Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Systemanalyse av nevroinflammatorisk og hemodynamisk respons på traumatisk hjerneskade

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/61504
Automatic Translation
*1, *2,3, 1,3, *1,2,3, *1,4,5
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen presenterer metoder for å karakterisere nevroinflammatorisk og hemodynamisk respons på mild traumatisk hjerneskade og å integrere disse dataene som en del av en multivariat systemanalyse ved hjelp av delvis minste kvadraters regresjon.

Abstract

Milde traumatiske hjerneskader (mTBIer) er et betydelig folkehelseproblem. Gjentatt eksponering for mTBI kan føre til kumulative, langvarige funksjonelle underskudd. Tallrike studier av vår gruppe og andre har vist at mTBI stimulerer cytokinuttrykk og aktiverer mikroglia, reduserer cerebral blodstrøm og metabolisme, og svekker cerebrovaskulær reaktivitet. Videre har flere arbeider rapportert en sammenheng mellom derangementer i disse nevroinflammatoriske og hemodynamiske markørene og kognitive svikt. Heri beskriver vi metoder for å karakterisere nevroinflammatorisk og hemodynamisk vevsrespons på mTBI hos mus. Spesielt beskriver vi hvordan du utfører en vektfallsmodell av mTBI, hvordan man langsgående måler cerebral blodstrøm ved hjelp av en ikke-invasiv optisk teknikk kalt diffus korrelasjonsspektroskopi, og hvordan man utfører en Luminex multiplekset immunoassay på hjernevevsprøver for å kvantifisere cytokiner og immunmodulerende fosforproteiner (f.eks. innenfor MAPK- og NFκB-banene) som reagerer på og regulerer aktiviteten til mikroglia og andre nevrale immunceller. Til slutt beskriver vi hvordan du integrerer disse dataene ved hjelp av en multivariat systemanalysetilnærming for å forstå sammenhengene mellom alle disse variablene. Å forstå sammenhengene mellom disse fysiologiske og molekylære variablene vil til slutt gjøre oss i stand til å identifisere mekanismer som er ansvarlige for mTBI.

Introduction

Oversikt
Milde traumatiske hjerneskader (mTBIer) påvirker ~ 1,6-3,8 millioner idrettsutøvere årlig1. Disse skadene, inkludert sub-concussive og hjernerystelser, kan etterlate pasienter med forbigående fysiske, emosjonelle, psykologiske og kognitive symptomer2. Videre kan repeterende mTBI (rmTBI) opprettholdt i et "sårbarhetsvindu" føre til kumulativ alvorlighetsgrad og varighet av kognitive konsekvenser som varer lenger enn effektene av en enkelt mTBI alene3, og til slutt til og med til permanent tap av funksjon 4,5,6. Selv om mange pasienter gjenoppretter innenfor en relativt kort tidsramme (<1 uke), lider 10-40% av pasientene lengre varige effekter av mTBI i > 1 måned, med noen som varer opptil 1 år 3,7,8,9. Til tross for den høye utbredelsen og varige konsekvensene av disse skadene, er skademekanismer dårlig forstått og det finnes ingen effektive behandlingsstrategier.

Gitt den høye variasjonen i resultatene etter mTBI/rmTBI, er en utfordring med å identifisere tidlige molekylære utløsere fra vev oppnådd i terminale mTBI/rmTBI-studier mangelen på langsgående data som demonstrerer definitive "akutte molekylære koblinger" av disse molekylære utløserne til langsiktige resultater. For å overvinne denne utfordringen har gruppen vår oppdaget at akutt redusert cerebral blodstrøm målt akutt ved hjelp av et optisk verktøy kalt diffus korrelasjonsspektroskopi (DCS), korrelerer sterkt med langsiktig kognitivt utfall i en musemodell av rmTBI10. Ved hjelp av denne hemodynamiske biomarkøren viste vi at mus med akutt lav cerebral blodstrøm (og i forlengelsen av verre anslått langtidsutfall) har samtidige akutte økninger i nevronal fosforsignalering innenfor både MAPK- og NFκB-veier, økning i nevronuttrykk av proinflammatoriske cytokiner, og økning i uttrykk for fagocytt/mikroglialmarkør Iba111 . Disse dataene antyder en mulig rolle for nevronal fosforsignalering, cytokinuttrykk og mikroglial aktivering i både akutt regulering av hjerneblodstrømsskade samt i å utløse en signalkaskade som fører til nevronal dysfunksjon og verre kognitivt utfall. Heretter beskriver vi vår tilnærming til samtidig sonde både det hemodynamiske og nevroinflammatoriske miljøet etter rmTBI og hvordan vi integrerer disse komplekse datasettene. Nærmere bestemt skisserer vi prosedyrer for fire viktige trinn i denne omfattende tilnærmingen: (1) en vektdråpemodell av mild traumatisk hjerneskade, (2) vurdering av cerebral blodstrøm med diffus korrelasjonsspektroskopi, (3) kvantifisering av nevroinflammatorisk miljø og (4) dataintegrasjon (figur 1). Nedenfor gir vi en kort introduksjon til hvert av disse viktige trinnene for å hjelpe leserne gjennom begrunnelsen bak metodene våre. Resten av manuskriptet gir en detaljert protokoll for hvert av disse viktige trinnene.

Vektfallsmodell av mild traumatisk hjerneskade
Selv om mange gode prekliniske modeller av repeterende mild TBI eksisterer 12,13,14,15,16,17,18, bruker vi en veletablert og klinisk relevant vektfall lukket hodeskade modell. Viktige trekk ved denne modellen inkluderer (1) stump innvirkning av den intakte skallen / hodebunnen etterfulgt av ubegrenset rotasjon av hodet om nakken, (2) ingen overt strukturell hjerneskade, ødem, blod-hjerne barriere skade, akutt celledød, eller kronisk hjernevev tap, og (3) vedvarende (opptil 1 år) kognitive underskudd som bare dukker opp etter flere treff19 (Figur 2).

Vurdering av cerebral blodstrøm med diffus korrelasjonsspektroskopi
Diffus korrelasjonsspektroskopi (DCS) er en ikke-invasiv optisk teknikk som måler blodstrømmen 5,20,21. I DCS plasseres en nær-infrarød lyskilde på vevsoverflaten. En detektor er plassert i en fast avstand fra kilden på vevsoverflaten for å oppdage lys som har formert seg spredt gjennom vevet (figur 3). Spredning av bevegelige røde blodlegemer fører til at den oppdagede lysintensiteten svinger med tiden. En enkel analytisk modell kjent som korrelasjonsdiffusjonsteori brukes til å relatere disse intensitetssvingningene til en indeks for blodstrøm (CBFi, figur 4). Selv om enhetene til CBFi (cm2/s) ikke er de tradisjonelle strømningsenhetene (ml/min/100 g), har en tidligere studie hos mus vist at CBFi sterkt korrelerer med cerebral blodstrøm målt ved arteriell spinn merket MR21.

