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Neuroscience

Analyse systémique de la réponse neuroinflammatoire et hémodynamique aux lésions cérébrales traumatiques

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/61504
Automatic Translation
*1, *2,3, 1,3, *1,2,3, *1,4,5
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole présente des méthodes pour caractériser la réponse neuro-inflammatoire et hémodynamique à une lésion cérébrale traumatique légère et pour intégrer ces données dans le cadre d’une analyse des systèmes multivariés utilisant la régression partielle des moindres carrés.

Abstract

Les lésions cérébrales traumatiques légères (TBI) constituent un problème de santé publique important. Une exposition répétée au TCC peut entraîner des déficits fonctionnels cumulatifs et durables. De nombreuses études menées par notre groupe et d’autres ont montré que le TCC stimule l’expression des cytokines et active la microglie, diminue le flux sanguin cérébral et le métabolisme et altère la réactivité cérébrovasculaire. De plus, plusieurs travaux ont rapporté une association entre les dérangements dans ces marqueurs neuro-inflammatoires et hémodynamiques et les troubles cognitifs. Nous détaillons ici les méthodes permettant de caractériser la réponse des tissus neuro-inflammatoires et hémodynamiques au TCC chez la souris. Plus précisément, nous décrivons comment effectuer un modèle de perte de poids de l’ITCm, comment mesurer longitudinalement le flux sanguin cérébral à l’aide d’une technique optique non invasive appelée spectroscopie de corrélation diffuse, et comment effectuer un immunodosage multiplexé Luminex sur des échantillons de tissu cérébral pour quantifier les cytokines et les phospho-protéines immunomodulatrices (par exemple, dans les voies MAPK et NFκB) qui répondent et régulent l’activité de la microglie et d’autres cellules immunitaires neurales. Enfin, nous détaillons comment intégrer ces données à l’aide d’une approche d’analyse de systèmes multivariés pour comprendre les relations entre toutes ces variables. Comprendre les relations entre ces variables physiologiques et moléculaires nous permettra en fin de compte d’identifier les mécanismes responsables de l’ITM.

Introduction

Aperçu
Les lésions cérébrales traumatiques légères (TBI) touchent environ 1,6 à 3,8 millions d’athlètes chaque année1. Ces blessures, y compris les commotions cérébrales et commotionnelles, peuvent laisser les patients avec des symptômes physiques, émotionnels, psychologiques et cognitifs transitoires2. De plus, les ITM répétitifs (ITMR) maintenus dans une « fenêtre de vulnérabilité » peuvent entraîner une gravité et une durée cumulatives des conséquences cognitives qui durent plus longtemps que les effets d’un seul TCC seul3, et finalement même à une perte permanente de la fonction 4,5,6. Bien que de nombreux patients se rétablissent dans un délai relativement court (<1 semaine), 10 à 40% des patients souffrent d’effets plus durables du TCC pendant > 1 mois, certains pouvant durer jusqu’à 1 an 3,7,8,9. Malgré la prévalence élevée et les conséquences durables de ces blessures, les mécanismes des blessures sont mal compris et aucune stratégie de traitement efficace n’existe.

Compte tenu de la grande variabilité des résultats après un TCC/ITRM, l’un des défis à relever pour identifier les déclencheurs moléculaires à un stade précoce des tissus obtenus dans les études sur les ITCm/ITRM en phase terminale est le manque de données longitudinales démontrant des « liens moléculaires aigus » définitifs de ces déclencheurs moléculaires avec des résultats à plus long terme. Pour surmonter ce défi, notre groupe a découvert que le débit sanguin cérébral extrêmement réduit mesuré de manière aiguë à l’aide d’un outil optique appelé spectroscopie de corrélation diffuse (DCS) est fortement corrélé avec les résultats cognitifs à long terme dans un modèle murin de rmTBI10. En utilisant ce biomarqueur hémodynamique, nous avons montré que les souris ayant un flux sanguin cérébral extrêmement bas (et, par extension, un résultat à long terme prédit pire) ont des augmentations aiguës concomitantes de la signalisation phospho neuronale dans les voies MAPK et NFκB, une augmentation de l’expression neuronale des cytokines pro-inflammatoires et une augmentation de l’expression du marqueur phagocytaire / microglial Iba111 . Ces données suggèrent un rôle possible pour la signalisation neuronale des phosphos, l’expression des cytokines et l’activation microgliale à la fois dans la régulation aiguë du flux sanguin cérébral après une blessure ainsi que dans le déclenchement d’une cascade de signalisation qui conduit à un dysfonctionnement neuronal et à des résultats cognitifs pires. Ici, nous détaillons notre approche pour sonder simultanément l’environnement hémodynamique et neuroinflammatoire après rmTBI et comment intégrer ces ensembles de données complexes. Plus précisément, nous décrivons les procédures pour quatre étapes clés de cette approche globale : (1) un modèle de perte de poids de lésion cérébrale traumatique légère, (2) l’évaluation du flux sanguin cérébral avec spectroscopie de corrélation diffuse, (3) la quantification de l’environnement neuroinflammatoire et (4) l’intégration des données (Figure 1). Ci-dessous, nous fournissons une brève introduction à chacune de ces étapes clés pour aider à guider les lecteurs à travers la raison d’être de nos méthodes. Le reste du manuscrit fournit un protocole détaillé pour chacune de ces étapes clés.

Modèle de perte de poids d’une lésion cérébrale traumatique légère
Bien qu’il existe de nombreux excellents modèles précliniques de TCC légerrépétitifs 12,13,14,15,16,17,18, nous utilisons un modèle de lésion de la tête fermée bien établi et cliniquement pertinent. Les principales caractéristiques de ce modèle comprennent (1) l’impact contondant du crâne et du cuir chevelu intact suivi d’une rotation sans restriction de la tête autour du cou, (2) aucune lésion cérébrale structurelle manifeste, œdème, lésion de la barrière hémato-encéphalique, mort cellulaire aiguë ou perte chronique de tissu cérébral, et (3) déficits cognitifs persistants (jusqu’à 1 an) qui n’apparaissent qu’après plusieurs coups19 (Figure 2).

Évaluation du flux sanguin cérébral par spectroscopie de corrélation diffuse
La spectroscopie de corrélation diffuse (DCS) est une technique optique non invasive qui mesure le flux sanguin 5,20,21. Dans DCS, une source de lumière proche infrarouge est placée à la surface du tissu. Un détecteur est placé à une distance fixe de la source à la surface du tissu pour détecter la lumière qui s’est multipliée diffusée à travers le tissu (Figure 3). La diffusion des globules rouges en mouvement fait fluctuer l’intensité lumineuse détectée avec le temps. Un modèle analytique simple connu sous le nom de théorie de la diffusion de corrélation est utilisé pour relier ces fluctuations d’intensité à un indice de flux sanguin (CBFi, Figure 4). Bien que les unités de CBFi (cm2/s) ne soient pas les unités traditionnelles de débit (mL/min/100 g), une étude antérieure chez la souris a montré que la CBFi est fortement corrélée au flux sanguin cérébral mesuré par IRM21 marquée par spin artériel.

À titre de référence, l’instrument DCS utilisé ici a été construit en interne et est composé d’un laser de 852 nm de longueur de cohérence, d’un réseau de photodiodes d’avalanche de comptage de 4 photons et d’une carte d’autocorrélation matérielle (tau unique, 8 canaux, temps d’échantillonnage minimum de 100 ns)21,22. Les données sont acquises avec un logiciel maison écrit en LabView. L’interface animale de l’appareil se compose d’une fibre source multimode de 400 μm (gamme de longueurs d’onde de 400 à 2200 nm, noyau de silice pure, revêtement dur TECS) et d’une fibre de détection monomode de 780 nm (gamme de longueurs d’onde de 780 à 970 nm, noyau de silice pure, revêtement dur TECS, coupure de 730 ± de 30 nm en deuxième mode) espacée de 6 mm et intégrée dans un capteur noir imprimé en 3D (4 mm x 8 mm, Graphique 3).

Quantification de l’environnement neuro-inflammatoire
Bien que la neuroinflammation soit régulée par divers processus cellulaires, deux mécanismes clés pertinents sont la signalisation extracellulaire par les cytokines/chimiokines et la signalisation intracellulaire par les phospho-protéines. Pour étudier l’environnement neuro-inflammatoire du cerveau après une lésion, les cerveaux sont extraits de souris, microdisséqués, et les cytokines/chimiokines et les phospho-protéines sont quantifiées à l’aide de Luminex (Figure 5, Figure 6, Figure 7). Les immunoessais multiplexés Luminex permettent la quantification simultanée d’une collection diversifiée de ces protéines en couplant des tests immuno-enzymatiques (ELISA) à des billes magnétiques marquées par fluorescence. Des étiquettes fluorescentes distinctes sont utilisées pour chaque protéine d’intérêt, et les perles de chaque étiquette sont fonctionnalisées avec un anticorps de capture contre cette protéine particulière. Des centaines de perles pour capturer chaque protéine sont mélangées ensemble, placées dans une plaque de 96 puits et incubées avec un échantillon. Après l’incubation de l’échantillon, un aimant est utilisé pour piéger les perles dans le puits pendant que l’échantillon est lavé. Ensuite, l’anticorps de détection biotinylé se lie à l’analyte d’intérêt pour former un sandwich anticorps-antigène similaire à un ELISA traditionnel, mais avec l’ELISA pour chaque protéine se produisant sur une perle différente marquée par fluorescence. L’ajout de streptavidine conjuguée à la phycoérythrine (SAPE) complète chaque réaction. L’instrument Luminex lit ensuite les perles et sépare le signal en fonction de chaque étiquette fluorescente / protéine.

Intégration des données
En raison du grand nombre d’analytes (p. ex. cytokines) mesurés dans le test Luminex, l’analyse des données peut être difficile à interpréter si chaque protéine quantifiée est analysée individuellement. Pour simplifier l’analyse et saisir les tendances observées chez les analytes, nous utilisons une méthode d’analyse multivariée appelée régression partielle des moindres carrés (PLSR, Figure 8)23. Le PLSR fonctionne en identifiant un axe de poids correspondant à chaque protéine mesurée (c.-à-d. cytokines ou phospho-protéines, appelées « variables prédictives ») qui, ensemble, expliquent de manière optimale la co variance des protéines mesurées avec une variable de réponse (p. ex., le flux sanguin cérébral). Les poids sont appelés « charges » et sont assemblés en un vecteur connu sous le nom de variable latente (LV). En projetant (ce qu’on appelle le « scoring ») les données sur les protéines mesurées sur chacune des deux LV, les données peuvent être retracées en termes de ces LV. Après avoir calculé le PLSR, nous utilisons une rotation varimax pour identifier un nouveau LV qui maximise la covariance entre les projections de l’échantillon sur le LV et la variable prédictive24. Cette approche nous permet de définir LV1 comme l’axe pour lequel la variance de la variable de réponse est la mieux expliquée. La VL2 maximise la copartisance entre la variable de réponse et les données résiduelles de la VL1, qui peuvent être associées à une variabilité biologique ou technique entre les échantillons. Enfin, nous effectuons une validation croisée LOOCV (Leave One Out Cross Validation) pour nous assurer que le modèle PLSR ne dépend pas fortement d’un échantillon23.

Dans ce protocole, nous détaillons les méthodes pour caractériser la réponse des tissus neuro-inflammatoires et hémodynamiques au TCC. Le flux de travail général est décrit à la figure 1. Dans ce protocole, les souris sont soumises à un ou plusieurs TLIS en utilisant un modèle de traumatisme crânien fermé en chute libre. Le débit sanguin cérébral est mesuré longitudinalement avant et à plusieurs moments après la blessure. Au moment de l’interrogation des changements neuro-inflammatoires, l’animal est euthanasié et le cerveau est extrait. Les régions cérébrales d’intérêt sont isolées par microdissection, puis lysées pour extraire des protéines. Les lysats sont ensuite utilisés à la fois pour les immunoessais multiplexés Luminex de l’expression des cytokines et des phospho-protéines ainsi que pour le Transfert Western. Enfin, cet ensemble de données holistique est intégré à l’aide d’une analyse de régression partielle des moindres carrés.

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Protocol

Toutes les procédures animales sont approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Emory (IACUC) et ont suivi les lignes directrices des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Modèle de perte de poids d’une lésion cérébrale traumatique légère

  1. Préparez la configuration du poids. Montez une visière sur une surface plane avec un tube de guidage de 1 m (2,54 cm de diamètre intérieur) aligné verticalement (vérifier à l’aide d’un niveau). Utilisez un boulon de 54 g (0,95 cm de diamètre de base du corps, 2 cm de diamètre de la tête, 10,2 cm de longueur) pour l’impact.
  2. Anesthésiez brièvement la souris. Induire la souris avec 4,5% d’isoflurane dans 100% d’oxygène pendant 45 secondes. Confirmez une profondeur suffisante de l’anesthésie par l’absence de réponse au pincement des orteils.
  3. Induire une blessure.
    1. Retirez rapidement la souris de l’anesthésie et placez la souris couchée au centre d’une membrane mince (tissu de 11,2 cm x 21,3 cm).
    2. Utilisez les deux mains pour maintenir le tissu tendu avec la souris couchée au centre. Fixez la queue de la souris sous un pouce. Placez la tête de la souris sous le tube de guidage (Figure 2).
    3. Déposez le boulon du haut du tube de guidage sur l’aspect dorsal de la tête de la souris, en visant un impact entre l’arrière des yeux et l’avant des oreilles. Lors de l’impact, la souris pénètre dans le tissu, ce qui permet une accélération rapide de la tête autour du cou (Figure 2).
  4. Récupération
    1. Après l’impact, placez la souris sur un coussin chauffant à 37 °C dans l’air ambiant. Surveiller la récupération pendant 1 h après la blessure. Dans les 1 h, les souris devraient être capables de se déplacer normalement, de trouver de la nourriture et de l’eau et de ne pas présenter de déficits moteurs globaux.
      REMARQUE : L’analgésie n’est pas utilisée selon l’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux, ce qui est justifié en raison de l’influence confondante de l’analgésie sur les paramètres d’intérêt (c.-à-d. le flux sanguin cérébral, les marqueurs de l’inflammation). La perte de conscience, définie comme le temps écoulé entre le retrait de l’anesthésie et le moment de retrouver le réflexe de redressement, est attendue et dure généralement de 20 s à 3 minutes (tableau supplémentaire 1). De brefs épisodes (<30 s) d’apnée et/ou d’activité semblable à une crise peuvent être observés, en particulier après des traumatismes crâniens répétitifs espacés une fois par jour.
  5. Répétez l’opération au besoin. Cette blessure peut se répéter une fois par jour, une fois par semaine ou une fois par mois. Le nombre et l’espacement des blessures dépendent de la gravité souhaitée des blessures. En règle générale, nous utilisons cinq coups espacés une fois par jour pour induire des déficits robustes dans l’apprentissage spatial et la mémoire.
    REMARQUE: Des études antérieures ont montré que cinq coups espacés une fois par jour sont suffisants pour induire des déficits dans l’apprentissage spatial et la mémoire qui durent plus de 1 an après la blessure sans œdème, hémorragie ou lésion structurelle manifeste du cerveau19. Les souris sont pesées quotidiennement et étroitement surveillées pour détecter les signes de déshydratation, les déficits moteurs et la perte d’appétit. Si elles sont déshydratées, les souris reçoivent un chow humide et une injection sous-cutanée de 1 mL de solution saline une fois par jour. Afin d’éviter des souffrances inutiles et d’assurer un critère d’évaluation sans cruauté, les souris sont euthanasiées si: la déshydratation persiste ou s’aggrave >24 h après le traitement salin sous-cutané, le poids corporel diminue de plus de 20% par rapport à la base de référence avant la blessure, des déficits moteurs tels que des cercles ou des traînées de pattes apparaissent et persistent >1 heure après la blessure.

2. Évaluation du flux sanguin cérébral par spectroscopie de corrélation diffuse

  1. Acquisition de données DCS
    1. Enlevez les poils sur le cuir chevelu. Parce que DCS fonctionne mieux en l’absence de poils, il est nécessaire d’enlever la fourrure sur la tête avant le début des expériences. En règle générale, l’épilation est effectuée 1 à 3 jours avant le début de l’étude.
      1. Induire les souris avec 4,5% d’isoflurane dans 100% d’oxygène pendant 45 secondes et maintenir avec 1-2% d’isoflurane dans 100% d’oxygène.
      2. Rasez la tête entre les yeux et les oreilles. Ensuite, utilisez une crème dépilatoire pour enlever la fourrure sur la tête comme dans la figure 3.
      3. Laissez l’animal se remettre de l’anesthésie sur un coussin chauffant, puis retournez en cage.
    2. Mesurez le flux sanguin cérébral avec DCS. Pour minimiser les artefacts de mouvement pendant la mesure, étudiez les souris sous une brève anesthésie à l’isoflurane.
      REMARQUE: Surveillez visuellement la respiration et la réponse au pincement des orteils tout au long des mesures et ajustez la concentration d’isoflurane au besoin pour assurer une profondeur d’anesthésie constante. Des variations significatives de la profondeur de l’anesthésie pourraient altérer le flux sanguin compte tenu des effets vasomodulateurs connus de l’isoflurane25.
      1. Induire avec 4,5% d’isoflurane dans 100% d’oxygène pendant 45 secondes, puis maintenir avec 1,0-1,75% d’isoflurane dans 100% d’oxygène. Confirmez une profondeur suffisante de l’anesthésie par l’absence de réponse au pincement des orteils et une respiration normale (entre ~ 60 et 80 respirations par minute).
      2. Après une période de stabilisation de 2 minutes, placez doucement le capteur DCS sur l’hémisphère droit de manière à ce que le bord supérieur du capteur optique s’aligne avec l’arrière de l’œil et le côté du capteur s’aligne le long de la ligne médiane (Figure 3). Coupez une main sur le capteur pour le protéger de la lumière de la pièce. Acquérir 5 secondes de données (acquisition 1 Hz).
      3. Repositionnez le capteur sur l’hémisphère gauche et acquérez 5 secondes de données.
      4. Répétez 3 fois/hémisphère pour tenir compte des hétérogénéités locales sous la surface du tissu.
    3. Récupération
      1. Retirez la souris de l’anesthésie et placez-la sur un coussin chauffant.
      2. Une fois que la souris a retrouvé son réflexe de redressement, retournez-la dans la cage.
  2. Analyse des données DCS
    1. Effectuer le contrôle de qualité initial. Chaque image de données DCS se compose d’une fonction Equation 110 d’autocorrélation d’intensité normalisée mesurée (Figure 4A) et d’un taux de comptage de photons (kHz).
      1. Pour supprimer les trames de données avec un artefact de mouvement significatif, ignorez les images de données pour lesquelles la valeur moyenne de la queue de la Equation 110 courbe (c’est-à-dire Equation 111) est > 1,005.
      2. Pour supprimer les trames de données avec un faible rapport signal/bruit, ignorez les trames de données si le taux de comptage de photons détecté est < 20 kHz.
    2. Extraire l’indice de flux sanguin cérébral. À l’aide de fminsearch dans Matlab, ajustez chaqueième trame de Equation 112 données mesurée pour CBFi(i). Limitez les ajustements à Equation 113, et recherchez la valeur de CBFi qui minimise la fonction de coût suivante :
      Equation 114
      Où la somme est sur tous les temps de retard mesurésEquation 115, et Equation 116 est la solution homogène semi-infinie de l’équation de diffusion de corrélation (Figure 4B) :
      Equation 117
      Ici, β est un facteur de cohérence déterminé par le dispositif expérimental, Equation 7, Equation 8, Equation 9, Equation 10, Equation11, Reff = 0,493 pour un indice de réfraction tissulaire supposé de 1,4, ρ est de 6 mm, et μ a et μ sont le coefficient d’absorption et de diffusion réduit du tissu (supposé être de 0,25 et 9,4/cm, respectivement 10,26,27).
      REMARQUE: Étant donné que β peut varier d’environ 10% au fil du temps, adaptez chaque trame de données pour β et CBFi simultanément.
    3. Effectuer un contrôle de qualité secondaire. Dans chaque répétition (qui se compose de 5 trames de données), éliminez les valeurs aberrantes. Les valeurs aberrantes sont définies comme les valeurs CBFi qui se situent en dehors des écarts-types de 1,5 du CBFi moyen pour cette répétition. Si plus de 1 point de données est identifié comme une valeur aberrante, ignorez toute la répétition.
    4. Estimer l’indice moyen du débit sanguin cérébral : Estimer un CBFi moyen par hémisphère en prenant la moyenne de toutes les bases de données pour toutes les répétitions (Figure 4C). Si aucune différence hémisphérique significative n’est observée, faites la moyenne entre les hémisphères pour obtenir une estimation de la moyenne globale CBFi.

3. Quantification multiplexée des cytokines et des phospho-protéines à l’aide de tests luminex

  1. Extraction tissulaire
    REMARQUE: La quantification des cytokines cérébrales et des protéines de signalisation phospho à l’aide de Luminex nécessite une extraction tissulaire.
    1. Anesthésier la souris en utilisant 4,5% d’isoflurane dans 100% d’oxygène pendant 1-2 min. Vérifiez le plan profond de l’anesthésie via l’absence de réponse de pincement des orteils. Euthanasier par décapitation.
    2. Récoltez le tissu.
      1. Retirez le cerveau. En règle générale, fixez l’hémisphère gauche pour l’histologie et microdissectez plusieurs régions de l’hémisphère droit dans le cortex et l’hippocampe (Figure 5).
      2. Placer les échantillons disséqués dans des tubes de microcentrifugation, congeler instantanément dans de l’azote liquide. Pour l’analyse des protéines sensibles au gel, il est optimal de subdiviser les sections de tissus avant la congélation éclair afin d’éviter un gel-dégel ultérieur.
        REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause et les échantillons de tissus peuvent être conservés à -80 ° C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à lyser les échantillons. Alternativement, les échantillons peuvent être lysés, puis stockés à -80 ° C.
    3. Échantillons de lyse.
      1. Préparer le tampon de lyse en ajoutant un inhibiteur de protéase et 2 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle au tampon de lyse.
      2. Ajouter 150 μL du tampon de lyse mixte pour environ 3 μg de tissu animal. À titre de référence, les échantillons de tissus du cortex visuel de souris sont d’environ 3 μg.
      3. Pour homogénéiser le tissu, triturez mécaniquement le tissu en le pipetant de haut en bas ~ 15-20 fois à l’aide d’une pipette de 1000 μL. Pour une trituration optimale de l’échantillon, un pilon homogénéisateur peut être utilisé.
      4. Placez les tubes d’échantillonnage sur un rotateur pendant 30 min à 4°C.
      5. Centrifugez les échantillons à 4 °C pendant 10 min à environ 15 000 x g et prélevez le surnageant. Les échantillons peuvent être traités immédiatement ou stockés à -80 °C pour une analyse plus approfondie.
        REMARQUE: Les lysats d’échantillon préparés à l’aide de ce protocole sont compatibles avec le transfert western, à partir duquel le marqueur phagocytaire / microglial Iba1 et / ou le marqueur d’activation des astrocytes GFAP peuvent être analysés pour compléter l’analyse des cytokines et des phospho-protéines pour les études de neuroinflammation11.
  2. Protocole d’immuno-dosage multiplex pour les cytokines et les phospho-protéines
    REMARQUE: Bien que similaire dans l’ensemble, il existe quelques différences mineures dans les protocoles pour les kits de cytokines et de phospho-protéines. Des différences sont notées à chaque étape. Les étapes de préparation des échantillons pour le test Luminex sont décrites ci-dessous.
    1. Préparation des réactifs (jour 1, idem pour les cytokines et les phospho-protéines)
      1. Laissez les réactifs se réchauffer à la température ambiante (~30 min).
      2. Bouteille de billes magnétiques multiplex sonicate pendant 30 secondes suivie de 1 min de vortex. Assurez-vous que les billes magnétiques multiplex sont protégées de la lumière avec du papier d’aluminium ou utilisez des bouteilles de protection lumineuses fournies.
      3. Préparez le tampon de lavage en mélangeant 0,1% de Tween20 dans 1xPBS ou utilisez le tampon de lavage fourni dans le kit.
    2. Préparation d’échantillons de tissus lysés (jour 1, idem pour les cytokines et les phospho-protéines)
      1. S’ils sont déjà congelés, retirez les échantillons de tissus lysés du congélateur et laissez décongeler sur la glace (~20 min). Centrifugez les échantillons pendant 10 min à 9 167 x g pour éliminer le précipité.
      2. Préparer 25 μL d’échantillon à la concentration protéique optimale déterminée par l’analyse linéaire (voir rubrique 3.3). Pour normaliser le volume total de tous les échantillons, diluer les échantillons dans le tampon d’essai fourni dans le kit.
    3. Préparation de la plaque de 96 puits (jour 1, idem pour les cytokines et les phospho-protéines)
      1. Utilisez la plaque de 96 puits incluse dans le kit ou une plaque avec un fond mince (par exemple, Brand Tech).
      2. Ajouter 200 μL de tampon de lavage (ou 1x PBS, 0,1% Tween) dans chaque puits et mélanger sur agitateur sur plaque pendant 10 min à 750 tr/min.
      3. Tampon de lavage décantant et tapotez la plaque sur une serviette en papier pour éliminer les résidus.
    4. Procédure d’immunodosage pour les cytokines (jour 1)
      1. Ajoutez ce qui suit à chaque puits dans l’ordre.
        1. Ajouter 25 μL de tampon d’essai à tous les puits.
          1. Ajouter 25 μL de tampon d’essai supplémentaire UNIQUEMENT aux puits de fond. Pour chaque essai expérimental, avoir au moins deux puits de fond. Les puits de fond n’ont pas d’échantillon chargé et définissent l’intensité fluorescente lue par l’instrument sans échantillon.
          2. Ajouter 25 μL de chaque échantillon dilué aux puits d’échantillonnage correspondants.
          3. Ajouter 25 μL de 1x billes magnétiques multiplex à tous les puits (Figure 6). Assurez-vous de vortexer les perles pendant 1 min avant d’ajouter aux puits.
      2. Scellez la plaque avec un scellant à plaque et recouvrez la plaque avec du papier d’aluminium. Incuber toute la nuit (12-16 h) à 2-8 °C.
    5. Procédure d’immunodosage pour les cytokines (jour 2)
      1. Placez la plaque de 96 puits sur le séparateur magnétique, en vous assurant que les puits sont alignés avec les aimants. Laisser reposer pendant 2 min. Décantez le contenu du puits alors que la plaque est encore fixée au séparateur magnétique.
      2. Lavez la plaque 2 fois en suivant les étapes suivantes.
        1. Ajouter 200 μL de tampon de lavage à chaque puits et placer sur le shaker pendant 2 min à température ambiante.
        2. Placez la plaque de puits sur le séparateur magnétique pendant 2 min à température ambiante.
        3. Décantez le contenu du puits pendant que la plaque du puits est toujours fixée au séparateur magnétique.
      3. Ajouter 25 μL d’anticorps de détection par puits (figure 6). Couvrir avec du papier d’aluminium. Incuber pendant 1 heure sur un agitateur à plaque (750 tr/min) à température ambiante.
      4. Laissez l’anticorps de détection à l’intérieur et ajoutez 25 μL de streptavidine-phycoérythrine (SAPE) à chaque puits (figure 6). Couvrir avec du papier d’aluminium. Incuber pendant 30 min sur agitateur sur plaque (750 tr/min) à température ambiante.
      5. Placez la plaque du puits sur un séparateur magnétique et laissez reposer pendant 2 min. Décanter le contenu du puits et se détacher du séparateur magnétique.
      6. Lavez la plaque du puits deux fois (voir étape 3.2.5.2).
      7. Ajoutez 75 μL de fluide d’entraînement Luminex (si vous utilisez un instrument MAGPIX) à chaque puits ou tampon d’essai (si vous utilisez un instrument 200 ou FlexMap 3D). Re-suspendre les perles sur le shaker à plaque pendant 5 min à température ambiante.
      8. Lisez sur Luminex Instrument (MAGPIX, 200 ou FlexMap 3D), en vous référant au manuel de l’utilisateur pour un bon fonctionnement (Figure 6).
    6. Procédure d’immunodosage pour les phospho-protéines (jour 1)
      1. Ajoutez ce qui suit à chaque puits dans l’ordre.
        1. Ajouter 25 μL de tampon d’essai à tous les puits.
          1. Ajouter 25 μL de tampon d’essai supplémentaire UNIQUEMENT aux puits de fond. Pour chaque essai expérimental, il est recommandé d’avoir au moins deux puits de fond. Les puits de fond n’ont pas d’échantillon chargé et définissent l’intensité fluorescente lue par l’instrument sans échantillon.
          2. Ajouter 25 μL de chaque échantillon dilué à chaque puits d’échantillonnage.
          3. Ajouter 25 μL de 1x billes magnétiques multiplex à tous les puits (Figure 6).
            REMARQUE: Le kit de dosage Luminex fournit une bille magnétique multiplex dans une solution mère 20x. Assurez-vous de vortex 20x stock multiplex solution de billes magnétiques pendant 2 min, puis diluez-la dans un tampon de dosage à 1x solution. Vortex 1x suspension de billes magnétiques multiplex pendant 1 min avant d’ajouter aux puits.
        2. Scellez la plaque avec un scellant à plaque et recouvrez la plaque avec du papier d’aluminium. Incuber pendant la nuit (12-16 heures) à 2-8 °C.
    7. Procédure d’immunodosage pour les phospho-protéines (jour 2)
      1. Placez la plaque de puits sur un séparateur magnétique, en vous assurant que la plaque de puits est entièrement alignée avec le séparateur magnétique. Laisser reposer pendant 2 min. Décanter le contenu du puits pendant que la plaque du puits est toujours fixée au séparateur magnétique.
      2. Lavez la plaque 2 fois (voir l’étape b de la procédure d’immunodosage de cytokine jour 2).
      3. Diluer l’anticorps de détection de stock 20x à 1x solution dans le tampon de dosage. Ajouter 25 μL d’anticorps de détection 1x par puits (Figure 6). Couvrir avec du papier d’aluminium. Incuber pendant 1 h sur agitateur sur plaque (750 tr/min) à température ambiante.
      4. Placez la plaque de 96 puits sur un séparateur magnétique et laissez reposer pendant 2 min. Décanter le contenu du puits, se détacher du séparateur magnétique.
      5. Diluer 25x stock SAPE dans le tampon de dosage à 1x tampon. Ajouter 25 μL de 1x SAPE (Figure 6). Couvrir de papier d’aluminium et incuber pendant 15 min sur agitateur à plaque (750 tr/min) à température ambiante.
      6. Laissez le SAPE dans les puits et ajoutez 25 μL de tampon d’amplification à chaque puits. Couvrir avec du papier d’aluminium.
      7. Incuber pendant 15 min sur agitateur sur plaque (750 tr/min) à température ambiante.
      8. Placez la plaque de puits sur le séparateur magnétique pendant 2 min. Décantez le contenu du puits et détachez-vous du séparateur magnétique.
      9. Ajoutez 75 μL de fluide d’entraînement Luminex (si vous utilisez un instrument MAGPIX) ou un tampon de dosage (si vous utilisez un instrument 200 ou FlexMap 3D). Remettez les perles sur un agitateur à plaque pendant 5 minutes à température ambiante.
      10. Lisez sur l’instrument Luminex (MAGPIX, 200 ou FlexMap 3D), en vous référant au manuel de l’utilisateur pour un bon fonctionnement (Figure 6).
  3. Linéarité de la courbe de dilution de l’échantillon
    1. Préparation des échantillons: Diluer en série des échantillons d’essai avec une concentration différente de protéines totales. Pour les tissus cérébraux en vrac, chargez les dilutions en série de 0 à 25 μg pour les cytokines et de 0 à 12 μg pour les phospho-protéines. La concentration en protéines totales peut être mesurée à l’aide d’un test d’acide bicinchoninique (ACA).
    2. Immunodosage multiplex : Effectuer le test Luminex (voir rubrique 3.2) sur des échantillons sélectionnés.
    3. Analyse des données
      1. Tracer l’intensité fluorescente pour chaque protéine par rapport à la quantité de protéines chargées (figure 7).
      2. Pour chaque analyte, déterminer la plage de protéines totales chargées pour lesquelles la relation entre la protéine totale et la lecture de l’intensité fluorescente est linéaire (figure 7).
      3. Pour déterminer la quantité de protéines totales qui doit être chargée pour l’essai complet, identifiez la partie linéaire de la courbe pour chaque analyte, puis sélectionnez une concentration de protéines qui se situe dans la plage linéaire pour la majorité des analytes.
        REMARQUE: Bien que la plupart des protéines partagent une plage linéaire similaire, les plages linéaires peuvent ne pas se chevaucher pour toutes les protéines. Si tel est le cas, il peut être nécessaire d’exécuter chaque échantillon plusieurs fois avec différentes quantités de protéines totales chargées. Alternativement, les échantillons non linéaires peuvent être exclus de l’analyse. De plus, certaines protéines peuvent ne pas avoir une plage linéaire.

4. Régression partielle des moindres carrés

REMARQUE : Un exemple de code R et un exemple de feuille de calcul de données sont fournis pour effectuer l’analyse partielle des moindres carrés.

  1. Préparation des données : Mettez en forme les données comme indiqué dans l’exemple de feuille de calcul de données fourni, « MyData ». Incluez les noms des variables dans la ligne 1, les noms des exemples dans la colonne A, la variable de réponse dans la colonne B et toutes les variables prédictives dans les colonnes C+. Remplissez les deux dernières lignes avec les données d’arrière-plan et définissez les deux exemples de noms sur « Arrière-plan ».
  2. Régression partielle des moindres carrés dans RStudio
    1. Installez R à partir de www.r-project.org (gratuit, open source).
    2. Installez RStudio Desktop à partir de www.rstudio.com (licence open source gratuite).
    3. Téléchargez l’exemple de code R fourni avec cette publication, « PLSR_Sample_Code.R » et enregistrez-le dans le même dossier que celui qui contient la feuille de calcul de données. Ouvrez le fichier de code dans RStudio.
    4. Dans la section Entrée utilisateur , remplacez « dataFileName » par le nom de la feuille de calcul de données.
    5. Effectuez les étapes suivantes en mettant en surbrillance la section de code à exécuter et en cliquant sur Exécuter dans le coin supérieur droit du script.
      1. Chargez les packages R nécessaires, les fonctions, l’adresse du répertoire de travail et les valeurs d’entrée utilisateur dans RStudio (sous-section « Préliminaires »).
      2. Chargez les données dans RStudio et préparez les données brutes pour le traitement en soustrayant le signal de fond moyen de toutes les mesures et en marquant z chaque analyte (sous-section « Lire les données et soustraire l’arrière-plan ») (Figure 8A).
      3. Effectuez une régression partielle des moindres carrés dans RStudio à l’aide du package plsRglmv1.2.5 28 disponible sur le Comprehensive R Archive Network (CRAN). Effectuer une rotation varimax (package stats v3.6.2)23 dans le plan LV1-LV2 pour identifier un nouvel axe horizontal qui sépare le mieux les échantillons par la variable de réponse (sous-section « PLS ») (Figure 8B).
      4. Effectuez une validation croisée Leave One Out (LOOCV) dans laquelle un échantillon est exclu de manière itérative des données et le modèle PLSR est recalculé. Calculer l’écart-type pour les charges d’analyte sur toutes les exécutions LOOCV (sous-section « LOOCV »).
  3. Créer des tracés représentatifs : exécutez l’exemple de code fourni comme indiqué ci-dessus pour créer des tracés représentatifs qui s’exportent automatiquement sous forme de fichiers pdf vers le répertoire de travail (le dossier contenant les fichiers de données et de code).
    1. Créez une carte thermique des données traitées comme illustré à la figure 8A (sous-section « PLS »). Colorez chaque entrée le long d’un spectre défini par z-score. Triez les analytes par l’ordre calculé dans la variable latente d’intérêt.
    2. Créez un diagramme de scores avec des scores LV1 tracés le long de l’axe horizontal et des scores LV2 tracés le long de l’axe vertical, comme illustré à la figure 8B (sous-section « PLS »). Colorez chaque point de données en fonction de sa mesure de variable de réponse pour visualiser la relation entre chaque variable latente et la variable de réponse.
    3. Créez un diagramme à barres affichant les charges pour chacune de vos variables prédictives afin de visualiser comment chaque analyte contribue aux variables latentes, comme le montre la figure 8C (sous-section « LOOCV »).
    4. Créez un graphique régressant les scores LV1 par rapport à votre variable de réponse pour visualiser dans quelle mesure le modèle PLSR sépare les échantillons, comme le montre la figure 8D (sous-section « PLS »).

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Representative Results

Les données précédemment recueillies ont été tirées de travaux antérieurs dans lesquels un groupe de huit souris C57BL/6 ont été soumises à trois blessures à la tête fermée (figure 2) espacées une fois par jour11. Dans ce travail, le flux sanguin cérébral a été mesuré par spectroscopie de corrélation diffuse 4 h après la dernière blessure (Figure 3, Figure 4). Après l’évaluation du CBF post-blessure, les animaux ont été euthanasiés et le tissu cérébral a été extrait pour la quantification des cytokines et des phospho-protéines par immunodosage (Figure 5). Nous avons également quantifié le marqueur d’activation phagocyte/microglial Iba1 via le transfert western (méthodes décrites aupoint 11). Le tissu cérébral de chaque souris a été lysé et la concentration totale en protéines a été mesurée à l’aide d’un test BCA. La quantification multiplexée des cytokines a été réalisée à l’aide de la cytokine/chimiokine 32-Plex de souris Milliplex MAP, qui a été lue à l’aide d’un système Luminex MAGPIX (Figure 6). Une analyse linéaire de l’aire de répartition a été effectuée pour déterminer une charge protéique appropriée (12 μg de protéines pour 12,5 μL de lysat) (figure 7) avant de recueillir des données sur tous les échantillons.

Les données sur les cytokines ont été préparées pour l’analyse en soustrayant les mesures de fond des données de l’échantillon, puis en marquant les données z pour chaque analyte (figure 8A). Une carte thermique a été générée à partir de données marquées z pour visualiser les différences dans l’expression des cytokines chez les animaux. La régression partielle des moindres carrés (PLSR) a été réalisée en utilisant le marqueur d’activation phagocytaire/microgliale Iba1 comme variable de réponse et les mesures de cytokines comme variables prédictives (Figure 8B). Une rotation varimax a été effectuée pour maximiser la co variance des données sur LV1 avec les mesures Iba1 (Figure 8D). Les poids de charge élevés dans LV1 (figure 8C) correspondent à l’expression de cytokines la plus associée à une expression élevée d’Iba1. Les régressions linéaires entre Iba1 et les cytokines montrent que les cytokines ayant les poids de charge les plus élevés dans la VL1 étaient également statistiquement significatives (figure 8E).

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail typique. Tout d’abord, les souris subissent une lésion de la tête fermée, puis le flux sanguin cérébral (CBF) est mesuré à l’aide de la spectroscopie de corrélation diffuse. Ensuite, les cerveaux sont collectés, les régions d’intérêt sont micro-disséquées et congelées à l’aide d’azote liquide. En préparation du test immunologique Luminex, les protéines sont lysées et la concentration totale en protéines est mesurée par un test d’acide bicinchoninique. Les lysats sont utilisés pour le transfert Western des protéines d’intérêt et les tests Luminex pour les cytokines et les phospho-protéines. Les données de CBF, Western blot et Luminex sont intégrées à l’aide de la régression partielle des moindres carrés (PLSR). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Modèle de perte de poids à tête fermée de lésion cérébrale traumatique légère. (A) La souris anesthésiée est saisie par la queue et placée sur une membrane sacrificielle tendue sous un tube guide. Un poids de 54 g est lâché de 1 m sur l’aspect dorsal de la tête. (B) Dans les ~1 ms suivant l’impact, la tête de la souris a rapidement tourné autour du cou lorsqu’elle perce la membrane sacrificielle. (C) Dans les ~5 ms suivant l’impact, toute la souris est tombée et est suspendue par sa queue agrippée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Mesure du flux sanguin cérébral par spectroscopie de corrélation diffuse. (A) Un capteur optique est doucement maintenu manuellement sur l’hémisphère droit pour mesurer le flux sanguin chez une souris anesthésiée. (B) Placement représentatif du capteur sur l’hémisphère droit. Le contour du capteur est représenté sous la forme d’un rectangle noir en pointillés, et l’emplacement de la source et des fibres du détecteur est en cercles rouges et bleus, respectivement. Le capteur est placé de telle sorte que le bord court du capteur s’aligne avec l’arrière de l’œil et que le bord long du capteur s’aligne sur la ligne médiane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse des données de spectroscopie de corrélation diffuse. (A) Courbes d’autocorrélation d’intensité mesurée représentatives, g2(τ), au départ, ligne de base pré-blessure (vert) et 4 h après 5 traumatismes crâniens fermés espacés une fois par jour (violet). Le décalage à droite de la courbe d’avant à après la blessure reflète une diminution du flux sanguin. (B) les données gEquation(τ) sont acquises à 1 Hz pendant 5 s par hémisphère et répétées à 3x/hémisphère. Chaque courbe gEquation(τ) mesurée est adaptée à la solution semi-infinie de l’équation de diffusion de corrélation pour un indice de flux sanguin cérébral (CBFi). (C) Les valeurs CBFi dans toutes les images et répétitions sont moyennées pour obtenir l’indice moyen du flux sanguin cérébral pour chaque hémisphère (désigné par une barre noire horizontale). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Microdissection cérébrale de souris. (A) Une fois que le cerveau est extrait de la souris, il est coupé en deux le long de la ligne pointillée. L’hémisphère gauche est fixé pour l’histologie et l’hémisphère droit est microdisséqué pour la pathologie. (B) Vue sagittale du cortex de l’hémisphère droit. L’hémisphère droit est microdisséqué en régions codées par couleur correspondantes. Pour l’analyse des protéines sensibles au gel, il est optimal de subdiviser les sections de tissus avant la congélation éclair. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Illustration de la procédure Luminex. (A) Ajouter des échantillons aux perles marquées par fluorescence. Les perles sont pré-enduites d’un anticorps de capture spécifique pour chaque protéine d’intérêt. B) Ajouter des anticorps de détection biotinylés. Les anticorps de détection de la biotine se lient aux analytes d’intérêt et forment un sandwich anticorps-antigène. (C) Ajouter la streptavidine conjuguée à la phycoérythrine (PE) (SAPE). SapE se lie aux anticorps de détection biotinylés, complétant la réaction. Pour les phospho-protéines, un tampon d’amplification (uniquement pour les tests de phospho-protéines) est ajouté après l’ajout à SAPE pour améliorer le signal de dosage. (D) L’instrument Luminex (MAGPIX, 200 ou FlexMap 3D) lit la réaction sur chaque bille marquée par fluorescence via une combinaison d’éclairage rouge/vert. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 7 : Illustration de la courbe de dilution de l’échantillon pour identifier la plage linéaire. Concentration en protéines des échantillons dilués en série par rapport à l’intensité fluorescente mesurée à partir du test Luminex. La plage linéaire est définie comme la plage de concentration en protéines pour laquelle la relation entre la concentration en protéines et l’intensité fluorescente est linéaire (flèche). Dans certains analytes, l’augmentation de la concentration en protéines au-delà d’une certaine limite peut diminuer la liaison des anticorps de sorte que la courbe de dilution devient non linéaire ou inversée (effet Hook). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 8 : Analyse de régression des moindres carrés partiels représentatifs (PLSR). (A) Expression de la protéine cytokine du panel (colonnes de gauche) avec expression d’Iba1 (colonne de droite) chez des souris 3xCHI (n = 8, z-score). (B) Le PLSR attribue des poids (charges) aux cytokines mesurées pour chaque variable latente. Des pondérations sont appliquées aux données mesurées pour calculer les scores de chaque échantillon sur chaque variable latente. (C) Le PLSR de 3xCHI échantillons par rapport à Iba1 a identifié un profil pondéré de cytokines, LV1, qui distinguait les échantillons par Iba1. Les cytokines de poids négatif ont été régulées à la hausse dans des échantillons à faible teneur en Iba1, tandis que les cytokines à poids positif ont été régulées à la hausse dans des échantillons à forte Iba1 (moyenne ± SD à l’aide d’un LOOCV). (D) Régression linéaire des scores LV1 pour chaque échantillon par rapport à Iba1. R2PLS mesure la qualité de l’ajustement entre Iba1 et LV1. (E) Régressions individuelles d’Iba1 par rapport à chacune des cytokines ayant les poids les plus élevés en LV1 en C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous détaillons ici les méthodes d’évaluation de la réponse hémodynamique et neuroinflammatoire à une lésion cérébrale traumatique légère répétitive. De plus, nous avons montré comment intégrer ces données dans le cadre d’une analyse de systèmes multivariés utilisant la régression partielle des moindres carrés. Dans le texte ci-dessous, nous discuterons de certaines des étapes clés et des limites associées au protocole ainsi que des avantages / inconvénients des méthodes par rapport aux méthodes existantes.

Modèle de perte de poids de lésion cérébrale traumatique légère. Cette méthode d’induction d’une lésion cérébrale traumatique est avantageuse en ce sens qu’elle présente un impact contondant suivi d’une accélération rapide de la rotation antérieure-postérieure couramment observée dans les traumatismes crâniens liés au sport10,19. Certes, le cerveau lissencéphale de la souris ne récapitule pas complètement la complexité du cerveau humain gyrocéphale; néanmoins, ce modèle induit bon nombre des mêmes séquelles cliniques et comportementales du TCC humain, y compris des déficits soutenus dans l’apprentissage spatial et la mémoire avec des blessures répétées. De plus, bien que l’impact soit de nature légère (pas de dommages structurels / neuronaux, pas de perméabilité à la barrière hémato-encéphalique, déficits cognitifs n’apparaissant qu’après plusieurs coups, etc.19), il induit une perte de conscience importante, contrairement aux humains où la perte de conscience est moins fréquente. Cette perte de conscience accrue peut être due à une interaction avec l’anesthésie administrée immédiatement avant l’impact, bien que la cause exacte ne soit pas bien comprise. Enfin, nous notons qu’il est essentiel d’aligner le tube guide de manière à ce que le boulon percute entre les sutures coronale et lamdoïde. Nous avons observé que des impacts plus postérieurs peuvent causer des déficits moteurs importants qui nécessitent une euthanasie.

Évaluation du flux sanguin cérébral avec spectroscopie de corrélation diffuse. Les mesures longitudinales non invasives du flux sanguin cérébral (CBF) avec les modalités traditionnelles utilisées dans les études sur les humains et les grands animaux, telles que l’imagerie par résonance magnétique par perfusion ou l’échographie Doppler transcrânienne, sont difficiles chez la souris pour diverses raisons, notamment la petite taille du cerveau et le volume sanguin total29. La spectroscopie de corrélation diffuse est bien adaptée chez la souris et offre les avantages supplémentaires d’être non invasive et relativement peu coûteuse par rapport à d’autres modalités20,30. Étant donné que le DCS est sensible aux artefacts de mouvement, les souris doivent être brièvement anesthésiées ou retenues31 pour évaluation. Nous utilisons généralement l’anesthésie à l’isoflurane en raison de son induction et de sa récupération rapides; cependant, l’isoflurane est un vasodilatateur cérébral, et les estimations du débit sanguin sous isoflurane doivent être interprétées avec prudence. Les diminutions du flux sanguin observées après la blessure par rapport aux animaux simulés blessés pourraient être confondues par une défaillance du système vasculaire cérébral blessé à vasodilater en réponse à l’isoflurane. Enfin, nous avons déjà démontré une excellente répétabilité intra-utilisateur des mesures du débit sanguin avec DCS chez la souris, mais seulement une répétabilité intra-utilisateur équitable21. Pour cette raison, nous recommandons que le même opérateur acquière des mesures DCS pour les expériences qui nécessitent une évaluation longitudinale du flux sanguin cérébral.

Quantification multiplexée des cytokines et des phospho-protéines à l’aide des tests Luminex. L’un des principaux défis de tout TEST ELISA est l’effet Hook, par lequel une concentration accrue de protéines peut réduire l’affinité des anticorps pour la protéine cible, entraînant ainsi une diminution du signal de dosage en réponse à une augmentation de la protéine32 (Figure 7). Cet effet peut être exacerbé lors de l’analyse de tissus entiers, dans lesquels les protéines en vrac peuvent également interférer. Ainsi, la première étape de l’utilisation des tests Luminex consiste à déterminer s’il existe une gamme de concentrations de protéines chargées pour lesquelles la lecture linéaire du test varie en fonction de la quantité de protéines chargées. Les analytes qui n’ont pas une telle plage linéaire (figure 7) doivent être exclus de l’analyse. Nous notons également que les niveaux de cytokines dans le cerveau sont généralement très faibles et apparaissent près de la limite de détection inférieure évaluée via des courbes standard fournies avec le kit Luminex. Pour cette raison, il est essentiel d’effectuer une analyse de télémétrie linéaire pour déterminer si la lecture de l’instrument reflète vraiment la quantité d’échantillon chargée. Pour les protéines clés d’intérêt, cette analyse de l’intervalle linéaire peut être complétée par un test de récupération des pics dans lequel la protéine recombinante est épilée dans un échantillon et la linéarité dans la lecture de l’instrument est évaluée33.

Parce que la neuroinflammation est régulée par diverses phospho-protéines intracellulaires et cytokines extracellulaires, il est essentiel de mesurer simultanément un large éventail de ces protéines afin de comprendre la réponse immunitaire neurale du cerveau au TCC. Les immunoessais multiplexés Luminex permettent la quantification simultanée de dizaines de cytokines et de phospho-protéines à partir d’un seul échantillon, offrant une vue holistique de la réponse immunitaire tissulaire après une blessure. Bien que ces analyses fournissent une vue d’ensemble des cytokines/chimiokines ainsi que des phospho-protéines, le test quantifie la quantité totale de chaque protéine à partir d’un homogénat tissulaire. Ainsi, il ne fournit pas de données spécifiques au type de cellule. La spécificité du type cellulaire peut être déterminée par immunohistochimie de suivi pour identifier la localisation des principales protéines d’intérêt avec des marqueurs pour les types cellulaires (par exemple, neurones, microglie, astrocytes, etc.) 11.

Analyse de régression des moindres carrés partiels pour l’intégration des données. La réponse tissulaire au TCC est multifactorielle, consistant en des changements physiologiques dans le flux sanguin ainsi que des changements dans le marqueur d’activation phagocytaire / microglial Iba1, diverses cytokines et phospho-protéines, entre autres11. En raison de la nature multiplexée des données recueillies, une méthode systématique est nécessaire pour tenir compte de la multidimensionnalité des relations entre les différentes variables prédictives. Le PLSR fournit une solution appropriée à ce problème en identifiant les LV qui identifient au maximum la co-variance entre les variables prédictives et la variable de résultat (par exemple, Iba1 dans la figure 8). Il est important de noter que les protéines dont la corrélation est forte avec la variable prédictive (c.-à-d. celles dont les charges sur LV1 sont élevées) sont souvent également corrélées dans l’analyse de régression univariée (figure 8E). Étant donné que le PLSR est souvent utilisé pour adapter un grand nombre de variables prédictives à un plus petit nombre d’échantillons, comme dans la figure 8, il est essentiel de comprendre la sensibilité des poids sur LV1 à des échantillons individuels. Pour un petit nombre d’échantillons (<10), le LOOCV est utile pour évaluer la sensibilité des poids (indiquée par des barres d’erreur SD à la figure 8C). Pour un plus grand nombre d’échantillons, il sera important d’évaluer la sensibilité en laissant plusieurs échantillons à la fois à l’aide d’une approche de sous-échantillonnage monte-carlo34. Nous renvoyons le lecteur à Analyse de données multivariées et mégavariées24 pour une discussion approfondie des approches et des utilisations des DPP. Enfin, nous notons que l’une des principales limites de ce type d’analyse est qu’elle est purement corrélative. PlSR ne prouve pas une relation mécaniste entre les variables prédictives et la variable de résultat. Nous considérons le PLSR comme une approche génératrice d’hypothèses précieuse qui est utilisée pour suggérer des cibles traitables à moduler dans de futures expériences qui établissent des relations causales.

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Disclosures

Aucun.

Acknowledgments

Ce projet a été soutenu par les National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) et R01 NS115994 (LBW/EB) et Children’s Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Ce travail a également été soutenu par le département de la Défense des États-Unis par le biais des programmes de recherche médicale dirigés par le Congrès sous le numéro de bourse. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Les opinions, interprétations, conclusions et recommandations sont celles de l’auteur et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la Défense. Ce matériel est basé sur des travaux soutenus par le Programme de bourses de recherche pour diplômés de la National Science Foundation dans le cadre de la subvention n ° 1937971. Toutes les opinions, constatations et conclusions ou recommandations exprimées dans ce document sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adjustable pipettes any adjustable pipette
Aluminum foil VWR 89107-726
Bio-Plex cell lysis kit C Bio-Rad 171304012
BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile BrandTech 781602 96
Complete mini protease inhibitor tablet Sigma-Aldrich 11836153001
Depilatory cream Amazon Nair
DiH2O VWR VWRL0200-1000
Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates Millipore Sigma Catalogue 40-285
Hardware Autocorrelator Board www.correlator.com Flex05-8ch
Isoflurane 250 mL MED-VET INTERNATIONAL RXISO-250
Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) VWR 21905-026
Laboratory vortex mixer VWR 10153-838
LabView National Instruments LabVIEW
Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software Luminex Corporation
Luminex Drive Fluid Luminex MPXDF-4PK
Luminex sheath fluid EMD Millipore SHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay Millipore Sigma MCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay Millipore Sigma 48-660MAG
Mini LabRoller rotator VWR 10136-084
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
Phosphate-buffered Saline (PBS) VWR 97064-158
Plate Sealer VWR 82050-992
Polypropylene microfuge tubes VWR 20901-547
Mini LabRoller Millipore Sigma Z674591
Reagent Reservoirs VWR 89094-668
R Programming Language
RStudio www.rstudio.com
Sonicator
Titer plate shaker VWR 12620-926
Tween20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
1 m acrylic guide tube McMaster-Carr 49035K85
4 photon counting avalanche photodiode Perkin-Elmer SPCM-AQ4C-IO
400 um multimode source fiber Thorlabs Inc. FT-400-EMT
54 g bolt Ace Hardware 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length
780 nm single mode detector fiber Thorlabs Inc. 780HP
852 nm long-coherence length laser TOPTICA Photonics iBeam smart

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurosciences numéro 183 Lésion cérébrale traumatique légère flux sanguin cérébral neuroinflammation ELISA multiplexé régression partielle des moindres carrés cytokines phospho-protéines
Analyse systémique de la réponse neuroinflammatoire et hémodynamique aux lésions cérébrales traumatiques
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Brothers, R. O., Bitarafan, S., Pybus, A. F., Wood, L. B., Buckley, E. M. Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (183), e61504, doi:10.3791/61504 (2022).

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