Summary
Bu protokol, hafif travmatik beyin hasarına nöroinflamatuar ve hemodinamik yanıtı karakterize etmek ve bu verileri kısmi en küçük kareler regresyonunu kullanarak çok değişkenli bir sistem analizinin bir parçası olarak entegre etmek için yöntemler sunmaktadır.
Abstract
Hafif travmatik beyin yaralanmaları (mTBI) önemli bir halk sağlığı sorunudur. mTBI'ya tekrar tekrar maruz kalmak, kümülatif, uzun süreli fonksiyonel eksikliklere yol açabilir. Grubumuz ve diğerleri tarafından yapılan çok sayıda çalışma, mTBI'nın sitokin ekspresyonunu uyardığını ve mikroglia'yı aktive ettiğini, serebral kan akışını ve metabolizmasını azalttığını ve serebrovasküler reaktiviteyi bozduğunu göstermiştir. Ayrıca, birkaç çalışma bu nöroinflamatuar ve hemodinamik belirteçlerdeki bozukluklar ile bilişsel bozukluklar arasında bir ilişki olduğunu bildirmiştir. Burada, farelerde mTBI'ya nöroinflamatuar ve hemodinamik doku yanıtını karakterize etmek için yöntemler detaylandırılmıştır. Spesifik olarak, mTBI'nın ağırlık düşürme modelinin nasıl gerçekleştirileceğini, diffüz korelasyon spektroskopisi adı verilen invaziv olmayan bir optik teknik kullanarak serebral kan akışının uzunlamasına nasıl ölçüleceğini ve mikroglia ve diğer nöral bağışıklık hücrelerinin aktivitesine yanıt veren ve düzenleyen sitokinleri ve immünomodülatör fosfo-proteinleri (örneğin, MAPK ve NFκB yolları içinde) ölçmek için beyin dokusu örnekleri üzerinde Luminex çoklanmış immünoassay nasıl yapılacağını açıklıyoruz. Son olarak, tüm bu değişkenler arasındaki ilişkileri anlamak için çok değişkenli bir sistem analizi yaklaşımı kullanarak bu verilerin nasıl entegre edileceğini ayrıntılarıyla açıklıyoruz. Bu fizyolojik ve moleküler değişkenler arasındaki ilişkileri anlamak, sonuçta mTBI'dan sorumlu mekanizmaları tanımlamamızı sağlayacaktır.
Introduction
Genel bakış
Hafif travmatik beyin yaralanmaları (mTBI'lar) yılda ~ 1.6-3.8 milyon sporcuyu etkilemektedir1. Sub-sarsıntılı ve sarsıntılı yaralanmalar da dahil olmak üzere bu yaralanmalar, hastaları geçici fiziksel, duygusal, psikolojik vebilişsel semptomları olan 2 bırakabilir. Dahası, bir "güvenlik açığı penceresi" içinde sürdürülen tekrarlayan mTBI (rmTBI), tek başına tek bir mTBI'nın etkilerinden daha uzun süren bilişsel sonuçların kümülatif ciddiyetine ve süresine ve hatta sonuçta 4,5,6 işlevinin kalıcı kaybına yol açabilir. Birçok hasta nispeten kısa bir zaman diliminde (<1 hafta) iyileşse de, hastaların% 10-40'ı 1 ay > mTBI'nın daha uzun süreli etkilerine maruz kalırken, bazıları 1 yıla kadar sürer 3,7,8,9. Bu yaralanmaların yüksek prevalansına ve kalıcı sonuçlarına rağmen, yaralanma mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır ve etkili bir tedavi stratejisi bulunmamaktadır.
mTBI / rmTBI sonrası sonuçlardaki yüksek değişkenlik göz önüne alındığında, terminal mTBI / rmTBI çalışmalarında elde edilen dokudan erken evre moleküler tetikleyicilerin tanımlanmasındaki bir zorluk, bu moleküler tetikleyicilerin uzun vadeli sonuçlara kesin "akut moleküler bağlantılarını" gösteren uzunlamasına verilerin eksikliğidir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için grubumuz, diffüz korelasyon spektroskopisi (DCS) adı verilen optik bir araç kullanılarak akut olarak ölçülen akut olarak azaltılmış serebral kan akışının, rmTBI10'un bir fare modelinde uzun vadeli bilişsel sonuçla güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu keşfetti. Bu hemodinamik biyobelirteci kullanarak, akut olarak düşük serebral kan akışına (ve buna bağlı olarak daha kötü tahmin edilen uzun vadeli sonuç) sahip farelerin, hem MAPK hem de NFκB yolaklarında nöronal fosfo-sinyallemede eşlik eden akut artışlara, pro-inflamatuar sitokinlerin nöronal ekspresyonunda artışlara ve fagosit / mikroglial belirteç Iba111'in ekspresyonunda artışlara sahip olduğunu gösterdik. . Bu veriler, nöronal fosfo-sinyalleme, sitokin ekspresyonu ve mikroglial aktivasyon için hem yaralanma sonrası serebral kan akışının akut düzenlenmesinde hem de nöronal disfonksiyona ve daha kötü bilişsel sonuçlara yol açan bir sinyal kaskadının tetiklenmesinde olası bir rol olduğunu göstermektedir. Burada, rmTBI sonrası hem hemodinamik hem de nöroinflamatuar ortamı aynı anda araştırmak için yaklaşımımızı ve bu karmaşık veri kümelerinin nasıl entegre edileceğini detaylandırıyoruz. Spesifik olarak, bu kapsamlı yaklaşımın dört temel adımı için prosedürleri özetliyoruz: (1) hafif travmatik beyin hasarının ağırlık verme modeli, (2) serebral kan akışının diffüz korelasyon spektroskopisi ile değerlendirilmesi, (3) nöroenflamatuar ortamın nicelleştirilmesi ve (4) veri entegrasyonu (Şekil 1). Aşağıda, okuyuculara yöntemlerimizin arkasındaki mantık boyunca rehberlik etmeye yardımcı olmak için bu önemli adımların her birine kısa bir giriş sunuyoruz. Makalenin geri kalanı, bu önemli adımların her biri için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.
Hafif travmatik beyin hasarının ağırlık verme modeli
Tekrarlayan hafif TBİ'nin birçok mükemmel preklinik modeli 12,13,14,15,16,17,18 olmasına rağmen, iyi kurulmuş ve klinik olarak ilgili bir ağırlık düşüşü kapalı kafa travması modeli kullanıyoruz. Bu modelin temel özellikleri arasında (1) sağlam kafatası / kafa derisinin künt etkisi ve ardından başın boyun etrafında sınırsız dönmesi, (2) açık yapısal beyin hasarı, ödem, kan-beyin bariyeri hasarı, akut hücre ölümü veya kronik beyin dokusu kaybı ve (3) sadece birden fazla vuruştan sonra ortaya çıkan kalıcı (1 yıla kadar) bilişsel eksiklikler19 (Şekil 2).
Serebral kan akımının diffüz korelasyon spektroskopisi ile değerlendirilmesi
Diffüz korelasyon spektroskopisi (DCS), kan akışını ölçen invaziv olmayan bir optik tekniktir 5,20,21. DCS'de, doku yüzeyine yakın kızılötesi bir ışık kaynağı yerleştirilir. Doku yüzeyindeki kaynaktan sabit bir mesafeye, dokuya dağılmış olan ışığı tespit etmek için bir dedektör yerleştirilir (Şekil 3). Hareket eden kırmızı kan hücrelerinin saçılması, tespit edilen ışık yoğunluğunun zamanla dalgalanmasına neden olur. Korelasyon difüzyon teorisi olarak bilinen basit bir analitik model, bu yoğunluk dalgalanmalarını bir kan akışı indeksi ile ilişkilendirmek için kullanılır (CBFi, Şekil 4). CBF i birimleri (cm2 / s) geleneksel akış birimleri (mL / dak / 100 g) olmamasına rağmen, farelerde yapılan önceki bir çalışma, CBFi'nin MRI 21 etiketli arteriyel spin ile ölçülen serebral kan akışı ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu göstermiştir.
Referans olarak, burada kullanılan DCS cihazı şirket içinde inşa edilmiştir ve 852 nm uzunluğunda bir tutarlılık uzunluğu lazeri, bir dizi 4 foton sayma çığ fotodiyotu ve bir donanım otokorelatör kartından (tek tau, 8 kanal, 100 ns minimum örnekleme süresi) oluşur 21,22. Veriler, LabView'da yazılmış ev yapımı yazılımlarla elde edilir. Cihazın hayvan arayüzü, 6 mm aralıklarla yerleştirilmiş ve siyah bir 3D baskılı sensöre (4 mm x 8 mm) gömülü 400 μm çok modlu kaynak fiber (400-2200 nm dalga boyu aralığı, saf silika çekirdek, TECS Sert Kaplama, 730 ± 30 nm ikinci mod kesme) ve 780 nm tek modlu dedektör fiberinden (4 mm x 8 mm, Şekil 3).
Nöroinflamatuar ortamın nicelleştirilmesi
Nöroinflamasyon çeşitli hücresel süreçler tarafından düzenlenmesine rağmen, iki temel ilgili mekanizma sitokinler / kemokinler tarafından hücre dışı sinyalizasyon ve fosfo-proteinler tarafından hücre içi sinyalleşmedir. Yaralanma sonrası beynin nöroinflamatuar ortamını araştırmak için, beyinler farelerden çıkarılır, mikrodisseke edilir ve sitokinler / kemokinler ve fosfo-proteinler Luminex kullanılarak ölçülür (Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7). Luminex çoklanmış immünotahliller, enzime bağlı immünosorbent tahlillerini (ELISA'lar) floresan olarak etiketlenmiş manyetik boncuklara bağlayarak bu proteinlerin çeşitli koleksiyonlarının eşzamanlı olarak ölçülmesini sağlar. İlgilenilen her protein için farklı floresan etiketler kullanılır ve her etiketin boncukları, söz konusu proteine karşı bir yakalama antikoru ile işlevselleştirilir. Her proteini yakalamak için yüzlerce boncuk birlikte karıştırılır, 96 kuyucuklu bir tabağa yerleştirilir ve numune ile inkübe edilir. Numune inkübasyonundan sonra, numune yıkanırken boncukları kuyuya hapsetmek için bir mıknatıs kullanılır. Daha sonra, biyotinile tespit antikoru, geleneksel bir ELISA'ya benzer bir antikor-antijen sandviç oluşturmak için ilgilenilen analite bağlanır, ancak farklı bir floresan etiketli boncuk üzerinde meydana gelen her protein için ELISA ile. Fikoeritrin konjuge streptavidin (SAPE) eklenmesi her reaksiyonu tamamlar. Luminex cihazı daha sonra boncukları okur ve sinyali her floresan etiketine / proteinine göre ayırır.
Veri entegrasyonu
Luminex testinde ölçülen çok sayıda analit (örneğin, sitokinler) nedeniyle, her bir nicelleştirilmiş protein ayrı ayrı analiz edilirse, veri analizinin yorumlanması zor olabilir. Analizi basitleştirmek ve analitler arasında gözlemlenen eğilimleri yakalamak için, kısmi en küçük kareler regresyonu adı verilen çok değişkenli bir analiz yöntemi kullanıyoruz (PLSR, Şekil 8)23. PLSR, ölçülen her proteine (yani, "öngörücü değişkenler" olarak adlandırılan sitokinler veya fosfo-proteinler) karşılık gelen bir ağırlık ekseni tanımlayarak, ölçülen proteinlerin bir yanıt değişkeni (örneğin, serebral kan akışı) ile birlikte en iyi şekilde açıklanmasını sağlayarak çalışır. Ağırlıklar "yüklemeler" olarak adlandırılır ve gizli değişken (LV) olarak bilinen bir vektöre monte edilir. İki LV'nin her birinde ölçülen protein verilerini yansıtarak ("puanlama" olarak adlandırılır), veriler bu LV'ler açısından yeniden çizilebilir. PLSR'yi hesapladıktan sonra, AG'ye yapılan numune projeksiyonları ile öngörücü değişken24 arasındaki kovaryansı en üst düzeye çıkaran yeni bir AG tanımlamak için bir varimax rotasyonu kullanıyoruz. Bu yaklaşım, LV1'i yanıt değişkeninin varyansının en iyi açıklandığı eksen olarak tanımlamamızı sağlar. LV2, yanıt değişkeni ile LV1 artık verileri arasındaki eş-varyansı en üst düzeye çıkarır, bu da numuneler arasındaki biyolojik veya teknik değişkenlikle ilişkilendirilebilir. Son olarak, PLSR modelinin herhangi bir örnek23'e büyük ölçüde bağımlı olmadığından emin olmak için bir Leave One Out Cross Validation (LOOCV) yürütüyoruz.
Bu protokolde, mTBI'ya nöroinflamatuar ve hemodinamik doku yanıtını karakterize etmek için yöntemleri detaylandırıyoruz. Genel iş akışı Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu protokolde, fareler ağırlık düşürme kapalı kafa travması modeli kullanılarak bir veya daha fazla mTBI'ye tabidir. Serebral kan akımı, yaralanmadan önce ve yaralanmadan sonra birden fazla zaman noktasında uzunlamasına ölçülür. Nöroenflamatuar değişikliklerin sorgulanması için ilgi duyulan zaman noktasında, hayvan ötenazi yapılır ve beyin çıkarılır. İlgilenilen beyin bölgeleri mikrodiseksiyon yoluyla izole edilir ve daha sonra proteini çıkarmak için lize edilir. Lisatlar daha sonra hem sitokin hem de fosfo-protein ekspresyonunun Luminex multipleks immünotahlilleri ve ayrıca Western lekesi için kullanılır. Son olarak, bu bütünsel veri kümesi kısmi en küçük kareler regresyon analizi kullanılarak tümleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzlarını takip etmiştir.
1. Hafif travmatik beyin hasarının ağırlık düşürme modeli
- Ağırlık bırakma kurulumunu hazırlayın. Dikey olarak hizalanmış 1 m'lik bir kılavuz tüp (2,54 cm iç çap) ile düz bir yüzeye bir mengene monte edin (bir seviye kullanarak kontrol edin). Darbe için 54 g'lık bir cıvata (0,95 cm temel gövde çapı, 2 cm kafa çapı, 10,2 cm uzunluk) kullanın.
- Kısaca fareyi uyuşturun. Fareyi 45 saniye boyunca %100 oksijende %4,5 izofluran ile çalıştırın. Bir ayak parmağı sıkışma yanıtının olmaması ile yeterli anestezi derinliğini onaylayın.
- Yaralanmaya neden olur.
- Fareyi anesteziden hızla çıkarın ve fareyi ince bir zarın ortasına (11,2 cm x 21,3 cm doku) yerleştirin.
- Doku gerginliğini korumak için her iki elinizi de fareyi merkeze doğru kullanın. Farenin kuyruğunu bir başparmağın altına sabitleyin. Fare kafasını kılavuz tüpün altına yerleştirin (Şekil 2).
- Cıvatayı kılavuz tüpün üstünden farenin başının sırt yönüne bırakın ve gözlerin arkası ile kulakların önü arasındaki darbeyi hedefleyin. Darbe üzerine, fare dokuya nüfuz edecek ve başın boyun etrafında hızlı bir şekilde hızlanmasına izin verecektir (Şekil 2).
- Kurtarma
- Darbeden sonra, fareyi sırtüstü yatırarak oda havasındaki 37 °C'lik bir ısıtma yastığına yerleştirin. Yaralanma sonrası 1 saat boyunca iyileşmeyi izleyin. 1 saat içinde, fareler normal şekilde ambulasyon yapabilmeli, yiyecek ve su bulabilmeli ve brüt motor açıkları gösterememelidir.
NOT: Analjezi, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayına göre kullanılmaz; bu, analjezinin ilgilenilen parametreler (yani, serebral kan akışı, inflamasyon belirteçleri) üzerindeki kafa karıştırıcı etkisi nedeniyle haklı çıkar. Anesteziden çıkarılmadan sağ refleksi yeniden kazanma zamanına kadar geçen süre olarak tanımlanan bilinç kaybı beklenir, ve tipik olarak 20 s ila 3 dakika sürer (Ek Tablo 1). Kısa (<30 sn) apne ve/veya nöbet benzeri aktivite atakları özellikle günde bir kez tekrarlanan kafa travmalarından sonra gözlenebilir.
- Darbeden sonra, fareyi sırtüstü yatırarak oda havasındaki 37 °C'lik bir ısıtma yastığına yerleştirin. Yaralanma sonrası 1 saat boyunca iyileşmeyi izleyin. 1 saat içinde, fareler normal şekilde ambulasyon yapabilmeli, yiyecek ve su bulabilmeli ve brüt motor açıkları gösterememelidir.
- Gerektiğinde tekrarlayın. Bu yaralanma günlük, haftalık veya aylık olarak bir kez tekrarlanabilir. Yaralanmaların sayısı ve aralığı, istenen yaralanma şiddetine bağlıdır. Tipik olarak, mekansal öğrenme ve hafızada sağlam eksikliklere neden olmak için günde bir kez aralıklı beş isabet kullanıyoruz.
NOT: Önceki çalışmalar, günde bir kez aralıklı beş vuruşun, ödem, kanama veya beyinde açık yapısal yaralanma olmaksızın yaralanma sonrası 1 yıldan fazla süren mekansal öğrenme ve hafızadaki eksiklikleri indüklemek için yeterli olduğunu göstermiştir19. Fareler günlük olarak tartılır ve dehidrasyon, motor eksiklikler ve iştahsızlık belirtileri açısından yakından izlenir. Susuz bırakılırsa, farelere nemli chow ve günde bir kez 1 mL salin deri altı enjeksiyonu verilir. Gereksiz acıları önlemek ve insancıl bir son nokta sağlamak için, fareler şu durumlarda ötenazi yapılır: dehidrasyon devam ederse veya kötüleşirse >24 saat deri altı salin tedavisinden sonra, vücut ağırlığı yaralanma öncesi başlangıçtan% 20'den fazla azalır, dairesel veya pençe sürükleme gibi motor eksiklikler ortaya çıkar ve yaralanmadan >1 saat sonra devam eder.
2. Serebral kan akımının diffüz korelasyon spektroskopisi ile değerlendirilmesi
- DCS veri toplama
- Kafa derisindeki saçları çıkarın. DCS saç yokluğunda en iyi şekilde çalıştığından, deneylerin başlamasından önce kafadaki kürkü çıkarmak gerekir. Tipik olarak, epilasyon çalışmanın başlamasından 1-3 gün önce yapılır.
- Fareleri 45 saniye boyunca% 100 oksijende% 4.5 izofluran ile indükleyin ve% 100 oksijende% 1-2 izofluran ile koruyun.
- Kafayı gözler ve kulaklar arasında tıraş edin. Ardından, Şekil 3'te olduğu gibi kafadaki kürkü çıkarmak için tüy dökücü krem kullanın.
- Hayvanın bir ısıtma pedi üzerinde anesteziden kurtulmasına izin verin ve sonra kafese geri dönün.
- DCS ile serebral kan akışını ölçün. Ölçüm sırasında hareket artefaktlarını en aza indirmek için, fareleri kısa izofluran anestezisi altında inceleyin.
NOT: Ölçümler boyunca solunum ve ayak parmağı sıkışma tepkisini görsel olarak izleyin ve tutarlı anestezi derinliği sağlamak için izofluran konsantrasyonunu gerektiği gibi ayarlayın. Anestezi derinliğindeki önemli değişiklikler, izofluran25'in bilinen vazomodülatör etkileri göz önüne alındığında kan akışını değiştirebilir.- 45 saniye boyunca% 100 oksijende% 4.5 izofluran ile indükleyin ve daha sonra% 100 oksijende% 1.0-1.75 izofluran ile koruyun. Ayak parmağı sıkışma yanıtı ve normal solunum (dakikada ~ 60-80 nefes arasında) yokluğunda yeterli anestezi derinliğini doğrulayın.
- 2 dakikalık bir stabilizasyon süresinden sonra, DCS sensörünü yavaşça sağ yarımkürenin üzerine koyun, böylece optik sensörün üst kenarı gözün arkasıyla aynı hizaya gelir ve sensörün yan tarafı orta hat boyunca hizalanır (Şekil 3). Oda ışığından korunmak için sensörün üzerine bir el koyun. 5 saniyelik veri elde edin (1 Hz toplama).
- Sensörü sol yarımküre üzerinde yeniden konumlandırın ve 5 saniyelik veri elde edin.
- Doku yüzeyinin altındaki lokal heterojenlikleri hesaba katmak için 3 kez / yarımküreyi tekrarlayın.
- Kurtarma
- Fareyi anesteziden çıkarın ve bir ısıtma pedine yerleştirin.
- Fare sağ refleksini geri kazandıktan sonra kafese geri döndürür.
- Kafa derisindeki saçları çıkarın. DCS saç yokluğunda en iyi şekilde çalıştığından, deneylerin başlamasından önce kafadaki kürkü çıkarmak gerekir. Tipik olarak, epilasyon çalışmanın başlamasından 1-3 gün önce yapılır.
- DCS veri analizi
- İlk kalite kontrolünü gerçekleştirin. DCS verilerinin her karesi,
ölçülen normalleştirilmiş yoğunluk otokorelasyon fonksiyonundan (Şekil 4A) ve foton sayım hızından (kHz) oluşur.- Önemli hareket yapıtına sahip veri çerçevelerini kaldırmak için, eğrinin kuyruğunun ortalama değerinin (yani,
) 1,005 > olduğu veri çerçevelerini atın. - Sinyal-gürültü oranı zayıf veri çerçevelerini kaldırmak için, algılanan foton sayım hızı 20 kHz'< ise veri çerçevelerini atın.
- Önemli hareket yapıtına sahip veri çerçevelerini kaldırmak için, eğrinin kuyruğunun
- Serebral kan akış indeksini çıkarın. Matlab'da fminsearch kullanarak,ölçülen her veri çerçevesini
CBFi(i) için sığdırın. Uyumları , ile 
sınırlayın ve aşağıdaki maliyet fonksiyonunu en aza indiren CBFi değerini bulun:
Toplamın ölçülen tüm gecikme sürelerinin
üzerinde olduğu ve 
korelasyon difüzyon denkleminin yarı sonsuz homojen çözümü olduğu durumlarda (Şekil 4B):
Burada β, deney düzeni tarafından belirlenen bir tutarlılık faktörüdür, , Reff = 0.493 1.4 kırılma varsayılan doku indeksi için, ρ 6 mm'dir ve μ a ve μ'ler dokunun emilimi ve azaltılmış saçılma katsayısıdır (sırasıyla 0.25 ve 9.4 / cm, 10,26,27
olduğu varsayılmaktadır).
NOT: β zaman içinde ~%10 değişebileceğinden, her veri çerçevesini β ve CBFi'ye aynı anda sığdırın. - İkincil kalite kontrolü gerçekleştirin. Her tekrarın içinde (5 veri çerçevesinden oluşur), aykırı değerleri atın. Aykırı değerler, bu tekrarlama için ortalama CBF i'nin 1.5 standart sapmasının dışında kalan CBFi değerleri olarak tanımlanır. 1'den fazla veri noktası aykırı değer olarak tanımlanırsa, tekrarın tamamını atın.
- Ortalama serebral kan akış indeksini tahmin edin: Tüm tekrarlar için tüm veri çerçevelerindeki ortalamayı alarak yarımküre başına ortalama CBFi'yi tahmin edin (Şekil 4C). Önemli bir hemisferik farklılık gözlenmezse, ortalama küresel CBFi'nin bir tahminini elde etmek için yarımküreler arasında ortalama.
- İlk kalite kontrolünü gerçekleştirin. DCS verilerinin her karesi,
ölçülen normalleştirilmiş yoğunluk otokorelasyon fonksiyonundan (Şekil 4A) ve foton sayım hızından (kHz) oluşur.
) 1,005 > olduğu veri çerçevelerini atın.
CBFi(i) için sığdırın. Uyumları , ile 
sınırlayın ve aşağıdaki maliyet fonksiyonunu en aza indiren CBFi değerini bulun:
üzerinde olduğu ve 
korelasyon difüzyon denkleminin yarı sonsuz homojen çözümü olduğu durumlarda (Şekil 4B):
olduğu varsayılmaktadır).3. Lumineks tahlilleri kullanılarak sitokinlerin ve fosfo-proteinlerin çoklanmış nicelleştirilmesi
- Doku ekstraksiyonu
NOT: Luminex kullanılarak beyin sitokinlerinin ve fosfo-sinyal proteinlerinin miktarının belirlenmesi doku ekstraksiyonu gerektirir.- 1-2 dakika boyunca% 100 oksijende% 4.5 izofluran kullanarak fareyi anestezi altına alın. Ayak parmağı sıkışma yanıtının olmaması yoluyla derin anestezi düzlemini kontrol edin. Dekapitasyon yoluyla ötenazi.
- Dokuyu hasat edin.
- Beyni çıkarın. Tipik olarak, histoloji için sol yarımküreyi sabitleyin ve korteks ve hipokampus içindeki sağ yarımküreden birkaç bölgeyi mikrodisseke edin (Şekil 5).
- Disseke edilmiş numuneleri mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin, sıvı azotta dondurun. Donmaya duyarlı proteinlerin analizi için, daha sonra donma-çözülmeyi önlemek için donmadan önce doku bölümlerini alt bölümlere ayırmak en uygunudur.
NOT: Protokol duraklatılabilir ve doku örnekleri, numuneleri lize etmeye hazır olana kadar -80 ° C'de saklanabilir. Alternatif olarak, numuneler lize edilebilir ve daha sonra -80 ° C'de saklanabilir.
- Lyse örnekleri.
- Lizis tamponuna proteaz inhibitörü ve 2 mM fenilmetilsülfonil florür ekleyerek lizis tamponunu hazırlayın.
- Yaklaşık 3 μg hayvan dokusu başına 150 μL karışık lizis tamponu ekleyin. Referans olarak, fare görsel korteks doku örnekleri yaklaşık 3 μg'dir.
- Dokuyu homojenize etmek için, 1000 μL'lik bir pipet kullanarak ~ 15-20 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak dokuyu mekanik olarak tritürleştirin. Optimum numune tritürasyonu için homojenizatör havan kullanılabilir.
- Numune tüplerini 4°C'de 30 dakika boyunca bir rotatöre yerleştirin.
- Numuneleri 4 ° C'de yaklaşık 15.000 x g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı toplayın. Numuneler hemen işlenebilir veya daha fazla analiz için -80 ° C'de saklanabilir.
NOT: Bu protokol kullanılarak hazırlanan örnek lizatlar, nöroinflamasyon çalışmaları11 için sitokin ve fosfo-protein analizini tamamlamak üzere fagosit / mikroglial belirteç Iba1 ve / veya astrosit aktivasyon belirteci GFAP'nin analiz edilebileceği Western blot ile uyumludur.
- Sitokinler ve fosfo-proteinler için multipleks immüno-tahlil protokolü
NOT: Genel olarak benzer olmasına rağmen, sitokin ve fosfo-protein kitleri için protokollerde bazı küçük farklılıklar vardır. Her adımda farklılıklar not edilir. Luminex testi için numune hazırlama adımları aşağıda özetlenmiştir.- Reaktiflerin hazırlanması (1. gün, sitokinler ve fosfo-proteinler için aynı)
- Reaktiflerin oda sıcaklığına (~ 30 dakika) ısınmasına izin verin.
- 30 saniye boyunca çok katlı manyetik boncuk şişesini sonikat ve ardından 1 dakikalık girdap. Multipleks manyetik boncukların alüminyum folyo ile ışıktan korunduğundan emin olun veya sağlanan hafif koruyucu şişeleri kullanın.
- %0,1 Tween20'yi 1xPBS'de karıştırarak yıkama tamponu hazırlayın veya alternatif olarak kitte verilen yıkama tamponunu kullanın.
- Lize doku örneklerinin hazırlanması (1. gün, sitokinler ve fosfo-proteinler için aynı)
- Daha önce dondurulmuşsa, lize doku örneklerini dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde çözülmeye izin verin (~ 20 dakika). Çökeltiyi gidermek için numuneleri 9.167 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Lineer aralık analizi ile belirlenen optimum protein konsantrasyonunda 25 μL numune hazırlayın (bkz. bölüm 3.3). Tüm numunelerin toplam hacmini normalleştirmek için, numuneleri kit içinde verilen tahlil tamponunda seyreltin.
- 96 kuyu plakasının hazırlanması (1. gün, sitokinler ve fosfo-proteinler için aynı)
- Kitte bulunan 96 kuyucuklu plakayı veya ince tabanlı bir plakayı kullanın (örneğin, Marka Teknolojisi).
- Her bir oyuğa 200 μL yıkama tamponu (veya 1x PBS, %0,1 Ara) ekleyin ve 750 rpm'de 10 dakika boyunca plaka çalkalayıcıda karıştırın.
- Dekant yıkama tamponu ve kalıntıları gidermek için plakayı bir kağıt havluya dokunun.
- Sitokinler için immünoassay prosedürü (1. gün)
- Her bir kuyucuğa aşağıdakileri sırayla ekleyin.
- Tüm kuyucuklara 25 μL tahlil tamponu ekleyin.
- YALNIZCA arka plan kuyularına 25 μL ek tahlil tamponu ekleyin. Her deneysel çalışma için en az iki arka plan kuyusuna sahip olun. Arka plan kuyularına numune yüklenmez ve numune olmadan cihaz tarafından okunan floresan yoğunluğunu tanımlar.
- Her seyreltilmiş numunenin 25 μL'sini ilgili numune kuyularına ekleyin.
- Tüm kuyucuklara 25 μL 1x multipleks manyetik boncuk ekleyin (Şekil 6). Kuyulara eklemeden önce 1 dakika boyunca boncukları vortekslediğinizden emin olun.
- Tüm kuyucuklara 25 μL tahlil tamponu ekleyin.
- Plakayı plaka kapatıcı ile kapatın ve plakayı alüminyum folyo ile örtün. 2-8 °C'de gece boyunca (12-16 saat) inkübe edin.
- Her bir kuyucuğa aşağıdakileri sırayla ekleyin.
- Sitokinler için immünoassay prosedürü (2. gün)
- 96 kuyu plakasını manyetik ayırıcı üzerine yerleştirin ve kuyuların mıknatıslarla hizalandığından emin olun. 2 dakika bekletin. Plaka hala manyetik ayırıcıya bağlıyken dekant kuyusu içeriği.
- Aşağıdaki adımları kullanarak plakayı 2 kez yıkayın.
- Her bir oyuğa 200 μL yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika çalkalayıcıya yerleştirin.
- Kuyu plakasını manyetik ayırıcı üzerine oda sıcaklığında 2 dakika boyunca yerleştirin.
- Kuyu plakası hala manyetik ayırıcıya bağlıyken kuyu içeriğini boşaltın.
- Kuyu başına 25 μL tespit antikoru ekleyin (Şekil 6). Folyo ile örtün. Oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcıda (750 rpm) 1 saat boyunca inkübe edin.
- Tespit antikorunu içeride bırakın ve her bir oyuğa 25 μL streptavidin-fikoeritrin (SAPE) ekleyin (Şekil 6). Folyo ile örtün. Oda sıcaklığında plaka çalkalayıcıda (750 rpm) 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Kuyu plakasını manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 2 dakika bekletin. Dekant kuyusu içeriği ve manyetik ayırıcıdan ayırın.
- Kuyu plakasını iki kez yıkayın (bkz. adım 3.2.5.2).
- Her bir kuyucuğa veya tahlil tamponuna (200 veya FlexMap 3D cihazı kullanılıyorsa) 75 μL Luminex Sürücü Sıvısı (MAGPIX cihazı kullanılıyorsa) ekleyin. Tabak çalkalayıcıdaki boncukları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tekrar askıya alın.
- Luminex Instrument (MAGPIX, 200 veya FlexMap 3D) hakkında bilgi edinin, düzgün çalışması için kullanım kılavuzuna bakın (Şekil 6).
- Fosfo-proteinler için immünoassay prosedürü (1. gün)
- Her bir kuyucuğa aşağıdakileri sırayla ekleyin.
- Tüm kuyucuklara 25 μL tahlil tamponu ekleyin.
- YALNIZCA arka plan kuyularına 25 μL ek tahlil tamponu ekleyin. Her deneysel çalışma için, en az iki arka plan kuyusuna sahip olmanız önerilir. Arka plan kuyularına numune yüklenmez ve numune olmadan cihaz tarafından okunan floresan yoğunluğunu tanımlar.
- Her bir seyreltilmiş numuneden 25 μL'yi her numune kuyucuğuna ekleyin.
- Tüm kuyucuklara 25 μL 1x multipleks manyetik boncuk ekleyin (Şekil 6).
NOT: Luminex tahlil kiti, 20x stok çözümünde multipleks manyetik boncuk sağlar. 20x stok multipleks manyetik boncuk çözeltisini 2 dakika boyunca vortekse ettiğinizden emin olun ve ardından tahlil tamponunda 1x çözeltisine seyreltin. Vortex 1x multipleks manyetik boncuk süspansiyonu kuyucuklara eklemeden önce 1 dakika boyunca.
- Plakayı plaka kapatıcı ile kapatın ve plakayı alüminyum folyo ile örtün. Gece boyunca (12-16 saat) 2-8 ° C'de inkübe edin.
- Tüm kuyucuklara 25 μL tahlil tamponu ekleyin.
- Her bir kuyucuğa aşağıdakileri sırayla ekleyin.
- Fosfo-proteinler için immünoassay prosedürü (2. gün)
- Kuyu plakasını manyetik bir ayırıcı üzerine yerleştirin ve kuyu plakasının manyetik ayırıcı ile tamamen hizalandığından emin olun. 2 dakika bekletin. Kuyu plakası hala manyetik ayırıcıya bağlıyken dekant kuyusu içeriği.
- Plakayı 2 kez yıkayın (sitokinin immünoassay prosedürü 2. günde b'ye bakınız).
- Tahlil tamponunda 20x stok algılama antikorunu 1x çözeltisine kadar seyreltin. Kuyu başına 25 μL 1x tespit antikoru ekleyin (Şekil 6). Folyo ile örtün. Oda sıcaklığında plaka çalkalayıcıda (750 rpm) 1 saat boyunca inkübe edin.
- 96 kuyucuklu plakayı manyetik ayırıcıya yerleştirin ve 2 dakika bekletin. Dekant kuyusu içeriği, manyetik ayırıcıdan ayırın.
- Tahlil tamponunda 25x stok SAPE'yi 1x tampona seyreltin. 25 μL 1x SAPE ekleyin (Şekil 6). Folyo ile örtün ve oda sıcaklığında plaka çalkalayıcıda (750 rpm) 15 dakika inkübe edin.
- SAPE'yi kuyucuklarda bırakın ve her bir kuyucuğa 25 μL amplifikasyon tamponu ekleyin. Folyo ile örtün.
- Oda sıcaklığında plaka çalkalayıcıda (750 rpm) 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Kuyu plakasını manyetik ayırıcıya 2 dakika boyunca yerleştirin. Kuyu içeriğini boşaltın ve manyetik ayırıcıdan ayırın.
- 75 μL Luminex Sürücü Sıvısı (MAGPIX cihazı kullanılıyorsa) veya tahlil tamponu (200 veya FlexMap 3D cihazı kullanılıyorsa) ekleyin. Boncukları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir tabak çalkalayıcıda tekrar askıya alın.
- Luminex cihazı (MAGPIX, 200 veya FlexMap 3D) hakkında bilgi edinin, düzgün çalışması için kullanım kılavuzuna bakın (Şekil 6).
- Reaktiflerin hazırlanması (1. gün, sitokinler ve fosfo-proteinler için aynı)
- Numune seyreltme eğrisinin doğrusallığı
- Numunelerin hazırlanması: Farklı konsantrasyonlarda toplam protein içeren test numunelerini seri olarak seyreltin. Toplu beyin dokuları için, sitokinler için 0-25 μg ve fosfo-proteinler için 0-12 μg seri seyreltmeler yükleyin. Toplam protein konsantrasyonu, bikinkoninik asit (BCA) testi kullanılarak ölçülebilir.
- Multipleks immünoassay: Seçilen numuneler üzerinde Luminex testini (bakınız bölüm 3.2) uygulayın.
- Veri analizi
- Her protein için floresan yoğunluğunu ve yüklenen protein miktarını çizin (Şekil 7).
- Her analit için, toplam protein ile floresan yoğunluğu okuması arasındaki ilişkinin doğrusal olduğu yüklü toplam protein aralığını tanımlayın (Şekil 7).
- Tam tahlil çalışması için yüklenmesi gereken toplam protein miktarını belirlemek için, her analit için eğrinin doğrusal kısmını tanımlayın ve ardından analitlerin çoğunluğu için doğrusal aralıkta kalan bir protein konsantrasyonu seçin.
NOT: Çoğu protein benzer bir doğrusal aralığı paylaşsa da, doğrusal aralıklar tüm proteinler için örtüşmeyebilir. Bu durumda, her numuneyi farklı miktarlarda toplam protein yüklü olarak birden çok kez çalıştırmak gerekebilir. Alternatif olarak, doğrusal olmayan numuneler analizin dışında bırakılabilir. Ek olarak, bazı proteinler herhangi bir şekilde doğrusal bir aralığa sahip olmayabilir.
4. Kısmi en küçük kareler regresyonu
NOT: Kısmi En Küçük Kareler Analizini gerçekleştirmek için örnek R kodu ve örnek veri elektronik tablosu sağlanır.
- Veri Hazırlama: Verileri sağlanan örnek veri elektronik tablosu "MyData"da gösterildiği gibi biçimlendirin. 1. satıra değişken adlarını, A sütununa örnek adlarını, B sütununa yanıt değişkenini ve C+ sütunlarındaki tüm tahminci değişkenlerini ekleyin. Son iki satırı arka plan verileriyle doldurun ve her iki örnek adını da "Arka Plan" olarak ayarlayın.
- RStudio'da Kısmi En Küçük Kareler Regresyonu
- R'yi www.r-project.org'dan yükleyin (ücretsiz, açık kaynak).
- RStudio Desktop'ı www.rstudio.com'dan yükleyin (ücretsiz, açık kaynak lisansı).
- Bu yayınla birlikte verilen örnek R kodu olan "PLSR_Sample_Code.R" dosyasını karşıdan yükleyin ve veri elektronik tablosunu içeren klasöre kaydedin. Kod dosyasını RStudio'da açın.
- Kullanıcı Girişi bölümünde, "dataFileName" ifadesini veri elektronik tablosunun adıyla değiştirin.
- Çalıştırılacak kod bölümünü vurgulayarak ve komut dosyasının sağ üst köşesindeki Çalıştır'ı tıklatarak aşağıdaki adımları uygulayın.
- RStudio'da gerekli R paketlerini, işlevleri, çalışma dizini adresini ve kullanıcı giriş değerlerini yükleyin ("Önhazırlıklar" alt bölümü).
- Verileri RStudio'ya yükleyin ve tüm ölçümlerden ortalama arka plan sinyalini çıkararak ve her analiti z-puanlamayla ham verileri işleme için hazırlayın ("Verileri Oku ve Arka Planı Çıkar" alt bölümü)(Şekil 8A).
- Comprehensive R Archive Network'te (CRAN) bulunan plsRglm paketi v1.2.528'i kullanarak RStudio'da kısmi en küçük kareler regresyonu gerçekleştirin. Örnekleri yanıt değişkenine göre en iyi şekilde ayıran yeni bir yatay ekseni tanımlamak için LV1-LV2 düzleminde bir varimax dönüşü (stats paketi v3.6.2)23 gerçekleştirin ("PLS" alt bölümü)(Şekil 8B).
- Bir örneğin yinelemeli olarak verilerin dışında bırakıldığı ve PLSR modelinin yeniden hesaplandığı bir Leave One Out Çapraz Doğrulama (LOOCV) gerçekleştirin. Tüm LOOCV çalıştırmalarındaki analit yüklemeleri için standart sapmayı hesaplama ("LOOCV" alt bölümü).
- Temsili grafikler oluşturun: Çalışma dizinine (verileri ve kod dosyalarını içeren klasör) otomatik olarak pdf dosyaları olarak dışa aktarılan temsili grafikler oluşturmak için sağlanan örnek kodu yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çalıştırın.
- İşlenen verilerin ısı haritasını Şekil 8A'da gösterildiği gibi oluşturun ("PLS" alt bölümü). Her girişi z-skoru ile tanımlanan bir spektrum boyunca renklendirin. Analitleri, gizli faiz değişkeninde hesaplanan sıraya göre sıralayın.
- Şekil 8B'de gösterildiği gibi yatay eksen boyunca çizilen LV1 puanları ve dikey eksen boyunca çizilen LV2 puanlarıyla ("PLS" alt bölümü) bir skor grafiği oluşturun. Her gizli değişken ile yanıt değişkeni arasındaki ilişkiyi görselleştirmek için her veri noktasını yanıt değişkeni ölçümüne göre renklendirin.
- Şekil 8C'de gösterildiği gibi her bir analitin gizli değişkenlere nasıl katkıda bulunduğunu görselleştirmek için tahminci değişkenlerinizin her biri için yükleri görüntüleyen bir çubuk grafik oluşturun ("LOOCV" alt bölümü).
- PLSR modelinin örnekleri Şekil 8B'de gösterildiği gibi ne kadar iyi ayırdığını görselleştirmek için yanıt değişkeninize karşı LV1 puanlarını gerileyen bir grafik oluşturun ("PLS" alt bölümü).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha önce toplanan veriler, sekiz C57BL / 6 fareden oluşan bir grubun, günde bir kez11 aralıklı üç kapalı kafa yaralanmasına maruz kaldığı önceki çalışmalardan alınmıştır (Şekil 2). Bu çalışmada serebral kan akımı son yaralanmadan 4 saat sonra diffüz korelasyon spektroskopisi ile ölçülmüştür (Şekil 3, Şekil 4). Yaralanma sonrası CBF değerlendirmesinden sonra, hayvanlar ötenazi yapıldı ve immünoassay yoluyla sitokinlerin ve fosfo-proteinlerin nicelleştirilmesi için beyin dokusu çıkarıldı (Şekil 5). Ayrıca fagosit/mikroglial aktivasyon belirteci Iba1'i Western blot ile ölçtük (11'de tanımlanan yöntemler). Her farenin beyin dokusu lize edildi ve toplam protein konsantrasyonu bir BCA testi kullanılarak ölçüldü. Multipleks sitokin miktarı, Luminex MAGPIX sistemi kullanılarak okunan Milliplex MAP Fare Sitokini / Chemokine 32-Plex kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 6). Tüm örneklerden veri toplamadan önce uygun bir protein yüklemesini (12.5 μL lizat başına 12 μg protein) belirlemek için doğrusal bir aralık analizi yapılmıştır (Şekil 7).
Sitokin verileri, örneklem verilerinden arka plan ölçümleri ve ardından her analit için z-skorlama verileri çıkarılarak analiz için hazırlandı (Şekil 8A). Hayvanlar arasında sitokin ekspresyonundaki farklılıkları görselleştirmek için z-skorlu verilerden bir ısı haritası oluşturuldu. Kısmi En Küçük Kareler Regresyonu (PLSR), yanıt değişkeni olarak fagosit/mikroglial aktivasyon belirteci Iba1 ve öngörücü değişkenler olarak sitokin ölçümleri kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 8B). LV1 üzerindeki verilerin Iba1 ölçümleri ile eş-varyansını en üst düzeye çıkarmak için bir varimax dönüşü gerçekleştirildi (Şekil 8D). LV1'deki yüksek yükleme ağırlıkları (Şekil 8C), en çok Iba1'in yüksek ekspresyonu ile ilişkili sitokin ekspresyonuna karşılık gelir. Iba1 ve sitokinler arasındaki doğrusal regresyonlar, LV1'de en büyük yükleme ağırlığına sahip sitokinlerin de istatistiksel olarak anlamlı olduğunu göstermektedir (Şekil 8E).
Şekil 1: Tipik iş akışı. İlk olarak, fareler bir ağırlık düşüşü kapalı kafa travmasına maruz kalır ve daha sonra serebral kan akışı (CBF) diffüz korelasyon spektroskopisi kullanılarak ölçülür. Daha sonra, beyinler toplanır, ilgilenilen bölgeler mikro disseke edilir ve sıvı azot kullanılarak dondurulur. Luminex immünotestine hazırlık olarak, proteinler lize edilir ve toplam protein konsantrasyonu bikinkoninik asit testi ile ölçülür. Lisatlar, ilgilenilen proteinlerin Batı lekesi ve sitokinler ve fosfo-proteinler için Luminex tahlilleri için kullanılır. CBF, Western blot ve Luminex'ten gelen veriler, kısmi en küçük kareler regresyonu (PLSR) kullanılarak entegre edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hafif travmatik beyin hasarının kapalı kafa ağırlığı düşürme modeli. (A) Anestezi uygulanan fare, kuyruk tarafından kavranır ve bir kılavuz tüpün altındaki gergin bir kurban zarına yerleştirilir. 54 g'lık bir ağırlık 1 m'den başın sırt kısmına düşürülür. (B) Çarpma sonrası ~ 1 ms içinde, farenin başı, kurban zarını kırarken boyun etrafında hızla dönmüştür. (C) Çarpma sonrası ~5 ms içinde, farenin tamamı düşmüştür ve kavranmış kuyruğundan asılıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Serebral kan akımının Diffüz Korelasyon Spektroskopisi ile ölçülmesi. (A) Anestezi uygulanan bir farede kan akışını ölçmek için bir optik sensör sağ yarımküre üzerinde nazikçe manuel olarak tutulur. (B) Sağ yarımküreye temsili sensör yerleşimi. Sensörün ana hatları kesikli siyah bir dikdörtgen olarak temsil edilir ve kaynağın ve dedektör liflerinin konumu sırasıyla kırmızı ve mavi dairelerdedir. Sensör, sensörün kısa kenarı gözün arkasıyla aynı hizada olacak ve sensörün uzun kenarı orta hat ile aynı hizada olacak şekilde yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Diffüz Korelasyon Spektroskopisi veri analizi. (A) Temsili ölçülen yoğunluk otokorelasyon eğrileri, g2 (τ), başlangıçta, yaralanma öncesi taban çizgisinde (yeşil) ve günde bir kez aralıklı 5 kapalı kafa yaralanmasından sonra 4 saat (mor). Eğrideki yaralanma öncesinden sonrasına doğru kayma, kan akışındaki azalmayı yansıtır. (B) g
(τ) verileri, yarımküre başına 5 s için 1 Hz'de elde edilir ve tekrarlanan 3x/yarımküre. Ölçülen her g(τ) eğrisi, serebral kan akış indeksi (CBFi) için korelasyon difüzyon denkleminin yarı sonsuz çözümüne uygundur. (C) Tüm çerçevelerdeki ve tekrarlardaki CBFi değerlerinin, her yarım küre için ortalama serebral kan akış indeksi elde etmek için ortalaması alınır (yatay siyah çubukla gösterilir). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Fare beyni mikrodiseksiyonu. (A) Beyin fareden çıkarıldıktan sonra, kesikli çizgi boyunca ikiye bölünür. Sol yarımküre histoloji için sabittir ve sağ yarımküre patoloji için mikrodisseke edilir. (B) Sağ yarımkürenin korteksinin Sagital görünümü. Sağ yarımküre, karşılık gelen renk kodlu bölgelere mikrodisseke edilir. Donmaya duyarlı proteinlerin analizi için, flaş dondurmadan önce doku bölümlerinin alt bölümlere ayrılması en uygunudur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Luminex prosedürünün çizimi. (A) Floresan etiketli boncuklara numune ekleyin. Boncuklar, ilgilenilen her protein için spesifik bir yakalama antikoru ile önceden kaplanmıştır. (B) Biyotinile tespit antikorları ekleyin. Biotin-tespit antikorları, ilgilenilen analitlere bağlanır ve bir antikor-antijen sandviç oluşturur. (C) Fikoeritrin (PE)-konjuge streptavidin (SAPE) ekleyin. SAPE, biyotinile tespit antikorlarına bağlanarak reaksiyonu tamamlar. Fosfo-proteinler için, tahlil sinyalini arttırmak için SAPE'ye eklendikten sonra bir amplifikasyon tamponu (sadece fosfo-protein tahlilleri için) eklenir. (D) Luminex cihazı (MAGPIX, 200 veya FlexMap 3D), floresan etiketli her boncuktaki reaksiyonu kırmızı/yeşil aydınlatma kombinasyonu aracılığıyla okur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Doğrusal aralığı tanımlamak için numune seyreltme eğrisinin çizimi. Seri olarak seyreltilmiş numunelerin protein konsantrasyonuna karşı Luminex tahlilinden ölçülen floresan yoğunluğu. Doğrusal aralık, protein konsantrasyonu ile floresan yoğunluğu arasındaki ilişkinin doğrusal (ok) olduğu protein konsantrasyon aralığı olarak tanımlanır. Bazı analitlerde, protein konsantrasyonunun belirli bir sınırın üzerine çıkarılması, seyreltme eğrisinin doğrusal olmayan veya ters çevrilmiş hale gelmesi için antikor bağlanmasını azaltabilir (Kanca etkisi). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Temsili Kısmi En Küçük Kareler Regresyonu (PLSR) Analizi. (A) Panel sitokin protein ekspresyonu (sol sütunlar) ve 3xCHI farelerde Iba1 ekspresyonu (sağ sütun) (n=8, z-skorlu). (B) PLSR, her gizli değişken için ölçülen sitokinlere ağırlıklar (yüklemeler) atar. Ağırlıklar, her gizli değişkendeki her numunenin puanlarını hesaplamak için ölçülen verilere uygulanır. (C) Iba1'e karşı 3xCHI örneklerinin PLSR'si, örnekleri Iba1 ile ayırt eden ağırlıklı bir sitokin profili olan LV1'i tanımladı. Düşük Iba1'li örneklerde negatif ağırlıklı sitokinler yukarı regüle edilirken, yüksek Iba1'li örneklerde pozitif ağırlıklı sitokinler (LOOCV kullanılarak SD ± ortalama) yukarı regüle edildi. (D) Her bir numune için LV1 puanlarının Iba1'e karşı doğrusal regresyonu. R2PLS , Iba1 ve LV1 arasındaki uyumun iyiliğini ölçer. (E) C'de LV1'de en büyük ağırlığa sahip sitokinlerin her birine karşı Iba1'in bireysel regresyonları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarına karşı hemodinamik ve nöroinflamatuar yanıtın değerlendirilmesi için yöntemler ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ayrıca, bu verilerin kısmi en küçük kareler regresyonunu kullanarak çok değişkenli sistem analizinin bir parçası olarak nasıl entegre edileceğini gösterdik. Aşağıdaki metinde, protokolle ilişkili bazı önemli adımlar ve sınırlamaların yanı sıra yöntemlerin mevcut yöntemlere göre avantajlarını / dezavantajlarını tartışacağız.
Hafif travmatik beyin hasarının ağırlık düşürme modeli. Bu travmatik beyin hasarı indüksiyon yöntemi, sporla ilişkili kafa yaralanmalarında yaygın olarak görülen hızlı anterior-posterior rotasyonel hızlanmayı takiben künt etkiye sahip olması bakımından avantajlıdır10,19. Elbette, lissensefalik fare beyni, jirosefalik insan beyninin karmaşıklığını tam olarak özetlemez; Bununla birlikte, bu model, mekansal öğrenme ve tekrarlanan yaralanmalarla hafızadaki sürekli eksiklikler de dahil olmak üzere, insan mTBI'sının aynı klinik ve davranışsal sekellerinin çoğunu indüklemektedir. Ek olarak, etki doğada hafif olsa da (yapısal / nöronal hasar yok, kan beyin bariyeri geçirgenliği yok, sadece çoklu vuruşlardan sonra ortaya çıkan bilişsel eksiklikler, vb.19), Bilinç kaybının daha az yaygın olduğu insanların aksine, önemli bilinç kaybına neden olur. Bu artan bilinç kaybı, kesin nedeni iyi anlaşılmamış olsa da, darbeden hemen önce verilen anestezi ile etkileşimden kaynaklanıyor olabilir. Son olarak, kılavuz tüpünün, cıvata darbelerinin koronal ve lamdoid sütürler arasında olacak şekilde hizalanmasının kritik olduğunu not ediyoruz. Daha posterior olan etkilerin ötenazi gerektiren önemli motor eksikliklere neden olabileceğini gözlemledik.
Serebral kan akımının Diffüz Korelasyon Spektroskopisi ile değerlendirilmesi. Perfüzyon manyetik rezonans görüntüleme veya transkraniyal Doppler ultrason gibi insan / büyük hayvan çalışmalarında kullanılan geleneksel modalitelerle serebral kan akışının (CBF) invaziv olmayan, uzunlamasına ölçümleri, küçük beyin boyutu ve toplam kan hacmi29 dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle farelerde zordur. Diffüz korelasyon spektroskopisi farelerde çok uygundur ve diğer modalitelere kıyasla noninvaziv ve nispeten ucuz olmanın ek avantajlarını sunar20,30. DCS hareket artefaktlarına duyarlı olduğundan, farelerin değerlendirme için kısaca anestezi altına alınması veyakısıtlanması gerekir 31. Hızlı indüksiyonu ve iyileşmesi nedeniyle tipik olarak izofluran anestezi kullanıyoruz; Bununla birlikte, izofluran bir serebral vazodilatördür ve izofluran altındaki kan akışı tahminleri dikkatle yorumlanmalıdır. Yaralanma sonrası görülen kan akışındaki azalmalar, sahte yaralı hayvanlara kıyasla, yaralı serebral vaskülatürin, izoflurana yanıt olarak vazodilat'a başarısız olmasıyla karıştırılabilir. Son olarak, daha önce farelerde DCS ile kan akışı ölçümlerinin mükemmel kullanıcı içi tekrarlanabilirliğini gösterdik, ancak yalnızca adil kullanıcı içi tekrarlanabilirlik21. Bu nedenle, aynı operatörün serebral kan akışının uzunlamasına değerlendirilmesini gerektiren deneyler için DCS ölçümleri almasını öneririz.
Luminex testleri kullanılarak sitokinlerin ve fosfo-proteinlerin çoklanmış nicelleştirilmesi. Herhangi bir ELISA ile ilgili önemli bir zorluk, artan protein konsantrasyonunun hedef protein için antikor afinitesini azaltabileceği, böylece artan protein32'ye yanıt olarak tahlil sinyalinin azalmasına yol açabileceği Kanca etkisidir (Şekil 7). Bu etki, bütün dokuları analiz ederken daha da şiddetlenebilir, burada toplu proteinler benzer şekilde müdahale edebilir. Bu nedenle, Luminex tahlillerini kullanmanın ilk adımı, tahlilin okunduğu bir dizi protein konsantrasyonunun yüklü olup olmadığını belirlemektir. yüklenen protein miktarına doğrusal olarak değişir. Böyle bir doğrusal aralığa sahip olmayan analitler (Şekil 7) analiz dışı bırakılmalıdır. Ayrıca, beyindeki sitokin seviyelerinin tipik olarak çok düşük olduğunu ve Luminex kiti ile birlikte verilen standart eğrilerle değerlendirilen alt algılama sınırının yakınında göründüğünü de not ediyoruz. Bu nedenle, cihaz okumasının yüklenen numune miktarını gerçekten yansıtıp yansıtmadığını belirlemek için doğrusal aralık analizi yapmak önemlidir. İlgilenilen anahtar proteinler için, bu doğrusal aralık analizi, rekombinant proteinin bir numuneye çivilendiği ve cihaz okumasındaki doğrusallığın değerlendirildiği bir başak geri kazanım testi ile tamamlanabilir33.
Nöroinflamasyon çeşitli hücre içi fosfo-proteinler ve hücre dışı sitokinler tarafından düzenlendiğinden, beynin mTBI'ya karşı nöral bağışıklık tepkisini anlamak için bu proteinlerin geniş bir dizisini aynı anda ölçmek çok önemlidir. Luminex çoklanmış immünoassayler, tek bir numuneden düzinelerce sitokin ve fosfo-proteinin eşzamanlı olarak ölçülmesini sağlayarak yaralanma sonrası doku immün yanıtının bütünsel bir görünümünü sağlar. Bu analizler sitokinler / kemokinlerin yanı sıra fosfo-proteinler hakkında geniş bir görüş sunsa da, tahlil bir doku homojenatından her proteinin toplam miktarını ölçer. Bu nedenle, hücre türüne özgü veriler vermez. Hücre tipi özgüllüğü, ilgilenilen en iyi proteinlerin hücre tipleri için belirteçlerle (örneğin, nöronlar, mikroglia, astrositler, vb.) lokalizasyonunu tanımlamak için takip immünohistokimyası ile belirlenebilir. 11.
Veri tümleştirmesi için kısmi en küçük kareler regresyon analizi. mTBI'ya doku yanıtı, kan akışındaki fizyolojik değişikliklerle birlikte fagosit / mikroglial aktivasyon belirteci Iba1, çeşitli sitokinler ve fosfo-proteinlerdeki değişikliklerden oluşan multifaktöriyeldir11. Toplanan verilerin çoklanmış doğası nedeniyle, çeşitli öngörücü değişkenler arasındaki ilişkilerin çok boyutluluğunu açıklamak için sistematik bir yönteme ihtiyaç vardır. PLSR, tahminci değişkenler ve sonuç değişkeni arasındaki eş-varyansı maksimum düzeyde tanımlayan LV'leri tanımlayarak bu soruna uygun bir çözüm sunar (örneğin, Şekil 8'deki Iba1). Önemli olarak, öngörücü değişkeni ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğu tespit edilen proteinler (yani, LV1 üzerinde yüksek yüklere sahip olanlar) genellikle tek değişkenli regresyon analizinde de ilişkilidir (Şekil 8E). PLSR, Şekil 8'de olduğu gibi çok sayıda öngörücü değişkenini daha az sayıda numuneye sığdırmak için sıklıkla kullanıldığından, LV1 üzerindeki ağırlıkların tek tek numunelere duyarlılığını anlamak çok önemlidir. Az sayıda numune için (<10) LOOCV, ağırlıkların hassasiyetini değerlendirmek için kullanışlıdır ( Şekil 8C'deki SD hata çubuklarıyla gösterilmiştir). Daha fazla sayıda numune için, Monte Carlo alt örnekleme yaklaşımı34 kullanarak aynı anda birden fazla numuneyi dışarıda bırakarak duyarlılığı değerlendirmek önemli olacaktır. PLSR yaklaşımları ve kullanımları hakkında derinlemesine bir tartışma için okuyucuyu Çoklu ve Megavariate Veri Analizi24'e yönlendiriyoruz. Son olarak, bu tür bir analizin önemli bir sınırlamasının, tamamen korelatif olması olduğunu not ediyoruz. PLSR, öngörücü değişkenler ile sonuç değişkeni arasında mekanik bir ilişki olduğunu kanıtlamaz. PLSR'yi, nedensel ilişkiler kuran gelecekteki deneylerde modüle etmek için izlenebilir hedefler önermek için kullanılan değerli bir hipotez üretme yaklaşımı olarak görüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiç kimse.
Acknowledgments
Bu proje Ulusal Sağlık Enstitüleri R21 NS104801 (EMB) ve R01 NS115994 (LBW / EB) ve Atlanta Çocuk Sağlığı Fakülte Odaklı Ödülü (EMB) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda ABD Savunma Bakanlığı tarafından Ödül No altındaki Kongre Tarafından Yönlendirilen Tıbbi Araştırma Programları aracılığıyla desteklenmiştir. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Görüşler, yorumlar, sonuçlar ve öneriler yazara aittir ve mutlaka Savunma Bakanlığı tarafından onaylanmamıştır. Bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı tarafından Hibe No. 1937971 altında desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç veya öneri yazarlara aittir ve mutlaka Ulusal Bilim Vakfı'nın görüşlerini yansıtmaz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable pipettes | any adjustable pipette | ||
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Bio-Plex cell lysis kit | C Bio-Rad | 171304012 | |
| BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile | BrandTech | 781602 96 | |
| Complete mini protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
| Depilatory cream | Amazon | Nair | |
| DiH2O | VWR | VWRL0200-1000 | |
| Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates | Millipore Sigma Catalogue | 40-285 | |
| Hardware Autocorrelator Board | www.correlator.com | Flex05-8ch | |
| Isoflurane 250 mL | MED-VET INTERNATIONAL | RXISO-250 | |
| Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) | VWR | 21905-026 | |
| Laboratory vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| LabView | National Instruments | LabVIEW | |
| Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software | Luminex Corporation | ||
| Luminex Drive Fluid | Luminex | MPXDF-4PK | |
| Luminex sheath fluid | EMD Millipore | SHEATHFLUID | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay | Millipore Sigma | MCYTMAG-70K-PX32 | |
| MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay | Millipore Sigma | 48-660MAG | |
| Mini LabRoller rotator | VWR | 10136-084 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | VWR | 97064-158 | |
| Plate Sealer | VWR | 82050-992 | |
| Polypropylene microfuge tubes | VWR | 20901-547 | |
| Mini LabRoller | Millipore Sigma | Z674591 | |
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-668 | |
| R Programming Language | |||
| RStudio | www.rstudio.com | ||
| Sonicator | |||
| Titer plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 1 m acrylic guide tube | McMaster-Carr | 49035K85 | |
| 4 photon counting avalanche photodiode | Perkin-Elmer | SPCM-AQ4C-IO | |
| 400 um multimode source fiber | Thorlabs Inc. | FT-400-EMT | |
| 54 g bolt | Ace Hardware | 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length | |
| 780 nm single mode detector fiber | Thorlabs Inc. | 780HP | |
| 852 nm long-coherence length laser | TOPTICA Photonics | iBeam smart |
References
- Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
- Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
- Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
- Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , National Academies Press (US). Washington (DC). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169016/ (2014).
- Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
- McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
- Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
- Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).
- Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
- Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
- Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
- Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
- Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
- Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
- Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury--part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
- Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
- Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
- Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).
- Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).
- Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
- Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
- Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
- Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).
- Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
- Bertrand, F., Maumy-Bertrand, M. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019).
- White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322 (2011).
- Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).
- Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
- Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
- Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).