For referanse ble DCS-instrumentet som ble brukt her bygget internt og består av en 852 nm lang coherence-lengde laser, en rekke 4 fotontellingsfotodioder og et autokorrelatorkort for maskinvare (enkelt tau, 8 kanaler, 100 ns minimum prøvetid)21,22. Data er anskaffet med hjemmelaget programvare skrevet i LabView. Dyregrensesnittet for enheten består av en 400 μm multimodus kildefiber (400-2200 nm bølgelengdeområde, ren silikakjerne, TECS Hard Cladding) og en 780 nm enkeltmodusdetektorfiber (780-970 nm bølgelengde, ren silikakjerne, TECS Hard Cladding, 730 ± 30 nm andre modus cut-off) fordelt 6 mm fra hverandre og innebygd i en svart 3D-trykt sensor (4 mm x 8 mm, Figur 3).

Kvantifisering av nevroinflammatorisk miljø
Selv om nevroinflammasjon er regulert av ulike cellulære prosesser, er to viktige relevante mekanismer ekstracellulær signalering av cytokiner / kjemokiner og intracellulær signalering av fosfoproteiner. For å undersøke hjernens nevroinflammatoriske miljø etter skaden, ekstraheres hjerner fra mus, mikrodisserte og cytokiner/kjemokiner og fosfoproteiner kvantifiseres ved hjelp av Luminex (figur 5, figur 6, figur 7). Luminex multipleksede immunoassays muliggjør samtidig kvantifisering av en mangfoldig samling av disse proteinene ved å koble enzymbundne immunosorbente analyser (ELISAer) til fluorescerende merkede magnetiske perler. Distinkte fluorescerende koder brukes for hvert protein av interesse, og perler av hver tag er funksjonalisert med et fangstantistoff mot det aktuelle proteinet. Hundrevis av perler for å fange hvert protein blandes sammen, plasseres i en 96 brønnplate og inkuberes med prøve. Etter prøveinkubasjon brukes en magnet til å fange perlene i brønnen mens prøven vaskes ut. Deretter binder biotinylert deteksjonsantistoff til analytten av interesse for å danne et antistoff-antigensmørbrød som ligner en tradisjonell ELISA, men med ELISA for hvert protein som forekommer på en annen fluorescerende merket perle. Tilsetning av fycoerythrin-konjugert streptavidin (SAPE) fullfører hver reaksjon. Luminex-instrumentet leser deretter perlene og skiller signalet i henhold til hver fluorescerende tag / protein.

Dataintegrasjon
På grunn av det store antallet analytter (f.eks. cytokiner) målt i Luminex-analysen, kan dataanalyse være vanskelig å tolke hvis hvert kvantifiserte protein analyseres individuelt. For å forenkle analysen og fange opp trender observert blant analytter, bruker vi en multivariat analysemetode kalt delvis minste kvadraters regresjon (PLSR, figur 8)23. PLSR virker ved å identifisere en vektakse som tilsvarer hvert målte protein (dvs. cytokiner eller fosfoproteiner, referert til som "prediktorvariabler") som sammen forklarer kovariasjon av de målte proteinene optimalt med en responsvariabel (f.eks. cerebral blodstrøm). Vektene kalles "laster" og monteres i en vektor kjent som en latent variabel (LV). Ved å projisere (referert til som "scoring") de målte proteindataene på hver av to LVer, kan dataene plottes på nytt når det gjelder disse LVene. Etter beregning av PLSR bruker vi en varimax-rotasjon for å identifisere en ny LV som maksimerer kovariansen mellom prøveprojeksjonene på LV og prediktorvariabelen24. Denne tilnærmingen lar oss definere LV1 som aksen som variansen til responsvariabelen best forklares for. LV2 maksimerer samvariasjonen mellom responsvariabelen og LV1 restdata, som kan være forbundet med biologisk eller teknisk variasjon mellom prøver. Til slutt gjennomfører vi en Leave One Out Cross Validation (LOOCV) for å sikre at PLSR-modellen ikke er sterkt avhengig av ett utvalg23.

I denne protokollen beskriver vi metoder for å karakterisere nevroinflammatorisk og hemodynamisk vevsrespons på mTBI. Den generelle arbeidsflyten er beskrevet i figur 1. I denne protokollen er mus underlagt en eller flere mTBIer ved hjelp av en vektfall lukket hodeskademodell. Cerebral blodstrøm måles langsgående før og på flere tidspunkter etter skade. På tidspunktet for interesse for avhør av nevroinflammatoriske endringer, blir dyret euthanized, og hjernen ekstraheres. Hjerneregioner av interesse isoleres via mikrodesisseksjon og lyser deretter for å trekke ut protein. Lysates brukes deretter til både Luminex multipleksed immunoassays av cytokin og fosfo-protein uttrykk samt vestlig blot. Til slutt er dette holistiske datasettet integrert ved hjelp av en delvis minste kvadratisk regresjonsanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprosedyrer er godkjent av Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og fulgte NIH Guidelines for care and use of Laboratory Animals.

1. Vekt-drop modell av mild traumatisk hjerneskade

  1. Klargjør vektfalloppsettet. Monter en skrustikke på et flatt underlag med et 1 m føringsrør (2,54 cm innvendig diameter) justert vertikalt (kontroller med et nivå). Bruk en 54 g bolt (0,95 cm grunnleggende kroppsdiameter, 2 cm hodediameter, 10,2 cm lengde) for sammenstøtet.
  2. Bedøv musen en kort stund. Induser musen med 4,5% isofluran i 100% oksygen i 45 sekunder. Bekreft tilstrekkelig dybde av anestesi ved mangel på tåklemmerespons.
  3. Fremkall skade.
    1. Fjern musen raskt fra anestesi og plasser musen utsatt i midten av en tynn membran (11,2 cm x 21,3 cm vev).
    2. Bruk begge hender til å holde vevet stramt med musen utsatt på midten. Fest musens hale under en tommel. Plasser musehodet under føringsrøret (figur 2).
    3. Slipp bolten fra toppen av føringsrøret på det dorsale aspektet av musens hode, med sikte på støt mellom baksiden av øynene og forsiden av ørene. Ved støt vil musen trenge inn i vevet, noe som gir rask akselerasjon av hodet om nakken (figur 2).
  4. Bedring
    1. Etter sammenstøt, plasser musens liggende på en 37 °C varmepute i romluften. Monitor utvinning for 1 time etter skade. Innen 1 time skal mus kunne ambulate normalt, finne mat og vann, og ikke vise brutto motorunderskudd.
      MERK: Analgesi brukes ikke per godkjenning av Institutional Animal Care and Use Committee, som er berettiget på grunn av den forvirrende påvirkningen av analgesi på parametrene av interesse (dvs. cerebral blodstrøm, markører av betennelse). Bevissthetstap, definert som tiden fra fjerning fra anestesi til tid for å gjenvinne høyre refleks, forventes og varer vanligvis fra 20 s til 3 minutter (Supplerende tabell 1). Korte (<30 s) episoder av apné og/eller anfallslignende aktivitet kan observeres, spesielt etter gjentatte hodeskader som er fordelt én gang daglig.
  5. Gjenta etter behov. Denne skaden kan gjentas én gang daglig, ukentlig eller månedlig. Antall og avstand mellom skader avhenger av ønsket skade alvorlighetsgrad. Vanligvis bruker vi fem treff plassert en gang daglig for å indusere robuste underskudd i romlig læring og hukommelse.
    MERK: Tidligere studier har vist at fem treff som er plassert én gang daglig, er tilstrekkelig til å indusere underskudd i romlig læring og hukommelse som varer over 1 år etter skade uten ødem, blødning eller overt strukturell skade på hjernen19. Mus veies daglig og overvåkes nøye for tegn på dehydrering, motoriske underskudd og tap av appetitt. Hvis dehydrert, får mus fuktig chow og en subkutan injeksjon på 1 ml saltvann en gang daglig. For å forhindre unødvendig lidelse og for å sikre et humant endepunkt, blir mus euthanized hvis: dehydrering vedvarer eller forverres >24 h post-subkutan saltvannsbehandling, kroppsvekten minker med mer enn 20% fra pre-skade baseline, motoriske underskudd som sirkler eller pote-dra vises og vedvarer >1 h etter skade.

2. Vurdering av cerebral blodstrøm med diffus korrelasjonsspektroskopi

  1. DCS-datainnsamling
    1. Fjern hår i hodebunnen. Fordi DCS fungerer best i fravær av hår, er det nødvendig å fjerne pels på hodet før starten av eksperimenter. Vanligvis gjøres hårfjerning 1-3 dager før studiestart.
      1. Induser mus med 4,5% isofluran i 100% oksygen i 45 sekunder og vedlikehold med 1-2% isofluran i 100% oksygen.
      2. Barber hodet mellom øynene og ørene. Bruk deretter depilatorisk krem for å fjerne pels på hodet som i figur 3.
      3. La dyret gjenopprette fra anestesi på en oppvarmingspute og gå deretter tilbake til buret.
    2. Mål cerebral blodstrøm med DCS. For å minimere bevegelsesartefakter under måling, studer mus under kort isofluranbedøvelse.
      MERK: Overvåk åndedretts- og tåklemmerespons visuelt gjennom målinger og juster isoflurankonsentrasjonen etter behov for å sikre konsistent dybde av anestesi. Signifikante variasjoner i dybden av anestesi kan endre blodstrømmen gitt de kjente vasomodulatoriske effektene av isofluran25.
      1. Induser med 4,5% isofluran i 100% oksygen i 45 sekunder, og oppretthold deretter med 1,0-1,75% isofluran i 100% oksygen. Bekreft tilstrekkelig dybde av anestesi ved fravær av tåklemmerespons og normal åndedrett (mellom ~ 60-80 pust per minutt).
      2. Etter en 2 minutters stabiliseringsperiode hviler du DCS-sensoren forsiktig over høyre halvkule slik at den øverste kanten på den optiske sensoren stiller seg opp med baksiden av øyet og siden av sensoren går opp langs midtlinjen (figur 3). Beger en hånd over sensoren for å beskytte mot romlys. Hent 5 sekunder med data (1 Hz-anskaffelse).
      3. Omplasser sensoren over venstre halvkule, og hent 5 sekunder med data.
      4. Gjenta 3 ganger/halvkule for å gjøre rede for lokale heterogeniteter under vevsoverflaten.
    3. Bedring
      1. Fjern musen fra anestesi og legg på en varmepute.
      2. Etter at musen gjenvinner sin høyre refleks, returner den til buret.
  2. DCS-dataanalyse
    1. Utfør innledende kvalitetskontroll. Hvert bilde av DCS-data består av en målt normalisert intensitets autokorrelasjonsfunksjon (Equation 110figur 4A) og antall foton (kHz).
      1. Hvis du vil fjerne datarammer med betydelig bevegelsesartefakt, forkaster du datarammer der gjennomsnittsverdien for kurvens hale Equation 110 (dvs. Equation 111) er > 1,005.
      2. Hvis du vil fjerne datarammer med dårlig signal-til-støy-forhold, fjerner du datarammer hvis den oppdagede fotonantallhastigheten er < 20 kHz.
    2. Trekk ut cerebral blodstrømsindeks. Bruk fminsearch i Matlab, passer hver ith målte dataramme Equation 112 for CBFi(i). Begrens passer til Equation 113, og finn verdien av CBFi som minimerer følgende kostnadsfunksjon:
      Equation 114
      Der summen er over alle målte forsinkelsestider,Equation 115 og Equation 116 er den halvt uendelige homogene løsningen av korrelasjonsdiffusjonsligningen (figur 4B):
      Equation 117
      Her er β en sammenhengsfaktor bestemt av det eksperimentelle oppsettet, Equation 7, Equation 8, Equation 9, Equation 10, Equation11Reff =0,493 for en antatt vevsindeks for brytning på 1,4, ρ er 6 mm, og μa og μ er absorpsjonen og redusert spredningskoeffisienten til vevet (antas åvære henholdsvis 0,25 og 9,4/cm).
      MERK: Fordi β kan variere ~ 10% over tid, passer hver dataramme for β og CBFi samtidig.
    3. Utfør sekundær kvalitetskontroll. I hver repetisjon (som består av 5 datarammer), kast ut ytterpunkter. Outliers er definert som de CBFi-verdiene som faller utenfor 1,5 standardavvik av gjennomsnittlig CBFi for den repetisjonen. Hvis mer enn ett datapunkt identifiseres som et ytterpunkt, forkaster du hele repetisjonen.
    4. Beregn gjennomsnittlig cerebral blodstrømsindeks: Beregn en gjennomsnittlig CBFi per halvkule ved å ta gjennomsnittet på tvers av alle datarammer for alle repetisjoner (figur 4C). Hvis det ikke observeres noen signifikante halvkuleformede forskjeller, er gjennomsnittet på tvers av halvkule for å oppnå et estimat av gjennomsnittlig global CBFi.

3. Multiplekset kvantifisering av cytokiner og fosfoproteiner ved hjelp av luminexanalyser

  1. Vev ekstraksjon
    MERK: Kvantifisering av hjernecytokiner og fosfosignalerende proteiner ved bruk av Luminex krever vevsekstraksjon.
    1. Bedøv musen ved hjelp av 4,5% isofluran i 100% oksygen i 1-2 min. Se etter dypt plan av anestesi via mangel på tå klype respons. Euthanize via halshugging.
    2. Høst vevet.
      1. Fjern hjernen. Vanligvis fikser du venstre halvkule for histologi og mikrodissekt flere regioner fra høyre halvkule i cortex og hippocampus (figur 5).
      2. Plasser dissekerte prøver i mikrocentrifugerør, blitsfrysing i flytende nitrogen. For analyse av frysefølsomme proteiner er det optimalt å dele vevsseksjoner før blitsfrysing for å unngå senere fryse-tine.
        MERK: Protokollen kan settes på pause, og vevsprøver kan lagres ved -80 °C til de er klare til å ta prøver. Alternativt kan prøver lyses, og deretter lagres ved -80 °C.
    3. Lyse prøver.
      1. Forbered lysisbufferen ved å tilsette proteasehemmer og 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid til lysisbufferen.
      2. Tilsett 150 μL av den blandede lysisbufferen per ca. 3 μg dyrevev. For referanse er musevisuelle cortex vevsprøver ca. 3 μg.
      3. For å homogenisere vevet, triturere vevet mekanisk ved å pipettere opp og ned ~ 15-20 ganger ved hjelp av en 1000 μL pipette. For optimal prøvetrianturasjon kan en homogenisator pestle brukes.
      4. Plasser prøverørene på en rotator i 30 min ved 4 °C.
      5. Sentrifuger prøvene ved 4 °C i 10 minutter ved ca. 15 000 x g, og samle supernatanten. Prøver kan behandles umiddelbart eller lagres ved -80 °C for videre analyse.
        MERK: Prøvelysater fremstilt ved hjelp av denne protokollen er kompatible med vestlig flekk, hvorfra fagocytten/mikroglialmarkøren Iba1 og/eller astrocyttaktiveringsmarkøren GFAP kan analyseres for å utfylle cytokin- og fosfoproteinanalyse for nevroinflammasjonsstudier11.
  2. Multipleks immunanalyseprotokoll for cytokiner og fosfoproteiner
    MERK: Selv om det er lignende generelt, er det noen mindre forskjeller i protokollene for cytokin- og fosfoproteinsett. Forskjeller er notert i hvert trinn. Trinnene for å forberede prøver for Luminex-analysen er beskrevet nedenfor.
    1. Tilberedning av reagenser (dag 1, samme for cytokiner og fosfoproteiner)
      1. La reagensene varmes opp til romtemperatur (~30 min).
      2. Soniker multipleks magnetiske perler flaske i 30 sekunder etterfulgt av 1 min vortexing. Sørg for at multipleksmagnetiske perler er skjermet fra lys med aluminiumsfolie eller bruk medfølgende lysbeskyttende flasker.
      3. Forbered vaskebufferen ved å blande 0,1% Tween20 i 1xPBS eller alternativt bruke vaskebufferen som følger med i settet.
    2. Fremstilling av lysede vevsprøver (dag 1, samme for cytokiner og fosfoproteiner)
      1. Hvis det tidligere er frosset, fjern lysvevsprøver fra fryseren og la det tine på is (~ 20 min). Sentrifugeprøver i 10 minutter ved 9167 x g for å fjerne bunnfall.
      2. Forbered 25 μL prøve ved optimal proteinkonsentrasjon bestemt av den lineære områdeanalysen (se pkt. 3.3). For å normalisere totalt volum for alle prøver, fortynn prøver i analysebufferen som følger med i settet.
    3. Tilberedning av 96 brønnplate (dag 1, samme for cytokiner og fosfoproteiner)
      1. Bruk 96 brønnplaten som følger med i settet, eller en med tynn bunn (f.eks.
      2. Tilsett 200 μL vaskebuffer (eller 1x PBS, 0,1% Tween) i hver brønn og bland på plate shaker i 10 min ved 750 rpm.
      3. Dekanter vaskebufferen og trykk platen på et papirhåndkle for å fjerne rester.
    4. Immunoassay prosedyre for Cytokines (dag 1)
      1. Legg til følgende i hver brønn i rekkefølge.
        1. Tilsett 25 μL analysebuffer til alle brønner.
          1. Tilsett 25 μL ekstra analysebuffer KUN til bakgrunnsbrønner. For hvert eksperimentelt løp har minst to bakgrunnsbrønner. Bakgrunnsbrønner har ingen prøve lastet og definerer fluorescerende intensitet lest av instrumentet uten prøve.
          2. Tilsett 25 μL av hver fortynnet prøve til tilsvarende prøvebrønner.
          3. Tilsett 25 μL 1x multipleks magnetiske perler til alle brønner (figur 6). Pass på å virvelperler i 1 min før du legger til brønner.
      2. Tetningsplate med plateforsegler og dekk platen med aluminiumsfolie. Inkuber over natten (12-16 h) ved 2-8 °C.
    5. Immunoassay prosedyre for cytokiner (dag 2)
      1. Plasser 96 brønnplate på magnetisk separator, og sørg for at brønnene er på linje med magnetene. La sitte i 2 min. Dekanter godt innhold mens platen fortsatt er festet til magnetseparatoren.
      2. Vask platen 2 ganger ved hjelp av følgende trinn.
        1. Tilsett 200 μL vaskebuffer til hver brønn og legg på shaker i 2 min ved romtemperatur.
        2. Plasser brønnplaten på magnetseparatoren i 2 minutter ved romtemperatur.
        3. Dekanter brønninnhold mens brønnplaten fortsatt er festet til magnetisk separator.
      3. Tilsett 25 μL påvisningsantistoff per brønn (figur 6). Dekk med folie. Inkuber i 1 time på en tallerken shaker (750 rpm) ved romtemperatur.
      4. La deteksjonsantistoffet ligge i og tilsett 25 μL streptavidin-phycoerythrin (SAPE) til hver brønn (figur 6). Dekk med folie. Inkuber i 30 min på plate shaker (750 rpm) ved romtemperatur.
      5. Plasser brønnplaten på en magnetisk separator og la den sitte i 2 min. Dekanter brønninnhold og løsne fra magnetisk separator.
      6. Vask brønnplaten to ganger (se trinn 3.2.5.2).
      7. Tilsett 75 μL Luminex Drive Fluid (hvis du bruker MAGPIX-instrument) i hver brønn- eller analysebuffer (hvis du bruker 200- eller FlexMap 3D-instrument). Re-suspendere perler på plate shaker i 5 min ved romtemperatur.
      8. Les på Luminex Instrument (MAGPIX, 200 eller FlexMap 3D), og se i brukerhåndboken for riktig drift (figur 6).
    6. Immunoassay prosedyre for fosfo-proteiner (dag 1)
      1. Legg til følgende i hver brønn i rekkefølge.
        1. Tilsett 25 μL analysebuffer til alle brønner.
          1. Tilsett 25 μL ekstra analysebuffer KUN til bakgrunnsbrønner. For hvert eksperimentelt løp anbefales det å ha minst to bakgrunnsbrønner. Bakgrunnsbrønner har ingen prøve lastet og definerer fluorescerende intensitet lest av instrumentet uten prøve.
          2. Tilsett 25 μL av hver fortynnet prøve til hver prøvebrønn.
          3. Tilsett 25 μL 1x multipleks magnetiske perler til alle brønner (figur 6).
            MERK: Luminex analysesett gir multipleks magnetisk perle i 20x lagerløsning. Pass på å virvel 20x lager multipleks magnetisk perle løsning i 2 min, og fortynn den deretter i analysebuffer til 1x løsning. Vortex 1x multiplex magnetisk perle suspensjon i 1 min før tilsetning til brønner.
        2. Tetningsplate med plateforsegler og dekk platen med aluminiumsfolie. Inkuber over natten (12-16 timer) ved 2-8 °C.
    7. Immunoassay prosedyre for fosfo-proteiner (dag 2)
      1. Plasser brønnplaten på en magnetisk separator, og sørg for at brønnplaten er helt på linje med magnetseparatoren. La sitte i 2 min. Dekanter brønninnhold mens brønnplaten fortsatt er festet til magnetseparatoren.
      2. Vask platen 2 ganger (se trinn b i cytokinens immunoassay prosedyre dag 2).
      3. Fortynn 20x lagerdeteksjonsantistoffet mot 1x-løsningen i analysebufferen. Tilsett 25 μL 1x deteksjonsantistoff per brønn (figur 6). Dekk med folie. Inkuber i 1 time på plate shaker (750 rpm) ved romtemperatur.
      4. Plasser 96 brønnplaten på magnetisk separator, og la den sitte i 2 min. Dekanter godt innhold, løsne fra magnetseparatoren.
      5. Fortynn 25x lager SAPE i analysebuffer til 1x buffer. Tilsett 25 μL 1x SAPE (figur 6). Dekk med folie og inkuber i 15 min på plate shaker (750 rpm) ved romtemperatur.
      6. La SAPE ligge i brønner, og tilsett 25 μL forsterkningsbuffer til hver brønn. Dekk med folie.
      7. Inkuber i 15 min på plate shaker (750 rpm) ved romtemperatur.
      8. Plasser brønnplaten på magnetseparatoren i 2 min. Dekanter brønninnhold og løsne fra magnetseparatoren.
      9. Tilsett 75 μL Luminex Drive Fluid (hvis du bruker MAGPIX-instrument) eller analysebuffer (hvis du bruker 200- eller FlexMap 3D-instrument). Re-suspendere perler på en plate shaker i 5 min ved romtemperatur.
      10. Les på Luminex-instrumentet (MAGPIX, 200 eller FlexMap 3D), og se i brukerhåndboken for riktig drift (figur 6).
  3. Linearitet av prøvefortynningskurve
    1. Fremstilling av prøver: Fortynn testprøver serielt med forskjellig konsentrasjon av totalt protein. For bulk hjernevev, last seriell fortynning fra 0-25 μg for cytokiner og 0-12 μg for fosfo-proteiner. Total proteinkonsentrasjon kan måles ved hjelp av bicinchoninic acid (BCA) analyse.
    2. Multiplex immunoassay: Utfør Luminex-analysen (se pkt. 3.2) på utvalgte prøver.
    3. Dataanalyse
      1. Plott fluorescerende intensitet for hvert protein vs. mengde protein lastet (figur 7).
      2. For hver analytt, identifiser området av totalt protein lastet som forholdet mellom totalt protein og fluorescerende intensitetsavlesning er lineær (figur 7).
      3. For å bestemme mengden av totalt protein som skal lastes for hele analyseløpet, identifiser den lineære delen av kurven for hver analytt og velg deretter en proteinkonsentrasjon som faller innenfor det lineære området for de fleste analytter.
        MERK: Selv om de fleste proteiner deler et lignende lineært område, kan det hende at de lineære områdene ikke overlapper for alle proteiner. Hvis dette er tilfelle, kan det være nødvendig å kjøre hver prøve flere ganger med forskjellige mengder totalt protein lastet. Alternativt kan ikke-lineære prøver utelates fra analysen. I tillegg kan det hende at noen proteiner ikke har et lineært område overhodet.

4. Delvis minste kvadraters regresjon

MERK: Eksempel R-kode og et eksempeldataregneark er gitt for å utføre delvis minste kvadraters analyse.

  1. Dataforberedelse: Formater dataene som vist i det medfølgende eksempeldataregnearket, "MyData". Inkluder variabelnavn i rad 1, eksempelnavn i kolonne A, svarvariabelen i kolonne B og alle prediktorvariabler i kolonne C+. Fyll de to siste radene med bakgrunnsdataene, og sett begge eksempelnavnene til Bakgrunn.
  2. Delvis minste kvadraters regresjon i RStudio
    1. Installer R fra www.r-project.org (gratis, åpen kildekode).
    2. Installer RStudio Desktop fra www.rstudio.com (gratis open source-lisens).
    3. Last ned eksempelkoden R som følger med denne publikasjonen, "PLSR_Sample_Code.R", og lagre den i samme mappe som inneholder dataregnearket. Åpne kodefilen i RStudio.
    4. I delen Brukerinndata endrer du "dataFileName" til navnet på dataregnearket.
    5. Utfør følgende trinn ved å merke kodedelen for å kjøre og klikke Kjør øverst til høyre i skriptet.
      1. Last inn nødvendige R-pakker, funksjoner, arbeidskatalogadressen og brukerinndataverdier i RStudio (underavsnitt "Foreløpige").
      2. Last inn dataene i RStudio og klargjør rådata for behandling ved å trekke fra gjennomsnittlig bakgrunnssignal fra alle målinger og z-skåre hver analytt (underavsnitt "Lese data og trekke fra bakgrunn")(Figur 8A).
      3. Utfør delvis minste kvadraters regresjon i RStudio ved hjelp av plsRglm-pakken v1.2.528 tilgjengelig på Comprehensive R Archive Network (CRAN). Utfør en varimax-rotasjon (statistikkpakke v3.6.2)23 i LV1-LV2-planet for å identifisere en ny horisontal akse som best skiller prøver ved hjelp av responsvariabelen (avsnittet "PLS")(figur 8B).
      4. Utfør en LOOCV (Leave One Out Cross Validation) der ett utvalg er iterativt utelatt fra dataene, og PLSR-modellen beregnes på nytt. Beregn standardavvik for analyttlastinger på tvers av alle LOOCV-kjøringer (underavsnitt "LOOCV").
  3. Opprett representative plott: Kjør den angitte eksempelkoden som beskrevet ovenfor for å opprette representative plott som automatisk eksporterer som pdf-filer til arbeidsmappen (mappen som inneholder dataene og kodefilene).
    1. Lag et varmekart over de behandlede dataene som vist i figur 8A (avsnittet "PLS"). Fargelegg hver oppføring langs et spektrum definert av z-score. Sorter analytter etter rekkefølgen som beregnes i latent interessevariabel.
    2. Lag en score plott med LV1 score plottet langs den horisontale aksen og LV2 score plottet langs den vertikale aksen, som vist i Figur 8B (subseksjon "PLS"). Fargelegg hvert datapunkt i henhold til måling av svarvariabelen for å visualisere forholdet mellom hver latente variabel og responsvariabelen.
    3. Opprett en stolpetegning som viser innlastinger for hver av prediktorvariablene for å visualisere hvordan hver analytt bidrar til latente variabler, som vist i figur 8C (underavsnitt "LOOCV").
    4. Lag en plott regresjon LV1 score mot din respons variabel for å visualisere hvor godt PLSR modellen skiller prøvene, som vist i Figur 8D (underavsnitt "PLS").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidligere innsamlede data ble tatt fra tidligere arbeid der en gruppe på åtte C57BL/6 mus ble utsatt for tre lukkede hodeskader (figur 2) fordelt en gang daglig11. I dette arbeidet ble hjerneblodstrømmen målt med diffus korrelasjonsspektroskopi 4 timer etter siste skade (figur 3, figur 4). Etter CBF-vurdering etter skade ble dyrene euthanized, og hjernevev ble ekstrahert for kvantifisering av cytokiner og fosfoproteiner via immunoassay (figur 5). Vi kvantifiserte også fagocytten/mikroglial aktiveringsmarkøren Iba1 via vestlig blot (metoder beskrevet i11). Hjernevev fra hver mus ble lysnet, og total proteinkonsentrasjon ble målt ved hjelp av en BCA-analyse. Multiplekset cytokin-kvantifisering ble utført ved hjelp av Milliplex MAP Mouse Cytokine/Chemokine 32-Plex, som ble lest ved hjelp av et Luminex MAGPIX-system (figur 6). En lineær områdeanalyse ble utført for å bestemme en passende proteinbelastning (12 μg protein per 12,5 μL lysat) (figur 7) før innsamling av data fra alle prøver.

Cytokindata ble utarbeidet for analyse ved å trekke bakgrunnsmålinger fra eksempeldata, og deretter z-score data for hver analytt (figur 8A). Et varmekart ble generert fra z-scorede data for å visualisere forskjeller i cytokinuttrykk blant dyr. Delvis minste kvadraters regresjon (PLSR) ble utført ved hjelp av fagocytt/mikroglial aktiveringsmarkør Iba1 som responsvariabel og cytokinmålinger som prediktorvariabler (figur 8B). En varimaxrotasjon ble utført for å maksimere samvariasjonen av dataene på LV1 med Iba1-målingene (figur 8D). Høye lastevekter i LV1 (figur 8C) tilsvarer cytokinuttrykket som er mest forbundet med høyt uttrykk for Iba1. Lineære regresjoner mellom Iba1 og cytokiner viser at de cytokinene med størst lastvekt i LV1 også var statistisk signifikante (figur 8E).

Figure 1
Figur 1: Vanlig arbeidsflyt. Først gjennomgår mus en vektfall lukket hodeskade, og deretter måles cerebral blodstrøm (CBF) ved hjelp av diffus korrelasjonsspektroskopi. Deretter samles hjerner, interesseområder er mikro dissekert og snap frosset ved hjelp av flytende nitrogen. Som forberedelse til Luminex-immunanalysen lyser proteiner, og total proteinkonsentrasjon måles ved bicinkononinsyreanalyse. Lysater brukes til vestlig flekk av proteiner av interesse og Luminex-analyser for cytokiner og fosfoproteiner. Data fra CBF, Western blot og Luminex er integrert ved hjelp av delvis minste kvadraters regresjon (PLSR). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Vektnedgangsmodell med lukket hode av mild traumatisk hjerneskade. (A) Den bedøvede musen gripes av halen og plasseres på en stram offermembran under et føringsrør. En 54 g vekt faller fra 1 m på dorsalaspektet av hodet. (B) Innen ~ 1 ms etter sammenstøt har musens hode raskt rotert om nakken når den bryter gjennom offermembranen. (C) Innenfor ~ 5 ms etter sammenstøt har hele musen falt og henger ved sin grep hale. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Måling av cerebral blodstrøm ved diffus korrelasjonsspektroskopi. (A) En optisk sensor holdes forsiktig manuelt over høyre halvkule for å måle blodstrømmen i en bedøvet mus. (B) Representativ sensorplassering på høyre halvkule. Omrisset av sensoren er representert som et stiplet svart rektangel, og plasseringen av kilden og detektorfibrene er i henholdsvis røde og blå sirkler. Sensoren er plassert slik at kortsiden av sensoren er på linje med baksiden av øyet og langsiden av sensoren er på linje med midtlinjen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Diffus korrelasjonsspektroskopidataanalyse. (A) Representative målte intensitetskurver for autokorrelasjon, g2(τ), ved baseline, pre-skade baseline (grønn) og 4 t etter 5 lukkede hodeskader fordelt en gang daglig (lilla). Det høyre skiftet i kurven fra pre- til post-skade gjenspeiler en reduksjon i blodstrømmen. (B) gEquation(τ)-data er samlet inn ved 1 Hz i 5 s per halvkule og gjentatt 3x/halvkule. Hver målt gEquation(τ)-kurve passer til den semi-uendelige løsningen på korrelasjonsdiffusjonsligningen for en cerebral blodstrømsindeks (CBFi). (C) CBFi verdier på tvers av alle rammer og repetisjoner er gjennomsnittet for å oppnå gjennomsnittlig cerebral blodstrømsindeks for hver halvkule (betegnet med horisontal svart stolpe). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Mikrodesinfeksjon i musehjernen. (A) Etter at hjernen er ekstrahert fra musen, blir den krysset langs den stiplede linjen. Den venstre halvkule er fast for histologi, og den høyre halvkule er mikrodissert for patologi. (B) Sagittal utsikt over cortex på høyre halvkule. Den høyre halvkule er mikrodissektert i tilsvarende fargekodede regioner. For analyse av frysefølsomme proteiner er det optimalt å dele vevsseksjoner før blitsfrysing. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Illustrasjon av Luminex-prosedyren. (A) Legg til prøver til fluorescerende merkede perler. Perler er forhåndsbelagt med et spesifikt fangstantistoff for hvert protein av interesse. (B) Tilsett biotinylerte påvisningsantistoffer. Biotin-deteksjon antistoffer binde seg til analytter av interesse og danner et antistoff-antigen sandwich. (C) Tilsett phycoerythrin (PE)-konjugert streptavidin (SAPE). SAPE binder seg til de biotinylerte deteksjonsantistoffene, og fullfører reaksjonen. For fosfoproteiner tilsettes en forsterkningsbuffer (kun for fosfoproteinanalyser) etter tilsetning til SAPE for å forbedre analysesignalet. (D) Luminex instrument (MAGPIX, 200 eller FlexMap 3D) leser reaksjon på hver fluorescerende merket perle via en kombinasjon av rød / grønn belysning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 7: Illustrasjon av prøvefortynningskurve for å identifisere det lineære området. Proteinkonsentrasjon av serie fortynnede prøver versus fluorescerende intensitet målt fra Luminex-analysen. Det lineære området er definert som proteinkonsentrasjonsområdet som forholdet mellom proteinkonsentrasjonen og fluorescerende intensitet er lineær (pil). I noen analytter kan økning av proteinkonsentrasjonen utover en viss grense redusere antistoffbinding slik at fortynningskurven blir ikke-lineær eller invertert (Hook-effekt). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 8: Representativ delvis minste kvadratisk regresjonsanalyse (PLSR). (A) Panel cytokinproteinuttrykk (venstre kolonne) sammen med Iba1-uttrykk (høyre kolonne) i 3xCHI-mus (n = 8, z-scoret). (B) PLSR tildeler vekter (laster) til målte cytokiner for hver latent variabel. Vektlegging brukes på målte data for å beregne poengsummer for hvert utvalg på hver latente variabel. (C) PLSR av 3xCHI-prøver mot Iba1 identifiserte en vektet profil av cytokiner, LV1, som utmerket prøver av Iba1. Cytokiner med negative vekter ble oppregulert i prøver med lav Iba1 mens cytokiner med positive vekter ble oppregulert i prøver med høy Iba1 (gjennomsnittlig ± SD ved hjelp av en LOOCV). (D) Lineær regresjon av LV1-poengsummer for hvert utvalg mot Iba1. R2PLS måler godheten i passform mellom Iba1 og LV1. (E) Individuelle regresjoner av Iba1 mot hver av cytokinene med størst vekt i LV1 i C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi metoder for vurdering av hemodynamisk og nevroinflammatorisk respons på repeterende mild traumatisk hjerneskade. Videre har vi vist hvordan du integrerer disse dataene som en del av en multivariat systemanalyse ved hjelp av delvis minste kvadraters regresjon. I teksten nedenfor vil vi diskutere noen av de viktigste trinnene og begrensningene knyttet til protokollen, samt fordelene / ulempene ved metodene over eksisterende metoder.

Vektfallsmodell av mild traumatisk hjerneskade. Denne metoden for traumatisk hjerneskadeinduksjon er fordelaktig ved at den har stump påvirkning etterfulgt av rask fremre-bakre rotasjonsakselerasjon som vanligvis ses i sportsrelaterte hodeskader10,19. Sikkert, den lissencephalic musehjernen recapitulaterer absolutt ikke fullt ut kompleksiteten i den gyrocephaliske menneskelige hjernen; Likevel induserer denne modellen mange av de samme kliniske og atferdsmessige oppfølgerne til menneskelig mTBI, inkludert vedvarende underskudd i romlig læring og minne med gjentatte skader. I tillegg, mens virkningen er mild i naturen (ingen strukturell / nevronskade, ingen blodhjernebarriere permeabilitet, kognitive underskudd som bare dukker opp etter flere treff, etc.19), induserer det betydelig bevissthetstap, i motsetning til mennesker der bevissthetstap er mindre vanlig. Dette økte bevissthetstapet kan skyldes en interaksjon med anestesi gitt umiddelbart før virkningen, selv om den eksakte årsaken ikke er godt forstått. Til slutt merker vi at det er kritisk å justere føringsrøret slik at bolten påvirker mellom koronar- og lamdoid suturer. Vi har observert at påvirkninger som er mer bakre kan forårsake betydelige motoriske underskudd som krever eutanasi.

Vurdering av cerebral blodstrøm med diffus korrelasjonsspektroskopi. Ikke-invasive, langsgående målinger av cerebral blodstrøm (CBF) med tradisjonelle modaliteter som brukes i menneskelige / store dyrestudier, for eksempel perfusjon magnetisk resonansavbildning eller transkraniell Doppler ultralyd, er utfordrende hos mus av ulike årsaker, inkludert liten hjernestørrelse og totalt blodvolum29. Diffus korrelasjonsspektroskopi er velegnet hos mus og gir de ekstra fordelene ved å være ikke-invasiv og relativt billig sammenlignet med andre modaliteter20,30. Fordi DCS er følsom for bevegelsesartefakter, må mus kort bedøves eller begrenses31 for vurdering. Vi bruker vanligvis isofluranbedøvelse på grunn av den raske induksjonen og utvinningen; Isofluran er imidlertid en cerebral vasodilator, og blodstrømsestimater under isofluran bør tolkes med forsiktighet. Reduksjon i blodstrømmen sett etter skade sammenlignet med sham-skadde dyr kan bli forvirret av en svikt i den skadede cerebral vaskulaturen til vasodilat som svar på isofluran. Til slutt har vi tidligere vist utmerket intra-bruker repeterbarhet av blodstrømsmålinger med DCS hos mus, men bare rettferdig intra-bruker repeterbarhet21. Av denne grunn anbefaler vi at den samme operatøren får DCS-målinger for eksperimenter som krever langsgående vurdering av cerebral blodstrøm.

Multiplekset kvantifisering av cytokiner og fosfoproteiner ved bruk av Luminex-analyser. En viktig utfordring med enhver ELISA er Hook-effekten, der økt proteinkonsentrasjon kan redusere antistoffaffinitet for målproteinet, og dermed føre til redusert analysesignal som svar på økt protein32 (figur 7). Denne effekten kan forverres når du analyserer hele vev, hvor bulkproteiner på samme måte kan forstyrre. Dermed er det første trinnet i å bruke Luminex-analyser å avgjøre om det er en rekke proteinkonsentrasjoner lastet som analysen leser ut lineært varierer med mengden protein lastet. Analytter som ikke har et slikt lineært område (figur 7), bør utelukkes fra analyse. Vi merker også at cytokinnivåene i hjernen vanligvis er svært lave og vises nær den nedre deteksjonsgrensen vurdert via standardkurver som leveres med Luminex-settet. Av denne grunn er det viktig å gjennomføre lineær avstandsanalyse for å avgjøre om instrumentavlesningen virkelig gjenspeiler mengden prøve lastet. For viktige proteiner av interesse kan denne lineære områdeanalysen suppleres med en spike recovery-analyse der rekombinant protein er pigget inn i en prøve, og linearitet i instrumentavlesningen evalueres33.

Fordi nevroinflammasjon er regulert av forskjellige intracellulære fosfoproteiner og ekstracellulære cytokiner, er det viktig å samtidig måle et bredt spekter av disse proteinene for å forstå hjernens nevrale immunrespons mot mTBI. Luminex multipleksed immunoassays muliggjør samtidig kvantifisering av dusinvis av cytokiner og fosforproteiner fra en enkelt prøve, noe som gir et helhetlig syn på vevet immunrespons etter skade. Selv om disse analysene gir et bredt syn på cytokiner/kjemokiner samt fosfoproteiner, kvantifiserer analysen total mengde av hvert protein fra et vevshomogenat. Dermed gir den ikke celletypespesifikke data. Cellespesifikk spesifisitet kan bestemmes av oppfølgingsimmunohistokjemi for å identifisere lokalisering av toppproteiner av interesse med markører for celletyper (f.eks. nevroner, mikroglia, astrocytter, etc.) 11.

Delvis minste kvadraters regresjonsanalyse for dataintegrasjon. Vevsresponsen på mTBI er multifaktoriell, bestående av fysiologiske endringer i blodstrømmen sammen med endringer i fagocytten / mikroglial aktiveringsmarkøren Iba1, forskjellige cytokiner og fosfoproteiner, blant andre11. På grunn av multiplekset karakter av dataene som samles inn, er det nødvendig med en systematisk metode for å redegjøre for flerdimensjonaliteten til relasjonene mellom de ulike prediktorvariablene. PLSR gir en passende løsning på dette problemet ved å identifisere LVer som maksimalt identifiserer kovariasjonen mellom prediktorvariablene og resultatvariabelen (f.eks. Iba1 i figur 8). Det er viktig at proteinene som er funnet å korrelere sterkt med prediktorvariabelen (dvs. de med høye belastninger på LV1) ofte korrelerer i den univariate regresjonsanalysen også (figur 8E). Fordi PLSR ofte brukes til å tilpasse et stort antall prediktorvariabler til et mindre antall prøver som i figur 8, er det avgjørende å få en forståelse av sensitiviteten til vektene på LV1 til individuelle prøver. For et lite antall prøver (<10) er LOOCV nyttig for å vurdere følsomheten til vektene (angitt via SD-feilfelt i figur 8C). For et større antall prøver vil det være viktig å vurdere følsomhet ved å la flere prøver være ute om gangen ved hjelp av en Monte Carlo sub-sampling tilnærming34. Vi henviser leseren til Multi and Megavariate Data Analysis24 for en grundig diskusjon av PLSR-tilnærminger og -bruksområder. Til slutt merker vi oss at en nøkkelbegrensning for denne typen analyse er at den er rent korrelativ. PLSR beviser ikke en mekanistisk sammenheng mellom prediktorvariabler og resultatvariabelen. Vi ser på PLSR som en verdifull hypotese som genererer tilnærming som brukes til å foreslå gjennomførbare mål for å modulere i fremtidige eksperimenter som etablerer årsakssammenhenger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Dette prosjektet ble støttet av National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) og R01 NS115994 (LBW/EB) og Children's Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Dette arbeidet ble også støttet av det amerikanske forsvarsdepartementet gjennom Congressionally Directed Medical Research Programs under Award No. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Meninger, tolkninger, konklusjoner og anbefalinger er forfatterens og er ikke nødvendigvis godkjent av Forsvarsdepartementet. Dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. 1937971. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adjustable pipettes any adjustable pipette
Aluminum foil VWR 89107-726
Bio-Plex cell lysis kit C Bio-Rad 171304012
BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile BrandTech 781602 96
Complete mini protease inhibitor tablet Sigma-Aldrich 11836153001
Depilatory cream Amazon Nair
DiH2O VWR VWRL0200-1000
Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates Millipore Sigma Catalogue 40-285
Hardware Autocorrelator Board www.correlator.com Flex05-8ch
Isoflurane 250 mL MED-VET INTERNATIONAL RXISO-250
Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) VWR 21905-026
Laboratory vortex mixer VWR 10153-838
LabView National Instruments LabVIEW
Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software Luminex Corporation
Luminex Drive Fluid Luminex MPXDF-4PK
Luminex sheath fluid EMD Millipore SHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay Millipore Sigma MCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay Millipore Sigma 48-660MAG
Mini LabRoller rotator VWR 10136-084
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
Phosphate-buffered Saline (PBS) VWR 97064-158
Plate Sealer VWR 82050-992
Polypropylene microfuge tubes VWR 20901-547
Mini LabRoller Millipore Sigma Z674591
Reagent Reservoirs VWR 89094-668
R Programming Language
RStudio www.rstudio.com
Sonicator
Titer plate shaker VWR 12620-926
Tween20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
1 m acrylic guide tube McMaster-Carr 49035K85
4 photon counting avalanche photodiode Perkin-Elmer SPCM-AQ4C-IO
400 um multimode source fiber Thorlabs Inc. FT-400-EMT
54 g bolt Ace Hardware 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length
780 nm single mode detector fiber Thorlabs Inc. 780HP
852 nm long-coherence length laser TOPTICA Photonics iBeam smart

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
  2. Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
  3. Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
  4. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  5. Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , National Academies Press (US). Washington (DC). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169016/ (2014).
  6. Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
  7. McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
  8. Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
  9. Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).
  10. Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
  11. Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
  12. Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
  13. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
  14. Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
  15. Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
  16. Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
  17. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury--part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
  18. Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
  19. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
  20. Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
  21. Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).
  22. Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).
  23. Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
  24. Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
  25. Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
  26. Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).
  27. Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
  28. Bertrand, F., Maumy-Bertrand, M. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019).
  29. White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322 (2011).
  30. Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).
  31. Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
  32. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
  33. Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
  34. Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 183 Mild traumatisk hjerneskade cerebral blodstrøm nevroinflammasjon multiplekset ELISA delvis minste kvadraters regresjon cytokiner fosfoproteiner
Systemanalyse av nevroinflammatorisk og hemodynamisk respons på traumatisk hjerneskade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brothers, R. O., Bitarafan, S.,… More

Brothers, R. O., Bitarafan, S., Pybus, A. F., Wood, L. B., Buckley, E. M. Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (183), e61504, doi:10.3791/61504 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter