Summary
このプロトコルは、軽度の外傷性脳損傷に対する神経炎症性および血行力学的応答を特徴付け、部分最小二乗回帰を用いた多変量系分析の一部としてこれらのデータを統合する方法を提示する。
Abstract
軽度の外傷性脳損傷(mTBI)は、重大な公衆衛生上の問題である。mTBIへの反復曝露は、累積的で長期的な機能的欠損につながる可能性がある。私たちのグループや他のグループによる多くの研究は、mTBIがサイトカイン発現を刺激し、ミクログリアを活性化し、脳血流と代謝を減少させ、脳血管反応性を損なうことを示しています。さらに、いくつかの研究は、これらの神経炎症および血行動態マーカーにおける狂乱と認知障害との関連を報告している。本明細書では、マウスにおけるmTBIに対する神経炎症性および血行動態組織応答を特徴付ける方法を詳述する。具体的には、mTBIの重量減少モデルを実行する方法、びまん性相関分光法と呼ばれる非侵襲的光学技術を用いて脳血流を縦方向に測定する方法、およびミクログリアおよび他の神経免疫細胞の活性に応答し調節するサイトカインおよび免疫調節リンタンパク質(例えば、MAPKおよびNFκB経路内)を定量するために、脳組織サンプルに対してルミネックス多重免疫アッセイを実行する方法について説明する。最後に、多変量システム分析アプローチを使用してこれらのデータを統合して、これらすべての変数間の関係を理解する方法を詳しく説明します。これらの生理学的変数と分子変数の関係を理解することで、最終的にはmTBIの原因となるメカニズムを同定することができます。
Introduction
概要
軽度の外傷性脳損傷(mTBI)は、年間約160万人から380万人のアスリートに影響を与えます1.副脳震盪および脳震盪傷害を含むこれらの傷害は、患者に一時的な身体的、感情的、心理的および認知的症状を残す可能性がある2。さらに、「脆弱性の窓」内で持続する反復的なmTBI(rmTBI)は、単一のmTBI単独の影響よりも長く続く認知的結果の累積的な重症度および持続時間をもたらし得3、そして最終的には機能の永久的な喪失につながることさえある4,5,6。多くの患者は比較的短い時間枠(<1週間)内に回復するが、患者の10〜40%はmTBIのより長い持続効果に1ヶ月>苦しみ、一部は1年まで持続する3、7、8、9。これらの傷害の高い有病率および永続的な結果にもかかわらず、傷害メカニズムはほとんど理解されておらず、効果的な治療戦略は存在しない。
mTBI/rmTBI後の転帰のばらつきが大きいことを考えると、末端mTBI/rmTBI研究で得られた組織から初期段階の分子トリガーを同定する際の課題の1つは、これらの分子トリガーの長期的な転帰への決定的な「急性分子リンク」を実証する縦断的データの欠如である。この課題を克服するために、我々のグループは、びまん性相関分光法(DCS)と呼ばれる光学ツールを使用して急性に測定された脳血流の急性減少が、rmTBI10のマウスモデルにおける長期的な認知転帰と強く相関することを発見した。この血行動態バイオマーカーを用いて、我々は、脳血流が極端に低いマウス(および、拡張により、より悪い予測された長期転帰)を有するマウスが、MAPKおよびNFκB経路の両方におけるニューロンホスホシグナル伝達の急性増加、炎症誘発性サイトカインのニューロン発現の増加、および貪食細胞/ミクログリアマーカーIba111の発現の増加を有することを示した。.これらのデータは、ニューロンホスホシグナル伝達、サイトカイン発現、およびミクログリア活性化が、傷害後の脳血流の急性調節と、ニューロン機能障害および認知転帰の悪化につながるシグナル伝達カスケードの誘発の両方において、可能な役割を示唆している。ここでは、rmTBI後の血行動態と神経炎症の両方の環境を同時にプローブするアプローチと、これらの複雑なデータセットを統合する方法を詳述します。具体的には、(1)軽度の外傷性脳損傷の重量減少モデル、(2)びまん性相関分光法による脳血流の評価、(3)神経炎症環境の定量化、(4)データ統合(図1)の4つの重要なステップの手順を概説する。以下では、これらの重要なステップのそれぞれを簡単に紹介し、読者に私たちの方法の背後にある理論的根拠を導くのに役立ちます。原稿の残りの部分では、これらの重要なステップのそれぞれについて詳細なプロトコルを提供しています。
軽度外傷性脳損傷の体重減少モデル
反復軽度のTBIの多くの優れた前臨床モデルが存在するが、12,13,14,15,16,17,18、我々は十分に確立され、臨床的に関連する体重減少閉鎖性頭部損傷モデルを採用している。このモデルの主な特徴には、(1)無傷の頭蓋骨/頭皮の鈍い衝撃に続いて首周りの頭部の無制限の回転、(2)明白な構造的脳損傷、浮腫、血液脳関門損傷、急性細胞死、または慢性脳組織喪失、および(3)複数回のヒット後にのみ現れる持続性(最大1年)認知障害19(図2)が含まれる。
びまん性相関分光法による脳血流の評価
びまん性相関分光法(DCS)は、血流5、20、21を測定する非侵襲的な光学技術です。DCSでは、近赤外光源を組織表面に配置する。検出器を組織表面の光源から一定の距離に配置して、組織を透過して散乱した光を検出します(図3)。移動する赤血球を散乱させると、検出された光強度が時間とともに変動します。相関拡散理論として知られる単純な分析モデルを使用して、これらの強度変動を血流の指標に関連付ける(CBFi、図4)。CBF i(cm2/s)の単位は従来の流れの単位(mL/min/100g)ではないが、マウスでの以前の研究では、CBFiが動脈スピン標識MRI 21によって測定された脳血流と強く相関することが示されている。
参考までに、ここで使用したDCS機器は社内で製造されたもので、長さ852nmのコヒーレンス長レーザ、4光子カウントアバランシェフォトダイオードのアレイ、およびハードウェア自己相関器ボード(シングルタウ、8チャネル、100ns最小サンプル時間)21,22で構成されています。データは、LabViewで書かれた自家製ソフトウェアで取得されます。このデバイスの動物インターフェースは、400 μmのマルチモードソースファイバ(400-2200 nmの波長範囲、純粋なシリカコア、TECSハードクラッディング)と780 nmのシングルモード検出器ファイバ(780-970 nmの波長範囲、純粋なシリカコア、TECSハードクラッディング、730 ± 30 nmのセカンドモードカットオフ)で構成され、6 mm間隔で黒の3Dプリントセンサー(4 mm x 8 mm、 図3)。
神経炎症環境の定量化
神経炎症は多様な細胞プロセスによって調節されるが、2つの重要な関連メカニズムはサイトカイン/ケモカインによる細胞外シグナル伝達およびリンタンパク質による細胞内シグナル伝達である。損傷後の脳の神経炎症環境を調べるために、マウスから脳を抽出し、微小解剖し、ルミネックスを用いてサイトカイン/ケモカインおよびリンタンパク質を定量する(図5、 図6、 図7)。ルミネックスの多重化イムノアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を蛍光タグ付き磁気ビーズに結合させることにより、これらのタンパク質の多様なコレクションの同時定量を可能にします。異なる蛍光タグが目的のタンパク質ごとに使用され、各タグのビーズがその特定のタンパク質に対する捕捉抗体で官能化されます。各タンパク質を捕捉するための何百ものビーズを一緒に混合し、96ウェルプレートに入れ、サンプルと共にインキュベートした。サンプルインキュベーション後、磁石を使用してビーズをウェルにトラップし、サンプルを洗い流します。次に、ビオチン化された検出抗体は、目的の分析物に結合して、従来のELISAと同様に抗体抗原サンドイッチを形成しますが、タンパク質ごとに異なる蛍光タグ付きビーズ上でELISAが発生します。フィコエリスリン結合型ストレプトアビジン(SAPE)を添加すると、各反応が完了する。次に、ルミネックス装置はビーズを読み取り、各蛍光タグ/タンパク質に従ってシグナルを分離します。
データ統合
ルミネックスアッセイでは多数の分析物(サイトカインなど)が測定されるため、定量された各タンパク質を個別に分析すると、データ分析の解釈が困難な場合があります。分析を簡素化し、分析種間で観察された傾向を捉えるために、偏最小二乗回帰(PLSR、 図8)23と呼ばれる多変量分析法を使用します。PLSRは、測定されたタンパク質の共分散を応答変数(例えば、脳血流)とともに最適に説明する、各測定されたタンパク質(すなわち、「予測変数」と呼ばれるサイトカインまたはリンタンパク質)に対応する重みの軸を同定することによって機能する。重みは「負荷量」と呼ばれ、潜在変数 (LV) と呼ばれるベクトルに組み立てられます。測定されたタンパク質データを2つのLVの各々に投影(「スコアリング」と呼ぶ)することによって、データはこれらのLVに関して再プロットされ得る。PLSRを計算した後、我々は、LVへのサンプル投影と予測変数24との間の共分散を最大化する新しいLVを識別するために、バリマックス回転を使用する。このアプローチにより、LV1を応答変数の分散が最もよく説明される軸として定義できます。LV2は、応答変数とLV1残差データとの間の共分散を最大化し、これはサンプル間の生物学的または技術的変動性と関連している可能性がある。最後に、PLSRモデルが1つのサンプルに大きく依存していないことを確認するために、1つのアウトクロス検証(LOOCV)を実行します23。
このプロトコールでは、mTBIに対する神経炎症性および血行力学的組織応答を特徴付ける方法を詳述する。一般的なワークフローの概要を 図 1 に示します。このプロトコルにおいて、マウスは、体重減少閉鎖頭部損傷モデルを用いて1つ以上のmTBIを受ける。脳血流は、傷害の前後に複数の時点で縦方向に測定される。神経炎症性変化の尋問の対象となる時点で、動物を安楽死させ、脳を抽出する。関心のある脳領域は、マイクロダイセクションによって単離され、次いで溶解されてタンパク質を抽出する。溶解物は、その後、サイトカインおよびリンタンパク質発現のルミネックス多重化免疫アッセイならびにウェスタンブロットの両方に使用される。最後に、この全体的なデータセットは、偏最小二乗回帰分析を使用して統合されます。
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Protocol
すべての動物の手順は、エモリー大学施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドラインに従っています。
1. 軽度外傷性脳損傷の体重減少モデル
- ウェイトドロップ設定を準備します。1 mのガイドチューブ(内径2.54 cm)を垂直に揃えて平らな面に万力を取り付けます(レベルを使用して確認してください)。衝撃には54gボルト(本体基本直径0.95cm、頭部径2cm、長さ10.2cm)を使用してください。
- マウスに簡単に麻酔をかける。マウスを100%酸素中の4.5%イソフルランで45秒間誘導する。つま先のピンチ反応がないことで十分な深さの麻酔を確認する。
- 怪我を誘発する。
- マウスを麻酔から急速に取り除き、マウスを薄い膜(11.2 cm x 21.3 cm組織)の中心に置きます。
- 両手を使って、マウスが中央にかかりやすい状態で組織を緊張させます。マウスの尻尾を親指で固定します。マウスヘッドをガイドチューブの下に置きます(図2)。
- ガイドチューブの上部からマウスの頭の背側側面にボルトを落とし、目の後ろと耳の前面の間の衝撃を狙います。衝撃を受けると、マウスは組織に浸透し、首の周りの頭の急速な加速を可能にします(図2)。
- 回復
- 衝撃後、マウスを仰臥位で室温の37°Cの加温パッドの上に置きます。怪我の後1時間の回復を監視します。1時間以内に、マウスは正常に歩行し、食物と水を見つけ、総運動欠損を示さないようにすべきである。
注:鎮痛は、関心のあるパラメータ(すなわち、脳血流、炎症のマーカー)に対する鎮痛の交絡の影響のために正当化される、施設動物ケアおよび使用委員会の承認に従って使用されていない。意識喪失は、麻酔からの除去から右反射を取り戻すまでの時間として定義され、予想され、典型的には20秒から3分続く(補足表1)。無呼吸および/または発作様活動の短い(<30秒)エピソードは、特に1日1回間隔をあけた反復的な頭部外傷の後に観察され得る。
- 衝撃後、マウスを仰臥位で室温の37°Cの加温パッドの上に置きます。怪我の後1時間の回復を監視します。1時間以内に、マウスは正常に歩行し、食物と水を見つけ、総運動欠損を示さないようにすべきである。
- 必要に応じて繰り返します。この傷害は、1日1回、毎週、または毎月繰り返すことができます。傷害の数および間隔は、所望の傷害の重症度に依存する。通常、私たちは空間学習と記憶の堅牢な欠陥を誘発するために、1日1回間隔をあけて5つのヒットを使用します。
注:以前の研究では、1日1回間隔をあけて5回のヒットが、浮腫、出血、または脳への明白な構造的損傷なしに、損傷後1年以上持続する空間学習および記憶の欠損を誘発するのに十分であることが示されている19。マウスは毎日体重を量り、脱水、運動障害、食欲不振の兆候を注意深く監視します。脱水した場合、マウスには湿った固形飼料と1日1回1mLの生理食塩水の皮下注射が与えられます。不必要な苦痛を予防し、人道的なエンドポイントを確保するために、脱水が皮下生理食塩水治療後>24時間持続または悪化し、体重が傷害前のベースラインから20%以上減少し、旋回または足引きなどの運動障害が現れ、傷害後>1時間持続する場合、マウスは安楽死させられる。
2. びまん性相関分光法による脳血流の評価
- DCSデータ集録
- 頭皮の毛を落とす。DCSは髪の毛がないときに最も効果的であるため、実験の開始前に頭の毛皮を取り除く必要があります。典型的には、脱毛は、研究の開始の1〜3日前に行われる。
- 100%酸素中の4.5%イソフルランでマウスを45秒間誘導し、100%酸素中に1〜2%イソフルランで維持する。
- 目と耳の間の頭を剃ります。次に、脱毛クリームを使用して、 図3のように頭の毛皮を取り除きます。
- 動物が温暖化パッドの麻酔から回復してからケージに戻るのを許してください。
- DCSで脳血流を測定します。測定中の運動アーチファクトを最小限に抑えるために、短いイソフルラン麻酔下でマウスを研究します。
注:測定全体を通して呼吸とつま先のピンチ反応を視覚的に監視し、必要に応じてイソフルラン濃度を調整して、一貫した麻酔の深さを確保します。麻酔の深さの有意な変動は、イソフルラン25の既知の血管調節効果を考えると血流を変化させ得る。- 100%酸素中の4.5%イソフルランで45秒間誘導し、次いで100%酸素中の1.0〜1.75%イソフルランで維持する。つま先のピンチ反応と正常な呼吸(毎分〜60〜80回の呼吸)がないことによって、麻酔の十分な深さを確認してください。
- 2分間の安定化の後、DCSセンサーを右半球の上にそっと置いて、光学センサーの上端が目の後ろと揃い、センサーの側面が正中線に沿って並ぶようにします(図3)。センサーに手をかざして、部屋の光から遮蔽します。5秒間のデータ集録(1Hz集録)。
- センサーを左半球上に再配置し、5 秒間のデータを取得します。
- 組織表面下の局所的な不均一性を説明するために、3回/半球を繰り返す。
- 回復
- マウスを麻酔から外し、温めるパッドの上に置きます。
- マウスが右反射を取り戻したら、ケージに戻します。
- 頭皮の毛を落とす。DCSは髪の毛がないときに最も効果的であるため、実験の開始前に頭の毛皮を取り除く必要があります。典型的には、脱毛は、研究の開始の1〜3日前に行われる。
- DCS データ分析
- 初期品質管理を行います。DCSデータの各フレームは、
測定された正規化された強度自己相関関数(図4A)と光子カウントレート(kHz)で構成されています。- モーションアーチファクトが著しいデータフレームを削除するには、曲線の裾の平均 値(つまり
、)が1.005>データフレームを破棄します。 - 信号対雑音比の低いデータフレームを削除するには、検出されたフォトンカウントレートが20kHz<場合はデータフレームを破棄します。
- モーションアーチファクトが著しいデータフレームを削除するには、曲線の裾の平均
- 脳血流指数を抽出する。Matlabでfminsearchを使用して、CBF i(i)の測定データフレーム
ごとにi番目を当てはめます。適合度を に制限
し、次のコスト関数を最小化する CBFi の値を見つけます。
ここで、合計は測定されたすべての遅延時間
にわたっており 
、相関拡散方程式の半無限均質解です(図4B)。
ここでβは、実験的セットアップによって決定されるコヒーレンス係数であり、
、 
Reff = 0.493 1.4の仮定された組織屈折率に対して、ρは6mmであり、μ aおよびμは組織の吸収および低減散乱係数である(それぞれ0.25および9.4/cm、10、26、27と仮定される)。
メモ: βは時間の経過とともに約 10% 変化する可能性があるため、β と CBFi の各データ フレームを同時に適合させます。 - 二次品質管理を行う。各繰り返し (5 つのデータ フレームで構成される) 内で、外れ値を破棄します。外れ値は、その繰り返しの平均CBF iの1.5標準偏差の外側にあるCBFi値として定義されます。1 つ以上のデータ ポイントが外れ値として識別された場合は、繰り返し全体を破棄します。
- 平均脳血流指数の推定:すべての繰り返しについて、すべてのデータフレームにわたる平均を取ることによって、半球あたりの平均CBFi を推定します(図4C)。有意な半球差が観察されない場合、半球全体にわたる平均、平均全球CBFiの推定値を得た。
- 初期品質管理を行います。DCSデータの各フレームは、
測定された正規化された強度自己相関関数(図4A)と光子カウントレート(kHz)で構成されています。
、)が1.005>データフレームを破棄します。
ごとにi番目を当てはめます。適合度を に制限
し、次のコスト関数を最小化する CBFi の値を見つけます。
にわたっており 
、相関拡散方程式の半無限均質解です(図4B)。
、 
Reff = 0.493 1.4の仮定された組織屈折率に対して、ρは6mmであり、μ aおよびμは組織の吸収および低減散乱係数である(それぞれ0.25および9.4/cm、10、26、27と仮定される)。3. ルミネックスアッセイを用いたサイトカインおよびリンタンパク質の多重化定量
- 組織抽出
注:ルミネックスを用いた脳サイトカインおよびホスホシグナル伝達タンパク質の定量には、組織抽出が必要です。- 100%酸素中の4.5%イソフルランを用いてマウスを1〜2分間麻酔する。つま先のピンチ応答の欠如を介して麻酔の深い平面を確認してください。斬首による安楽死。
- 組織を収穫する。
- 脳を取り除きます。典型的には、組織学のために左半球を固定し、皮質および海馬内の右半球からいくつかの領域を微小解剖する(図5)。
- 解剖した試料を微量遠心管に入れ、液体窒素中で急速凍結する。凍結感受性タンパク質の分析には、後の凍結融解を避けるために、フラッシュ凍結の前に組織切片を細分化することが最適である。
注:プロトコルは一時停止することができ、組織サンプルはサンプルを溶解する準備ができるまで-80°Cで保存することができます。あるいは、サンプルを溶解し、次いで-80°Cで保存することができる。
- 溶解サンプル。
- 溶解緩衝液にプロテアーゼ阻害剤および2mMフェニルメチルスルホニルフルオリドを添加して溶解緩衝液を調製する。
- 約3μgの動物組織あたり150μLの混合溶解緩衝液を加える。参考までに、マウス視覚野組織サンプルは約3μgである。
- 組織を均質化するには、1000 μLのピペットを使用して上下に約15〜20回ピペッティングすることにより、組織を機械的に粉砕します。最適なサンプル粉砕のために、ホモジナイザー乳棒を使用することができる。
- サンプルチューブを回転子の上に置き、4°Cで30分間置きます。
- サンプルを約 15,000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離し、上清を収集します。サンプルはすぐに処理することも、さらなる分析のために-80°Cで保存することもできます。
注:このプロトコルを使用して調製されたサンプル溶解物はウェスタンブロットと互換性があり、そこから貪食細胞/ミクログリアマーカーIba1および/またはアストロサイト活性化マーカーGFAPを分析して、神経炎症研究のためのサイトカインおよびリンタンパク質分析を補完することができる11。
- サイトカインおよびリンタンパク質のマルチプレックス免疫アッセイプロトコル
注:全体的には似ていますが、サイトカインおよびリンタンパク質キットのプロトコルにはいくつかの小さな違いがあります。相違点は各ステップで注記される。ルミネックスアッセイ用のサンプルを調製するステップを以下に概説する。- 試薬の調製(1日目、サイトカインおよびリンタンパク質についても同様)
- 試薬を室温まで温めます(約30分)。
- 超音波処理マルチプレックス磁気ビーズボトルを30秒間、続いて1分間のボルテックス。多重磁気ビーズがアルミホイルで光から遮蔽されていることを確認するか、付属の光保護ボトルを使用してください。
- 1xPBSに0.1% Tween20を混合して洗浄緩衝液を調製するか、またはキットに付属の洗浄緩衝液を使用する。
- 溶解組織サンプルの調製(1日目、サイトカインおよびリンタンパク質についても同様)
- 以前に凍結した場合は、溶解した組織サンプルを冷凍庫から取り出し、氷上で解凍する(〜20分)。サンプルを9,167 x g で10分間遠心分離し、沈殿物を除去した。
- 線形範囲分析によって決定された最適なタンパク質濃度で25 μLのサンプルを調製します(セクション3.3を参照)。すべてのサンプルの総量を正規化するために、キットに付属のアッセイバッファーでサンプルを希釈します。
- 96ウェルプレートの作製(1日目、サイトカインおよびリンタンパク質についても同様)
- キットに含まれている96ウェルプレート、または底が薄いプレート(Brand Techなど)を使用してください。
- 200 μL の洗浄バッファー (または 1x PBS, 0.1% Tween) を各ウェルに加え、プレートシェーカー上で 750 rpm で 10 分間混合します。
- デカント洗浄バッファーとペーパータオルの上にプレートをタップして残留物を除去します。
- サイトカインの免疫アッセイ手順(1日目)
- 各ウェルに以下を順番に追加します。
- 25 μL のアッセイバッファーをすべてのウェルに加えます。
- 25 μL の追加アッセイバッファーをバックグラウンドウェルにのみ追加します。すべての実験実行について、少なくとも2つのバックグラウンドウェルがあります。バックグラウンドウェルにはサンプルがロードされておらず、サンプルなしで機器によって読み取られた蛍光強度を定義します。
- 各希釈サンプルの25 μLを対応するサンプルウェルに加える。
- 25 μL の 1x マルチプレックス磁気ビーズをすべてのウェルに加えます (図 6)。井戸に加える前に、ビーズを1分間渦巻きにしてください。
- 25 μL のアッセイバッファーをすべてのウェルに加えます。
- プレートシーラーでプレートをシールし、プレートをアルミホイルで覆います。2-8°Cで一晩(12-16時間)インキュベートする。
- 各ウェルに以下を順番に追加します。
- サイトカインの免疫学的測定手順(2日目)
- 96ウェルプレートを磁気セパレータの上に置き、ウェルが磁石と揃っていることを確認します。2分間座らせてください。プレートがまだ磁気セパレータに取り付けられている間に内容物をデカントします。
- 以下の手順を用いてプレートを2回洗浄する。
- 各ウェルに200 μLの洗浄バッファーを加え、シェーカー上で室温で2分間置きます。
- ウェルプレートを磁気セパレータの上に置き、室温で2分間置きます。
- ウェルプレートがまだ磁気分離器に取り付けられている間にウェル内容物をデカントする。
- 1ウェルあたり25 μLの検出抗体を追加します(図6)。ホイルで覆う。室温でプレートシェーカー(750rpm)上で1時間インキュベートする。
- 検出抗体を放置し、25 μLのストレプトアビジン-フィコエリスリン(SAPE)を各ウェルに加えます(図6)。ホイルで覆う。室温でプレートシェーカー(750rpm)上で30分間インキュベートする。
- ウェルプレートを磁気セパレータの上に置き、2分間放置します。内容物をデカントし、磁気セパレータから切り離します。
- ウェルプレートを2回洗浄する(ステップ3.2.5.2参照)。
- 75 μL のルミネックスドライブ流体(MAGPIX 装置を使用する場合)を各ウェルまたはアッセイバッファー(200 または FlexMap 3D 装置を使用する場合)に加えます。ビーズをプレートシェーカーで室温で5分間再懸濁する。
- ルミネックス機器(MAGPIX、200、またはFlexMap 3D)を、適切な操作のためにユーザーズマニュアルを参照してお読みください(図6)。
- リンタンパク質の免疫学的測定手順(1日目)
- 各ウェルに以下を順番に追加します。
- 25 μL のアッセイバッファーをすべてのウェルに加えます。
- 25 μL の追加アッセイバッファーをバックグラウンドウェルにのみ追加します。すべての実験実行では、少なくとも2つのバックグラウンドウェルを持つことをお勧めします。バックグラウンドウェルにはサンプルがロードされておらず、サンプルなしで機器によって読み取られた蛍光強度を定義します。
- 各希釈サンプルの25 μLを各サンプルウェルに加える。
- 25 μL の 1x マルチプレックス磁気ビーズをすべてのウェルに加えます (図 6)。
注:ルミネックスアッセイキットは、20倍のストック溶液に多重磁気ビーズを提供します。20xストックマルチプレックス磁気ビーズ溶液を2分間渦巻き、アッセイバッファーで1x溶液に希釈してください。ボルテックス1xマルチプレックス磁気ビーズ懸濁液をウェルに加える前に1分間。
- プレートシーラーでプレートをシールし、プレートをアルミホイルで覆います。2-8°Cで一晩(12-16時間)インキュベートする。
- 25 μL のアッセイバッファーをすべてのウェルに加えます。
- 各ウェルに以下を順番に追加します。
- リンタンパク質の免疫学的測定手順(2日目)
- ウェルプレートを磁気セパレータの上に置き、ウェルプレートが磁気セパレータと完全に揃っていることを確認します。2分間座らせてください。ウェルプレートがまだ磁気分離器に取り付けられている間にウェル内容物をデカントする。
- プレートを2回洗浄する(サイトカインの免疫アッセイ手順2日目のステップbを参照のこと)。
- 20倍ストック検出抗体をアッセイバッファー中の1x溶液に希釈する。1ウェルあたり25 μLの1x検出抗体を追加します(図6)。ホイルで覆う。室温でプレートシェーカー(750rpm)上で1時間インキュベートする。
- 96ウェルプレートを磁気セパレータの上に置き、2分間座らせます。内容物をデカントし、磁気セパレータから切り離す。
- アッセイバッファー中の25倍ストックSAPEを1倍バッファーに希釈する。25 μL の 1x SAPE を追加します (図 6)。ホイルで覆い、室温でプレートシェーカー(750rpm)上で15分間インキュベートする。
- SAPEをウェルに残し、各ウェルに25 μLの増幅バッファーを追加します。ホイルで覆う。
- 室温でプレートシェーカー(750rpm)上で15分間インキュベートする。
- ウェルプレートを磁気分離器の上に2分間置きます。内容物をデカントし、磁気セパレータから切り離します。
- 75 μL のルミネックスドライブフルード(MAGPIX装置を使用する場合)またはアッセイバッファー(200またはFlexMap 3D装置を使用する場合)を追加します。ビーズをプレートシェーカーに室温で5分間再懸濁する。
- ルミネックスの機器(MAGPIX、200、またはFlexMap 3D)を、適切な操作のためにユーザーズマニュアルを参照してお読みください(図6)。
- 試薬の調製(1日目、サイトカインおよびリンタンパク質についても同様)
- サンプル希釈曲線の直線性
- サンプルの調製:異なる濃度の総タンパク質で試験サンプルを段階的に希釈する。バルク脳組織の場合、サイトカインの場合は0〜25μg、リンタンパク質の場合は0〜12μgの段階希釈をロードします。総タンパク質濃度は、ビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いて測定することができる。
- マルチプレックスイムノアッセイ:選択したサンプルに対してルミネックスアッセイ(セクション3.2を参照)を実行します。
- データ解析
- 各タンパク質の蛍光強度と負荷されたタンパク質の量をプロットします(図7)。
- 各分析物について、総タンパク質と蛍光強度の読み出しとの関係が線形である負荷された総タンパク質の範囲を特定します(図7)。
- アッセイの実行全体に対してロードする必要がある総タンパク質の量を決定するには、各分析物の曲線の線形部分を特定し、大多数の分析物の線形範囲内にあるタンパク質濃度を選択します。
注:ほとんどのタンパク質は同様の線形範囲を共有していますが、線形範囲はすべてのタンパク質で重複しているとは限りません。この場合、ロードされた総タンパク質の量が異なる状態で各サンプルを複数回実行する必要があるかもしれません。あるいは、非線形サンプルを分析から除外してもよい。さらに、いくつかのタンパク質は線形範囲を全く有さないかもしれない。
4. 偏最小二乗回帰
注: 部分最小二乗分析を実行するために、サンプル R コードとサンプル データ スプレッドシートが提供されています。
- データ準備: 提供されているサンプル データ スプレッドシート "MyData" に示すように、データを書式設定します。行1に変数名、列Aにサンプル名、列Bに応答変数、列C+にすべての予測変数を含めます。最後の 2 行に背景データを入力し、両方のサンプル名を "Background" に設定します。
- RStudio における偏最小二乗回帰
- www.r-project.org (無料、オープン ソース) から R をインストールします。
- www.rstudio.com から RStudio Desktop をインストールします (無料のオープン ソース ライセンス)。
- この資料 "PLSR_Sample_Code.R" に付属のサンプル R コードをダウンロードし、データ スプレッドシートを含む同じフォルダーに保存します。RStudio でコード ファイルを開きます。
- [ユーザー入力] セクションで、"dataFileName" をデータ スプレッドシートの名前に変更します。
- 実行するコードのセクションを強調表示し、スクリプトの右上隅にある [ 実行 ] をクリックして、次の手順を実行します。
- 必要な R パッケージ、関数、作業ディレクトリのアドレス、およびユーザー入力値を RStudio に読み込みます (サブセクション「暫定版」)。
- データをRStudioにロードし、すべての測定値から平均バックグラウンド信号を差し引いて処理用の生データを準備し、各分析物にzスコアリングします(サブセクション「データの読み取りとバックグラウンドの減算」)(図8A)。
- 包括的 R アーカイブ ネットワーク (CRAN) で利用可能な plsRglm パッケージ v1.2.528 を使用して、 RStudio で偏最小二乗回帰を実行します。LV1-LV2平面でバリマックス回転(統計パッケージv3.6.2)23 を実行して、応答変数によってサンプルを最も適切に分離する新しい水平軸を特定します(サブセクション「PLS」)(図8B)。
- 1つのサンプルがデータから繰り返し除外され、PLSRモデルが再計算されるLeave One Outクロスバリデーション(LOOCV)を実行します。すべてのLOOCV実行における分析物負荷量の標準偏差を計算します(サブセクション「LOOCV」)。
- 代表的なプロットを作成する: 上記のように提供されたサンプルコードを実行して、作業ディレクトリ(データファイルとコードファイルを含むフォルダ)にPDFファイルとして自動的にエクスポートする代表的なプロットを作成します。
- 図 8A (サブセクション「PLS」) に示すように、処理されたデータのヒート・マップを作成します。各エントリは、Z スコアで定義されたスペクトルに沿って色を付けます。分析種を、対象の潜在変数で計算された順序でソートします。
- 図 8B (サブセクション「PLS」) に示すように、LV1 スコアを横軸に沿ってプロットし、LV2 スコアを縦軸に沿ってプロットしてスコアプロットを作成します。各データポイントを応答変数の測定値に従って色付けし、各潜在変数と応答変数の関係を視覚化します。
- 図8C(サブセクション「LOOCV」)に示すように、各予測変数の負荷量を表示する棒グラフを作成して、各分析物が潜在変数にどのように寄与しているかを視覚化します。
- 応答変数に対してLV1スコアを回帰させるプロットを作成して、PLSRモデルがサンプルをどの程度適切に分離しているかを視覚化します( 図8D (サブセクション「PLS」)を参照)。
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Representative Results
以前に収集されたデータは、8匹のC57BL/6マウスのグループが1日1回間隔をあけて3つの閉鎖頭部外傷(図2)を受けた以前の研究から採取された11。この作業において、脳血流は、最後の傷害の4時間後にびまん性相関分光法を用いて測定した(図3、 図4)。傷害後のCBF評価後、動物を安楽死させ、免疫学的測定法によるサイトカインおよびリンタンパク質の定量のために脳組織を抽出した(図5)。また、ウエスタンブロットを介して貪食細胞/ミクログリア活性化マーカーIba1を定量した(11に記載の方法)。各マウス由来の脳組織を溶解し、BCAアッセイを用いて総タンパク質濃度を測定した。多重化サイトカイン定量は、ルミネックスMAGPIXシステムを用いて読み取られたミリプレックスMAPマウスサイトカイン/ケモカイン32-プレックスを用いて行った(図6)。すべてのサンプルからデータを収集する前に、適切なタンパク質負荷(溶解液12.5 μLあたり12 μgのタンパク質)を決定するために、線形範囲分析を実施しました(図7)。
サイトカインデータは、サンプルデータからバックグラウンド測定値を差し引くことによって分析のために調製し、次いで各分析物についてzスコアリングデータを差し引いた(図8A)。動物間のサイトカイン発現の違いを視覚化するために、zスコアデータからヒートマップを生成しました。偏最小二乗回帰(PLSR)は、貪食細胞/ミクログリア活性化マーカーIba1を応答変数として、サイトカイン測定値を予測変数として使用して実施した(図8B)。LV1上のデータとIba1測定値との共分散を最大化するために、バリマックス回転が実行されました(図8D)。LV1における高負荷重み(図8C)は、Iba1の高発現に最も関連するサイトカイン発現に対応する。Iba1とサイトカインとの間の線形回帰は、LV1において最大の負荷重みを有するサイトカインも統計的に有意であったことを示している(図8E)。
図 1: 一般的なワークフロー まず、マウスは体重減少閉鎖頭部損傷を受け、次いで脳血流(CBF)をびまん性相関分光法を用いて測定する。次に、脳を採取し、関心のある領域を微小解剖し、液体窒素を用いて凍結する。ルミネックス免疫測定法の準備において、タンパク質を溶解し、総タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイによって測定する。溶解物は、目的のタンパク質のウェスタンブロットおよびサイトカインおよびリンタンパク質のルミネックスアッセイに使用されます。CBF、ウェスタンブロット、およびルミネックスからのデータは、偏最小二乗回帰(PLSR)を使用して積分されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:軽度の外傷性脳損傷の閉頭重量低下モデル。 (A)麻酔をかけられたマウスは尾につかまれ、ガイドチューブの下の張り詰めた犠牲膜に置かれます。54gの体重を1mから頭部の背側側面に落とす。(B)衝突後約1ms以内に、マウスの頭は犠牲膜を突き破るときに首の周りを急速に回転した。(C)衝突後約5ミリ秒以内に、マウス全体が落下し、掴んだ尾にぶら下がっている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:びまん性相関分光法による脳血流の測定 (A)光学センサーを右半球に手作業で優しく保持し、麻酔をかけたマウスの血流を測定します。(B)右半球への代表的なセンサ配置。センサーの輪郭は破線の黒い長方形で表され、ソースと検出器のファイバーの位置はそれぞれ赤と青の円で示されます。センサーは、センサーの短い端が目の後ろに並び、センサーの長い端が正中線に揃うように配置されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:拡散相関分光法データ解析 (a)代表的な測定強度自己相関曲線、g2(τ)、ベースライン時、傷害前ベースライン(緑色)および5回閉鎖後4時間後5回閉鎖頭部外傷(紫色)を1日1回間隔をあけた。傷害前から傷害後への曲線の右シフトは、血流の減少を反映している。(B) g
(τ)データは、1Hzで半球あたり5秒間取得し、3x/半球を繰り返します。測定された各g(τ)曲線は、脳血流指数(CBFI)の相関拡散方程式に対する半無限解に適合する。(C)すべてのフレームおよび反復にわたるCBFi 値を平均化して、各半球の平均脳血流指数(水平の黒いバーで示す)を得る。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マウス脳微小解剖。 (A)マウスから脳を抽出した後、破線に沿って二等分する。左半球は組織学のために固定され、右半球は病理学のために微小解剖される。(b)右半球の皮質の矢状視。右半球は、対応する色分けされた領域に微小解剖される。凍結感受性タンパク質の分析には、フラッシュ凍結の前に組織切片を細分化することが最適である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ルミネックスの手順の説明図。 (A)蛍光タグ付きビーズにサンプルを加える。ビーズは、目的のタンパク質ごとに特異的な捕捉抗体で予めコーティングされている。(b)ビオチン化検出抗体を添加する工程。ビオチン検出抗体は、目的の分析物に結合し、抗体抗原サンドイッチを形成します。(C)フィコエリスリン(PE)結合型ストレプトアビジン(SAPE)を添加する。SAPEはビオチン化検出抗体に結合し、反応を完結させる。リンタンパク質の場合、SAPEへの添加に続いて増幅バッファー(リンタンパク質アッセイのみ)が添加され、アッセイシグナルが増強される。(D)ルミネックス機器(MAGPIX、200、またはFlexMap 3D)は、赤/緑の照明の組み合わせを介して蛍光タグが付けられた各ビーズの反応を読み取ります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:線形範囲を識別するためのサンプル希釈曲線の説明図。 段階的に希釈されたサンプルのタンパク質濃度対蛍光強度は、ルミネックスアッセイから測定される。線形範囲とは、タンパク質濃度と蛍光強度との関係が直線となるタンパク質濃度範囲(矢印)と定義される。一部の分析種では、タンパク質濃度を特定の限界を超えて増加させると、希釈曲線が非線形または反転(フック効果)になるように抗体結合が低下する可能性があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 8: 代表的な偏最小二乗回帰 (PLSR) 分析 (a)パネルサイトカインタンパク質発現(左列)およびIba1発現(右列)を3xCHIマウス(n=8、zスコア付け)と共に示す。(B)PLSRは、各潜在変数の測定されたサイトカインに重み(負荷量)を割り当てる。測定データに重みを適用して、各潜在変数の各サンプルのスコアを計算します。(c)Iba1に対する3xCHIサンプルのPLSRは、Iba1によってサンプルを区別したサイトカインLV1の重み付けプロファイルを同定した。負の重みを有するサイトカインは、低いIba1を有するサンプルにおいてアップレギュレートされたが、陽性重量を有するサイトカインは、高いIba1を有するサンプルにおいてアップレギュレートされた(LOOCVを用いた平均±SDである)。(D)Iba1に対する各サンプルのLV1スコアの線形回帰。R2PLSは 、Iba1とLV1の間の適合度を測定する。(e) CにおけるLV1において最も大きな重みを有するサイトカインの各々に対するIba1の個々の回帰。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本明細書では、反復的な軽度の外傷性脳損傷に対する血行動態および神経炎症反応の評価方法を詳述する。さらに、偏最小二乗回帰を使用した多変量システム分析の一部としてこれらのデータを統合する方法を示しました。以下のテキストでは、プロトコルに関連する重要な手順と制限事項のいくつか、および既存の方法に対する方法の長所/短所について説明します。
軽度の外傷性脳損傷の体重減少モデル。外傷性脳損傷誘発のこの方法は、スポーツ関連の頭部外傷において一般的に見られる急速な前後回転加速に続く鈍い衝撃を特徴とする点で有利である10,19。確かに、唐生脳マウスの脳は、ジャイロケファリックな人間の脳の複雑さを完全には再現していません。それにもかかわらず、このモデルは、反復傷害を伴う空間学習および記憶の持続的な欠損を含む、ヒトmTBIの同じ臨床的および行動的後遺症の多くを誘発する。さらに、その影響は本質的に軽度であるが(構造的/ニューロン的損傷なし、血液脳関門透過性なし、複数回のヒット後にのみ出現する認知障害など19)、意識喪失があまり一般的ではない人間とは対照的に、意識の著しい喪失を誘発する。この意識喪失の増加は、正確な原因がよく理解されていないが、衝撃の直前に与えられた麻酔との相互作用に起因する可能性がある。最後に、ボルトがコロナ縫合糸とラムド縫合糸の間に衝突するようにガイドチューブを整列させることが重要であることに注意する。我々は、より後方的な影響が、安楽死を必要とする重大な運動障害を引き起こす可能性があることを観察した。
びまん性相関分光法による脳血流の評価。灌流磁気共鳴画像法や経頭蓋ドップラー超音波などのヒト/大型動物試験で使用される従来のモダリティを用いた脳血流(CBF)の非侵襲的縦断的測定は、小さな脳サイズおよび総血液量29を含む様々な理由でマウスにおいて困難である。びまん性相関分光法はマウスによく適しており、他のモダリティと比較して非侵襲的で比較的安価であるという追加の利点を提供する20,30。DCSは運動アーチファクトに敏感であるため、マウスは評価のために短期間麻酔または拘束される必要がある31。我々は通常、その迅速な誘導と回復のためにイソフルラン麻酔を使用します。しかし、イソフルランは脳血管拡張薬であり、イソフルラン下での血流推定値は慎重に解釈されるべきである。偽傷害動物と比較して傷害後に見られる血流の減少は、イソフルランに応答して血管拡張する損傷した脳血管系の失敗によって交絡する可能性がある。最後に、我々は以前、マウスにおけるDCSによる血流測定の優れたユーザー内再現性を実証したが、公正なユーザー内再現性のみを実証した21。このため、脳血流の縦断的評価を必要とする実験では、同じオペレータがDCS測定値を取得することをお勧めします。
ルミネックスアッセイを用いたサイトカインおよびリンタンパク質の多重化定量。 ELISAにおける重要な課題はフック効果であり、タンパク質濃度の増加は標的タンパク質に対する抗体親和性を低下させる可能性があり、したがってタンパク質の増加に応答してアッセイシグナルが低下する32(図7)。この効果は、組織全体を分析する際に悪化する可能性があり、バルクタンパク質も同様に干渉する可能性があります。したがって、ルミネックスアッセイを利用する際の最初のステップは、アッセイがロードされたタンパク質の量によって直線的に読み出される負荷されたタンパク質濃度の範囲があるかどうかを決定することです。このような直線範囲を持たない分析種(図7)は、分析から除外する必要があります。また、脳内のサイトカインレベルは通常非常に低く、ルミネックスキットに付属の標準曲線で評価された検出下限付近に現れることにも注目しています。このため、リニアレンジ解析を実行して、機器の読み出しが本当に負荷されたサンプル量を反映しているかどうかを判断することが不可欠です。関心のある主要タンパク質について、この線形範囲分析は、組換えタンパク質をサンプルにスパイクし、器械読み取り値における直線性が評価されるスパイク回収アッセイによって補完され得る33。
神経炎症は多様な細胞内リンタンパク質と細胞外サイトカインによって調節されるため、mTBIに対する脳の神経免疫応答を理解するためには、これらのタンパク質の広い範囲を同時に測定することが重要です。ルミネックスの多重化イムノアッセイは、単一サンプルからの数十のサイトカインおよびリンタンパク質の同時定量を可能にし、損傷後の組織免疫応答の全体像を提供します。これらの分析はサイトカイン/ケモカインおよびリンタンパク質の広い視野を提供するが、アッセイは組織ホモジネートからの各タンパク質の総量を定量化する。したがって、細胞型特異的なデータは得られない。細胞型特異性は、フォローアップ免疫組織化学によって決定することができ、細胞型(例えば、ニューロン、ミクログリア、アストロサイトなど)のマーカーを有する関心のあるトップタンパク質の局在を同定することができる。11。
データ統合のための偏最小二乗回帰分析。 mTBIに対する組織応答は多因子性であり、血流の生理学的変化と、貪食細胞/ミクログリア活性化マーカーIba1、多様なサイトカイン、およびリンタンパク質の変化からなる11。収集されるデータの多重化の性質上、さまざまな予測変数間の関係の多次元性を説明する体系的な方法が必要です。PLSRは、予測変数と結果変数の間の共分散を最大限特定するLVを特定することによって、この問題に対する適切な解決策を提供します(例えば、 図8のIba1)。重要なことに、予測変数と強く相関することが判明しているタンパク質(すなわち、LV1に高い負荷量を持つタンパク質)は、単変量回帰分析においてもしばしば相関する(図8E)。PLSRは、 図8のように多数の予測変数を少数のサンプルに適合させるためによく使用されるため、個々のサンプルに対するLV1の重みの感度を理解することが重要です。少数のサンプル(<10)の場合、LOOCVは重みの感度を評価するのに役立ちます( 図8CのSDエラーバーで示されています)。サンプル数が多い場合、モンテカルロサブサンプリングアプローチ34を使用して一度に複数のサンプルを残して感度を評価することが重要です。PLSRのアプローチと使用法の詳細な説明については、読者に多変量 およびメガ変量データ分析24 を参照させます。最後に、このタイプの分析の主な制限は、純粋に相関的であることです。PLSRは、予測変数と結果変数の間の機構的関係を証明しません。我々は、PLSRを、因果関係を確立する将来の実験において調節する扱いやすい標的を提案するために使用される貴重な 仮説生成 アプローチと見なしている。
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Disclosures
何一つ。
Acknowledgments
このプロジェクトは、国立衛生研究所R21 NS104801(EMB)およびR01 NS115994(LBW / EB)およびアトランタジュニア教員フォーカスアワード(EMB)の小児医療によって支援されました。この研究は、米国国防総省によって、議会が指示する医学研究プログラムを通じて、賞番号の下でも支援されました。W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB).意見、解釈、結論および勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されるものではありません。この資料は、助成金番号1937971の下で国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムによって支援された研究に基づいています。本資料に記載されている意見、所見、結論または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable pipettes | any adjustable pipette | ||
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Bio-Plex cell lysis kit | C Bio-Rad | 171304012 | |
| BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile | BrandTech | 781602 96 | |
| Complete mini protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
| Depilatory cream | Amazon | Nair | |
| DiH2O | VWR | VWRL0200-1000 | |
| Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates | Millipore Sigma Catalogue | 40-285 | |
| Hardware Autocorrelator Board | www.correlator.com | Flex05-8ch | |
| Isoflurane 250 mL | MED-VET INTERNATIONAL | RXISO-250 | |
| Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) | VWR | 21905-026 | |
| Laboratory vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| LabView | National Instruments | LabVIEW | |
| Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software | Luminex Corporation | ||
| Luminex Drive Fluid | Luminex | MPXDF-4PK | |
| Luminex sheath fluid | EMD Millipore | SHEATHFLUID | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay | Millipore Sigma | MCYTMAG-70K-PX32 | |
| MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay | Millipore Sigma | 48-660MAG | |
| Mini LabRoller rotator | VWR | 10136-084 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | VWR | 97064-158 | |
| Plate Sealer | VWR | 82050-992 | |
| Polypropylene microfuge tubes | VWR | 20901-547 | |
| Mini LabRoller | Millipore Sigma | Z674591 | |
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-668 | |
| R Programming Language | |||
| RStudio | www.rstudio.com | ||
| Sonicator | |||
| Titer plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 1 m acrylic guide tube | McMaster-Carr | 49035K85 | |
| 4 photon counting avalanche photodiode | Perkin-Elmer | SPCM-AQ4C-IO | |
| 400 um multimode source fiber | Thorlabs Inc. | FT-400-EMT | |
| 54 g bolt | Ace Hardware | 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length | |
| 780 nm single mode detector fiber | Thorlabs Inc. | 780HP | |
| 852 nm long-coherence length laser | TOPTICA Photonics | iBeam smart |
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