloeding of openlijk structureel letsel aan de hersenen19. Muizen worden dagelijks gewogen en nauwlettend gecontroleerd op tekenen van uitdroging, motorische tekorten en verlies van eetlust. Indien gedehydrateerd, krijgen muizen vochtige chow en een subcutane injectie van 1 ml zoutoplossing eenmaal daags. Om onnodig lijden te voorkomen en een humaan eindpunt te garanderen, worden muizen geëuthanaseerd als: uitdroging aanhoudt of verergert >24 uur na subcutane zoutoplossingbehandeling, het lichaamsgewicht met meer dan 20% afneemt ten opzichte van de uitgangswaarde van vóór het letsel, motorische tekorten zoals cirkelen of poot slepen verschijnen en aanhouden >1 uur na het letsel.

2. Beoordeling van de cerebrale bloedstroom met diffuse correlatiespectroscopie

  1. DCS data acquisitie
    1. Verwijder haar op de hoofdhuid. Omdat DCS het beste werkt in afwezigheid van haar, is het noodzakelijk om de vacht op het hoofd te verwijderen vóór het begin van experimenten. Meestal wordt ontharing 1-3 dagen voor aanvang van het onderzoek uitgevoerd.
      1. Induceer muizen met 4,5% isofluraan in 100% zuurstof gedurende 45 seconden en houd met 1-2% isofluraan in 100% zuurstof.
      2. Scheer het hoofd tussen de ogen en de oren. Gebruik vervolgens ontharingscrème om de vacht op het hoofd te verwijderen, zoals in figuur 3.
      3. Laat het dier herstellen van de anesthesie op een warmhoudkussen en keer dan terug naar de kooi.
    2. Meet de cerebrale bloedstroom met DCS. Om bewegingsartefacten tijdens de meting te minimaliseren, bestudeert u muizen onder korte isofluraan-anesthesie.
      OPMERKING: Controleer visueel de ademhaling en teenknelrespons tijdens metingen en pas de isofluraanconcentratie indien nodig aan om een consistente diepte van de anesthesie te garanderen. Significante variaties in de diepte van de anesthesie kunnen de bloedstroom veranderen gezien de bekende vasomodulatoire effecten van isofluraan25.
      1. Induceer met 4,5% isofluraan in 100% zuurstof gedurende 45 seconden en handhaaf vervolgens met 1,0-1,75% isofluraan in 100% zuurstof. Bevestig voldoende diepte van de anesthesie door de afwezigheid van een teen knijpreactie en normale ademhaling (tussen ~ 60-80 ademhalingen per minuut).
      2. Na een stabilisatieperiode van 2 minuten laat u de DCS-sensor voorzichtig over de rechterhersenhelft rusten, zodat de bovenrand van de optische sensor zich uitstrekt met de achterkant van het oog en de zijkant van de sensor langs de middellijn omhoog (figuur 3). Geef de sensor een hand om af te schermen tegen ruimtelicht. Verkrijg 5 seconden data (1 Hz acquisitie).
      3. Verplaats de sensor over de linkerhersenhelft en verkrijg 5 seconden aan gegevens.
      4. Herhaal dit 3 keer/halfrond om rekening te houden met lokale heterogeniteiten onder het weefseloppervlak.
    3. Terugwinning
      1. Verwijder de muis uit de anesthesie en plaats op een opwarmkussen.
      2. Nadat de muis zijn rechtreflex heeft herwonnen, keert u deze terug naar de kooi.
  2. DCS data analyse
    1. Voer de eerste kwaliteitscontrole uit. Elk frame met DCS-gegevens bestaat uit een gemeten genormaliseerde intensiteitsautocorrelatiefunctie Equation 110 (figuur 4A) en fotonentelling (kHz).
      1. Als u gegevensframes met significante bewegingsartefacten wilt verwijderen, verwijdert u gegevensframes waarvoor de gemiddelde waarde van de staart van de Equation 110 curve (d.w.z. Equation 111) > 1,005 is.
      2. Als u gegevensframes met een slechte signaal-ruisverhouding wilt verwijderen, verwijdert u gegevensframes als de gedetecteerde fotontelsnelheid < 20 kHz is.
    2. Extract cerebrale bloedstroom index. Met behulp van fminsearch in Matlab, paselk gemeten gegevensframe Equation 112 voor CBFi(i) aan. Beperk past op Equation 113en zoek de waarde van CBFi die de volgende kostenfunctie minimaliseert:
      Equation 114
      Waarbij de som over alle gemeten vertragingstijdenEquation 115 gaat en Equation 116 de semi-oneindige homogene oplossing van de correlatiediffusievergelijking is (figuur 4B):
      Equation 117
      Hier is β een coherentiefactor bepaald door de experimentele opstelling, Equation 7, , Equation 8Equation 9, Equation 10, Equation11, Reff = 0,493 voor een veronderstelde weefselindex van breking van 1,4, ρ is 6 mm, en μa en μ zijn de absorptie en verminderde verstrooiingscoëfficiënt van het weefsel (verondersteld 0,25 en 9,4 / cm te zijn, respectievelijk 10,26,27).
      OPMERKING: Omdat β in de loop van de tijd ~ 10% kunnen variëren, past u elk gegevensframe voor β en CBFi tegelijkertijd.
    3. Voer secundaire kwaliteitscontrole uit. Gooi binnen elke herhaling (die uit 5 dataframes bestaat) uitschieters weg. Uitschieters worden gedefinieerd als die CBFi-waarden die buiten 1,5 standaardafwijkingen van het gemiddelde CBFi voor die herhaling vallen. Als meer dan 1 gegevenspunt als uitschieter wordt geïdentificeerd, gooit u de hele herhaling weg.
    4. Schatting gemiddelde cerebrale bloedstroomindex: Schat een gemiddelde CBFi per hemisfeer door het gemiddelde te nemen over alle gegevensframes voor alle herhalingen (figuur 4C). Als er geen significante hemisferische verschillen worden waargenomen, gemiddeld over de hemisferen om een schatting van de gemiddelde wereldwijde CBFi te verkrijgen.

3. Multiplexed kwantificering van cytokines en fosfo-eiwitten met behulp van luminex assays

  1. Weefselextractie
    OPMERKING: Kwantificering van hersencytokines en fosfo-signalerende eiwitten met behulp van Luminex vereist weefselextractie.
    1. Verdoving muis met 4,5% isofluraan in 100% zuurstof gedurende 1-2 min. Controleer op diepe anesthesie via het ontbreken van een teen knijpreactie. Euthanaseren via onthoofding.
    2. Oogst het weefsel.
      1. Verwijder de hersenen. Fixeer meestal de linkerhersenhelft voor histologie en microdisseer verschillende regio's van de rechterhersenhelft in de cortex en hippocampus (figuur 5).
      2. Plaats ontleedde monsters in microcentrifugebuizen, flash freeze in vloeibare stikstof. Voor analyse van vriesgevoelige eiwitten is het optimaal om weefselsecties te verdelen voordat ze worden ingevroren om latere bevriezing en dooi te voorkomen.
        OPMERKING: Het protocol kan worden gepauzeerd en weefselmonsters kunnen worden bewaard bij -80 °C totdat ze klaar zijn om monsters te lyseren. Als alternatief kunnen monsters worden gelyseerd en vervolgens worden bewaard bij -80 °C.
    3. Lyse monsters.
      1. Bereid de lysisbuffer voor door proteaseremmer en 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride toe te voegen aan de lysisbuffer.
      2. Voeg 150 μL van de gemengde lysisbuffer toe per ongeveer 3 μg dierlijk weefsel. Ter referentie, de weefselmonsters van de visuele cortex van muizen zijn ongeveer 3 μg.
      3. Om het weefsel te homogeniseren, triturate u het weefsel mechanisch door ~ 15-20 keer op en neer te pipetteren met behulp van een pipet van 1000 μL. Voor een optimale monstertrituratie kan een homogenisator stamper worden gebruikt.
      4. Plaats de monsterbuizen gedurende 30 minuten op een rotator bij 4°C.
      5. Centrifugeer de monsters bij 4°C gedurende 10 minuten bij ongeveer 15.000 x g en verzamel het supernatant. Monsters kunnen onmiddellijk worden verwerkt of bij -80 °C worden opgeslagen voor verdere analyse.
        OPMERKING: Monsterlysaten bereid met behulp van dit protocol zijn compatibel met Western blot, waaruit de fagocyt/ microgliale marker Iba1 en / of de astrocytenactivatiemarker GFAP kunnen worden geanalyseerd als aanvulling op cytokine- en fosfo-eiwitanalyse voor neuro-inflammatiestudies11.
  2. Multiplex immuno-assay protocol voor cytokines en fosfo-eiwitten
    OPMERKING: Hoewel vergelijkbaar over het algemeen, zijn er enkele kleine verschillen in de protocollen voor cytokine- en fosfo-eiwitkits. In elke stap worden verschillen genoteerd. De stappen om monsters voor te bereiden voor de Luminex-test worden hieronder beschreven.
    1. Bereiding van reagentia (dag 1, hetzelfde voor cytokines en fosfo-eiwitten)
      1. Laat reagentia opwarmen tot kamertemperatuur (~ 30 min).
      2. Sonicate multiplex magnetische kralen fles gedurende 30 seconden gevolgd door 1 minuut vortexing. Zorg ervoor dat multiplex magnetische kralen worden afgeschermd van licht met aluminiumfolie of gebruik de meegeleverde lichte beschermende flessen.
      3. Bereid de wasbuffer voor door 0,1% Tween20 in 1xPBS te mengen of gebruik de wasbuffer in de kit.
    2. Bereiding van gelyseerde weefselmonsters (dag 1, hetzelfde voor cytokines en fosfo-eiwitten)
      1. Indien eerder ingevroren, verwijder dan gelyseerde weefselmonsters uit de vriezer en laat ontdooien op ijs (~ 20 min). Centrifugeer monsters gedurende 10 minuten bij 9.167 x g om neerslag te verwijderen.
      2. Bereid 25 μL monster bij de optimale eiwitconcentratie die is bepaald door de lineaire bereikanalyse (zie rubriek 3.3). Om het totale volume voor alle monsters te normaliseren, verdunt u de monsters in de testbuffer die in de kit is meegeleverd.
    3. Bereiding van 96 putplaat (dag 1, hetzelfde voor cytokines en fosfo-eiwitten)
      1. Gebruik de 96-putplaat die in de kit is inbegrepen of een met een dunne bodem (bijv. Brand Tech).
      2. Voeg 200 μL wasbuffer (of 1x PBS, 0,1% Tween) toe aan elke put en meng gedurende 10 minuten bij 750 tpm op de bordenschudder.
      3. Decanteer de wasbuffer en tik de plaat op een papieren handdoek om residu te verwijderen.
    4. Immunoassay procedure voor Cytokines (dag 1)
      1. Voeg het volgende toe aan elk putje in de aangegeven volgorde.
        1. Voeg 25 μL testbuffer toe aan alle putten.
          1. Voeg 25 μL extra assaybuffer ALLEEN toe aan achtergrondputten. Zorg voor elke experimentele run voor ten minste twee achtergrondputten. Achtergrondputten hebben geen monster geladen en definiëren de fluorescerende intensiteit die door het instrument wordt gelezen zonder monster.
          2. Voeg 25 μL van elk verdund monster toe aan overeenkomstige monsterputten.
          3. Voeg 25 μL 1x multiplex magnetische kralen toe aan alle putten (figuur 6). Zorg ervoor dat u kralen gedurende 1 minuut vortext voordat u ze aan putten toevoegt.
      2. Sluit de plaat af met platensealer en bedek de plaat met aluminiumfolie. Incubeer 's nachts (12-16 uur) bij 2-8 °C.
    5. Immunoassay procedure voor cytokines (dag 2)
      1. Plaats 96 putplaat op magnetische separator en zorg ervoor dat de putten zijn uitgelijnd met de magneten. Laat 2 min zitten. Decanteer de inhoud van de put terwijl de plaat nog steeds aan de magnetische afscheider is bevestigd.
      2. Was het bord 2 keer met behulp van de volgende stappen.
        1. Voeg 200 μL wasbuffer toe aan elke put en plaats deze gedurende 2 minuten op kamertemperatuur op de shaker.
        2. Plaats de putplaat gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur op de magneetscheider.
        3. Decanteer de inhoud van de put terwijl de putplaat nog steeds aan de magnetische afscheider is bevestigd.
      3. Voeg 25 μL detectieantilichaam per putje toe (figuur 6). Dek af met folie. Incubeer gedurende 1 uur op een platenschudder (750 rpm) bij kamertemperatuur.
      4. Laat het detectieantilichaam erin en voeg 25 μL streptavidin-phycoerythrin (SAPE) toe aan elke put (figuur 6). Dek af met folie. Incubeer gedurende 30 minuten op de platenschudder (750 rpm) bij kamertemperatuur.
      5. Plaats de putplaat op een magneetscheider en laat 2 min zitten. Decanteer de inhoud van de put en maak los van de magnetische afscheider.
      6. Was de putplaat tweemaal (zie stap 3.2.5.2).
      7. Voeg 75 μL Luminex Drive Fluid (bij gebruik van magpix-instrument) toe aan elke put of testbuffer (bij gebruik van 200 of FlexMap 3D-instrument). Hang kralen opnieuw op de platenschudder gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      8. Lees verder luminex instrument (MAGPIX, 200 of FlexMap 3D), verwijzend naar de gebruikershandleiding voor een goede werking (figuur 6).
    6. Immunoassay procedure voor fosfo-eiwitten (dag 1)
      1. Voeg het volgende toe aan elk putje in de aangegeven volgorde.
        1. Voeg 25 μL testbuffer toe aan alle putten.
          1. Voeg 25 μL extra assaybuffer ALLEEN toe aan achtergrondputten. Voor elke experimentele run wordt aanbevolen om ten minste twee achtergrondputten te hebben. Achtergrondputten hebben geen monster geladen en definiëren de fluorescerende intensiteit die door het instrument wordt gelezen zonder monster.
          2. Voeg 25 μL van elk verdund monster toe aan elke monsterput.
          3. Voeg 25 μL 1x multiplex magnetische kralen toe aan alle putten (figuur 6).
            OPMERKING: De Luminex assay kit biedt multiplex magnetische kraal in 20x stock oplossing. Zorg ervoor dat u 20x multiplex magnetische kraaloplossing gedurende 2 minuten vortext en verdun het vervolgens in assaybuffer tot 1x oplossing. Vortex 1x multiplex magnetische kraal suspensie gedurende 1 min voordat deze aan putten wordt toegevoegd.
        2. Sluit de plaat af met platensealer en bedek de plaat met aluminiumfolie. Incubeer 's nachts (12-16 uur) bij 2-8 °C.
    7. Immunoassay procedure voor fosfo-eiwitten (dag 2)
      1. Plaats de putplaat op een magnetische afscheider en zorg ervoor dat de putplaat volledig is uitgelijnd met de magnetische afscheider. Laat 2 min zitten. Decanteer de inhoud van de put terwijl de putplaat nog steeds aan de magnetische afscheider is bevestigd.
      2. Was het bord 2 keer (zie stap b in de immunoassayprocedure van cytokine dag 2).
      3. Verdun het 20x voorraaddetectieantilichaam tot 1x oplossing in assaybuffer. Voeg 25 μL 1x detectieantilichaam per putje toe (figuur 6). Dek af met folie. Incubeer gedurende 1 uur op de platenschudder (750 rpm) bij kamertemperatuur.
      4. Plaats de 96 well plaat op de magneetscheider en laat 2 min zitten. Decanteer de inhoud van de put, maak los van de magnetische afscheider.
      5. Verdun 25x voorraad SAPE in assaybuffer tot 1x buffer. Voeg 25 μL 1x SAPE toe (figuur 6). Dek af met folie en incubeer gedurende 15 minuten op de platenschudder (750 rpm) bij kamertemperatuur.
      6. Laat de SAPE in putjes en voeg 25 μL versterkingsbuffer toe aan elke put. Dek af met folie.
      7. Incubeer gedurende 15 minuten op de plaatschudder (750 rpm) bij kamertemperatuur.
      8. Plaats de putplaat gedurende 2 minuten op de magneetscheider. Decanteer de inhoud van de put en maak los van de magnetische afscheider.
      9. Voeg 75 μL Luminex Drive Fluid (bij gebruik van magpix-instrument) of assaybuffer toe (bij gebruik van 200 of FlexMap 3D-instrument). Hang kralen opnieuw op een platenschudder gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      10. Lees verder over het Luminex-instrument (MAGPIX, 200 of FlexMap 3D), verwijzend naar de gebruikershandleiding voor een goede werking (figuur 6).
  3. Lineariteit van de monsterverdunningscurve
    1. Bereiding van monsters: Serieel verdunde testmonsters met verschillende concentratie van totaal eiwit. Voor bulk hersenweefsels, laad seriële verdunningen van 0-25 μg voor cytokines en 0-12 μg voor fosfo-eiwitten. De totale eiwitconcentratie kan worden gemeten met behulp van bicinchoninezuur (BCA) assay.
    2. Multiplex immunoassay: Voer de Luminex-test (zie rubriek 3.2) uit op geselecteerde monsters.
    3. Data-analyse
      1. Plot fluorescerende intensiteit voor elk eiwit versus de hoeveelheid geladen eiwit (figuur 7).
      2. Identificeer voor elke analyt het bereik van het totale geladen eiwit waarvoor de relatie tussen het totale eiwit en de fluorescerende intensiteitsuitlezing lineair is (figuur 7).
      3. Om de hoeveelheid totaal eiwit te bepalen die moet worden geladen voor de volledige testrun, identificeert u het lineaire deel van de curve voor elke analyt en selecteert u vervolgens een eiwitconcentratie die binnen het lineaire bereik valt voor de meerderheid van de analyten.
        OPMERKING: Hoewel de meeste eiwitten een vergelijkbaar lineair bereik delen, overlappen de lineaire bereiken elkaar mogelijk niet voor alle eiwitten. Als dit het geval is, kan het nodig zijn om elk monster meerdere keren uit te voeren met verschillende hoeveelheden totaal eiwit geladen. Als alternatief kunnen niet-lineaire monsters buiten de analyse worden gelaten. Bovendien hebben sommige eiwitten mogelijk helemaal geen lineair bereik.

4. Partiële kleinste kwadraten regressie

OPMERKING: Voorbeeld R-code en een voorbeeldgegevensspreadsheet worden verstrekt om de gedeeltelijke kleinste kwadratenanalyse uit te voeren.

  1. Gegevensvoorbereiding: Maak de gegevens op zoals weergegeven in de meegeleverde spreadsheet met voorbeeldgegevens, "MyData". Neem variabelenamen op in rij 1, voorbeeldnamen in kolom A, de responsvariabele in kolom B en alle predictorvariabelen in kolom C+. Vul de laatste twee rijen met de achtergrondgegevens en stel beide voorbeeldnamen in op "Achtergrond".
  2. Gedeeltelijke regressie van de kleinste kwadraten in RStudio
    1. Installeer R vanaf www.r-project.org (gratis, open source).
    2. Installeer RStudio Desktop vanaf www.rstudio.com (gratis, open source licentie).
    3. Download de voorbeeld-R-code die bij deze publicatie is geleverd, 'PLSR_Sample_Code.R', en sla deze op in dezelfde map die de gegevensspreadsheet bevat. Open het codebestand in RStudio.
    4. Wijzig in het gedeelte Gebruikersinvoer 'dataFileName' in de naam van de gegevensspreadsheet.
    5. Voer de volgende stappen uit door het gedeelte van de code dat moet worden uitgevoerd te markeren en in de rechterbovenhoek van het script op Uitvoeren te klikken.
      1. Laad de benodigde R-pakketten, functies, het werkmapadres en gebruikersinvoerwaarden in RStudio (subsectie "Voorrondes").
      2. Laad de gegevens in RStudio en bereid onbewerkte gegevens voor op verwerking door het gemiddelde achtergrondsignaal van alle metingen af te trekken en elke analyt te z-scoren (subsectie "Gegevens lezen en achtergrond aftrekken") (Figuur 8A).
      3. Voer gedeeltelijke kleinste kwadratenregressie uit in RStudio met behulp van het plsRglm-pakket v1.2.528 dat beschikbaar is op het Comprehensive R Archive Network (CRAN). Voer een varimaxrotatie uit (statistiekenpakket v3.6.2)23 in het LV1-LV2-vlak om een nieuwe horizontale as te identificeren die monsters het beste scheidt door de responsvariabele (subsectie "PLS") (Figuur 8B).
      4. Voer een Leave One Out Cross Validation (LOOCV) uit waarbij één monster iteratief uit de gegevens wordt weggelaten en het PLSR-model opnieuw wordt berekend. Bereken standaarddeviatie voor analytbelastingen voor alle LOOCV-runs (subsectie "LOOCV").
  3. Representatieve plots maken: Voer de meegeleverde voorbeeldcode uit zoals hierboven beschreven om representatieve plots te maken die automatisch als pdf-bestanden worden geëxporteerd naar de werkmap (de map met de gegevens- en codebestanden).
    1. Maak een heatmap van de verwerkte gegevens zoals weergegeven in figuur 8A (subsectie "PLS"). Kleur elk item langs een spectrum gedefinieerd door z-score. Sorteer analyten op de volgorde berekend in de latente variabele van belang.
    2. Maak een scoresplot met LV1-scores uitgezet langs de horizontale as en LV2-scores uitgezet langs de verticale as, zoals weergegeven in figuur 8B (subsectie "PLS"). Kleur elk gegevenspunt volgens de meting van de responsvariabele om de relatie tussen elke latente variabele en de responsvariabele te visualiseren.
    3. Maak een staafplot met belastingen voor elk van uw predictorvariabelen om te visualiseren hoe elke analyt bijdraagt aan de latente variabelen, zoals weergegeven in figuur 8C (subsectie "LOOCV").
    4. Maak een plot met regressieve LV1-scores ten opzichte van uw responsvariabele om te visualiseren hoe goed het PLSR-model de monsters scheidt, zoals weergegeven in figuur 8D (subsectie "PLS").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eerder verzamelde gegevens werden genomen van eerder werk waarbij een groep van acht C57BL /6-muizen werd onderworpen aan drie gesloten hoofdletsels (figuur 2) eenmaal daagsverdeeld 11. In dit werk werd de cerebrale bloedstroom gemeten met diffuse correlatiespectroscopie 4 uur na het laatste letsel (figuur 3, figuur 4). Na cbf-beoordeling na het letsel werden de dieren geëuthanaseerd en werd hersenweefsel geëxtraheerd voor kwantificering van cytokines en fosfo-eiwitten via immunoassay (figuur 5). We kwantificeerden ook de fagocyt/microgliale activeringsmarker Iba1 via Western blot (methoden beschreven in11). Hersenweefsel van elke muis werd gelyseerd en de totale eiwitconcentratie werd gemeten met behulp van een BCA-test. Gemultiplexte cytokinekwantificering werd uitgevoerd met behulp van het Milliplex MAP Mouse Cytokine/Chemokine 32-Plex, dat werd gelezen met behulp van een Luminex MAGPIX-systeem (figuur 6). Een lineaire bereikanalyse werd uitgevoerd om een geschikte eiwitbelasting te bepalen (12 μg eiwit per 12,5 μL lysaat) (figuur 7) voordat gegevens van alle monsters werden verzameld.

Cytokinegegevens werden voorbereid voor analyse door achtergrondmetingen af te trekken van steekproefgegevens en vervolgens z-scoringsgegevens voor elke analyt (figuur 8A). Een heatmap werd gegenereerd op basis van z-gescoorde gegevens om verschillen in cytokine-expressie tussen dieren te visualiseren. Partiële Kleinste Kwadraten Regressie (PLSR) werd uitgevoerd met behulp van de fagocyt/microgliale activeringsmarker Iba1 als responsvariabele en cytokinemetingen als de predictorvariabelen (figuur 8B). Een varimaxrotatie werd uitgevoerd om de co-variantie van de gegevens op LV1 met de Iba1-metingen te maximaliseren (figuur 8D). Hoge belastingsgewichten in LV1 (figuur 8C) komen overeen met de cytokine-expressie die het meest geassocieerd is met een hoge expressie van Iba1. Lineaire regressies tussen Iba1 en cytokines laten zien dat die cytokines met de grootste belastingsgewichten in LV1 ook statistisch significant waren (figuur 8E).

Figure 1
Figuur 1: Typische workflow. Eerst ondergaan muizen een gewichtsdaling gesloten hoofdletsel en vervolgens wordt de cerebrale bloedstroom (CBF) gemeten met behulp van diffuse correlatiespectroscopie. Vervolgens worden hersenen verzameld, interessante gebieden worden micro-ontleed en vastgevroren met behulp van vloeibare stikstof. Ter voorbereiding op de Luminex-immunoassay worden eiwitten gelyseerd en wordt de totale eiwitconcentratie gemeten met behulp van bicinchoninezuurtest. Lysaten worden gebruikt voor Western blot van eiwitten van belang en Luminex assays voor cytokines en fosfo-eiwitten. Gegevens van CBF, Western blot en Luminex zijn geïntegreerd met behulp van partiële kleinste kwadratenregressie (PLSR). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Closed-head weight drop model van licht traumatisch hersenletsel. (A) De verdoofde muis wordt bij de staart vastgepakt en op een strak offermembraan onder een geleidebuis geplaatst. Een gewicht van 54 g wordt vanaf 1 m op het dorsale aspect van het hoofd laten vallen. (B) Binnen ~ 1 ms na de impact heeft het hoofd van de muis snel rond de nek gedraaid terwijl het door het offermembraan breekt. (C) Binnen ~ 5 ms na de botsing is de hele muis gevallen en hangt aan zijn gegrepen staart. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Meting van de cerebrale bloedstroom door diffuse correlatiespectroscopie. (A) Een optische sensor wordt voorzichtig handmatig over de rechterhersenhelft gehouden om de bloedstroom in een verdoofde muis te meten. (B) Representatieve sensorplaatsing op de rechterhersenhelft. De omtrek van de sensor wordt weergegeven als een onderbroken zwarte rechthoek en de locatie van de bron- en detectorvezels bevinden zich respectievelijk in rode en blauwe cirkels. De sensor is zo geplaatst dat de korte rand van de sensor uitlijnt met de achterkant van het oog en de lange rand van de sensor uitlijnt met de middellijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Diffuse Correlatie Spectroscopie data-analyse. (A) Representatieve gemeten intensiteitsautocorrelatiecurven, g2(τ), bij baseline, pre-injury baseline (groen) en 4 h na 5 gesloten hoofdletsels eenmaal daags uit elkaar (paars). De juiste verschuiving in de curve van pre- naar post-blessure weerspiegelt een afname van de bloedstroom. (B) gEquation(τ)-gegevens worden verkregen bij 1 Hz gedurende 5 s per halfrond en herhaald 3x/halfrond. Elke gemeten gEquation(τ)-curve is geschikt voor de semi-oneindige oplossing voor de correlatiediffusievergelijking voor een cerebrale bloedstroomindex (CBFi). (C) CBFi-waarden over alle frames en herhalingen worden gemiddeld om de gemiddelde cerebrale bloedstroomindex voor elke hemisfeer te verkrijgen (aangegeven door horizontale zwarte balk). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Microdissectie van muizenhersenen. (A) Nadat de hersenen uit de muis zijn geëxtraheerd, wordt deze langs de stippellijn doorsneden. De linkerhersenhelft is gefixeerd voor histologie en de rechterhersenhelft is gemicrodisseceerd voor pathologie. (B) Sagittale weergave van de cortex van de rechterhersenhelft. De rechterhersenhelft wordt gemicrodisseceerd in overeenkomstige kleurgecodeerde gebieden. Voor analyse van vriesgevoelige eiwitten is het optimaal om weefselsecties te verdelen voordat ze worden ingevroren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Illustratie van de Luminex-procedure. (A) Voeg monsters toe aan fluorescerend getagde kralen. Kralen zijn vooraf gecoat met een specifiek vangantilichaam voor elk eiwit van belang. (B) Voeg gebiotinyleerde detectieantistoffen toe. Biotine-detectie antilichamen binden aan de analyten van belang en vormen een antilichaam-antigeen sandwich. (C) Voeg phycoerythrin (PE)-geconjugeerde streptavidin (SAPE) toe. SAPE bindt zich aan de gebiotinyleerde detectieantistoffen en voltooit de reactie. Voor fosfo-eiwitten wordt een versterkingsbuffer (alleen voor fosfo-eiwittests) toegevoegd na de toevoeging aan SAPE om het testsignaal te verbeteren. (D) Luminex-instrument (MAGPIX, 200 of FlexMap 3D) leest de reactie op elke fluorescerend getagde kraal via een combinatie van rood/groene verlichting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 7: Illustratie van de monsterverdunningscurve om het lineaire bereik te identificeren. Eiwitconcentratie van serieel verdunde monsters versus fluorescerende intensiteit gemeten aan de hand van de Luminex-test. Het lineaire bereik wordt gedefinieerd als het eiwitconcentratiebereik waarvoor de relatie tussen de eiwitconcentratie en fluorescerende intensiteit lineair is (pijl). In sommige analyten kan het verhogen van de eiwitconcentratie boven een bepaalde limiet de antilichaambinding zodanig verminderen dat de verdunningscurve niet-lineair of omgekeerd wordt (Hook-effect). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 8: Representatieve Partiële Kleinste Kwadraten Regressie (PLSR) Analyse. (A) Panel cytokine eiwit expressie (linker kolommen) samen met Iba1 expressie (rechter kolom) in 3xCHI muizen (n=8, z-gescoord). (B) PLSR kent gewichten (belastingen) toe aan gemeten cytokines voor elke latente variabele. Gewichten worden toegepast op gemeten gegevens om scores te berekenen voor elk monster op elke latente variabele. (C) PLSR van 3xCHI-monsters tegen Iba1 identificeerde een gewogen profiel van cytokines, LV1, dat monsters onderscheidde door Iba1. Cytokines met negatieve gewichten werden geupreguleerd in monsters met een laag Iba1,terwijl cytokines met positieve gewichten werden geupreguleerd in monsters met een hoog Iba1 (gemiddelde ± SD met behulp van een LOOCV). (D) Lineaire regressie van LV1-scores voor elke steekproef ten opzichte van Iba1. R2PLS meet de goedheid van fit tussen Iba1 en LV1. (E) Individuele regressies van Iba1 tegen elk van de cytokines met de grootste gewichten in LV1 in C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hierin beschrijven we methoden voor de beoordeling van de hemodynamische en neuro-inflammatoire respons op repetitief mild traumatisch hersenletsel. Verder hebben we laten zien hoe we deze gegevens kunnen integreren als onderdeel van een multivariate systeemanalyse met behulp van partiële kleinste kwadratenregressie. In de onderstaande tekst zullen we enkele van de belangrijkste stappen en beperkingen in verband met het protocol bespreken, evenals de voor- / nadelen van de methoden ten opzichte van bestaande methoden.

Weight-drop model van mild traumatisch hersenletsel. Deze methode van inductie van traumatisch hersenletsel is voordelig omdat het een stompe impact heeft, gevolgd door een snelle anterieure-posterieure rotatieversnelling die vaak wordt gezien bij sportgerelateerd hoofdletsel10,19. Zeker, het lissencephalic muisbrein vat de complexiteit van het gyrocefale menselijke brein niet volledig samen; niettemin induceert dit model veel van dezelfde klinische en gedragsmatige gevolgen van menselijke mTBI, inclusief aanhoudende tekorten in ruimtelijk leren en geheugen met herhaalde verwondingen. Bovendien, hoewel de impact mild van aard is (geen structurele / neuronale schade, geen doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière, cognitieve tekorten die pas na meerdere treffers ontstaan, enz.19), veroorzaakt het wel aanzienlijk bewustzijnsverlies, in tegenstelling tot mensen waar bewustzijnsverlies minder vaak voorkomt. Dit verhoogde bewustzijnsverlies kan te wijten zijn aan een interactie met de anesthesie die onmiddellijk voorafgaand aan de impact wordt gegeven, hoewel de exacte oorzaak niet goed wordt begrepen. Ten slotte merken we op dat het uitlijnen van de geleidebuis zodanig dat de bout tussen de coronale en lamdoïde hechtingen botst, van cruciaal belang is. We hebben waargenomen dat effecten die meer achteraan zijn, aanzienlijke motorische tekorten kunnen veroorzaken die euthanasie vereisen.

Beoordeling van de cerebrale bloedstroom met diffuse correlatiespectroscopie. Niet-invasieve, longitudinale metingen van cerebrale bloedstroom (CBF) met traditionele modaliteiten die worden gebruikt in studies met mens / groot dier, zoals perfusie magnetische resonantie beeldvorming of transcraniële Doppler-echografie, zijn om verschillende redenen een uitdaging bij muizen, waaronder kleine hersengrootte en totaal bloedvolume29. Diffuse correlatiespectroscopie is zeer geschikt bij muizen en biedt de extra voordelen van niet-invasief en relatief goedkoop in vergelijking met andere modaliteiten20,30. Omdat DCS gevoelig is voor bewegingsartefacten, moeten muizen kort worden verdoofd of in bedwang worden gehouden31 voor beoordeling. We gebruiken meestal isofluraan anesthesie vanwege de snelle inductie en herstel; isofluraan is echter een cerebrale vaatverwijder en schattingen van de bloedstroom onder isofluraan moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Afnames in de bloedstroom die na het letsel worden waargenomen in vergelijking met sham-gewonde dieren kunnen worden verstoord door een falen van de gewonde cerebrale vasculatuur om te vaatodileren als reactie op isofluraan. Ten slotte hebben we eerder een uitstekende intra-user herhaalbaarheid van bloedstroommetingen met DCS bij muizen aangetoond, maar alleen een eerlijke intra-user herhaalbaarheid21. Om deze reden raden we aan dat dezelfde operator DCS-metingen aanschaft voor experimenten die longitudinale beoordeling van de cerebrale bloedstroom vereisen.

Multiplexe kwantificering van cytokines en fosfo-eiwitten met behulp van Luminex-assays. Een belangrijke uitdaging bij elke ELISA is het Hook-effect, waarbij een verhoogde eiwitconcentratie de antilichaamaffiniteit voor het doeleiwit kan verminderen, wat leidt tot een verminderd testsignaal in reactie op verhoogd eiwit32 (figuur 7). Dit effect kan worden verergerd bij het analyseren van hele weefsels, waarbij bulkeiwitten op dezelfde manier kunnen interfereren. De eerste stap bij het gebruik van Luminex-assays is dus om te bepalen of er een reeks eiwitconcentraties is geladen waarvoor de test lineair varieert met de hoeveelheid geladen eiwit. Analyten die niet over een dergelijk lineair bereik beschikken (figuur 7) moeten van de analyse worden uitgesloten. We merken ook op dat cytokineniveaus in de hersenen meestal erg laag zijn en in de buurt van de onderste detectiegrens lijken te komen die wordt beoordeeld via standaardcurven die bij de Luminex-kit worden geleverd. Om deze reden is het essentieel om lineaire bereikanalyse uit te voeren om te bepalen of de uitlezing van het instrument echt de hoeveelheid geladen monster weerspiegelt. Voor belangrijke eiwitten van belang kan deze lineaire bereikanalyse worden aangevuld met een spike recovery assay waarbij recombinant eiwit in een monster wordt geprikt en lineariteit in de instrumentaflezing wordt geëvalueerd33.

Omdat neuro-inflammatie wordt gereguleerd door diverse intracellulaire fosfo-eiwitten en extracellulaire cytokines, is het van cruciaal belang om tegelijkertijd een breed scala van deze eiwitten te meten om de neurale immuunrespons van de hersenen op mTBI te begrijpen. Luminex multiplexed immunoassays maken gelijktijdige kwantificering van tientallen cytokines en fosfo-eiwitten uit één monster mogelijk, waardoor een holistisch beeld ontstaat van de weefselimmuunrespons na letsel. Hoewel deze analyses een breed beeld geven van cytokines/chemokines en fosfo-eiwitten, kwantificeert de test de totale hoeveelheid van elk eiwit uit een weefselhomogenaat. Het levert dus geen celtypespecifieke gegevens op. Celtypespecificiteit kan worden bepaald door follow-up immunohistochemie om lokalisatie van topeiwitten van belang te identificeren met markers voor celtypen (bijv. Neuronen, microglia, astrocyten, enz.) 11.

Partiële kleinste kwadraten regressie analyse voor data integratie. De weefselrespons op mTBI is multifactorieel, bestaande uit fysiologische veranderingen in de bloedstroom samen met veranderingen in de fagocyt/microgliale activeringsmarker Iba1, diverse cytokines en fosfo-eiwitten, onder andere11. Vanwege de multiplexed aard van de verzamelde gegevens is een systematische methode nodig om de multidimensionaliteit van de relaties tussen de verschillende predictorvariabelen te verklaren. PLSR biedt een geschikte oplossing voor dit probleem door LV's te identificeren die maximaal de co-variantie tussen de predictorvariabelen en de uitkomstvariabele identificeren (bijv. Iba1 in figuur 8). Belangrijk is dat de eiwitten die sterk gecorreleerd zijn met de predictorvariabele (d.w.z. die met hoge belastingen op LV1) vaak ook correleren in de univariate regressieanalyse (figuur 8E). Omdat PLSR vaak wordt gebruikt om een groot aantal voorspelvariabelen in te passen op een kleiner aantal monsters zoals in figuur 8, is het van cruciaal belang om inzicht te krijgen in de gevoeligheid van de gewichten op LV1 voor individuele monsters. Voor een klein aantal monsters (<10) is LOOCV nuttig voor het beoordelen van de gevoeligheid van de gewichten (aangegeven via SD-foutbalken in figuur 8C). Voor een groter aantal monsters is het belangrijk om de gevoeligheid te beoordelen door meerdere monsters tegelijk weg te laten met behulp van een Monte Carlo-subbemonsteringsbenadering34. We verwijzen de lezer naar Multi en Megavariate Data Analysis24 voor een diepgaande bespreking van PLSR-benaderingen en -toepassingen. Ten slotte merken we op dat een belangrijke beperking van dit type analyse is dat het puur correlatief is. PLSR bewijst geen mechanistische relatie tussen predictorvariabelen en de uitkomstvariabele. We zien PLSR als een waardevolle hypothese genererende benadering die wordt gebruikt om handelbare doelen te suggereren om te moduleren in toekomstige experimenten die causale relaties vaststellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen.

Acknowledgments

Dit project werd ondersteund door de National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) en R01 NS115994 (LBW/EB) en Children's Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Dit werk werd ook ondersteund door het Amerikaanse ministerie van Defensie via de congressionally directed medical research programs onder Award No. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteur en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het ministerie van Defensie. Dit materiaal is gebaseerd op werk dat wordt ondersteund door het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program onder Grant No. 1937971. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van de National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adjustable pipettes any adjustable pipette
Aluminum foil VWR 89107-726
Bio-Plex cell lysis kit C Bio-Rad 171304012
BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile BrandTech 781602 96
Complete mini protease inhibitor tablet Sigma-Aldrich 11836153001
Depilatory cream Amazon Nair
DiH2O VWR VWRL0200-1000
Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates Millipore Sigma Catalogue 40-285
Hardware Autocorrelator Board www.correlator.com Flex05-8ch
Isoflurane 250 mL MED-VET INTERNATIONAL RXISO-250
Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) VWR 21905-026
Laboratory vortex mixer VWR 10153-838
LabView National Instruments LabVIEW
Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software Luminex Corporation
Luminex Drive Fluid Luminex MPXDF-4PK
Luminex sheath fluid EMD Millipore SHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay Millipore Sigma MCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay Millipore Sigma 48-660MAG
Mini LabRoller rotator VWR 10136-084
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
Phosphate-buffered Saline (PBS) VWR 97064-158
Plate Sealer VWR 82050-992
Polypropylene microfuge tubes VWR 20901-547
Mini LabRoller Millipore Sigma Z674591
Reagent Reservoirs VWR 89094-668
R Programming Language
RStudio www.rstudio.com
Sonicator
Titer plate shaker VWR 12620-926
Tween20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
1 m acrylic guide tube McMaster-Carr 49035K85
4 photon counting avalanche photodiode Perkin-Elmer SPCM-AQ4C-IO
400 um multimode source fiber Thorlabs Inc. FT-400-EMT
54 g bolt Ace Hardware 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length
780 nm single mode detector fiber Thorlabs Inc. 780HP
852 nm long-coherence length laser TOPTICA Photonics iBeam smart

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
  2. Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
  3. Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
  4. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  5. Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , National Academies Press (US). Washington (DC). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169016/ (2014).
  6. Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
  7. McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
  8. Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
  9. Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).
  10. Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
  11. Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
  12. Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
  13. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
  14. Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
  15. Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
  16. Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
  17. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury--part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
  18. Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
  19. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
  20. Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
  21. Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).
  22. Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).
  23. Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
  24. Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
  25. Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
  26. Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).
  27. Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
  28. Bertrand, F., Maumy-Bertrand, M. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019).
  29. White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322 (2011).
  30. Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).
  31. Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
  32. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
  33. Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
  34. Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).

Tags

Neurowetenschappen Mild traumatisch hersenletsel cerebrale bloedstroom neuro-inflammatie multiplexed ELISA partiële kleinste kwadraten regressie cytokines fosfo-eiwitten
Systeemanalyse van de neuro-inflammatoire en hemodynamische respons op traumatisch hersenletsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brothers, R. O., Bitarafan, S.,… More

Brothers, R. O., Bitarafan, S., Pybus, A. F., Wood, L. B., Buckley, E. M. Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (183), e61504, doi:10.3791/61504 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter