Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Системный анализ нейровоспалительного и гемодинамического ответа на черепно-мозговую травму

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/61504
Automatic Translation
*1, *2,3, 1,3, *1,2,3, *1,4,5
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta
* These authors contributed equally

Summary

В этом протоколе представлены методы характеристики нейровоспалительного и гемодинамического ответа на легкую черепно-мозговую травму и интеграции этих данных в рамках многомерного системного анализа с использованием частичной регрессии наименьших квадратов.

Abstract

Легкие черепно-мозговые травмы (mTBI) являются серьезной проблемой общественного здравоохранения. Повторное воздействие МТМТ может привести к кумулятивному, длительному функциональному дефициту. Многочисленные исследования, проведенные нашей группой и другими, показали, что mTBI стимулирует экспрессию цитокинов и активирует микроглию, уменьшает мозговой кровоток и обмен веществ, а также ухудшает цереброваскулярную реактивность. Кроме того, в нескольких работах сообщалось о связи между расстройствами в этих нейровоспалительных и гемодинамических маркерах и когнитивными нарушениями. Здесь мы подробно описываем методы характеристики нейровоспалительного и гемодинамического тканевого ответа на МТМТ у мышей. В частности, мы описываем, как выполнить модель снижения веса mTBI, как продольно измерять мозговой кровоток с использованием неинвазивного оптического метода, называемого диффузной корреляционной спектроскопией, и как выполнить мультиплексированный иммуноанализ Luminex на образцах тканей мозга для количественной оценки цитокинов и иммуномодулирующих фосфо-белков (например, в пределах путей MAPK и NFκB), которые реагируют и регулируют активность микроглии и других нервных иммунных клеток. Наконец, мы подробно расскажем, как интегрировать эти данные с использованием подхода к многомерному системному анализу, чтобы понять взаимосвязи между всеми этими переменными. Понимание взаимосвязей между этими физиологическими и молекулярными переменными в конечном итоге позволит нам определить механизмы, ответственные за mTBI.

Introduction

Обзор
Легкие черепно-мозговые травмы (мТБИ) затрагивают ~ 1,6-3,8 миллиона спортсменов ежегодно1. Эти травмы, включая субконтузивные и сотрясающие травмы, могут оставить пациентов с преходящими физическими, эмоциональными, психологическими и когнитивными симптомами2. Более того, повторяющиеся mTBI (rmTBI), поддерживаемые в «окне уязвимости», могут привести к кумулятивной серьезности и продолжительности когнитивных последствий, которые длятся дольше, чем эффекты одной МЧТв одиночку 3, и в конечном итоге даже к постоянной потере функции 4,5,6. Хотя многие пациенты выздоравливают в течение относительно короткого периода времени (<1 неделя), 10-40% пациентов страдают от более длительных последствий МТМТ в течение > 1 месяца, причем некоторые из них длятся до 1 года 3,7,8,9. Несмотря на высокую распространенность и длительные последствия этих травм, механизмы травм плохо изучены, и не существует эффективных стратегий лечения.

Учитывая высокую вариабельность исходов после mTBI/rmTBI, одной из проблем при выявлении молекулярных триггеров на ранней стадии из ткани, полученных в исследованиях терминальной mTBI/rmTBI, является отсутствие продольных данных, демонстрирующих окончательные «острые молекулярные связи» этих молекулярных триггеров с долгосрочными исходами. Чтобы преодолеть эту проблему, наша группа обнаружила, что остро сниженный мозговой кровоток, измеренный остро с использованием оптического инструмента, называемого диффузной корреляционной спектроскопией (DCS), сильно коррелирует с долгосрочным когнитивным результатом в мышиной модели rmTBI10. Используя этот гемодинамический биомаркер, мы показали, что у мышей с остро низким мозговым кровотоком (и, как следствие, худшим прогнозируемым долгосрочным исходом) наблюдается сопутствующее острое увеличение нейрональной фосфо-сигнализации в путях MAPK и NFκB, увеличение нейронной экспрессии провоспалительных цитокинов и увеличение экспрессии фагоцитарного / микроглиального маркера Iba111 . Эти данные свидетельствуют о возможной роли нейрональной фосфо-сигнализации, экспрессии цитокинов и активации микроглии как в острой регуляции мозгового кровотока после травмы, так и в запуске сигнального каскада, который приводит к дисфункции нейронов и худшему когнитивному результату. Здесь мы подробно описываем наш подход к одновременному исследованию гемодинамической и нейровоспалительной среды после rmTBI и как интегрировать эти сложные наборы данных. В частности, мы описываем процедуры для четырех ключевых шагов к этому комплексному подходу: (1) модель снижения веса легкой черепно-мозговой травмы, (2) оценка мозгового кровотока с помощью диффузной корреляционной спектроскопии, (3) количественная оценка нейровоспалительной среды и (4) интеграция данных (рисунок 1). Ниже мы предоставляем краткое введение в каждый из этих ключевых шагов, чтобы помочь читателям понять обоснование наших методов. Остальная часть рукописи содержит подробный протокол для каждого из этих ключевых шагов.

Модель снижения веса легкой черепно-мозговой травмы
Хотя существует много отличных доклинических моделей повторяющейся легкой ЧМТ 12,13,14,15,16,17,18, мы используем хорошо зарекомендовавшую себя и клинически значимую модель закрытой черепно-мозговой травмы. Ключевые особенности этой модели включают (1) тупое воздействие неповрежденного черепа / кожи головы с последующим неограниченным вращением головы вокруг шеи, (2) отсутствие явной структурной черепно-мозговой травмы, отека, повреждения гематоэнцефалического барьера, острой гибели клеток или хронической потери мозговой ткани и (3) стойкого (до 1 года) когнитивного дефицита, который возникает только после многократных ударов19 (Рисунок 2).

Оценка мозгового кровотока с помощью диффузной корреляционной спектроскопии
Диффузная корреляционная спектроскопия (DCS) является неинвазивным оптическим методом, который измеряет кровоток 5,20,21. В DCS источник света ближнего инфракрасного диапазона помещается на поверхность ткани. Детектор размещается на фиксированном расстоянии от источника на поверхности ткани для обнаружения света, который многократно рассеян через ткань (рисунок 3). Рассеяние движущихся красных кровяных клеток приводит к тому, что обнаруженная интенсивность света колеблется со временем. Простая аналитическая модель, известная как теория корреляционной диффузии, используется для связи этих колебаний интенсивности с индексом кровотока (CBFi, рисунок 4). Хотя единицы CBFi (см2 /с) не являются традиционными единицами потока (мл / мин / 100 г), предыдущее исследование на мышах показало, что CBFi сильно коррелирует с мозговым кровотоком, измеренным артериальным спином, меченым МРТ21.

Для справки, используемый здесь прибор DCS был построен собственными силами и состоит из лазера когерентной длиной 852 нм, массива из 4 фотонных лавинных фотодиодов и аппаратной платы автокоррелятора (один тау, 8 каналов, минимальное время выборки 100 нс)21,22. Данные собираются с помощью самодельного программного обеспечения, написанного в LabView. Животный интерфейс для устройства состоит из многомодового исходного волокна 400 мкм (диапазон длин волн 400-2200 нм, чистый кремнеземный сердечник, жесткая оболочка TECS) и одномодового детекторного волокна 780 нм (диапазон длин волн 780-970 нм, чистый кремнеземный сердечник, жесткая оболочка TECS, отсечка режима 730 ± 30 нм секундного режима), расположенных на расстоянии 6 мм друг от друга и встроенных в черный 3D-печатный датчик (4 мм x 8 мм, Рисунок 3).

Количественная оценка нейровоспалительной среды
Хотя нейровоспаление регулируется различными клеточными процессами, двумя ключевыми соответствующими механизмами являются внеклеточная сигнализация цитокинами / хемокинами и внутриклеточная сигнализация фосфо-белками. Чтобы исследовать нейровоспалительную среду головного мозга после травмы, мозг извлекают из мышей, микрорассекают, а цитокины / хемокины и фосфо-белки количественно оцениваются с использованием Luminex (рисунок 5, рисунок 6, рисунок 7). Мультиплексированные иммуноанализы Luminex позволяют одновременно количественно оценивать разнообразную коллекцию этих белков путем соединения иммуноферментных анализов (ИФА) с флуоресцентно помеченными магнитными шариками. Для каждого интересующего белка используются различные флуоресцентные метки, а шарики каждой метки функционализируются антителом захвата против этого конкретного белка. Сотни шариков для захвата каждого белка смешиваются вместе, помещаются в пластину из 96 лунок и инкубируются с образцом. После инкубации образца магнит используется для улавливания шариков в скважине, в то время как образец вымывается. Затем биотинилированное детектирующее антитело связывается с анализируемым веществом, представляющим интерес, чтобы сформировать сэндвич антитело-антиген, похожий на традиционный ИФА, но с ИФА для каждого белка, встречающегося на другой флуоресцентно помеченной бусине. Добавление фикоэритрин-конъюгированного стрептавидина (SAPE) завершает каждую реакцию. Затем прибор Luminex считывает шарики и разделяет сигнал в соответствии с каждой флуоресцентной меткой / белком.

Интеграция данных
Из-за большого количества аналитов (например, цитокинов), измеренных в анализе Luminex, анализ данных может быть трудно интерпретировать, если каждый количественный белок анализируется индивидуально. Для упрощения анализа и фиксации тенденций, наблюдаемых среди аналитов, мы используем метод многомерного анализа, называемый частичной регрессией наименьших квадратов (PLSR, рисунок 8)23. PLSR работает, идентифицируя ось весов, соответствующих каждому измеренному белку (т. Е. Цитокины или фосфо-белки, называемые «предикторными переменными»), которые вместе оптимально объясняют кодисперсию измеренных белков с переменной ответа (например, мозговой кровоток). Веса называются «нагрузками» и собираются в вектор, известный как латентная переменная (LV). Проецируя (называемое «скорингом») измеренные белковые данные на каждом из двух LN, данные могут быть повторно построены в терминах этих LV. После вычисления PLSR мы используем вариамационное вращение для идентификации нового РН, который максимизирует ковариацию между проекциями выборки на LV и предикторной переменной24. Такой подход позволяет определить LV1 как ось, для которой лучше всего объяснить дисперсию переменной ответа. LV2 максимизирует кодисперсию между переменной отклика и остаточными данными LV1, которые могут быть связаны с биологической или технической изменчивостью между образцами. Наконец, мы проводим перекрестную проверку Leave One Out (LOOCV), чтобы убедиться, что модель PLSR не сильно зависит от какой-либо одной выборки23.

В этом протоколе мы подробно описываем методы характеристики нейровоспалительного и гемодинамического ответа тканей на mTBI. Общий рабочий процесс описан на рисунке 1. В этом протоколе мыши подвергаются воздействию одного или нескольких мТБИ с использованием модели закрытой травмы головы с пониженным падением веса. Мозговой кровоток измеряется продольно до и в несколько временных точек после травмы. В момент, представляющий интерес для опроса о нейровоспалительных изменениях, животное усыпляется, а мозг извлекается. Области мозга, представляющие интерес, выделяются с помощью микродиссекции, а затем лизируются для извлечения белка. Лизаты затем используются как для мультиплексированных иммуноанализов Luminex цитокиновой и фосфо-белковой экспрессии, так и для вестерн-блоттинга. Наконец, этот целостный набор данных интегрируется с использованием частичного регрессионного анализа наименьших квадратов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры для животных одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Эмори (IACUC) и соответствуют Руководящим принципам NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Модель снижения веса легкой черепно-мозговой травмы

  1. Подготовьте настройку снижения веса. Установите тиски на плоскую поверхность с помощью направляющей трубки длиной 1 м (внутренний диаметр 2,54 см), выровненной по вертикали (проверьте с помощью уровня). Используйте болт 54 г (основной диаметр корпуса 0,95 см, диаметр головки 2 см, длина 10,2 см).
  2. Кратко обезболивайте мышь. Индуцировать мышь 4,5% изофлурана в 100% кислороде в течение 45 секунд. Подтверждают достаточную глубину анестезии отсутствием реакции на защемление пальца ноги.
  3. Вызвать травму.
    1. Быстро выведите мышь из наркоза и поместите мышь лежа на центр тонкой мембраны (ткань 11,2 см х 21,3 см).
    2. Используйте обе руки, чтобы держать ткань подтянутой мышью, лежащей по центру. Закрепите хвост мыши под большим пальцем. Расположите головку мыши под направляющей трубкой (рисунок 2).
    3. Опустите болт с верхней части направляющей трубки на спинной аспект головы мыши, стремясь к удару между задней частью глаз и передней частью ушей. При ударе мышь проникнет в ткань, что позволит быстро ускорить движение головы вокруг шеи (рисунок 2).
  4. Выздоровление
    1. После удара поместите мышь лежа на согревательной подушке при температуре 37 °C в воздухе комнаты. Следите за восстановлением в течение 1 ч после травмы. В течение 1 ч мыши должны быть в состоянии нормально амбулировать, находить пищу и воду и не проявлять грубого двигательного дефицита.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анальгезия не используется по одобрению Институционального комитета по уходу за животными и их использованию, что оправдано из-за смешанного влияния анальгезии на интересующие параметры (т.е. мозговой кровоток, маркеры воспаления). Потеря сознания, определяемая как время от снятия с анестезии до времени восстановления рефлекса, ожидается и обычно длится от 20 с до 3 минут (дополнительная таблица 1). Могут наблюдаться короткие (<30 с) эпизоды апноэ и / или судорожной активности, особенно после повторяющихся травм головы, расположенных один раз в день.
  5. Повторите по мере необходимости. Эта травма может повторяться один раз в день, еженедельно или ежемесячно. Количество и расстояние между травмами зависят от желаемой тяжести травмы. Как правило, мы используем пять ударов с интервалом один раз в день, чтобы вызвать устойчивый дефицит пространственного обучения и памяти.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие исследования показали, что пяти ударов, расположенных один раз в день, достаточно, чтобы вызвать дефицит пространственного обучения и памяти, длящийся более 1 года после травмы, без отека, кровоизлияния или открытой структурной травмы головного мозга19. Мышей ежедневно взвешивают и тщательно контролируют на наличие признаков обезвоживания, двигательного дефицита и потери аппетита. При обезвоживании мышам дают влажный чау-чау и подкожную инъекцию 1 мл физиологического раствора один раз в день. Чтобы предотвратить ненужные страдания и обеспечить гуманную конечную точку, мышей усыпляют, если: обезвоживание сохраняется или ухудшается >24 ч после подкожного физиологического лечения, масса тела снижается более чем на 20% от исходного уровня до травмы, двигательные дефициты, такие как кружение или перетаскивание лап, появляются и сохраняются >1 ч после травмы.

2. Оценка мозгового кровотока с помощью диффузной корреляционной спектроскопии

  1. Сбор данных DCS
    1. Удалить волосы на коже головы. Поскольку DCS лучше всего работает при отсутствии волос, необходимо удалить мех на голове до начала экспериментов. Как правило, эпиляцию делают за 1-3 дня до начала исследования.
      1. Индуцировать у мышей 4,5% изофлурана в 100% кислороде в течение 45 секунд и поддерживать 1-2% изофлураном в 100% кислороде.
      2. Побрить голову между глазами и ушами. Затем используйте крем для депиляции, чтобы удалить мех на голове, как показано на рисунке 3.
      3. Дайте животному восстановиться после анестезии на согревающей подушке, а затем вернитесь в клетку.
    2. Измерьте мозговой кровоток с помощью DCS. Чтобы свести к минимуму артефакты движения во время измерения, исследуйте мышей под кратковременной изофлурановой анестезией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально контролируйте дыхание и реакцию на защемление пальцев ног на протяжении всех измерений и регулируйте концентрацию изофлурана по мере необходимости для обеспечения постоянной глубины анестезии. Значительные изменения глубины анестезии могут изменить кровоток, учитывая известные вазомодулирующие эффекты изофлурана25.
      1. Индуцировать 4,5% изофлурана в 100% кислороде в течение 45 секунд, а затем поддерживать 1,0-1,75% изофлурана в 100% кислороде. Подтвердите достаточную глубину анестезии отсутствием реакции на защемление пальца ноги и нормальным дыханием (между ~60-80 вдохами в минуту).
      2. После 2-минутного периода стабилизации осторожно уложите датчик DCS на правое полушарие таким образом, чтобы верхний край оптического датчика выровнялся с задней частью глаза, а сторона датчика выровнялась вдоль средней линии (рисунок 3). Поднимите руку на датчик, чтобы защититься от комнатного света. Получение данных за 5 секунд (1 Гц).
      3. Переместите датчик над левым полушарием и получите 5 секунд данных.
      4. Повторите 3 раза / полушарие, чтобы учесть локальные неоднородности под поверхностью ткани.
    3. Выздоровление
      1. Выньте мышь из наркоза и поместите на согревающую прокладку.
      2. После того, как мышь восстановит свой правый рефлекс, верните ее в клетку.
  2. Анализ данных DCS
    1. Выполните первоначальный контроль качества. Каждый кадр данных DCS состоит из измеренной нормированной функции Equation 110 автокорреляции интенсивности (рисунок 4A) и скорости подсчета фотонов (кГц).
      1. Чтобы удалить кадры данных со значительным артефактом движения, отбросьте кадры данных, Equation 111для которых среднее значение хвоста кривой Equation 110 (т.е. ) составляет > 1,005.
      2. Чтобы удалить кадры данных с плохим отношением сигнал/шум, откажитесь от кадров данных, если скорость обнаружения фотонов составляет < 20 кГц.
    2. Экстракт индекса мозгового кровотока. Используя fminsearch в Matlab, поместите каждыйi-й измеренный кадр Equation 112 данных для CBFi(i). Ограничьте соответствия Equation 113, и найдите значение CBFi , которое минимизирует следующую функцию затрат:
      Equation 114
      Где сумма находится над всеми измеренными временами задержкиEquation 115 и Equation 116 является полубесконечным однородным решением уравнения корреляционной диффузии (рисунок 4B):
      Equation 117
      Здесь β — фактор когерентности, определяемый экспериментальной установкой, Equation 7, Equation 8, Equation 9Equation 10, Equation11Reff = 0,493 для предполагаемого тканевого показателя преломления 1,4, ρ составляет 6 мм, а μa и μ — коэффициент поглощения и пониженного рассеяния ткани (предполагается, что он равен 0,25 и 9,4/см соответственно 10,26,27).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку β может варьироваться ~ 10% с течением времени, установите каждый кадр данных для β и CBFi одновременно.
    3. Выполняйте вторичный контроль качества. В каждом повторении (которое состоит из 5 фреймов данных) отбрасывайте выбросы. Выбросы определяются как те значения CBFi , которые выходят за пределы 1,5 стандартных отклонений среднего CBFi для этого повторения. Если более 1 точки данных идентифицировано как выброс, отбросьте все повторение.
    4. Оценка среднего индекса мозгового кровотока: Оцените средний CBFi на полушарие, взяв среднее значение по всем кадрам данных для всех повторений (рисунок 4C). Если существенных различий в масштабах полушария не наблюдается, усредните по полушариям, чтобы получить оценку среднего глобального CBFi.

3. Мультиплексированная количественная оценка цитокинов и фосфопротеинов с использованием анализов luminex

  1. Извлечение тканей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка цитокинов мозга и фосфо-сигнальных белков с использованием Luminex требует экстракции ткани.
    1. Обезболить мышь с использованием 4,5% изофлурана в 100% кислороде в течение 1-2 мин. Проверьте наличие глубокой плоскости анестезии из-за отсутствия реакции на защемление пальца ноги. Усыпление путем обезглавливания.
    2. Заготовьте ткань.
      1. Удалите мозг. Как правило, фиксируют левое полушарие для гистологии и микрорассекают несколько областей от правого полушария в пределах коры и гиппокампа (рисунок 5).
      2. Поместите рассеченные образцы в микроцентрифужные трубки, мгновенно заморозьте в жидком азоте. Для анализа чувствительных к замораживанию белков оптимально подразделять участки ткани перед мгновенным замораживанием, чтобы избежать последующего замораживания-оттаивания.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен, и образцы тканей могут храниться при -80 °C до тех пор, пока они не будут готовы к лизированию образцов. Альтернативно, образцы могут быть лизированы, а затем сохранены при -80 °C.
    3. Образцы лиза.
      1. Готовят буфер лизиса, добавляя ингибитор протеазы и 2 мМ фенилметилсульфонилфторида в буфер лизиса.
      2. Добавьте 150 мкл смешанного буфера лизиса примерно на 3 мкг ткани животных. Для справки, образцы ткани зрительной коры головного мозга мыши составляют примерно 3 мкг.
      3. Чтобы гомогенизировать ткань, механически тритурируйте ткань путем пипетирования вверх и вниз ~ 15-20 раз с использованием пипетки 1000 мкл. Для оптимальной тритурации образцов может быть использован гомогенизатор пестика.
      4. Поместите пробирки на ротатор на 30 мин при 4°C.
      5. Центрифугируйте образцы при 4°C в течение 10 мин при приблизительно 15 000 х г и соберите супернатант. Образцы могут быть немедленно обработаны или сохранены при -80°C для дальнейшего анализа.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы лизатов, приготовленные с использованием этого протокола, совместимы с вестерн-блоттингом, из которого фагоцитарный/микроглиальный маркер Iba1 и/или маркер активации астроцитов GFAP могут быть проанализированы для дополнения анализа цитокинов и фосфобелков для исследований нейровоспаления11.
  2. Протокол мультиплексного иммуноанализа на цитокины и фосфобенины
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на сходство в целом, существуют некоторые незначительные различия в протоколах для наборов цитокинов и фосфобелков. Различия отмечаются на каждом этапе. Этапы подготовки образцов для анализа Luminex описаны ниже.
    1. Приготовление реагентов (день 1, то же самое для цитокинов и фосфопротеинов)
      1. Дайте реагентам нагреться до комнатной температуры (~30 мин).
      2. Ультразвуковые мультиплексные магнитные шарики бутылки в течение 30 секунд с последующим 1 минутой вихря. Убедитесь, что мультиплексные магнитные шарики защищены от света алюминиевой фольгой или используйте предоставленные легкие защитные бутылки.
      3. Подготовьте буфер для стирки, перемешав 0,1% Tween20 в 1xPBS или в качестве альтернативы используйте буфер для стирки, поставляемый в комплекте.
    2. Подготовка лизированных образцов тканей (день 1, то же самое для цитокинов и фосфо-белков)
      1. При предварительной заморозке извлеките образцы лизированных тканей из морозильной камеры и дайте оттаять на льду (~20 мин). Центрифужные образцы в течение 10 мин при 9,167 х г для удаления осадка.
      2. Готовят 25 мкл образца при оптимальной концентрации белка, определяемой линейным диапазонным анализом (см. раздел 3.3). Чтобы нормализовать общий объем для всех образцов, разбавьте образцы в буфере анализа, предусмотренном в комплекте.
    3. Приготовление 96 луночной пластины (день 1, то же самое для цитокинов и фосфо-белков)
      1. Используйте пластину из 96 скважин, входящую в комплект, или пластину с тонким дном (например, Brand Tech).
      2. Добавьте 200 мкл промывочного буфера (или 1x PBS, 0,1% анимации) в каждую лунку и перемешайте на шейкере в течение 10 минут при 750 об/мин.
      3. Декант промыть буфер и постучать пластиной по бумажному полотенцу, чтобы удалить остатки.
    4. Процедура иммуноанализа на цитокины (день 1)
      1. Добавьте следующее к каждой скважине по порядку.
        1. Добавьте 25 мкл пробирного буфера во все скважины.
          1. Добавьте 25 мкл дополнительного буфера анализа ТОЛЬКО в фоновые скважины. Для каждого экспериментального запуска есть по крайней мере две фоновые скважины. Фоновые скважины не имеют загруженного образца и определяют интенсивность флуоресценции, считываемую прибором без образца.
          2. Добавьте 25 мкл каждого разбавленного образца в соответствующие пробоотборные скважины.
          3. Добавьте 25 мкл 1x мультиплексных магнитных шариков ко всем скважинам (рисунок 6). Обязательно вихревые шарики в течение 1 мин перед добавлением в лунки.
      2. Уплотните пластину с помощью пластинчатого герметика и покройте пластину алюминиевой фольгой. Инкубировать в течение ночи (12-16 ч) при 2-8 °C.
    5. Процедура иммуноанализа на цитокины (2 день)
      1. Поместите пластину 96 скважин на магнитный сепаратор, убедившись, что скважины выровнены с магнитами. Дать постоять 2 мин. Декантируйте содержимое скважины, пока пластина еще прикреплена к магнитному сепаратору.
      2. Помойте тарелку 2 раза, выполнив следующие действия.
        1. Добавьте 200 мкл промывочного буфера в каждую лунку и поместите на шейкер на 2 мин при комнатной температуре.
        2. Поместите пластину скважины на магнитный сепаратор на 2 мин при комнатной температуре.
        3. Декантируйте содержимое скважины, в то время как пластина скважины все еще прикреплена к магнитному сепаратору.
      3. Добавьте 25 мкл детектирующего антитела на лунку (рисунок 6). Накрыть фольгой. Инкубировать в течение 1 часа на пластинчатом шейкере (750 об/мин) при комнатной температуре.
      4. Оставьте антитело для обнаружения и добавьте 25 мкл стрептавидина-фикоэритрина (SAPE) в каждую лунку (рисунок 6). Накрыть фольгой. Инкубировать в течение 30 мин на пластинчатом шейкере (750 об/мин) при комнатной температуре.
      5. Поместите пластину колодца на магнитный сепаратор и оставьте на 2 мин. Декантировать содержимое скважины и отсоединять от магнитного сепаратора.
      6. Промыть плиту колодца два раза (см. шаг 3.2.5.2).
      7. Добавьте 75 мкл приводной жидкости Luminex (при использовании прибора MAGPIX) в каждую скважину или буфер анализа (если используется прибор 200 или FlexMap 3D). Повторно суспендировать шарики на шейкере пластин в течение 5 мин при комнатной температуре.
      8. Читайте на Luminex Instrument (MAGPIX, 200 или FlexMap 3D), ссылаясь на руководство пользователя для правильной работы (рисунок 6).
    6. Процедура иммуноанализа на фосфопротеины (день 1)
      1. Добавьте следующее к каждой скважине по порядку.
        1. Добавьте 25 мкл пробирного буфера во все скважины.
          1. Добавьте 25 мкл дополнительного буфера анализа ТОЛЬКО в фоновые скважины. Для каждого экспериментального запуска рекомендуется иметь не менее двух фоновых скважин. Фоновые скважины не имеют загруженного образца и определяют интенсивность флуоресценции, считываемую прибором без образца.
          2. Добавьте 25 мкл каждого разбавленного образца в каждую пробную скважину.
          3. Добавьте 25 мкл 1x мультиплексных магнитных шариков ко всем скважинам (рисунок 6).
            ПРИМЕЧАНИЕ: Набор для анализа Luminex обеспечивает мультиплексную магнитную бусину в 20-кратном стоковом растворе. Обязательно вихрево 20x запас мультиплексного магнитного шарика раствора в течение 2 мин, а затем разбавьте его в буфере анализа до 1x раствора. Вихревая 1x мультиплексная магнитная шариковая суспензия в течение 1 мин перед добавлением в скважины.
        2. Уплотните пластину с помощью пластинчатого герметика и покройте пластину алюминиевой фольгой. Инкубировать на ночь (12-16 часов) при 2-8 °C.
    7. Процедура иммуноанализа на фосфопротеины (день 2)
      1. Поместите пластину скважины на магнитный сепаратор, убедившись, что пластина скважины полностью выровнена с магнитным сепаратором. Дать постоять 2 мин. Декантируйте содержимое скважины, в то время как пластина скважины все еще прикреплена к магнитному сепаратору.
      2. Промойте пластину 2 раза (см. шаг b в процедуре иммуноанализа цитокинов на 2-й день).
      3. Разбавьте 20-кратное антитело для обнаружения запасов до 1x раствора в буфере анализа. Добавьте 25 мкл 1x антитела обнаружения на лунку (рисунок 6). Накрыть фольгой. Инкубировать в течение 1 ч на пластинчатом шейкере (750 об/мин) при комнатной температуре.
      4. Поместите пластину из 96 лунок на магнитный сепаратор и оставьте на 2 мин. Декантировать содержимое скважины, отсоединить от магнитного сепаратора.
      5. Разбавьте 25-кратный запас SAPE в буфере анализа до 1x буфера. Добавьте 25 мкл 1x SAPE (рисунок 6). Накрыть фольгой и инкубировать в течение 15 мин на пластинчатом шейкере (750 об/мин) при комнатной температуре.
      6. Оставьте SAPE в скважинах и добавьте 25 мкл буфера амплификации в каждую скважину. Накрыть фольгой.
      7. Инкубировать в течение 15 мин на пластинчатом шейкере (750 об/мин) при комнатной температуре.
      8. Поместите пластину скважины на магнитный сепаратор на 2 мин. Декантировать содержимое скважины и отсоединять от магнитного сепаратора.
      9. Добавьте 75 мкл приводной жидкости Luminex (при использовании прибора MAGPIX) или буфер анализа (при использовании прибора 200 или FlexMap 3D). Повторно суспендируйте бусины на шейкере пластин в течение 5 мин при комнатной температуре.
      10. Читайте на приборе Luminex (MAGPIX, 200 или FlexMap 3D), ссылаясь на руководство пользователя для правильной работы (рисунок 6).
  3. Кривая линейности разбавления пробы
    1. Подготовка образцов: Серийно разбавляйте тестовые образцы с различной концентрацией общего белка. Для объемных тканей головного мозга нагрузите последовательные разведения от 0-25 мкг для цитокинов и 0-12 мкг для фосфо-белков. Общая концентрация белка может быть измерена с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA).
    2. Мультиплексный иммуноанализ: Выполните анализ Luminex (см. раздел 3.2) на выбранных образцах.
    3. Анализ данных
      1. График флуоресцентной интенсивности для каждого белка по сравнению с количеством загруженного белка (рисунок 7).
      2. Для каждого анализируемого вещества определите диапазон общего загруженного белка, для которого соотношение между общим белком и считыванием интенсивности флуоресцентности является линейным (рисунок 7).
      3. Чтобы определить количество общего белка, которое должно быть загружено для полного прогона анализа, определите линейную часть кривой для каждого анализируемого вещества, а затем выберите концентрацию белка, которая попадает в линейный диапазон для большинства аналитов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя большинство белков имеют сходный линейный диапазон, линейные диапазоны могут не перекрываться для всех белков. Если это так, может потребоваться запустить каждый образец несколько раз с различным количеством загруженного общего белка. В качестве альтернативы, нелинейные образцы могут быть исключены из анализа. Кроме того, некоторые белки могут вообще не иметь линейного диапазона.

4. Частичная регрессия наименьших квадратов

ПРИМЕЧАНИЕ: Пример кода R и образец электронной таблицы данных предоставляются для проведения частичного анализа наименьших квадратов.

  1. Подготовка данных: отформатируйте данные, как показано в предоставленном образце электронной таблицы данных "MyData". Включите имена переменных в строку 1, имена образцов в столбце A, переменную ответа в столбце B и все переменные предиктора в столбцы C+. Заполните последние две строки фоновыми данными и задайте для обоих образцов имя "Фон".
  2. Частичная регрессия наименьших квадратов в RStudio
    1. Установите R с www.r-project.org (бесплатно, с открытым исходным кодом).
    2. Установите RStudio Desktop с www.rstudio.com (бесплатная лицензия с открытым исходным кодом).
    3. Загрузите образец кода R, поставляемый с этой публикацией, "PLSR_Sample_Code.R", и сохраните его в той же папке, которая содержит электронную таблицу данных. Откройте файл кода в RStudio.
    4. В разделе Пользовательский ввод измените "dataFileName" на имя электронной таблицы данных.
    5. Выполните следующие действия, выделив раздел выполняемого кода и щелкнув Выполнить в правом верхнем углу сценария.
      1. Загрузите необходимые R-пакеты, функции, адрес рабочего каталога и значения пользовательского ввода в RStudio (подраздел "Предварительные настройки").
      2. Загрузите данные в RStudio и подготовьте необработанные данные для обработки, вычитая средний фоновый сигнал из всех измерений и z-оценки каждого анализируемого (подраздел «Чтение данных и вычитание фона») (рисунок 8A).
      3. Выполните частичную регрессию наименьших квадратов в RStudio с помощью пакета plsRglm v1.2.528 , доступного в Comprehensive R Archive Network (CRAN). Выполните вариамационное вращение (пакет статистики v3.6.2)23 в плоскости LV1-LV2, чтобы определить новую горизонтальную ось, которая лучше всего разделяет образцы по переменной отклика (подраздел "PLS") (рисунок 8B).
      4. Проведите перекрестную проверку (LOOCV), в которой один образец итеративно исключается из данных, а модель PLSR пересчитывается. Вычисление стандартного отклонения для загрузки анализируемого вещества во всех прогонах LOOCV (подраздел "LOOCV").
  3. Создание репрезентативных участков: Запустите предоставленный пример кода, как описано выше, чтобы создать репрезентативные графики, которые автоматически экспортируются в виде pdf-файлов в рабочий каталог (папку, содержащую файлы данных и кода).
    1. Создайте тепловую карту обработанных данных, как показано на рисунке 8A (подраздел "PLS"). Окрасьте каждую запись по спектру, определяемому z-оценкой. Сортируйте аналиты по порядку, вычисленному в латентной переменной интереса.
    2. Создайте график оценок с оценками LV1, построенными вдоль горизонтальной оси, и оценками LV2, построенными вдоль вертикальной оси, как показано на рисунке 8B (подраздел "PLS"). Раскрасьте каждую точку данных в соответствии с ее измерением переменной отклика, чтобы визуализировать связь между каждой скрытой переменной и переменной ответа.
    3. Создайте гистограмму, отображающую нагрузки для каждой из ваших предикторных переменных, чтобы визуализировать, как каждый анализируемый вносит вклад в латентные переменные, как показано на рисунке 8C (подраздел «LOOCV»).
    4. Создайте график, регрессирующий оценки LV1 по отношению к переменной ответа, чтобы визуализировать, насколько хорошо модель PLSR разделяет выборки, как показано на рисунке 8D (подраздел "PLS").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ранее собранные данные были взяты из предыдущей работы, в которой группа из восьми мышей C57BL/6 подвергалась трем закрытым травмам головы (рисунок 2), расположенным один раз в день11. В этой работе мозговой кровоток измеряли с помощью диффузной корреляционной спектроскопии через 4 ч после последней травмы (рисунок 3, рисунок 4). После оценки CBF после травмы животных усыпляли, а ткань мозга извлекали для количественной оценки цитокинов и фосфобелей с помощью иммуноанализа (рисунок 5). Мы также количественно определили маркер активации фагоцитов/микроглий Iba1 с помощью вестерн-блоттинга (методы, описанные в11). Мозговая ткань каждой мыши была лизирована, а общая концентрация белка была измерена с использованием анализа BCA. Количественная оценка мультиплексированных цитокинов проводилась с использованием Milliplex MAP Mouse Cytokine/Chemokine 32-Plex, который считывался с использованием системы Luminex MAGPIX (рисунок 6). Линейный анализ диапазона проводился для определения соответствующей белковой нагрузки (12 мкг белка на 12,5 мкл лизата) (рисунок 7) до сбора данных из всех образцов.

Данные цитокинов готовили для анализа путем вычитания фоновых измерений из данных выборки, а затем z-скоринговых данных для каждого анализируемого вещества (рисунок 8А). Тепловая карта была сгенерирована из z-скорбированных данных для визуализации различий в экспрессии цитокинов среди животных. Частичную регрессию наименьших квадратов (PLSR) проводили с использованием маркера активации фагоцитов/микроглии Iba1 в качестве переменной ответа и измерений цитокинов в качестве предикторных переменных (рисунок 8B). Было выполнено вариамационное вращение для максимизации кодисперсии данных на LV1 с измерениями Iba1 (рисунок 8D). Высокие нагрузочные веса в LV1 (рисунок 8C) соответствуют экспрессии цитокинов, наиболее связанной с высокой экспрессией Iba1. Линейные регрессии между Iba1 и цитокинами показывают, что цитокины с наибольшим нагрузочным весом в LV1 также были статистически значимыми (рисунок 8E).

Figure 1
Рисунок 1: Типичный рабочий процесс. Сначала мыши подвергаются закрытой черепно-мозговой травме, а затем мозговой кровоток (CBF) измеряется с помощью диффузной корреляционной спектроскопии. Далее собирается мозг, области, представляющие интерес, микропросекаются и замораживаются с использованием жидкого азота. При подготовке к иммуноанализу Luminex белки лизируют, а общую концентрацию белка измеряют с помощью анализа бицинхониновой кислоты. Лизаты используются для вестерн-блоттинга интересующих белков, а анализы Luminex для цитокинов и фосфо-белков. Данные из CBF, Western blot и Luminex интегрируются с использованием частичной регрессии наименьших квадратов (PLSR). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Модель снижения веса с закрытой головой легкой черепно-мозговой травмы. (A) Обезболенную мышь захватывают за хвост и помещают на подтянутую жертвенную мембрану под направляющей трубкой. Вес 54 г сбрасывается с 1 м на спинной аспект головы. (B) В течение ~ 1 мс после удара голова мыши быстро вращается вокруг шеи, когда она прорывается через жертвенную мембрану. (C) В течение ~ 5 мс после удара вся мышь упала и висит за схваченный хвост. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Измерение мозгового кровотока методом диффузной корреляционной спектроскопии. (A) Оптический датчик осторожно вручную удерживается над правым полушарием для измерения кровотока у анестезированной мыши. (B) Репрезентативное размещение датчика в правом полушарии. Контур датчика представлен в виде пунктирного черного прямоугольника, а расположение источников и детекторных волокон расположено в красных и синих кругах соответственно. Датчик расположен таким образом, чтобы короткий край датчика совпадал с задней частью глаза, а длинный край датчика выравнивался со средней линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Анализ данных диффузной корреляционной спектроскопии. (A) Репрезентативные измеренные кривые автокорреляции интенсивности, g2(τ), на исходном уровне, исходном уровне до травмы (зеленый) и через 4 ч после 5 закрытых травм головы, расположенных один раз в день (фиолетовый). Правый сдвиг кривой от до-до-после травмы отражает снижение кровотока. (B) gEquation(τ) данные получаются при 1 Гц в течение 5 с на полушарие и повторяются 3x/полушарие. Каждая измеренная кривая gEquation(τ) соответствует полубесконечному решению уравнения корреляционной диффузии для индекса мозгового кровотока (CBFi). (C) Значения CBFi по всем кадрам и повторениям усредняются для получения среднего индекса мозгового кровотока для каждого полушария (обозначаемого горизонтальной черной полосой). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Микродиссекция мозга мыши. (А) После того, как мозг извлечен из мыши, он делится пополам вдоль пунктирной линии. Левое полушарие фиксируется для гистологии, а правое полушарие микрорассекается для патологии. (B) Сагиттальный вид коры правого полушария. Правое полушарие микрораспределено на соответствующие цветовые области. Для анализа чувствительных к замораживанию белков оптимально подразделять участки тканей перед мгновенной заморозкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Иллюстрация процедуры Luminex. (A) Добавить образцы к бусинам с флуоресцентной маркировкой. Бусины предварительно покрыты специфическим антителом захвата для каждого интересующего белка. (B) Добавить биотинилированные антитела для обнаружения. Антитела, обнаруживающие биотин, связываются с интересующими их аналитами и образуют сэндвич антитело-антиген. (C) Добавить фикоэритрин (ПЭ)-конъюгированный стрептавидин (SAPE). SAPE связывается с биотинилированными антителами обнаружения, завершая реакцию. Для фосфо-белков добавляется буфер амплификации (только для фосфо-белковых анализов) после добавления к SAPE для усиления сигнала анализа. (D) Прибор Luminex (MAGPIX, 200 или FlexMap 3D) считывает реакцию на каждую бусину с флуоресцентной меткой с помощью комбинации красной/зеленой подсветки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 7: Иллюстрация кривой разбавления пробы для определения линейного диапазона. Концентрация белка в последовательно разбавленных образцах по сравнению с интенсивностью флуоресценции, измеренной с помощью анализа Luminex. Линейный диапазон определяется как диапазон концентрации белка, для которого связь между концентрацией белка и интенсивностью флуоресцентности является линейной (стрелка). В некоторых аналитах увеличение концентрации белка сверх определенного предела может уменьшить связывание антител таким образом, что кривая разбавления становится нелинейной или инвертированной (эффект Хука). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 8: Репрезентативный анализ частичной регрессии наименьших квадратов (PLSR). (A) Экспрессия цитокинового белка панели (левые столбцы) вместе с экспрессией Iba1 (правая колонка) у мышей 3xCHI (n = 8, z-балл). (B) PLSR присваивает веса (нагрузки) измеренным цитокинам для каждой латентной переменной. Веса применяются к измеренным данным для вычисления баллов для каждой выборки по каждой латентной переменной. (C) PLSR образцов 3xCHI против Iba1 идентифицировал взвешенный профиль цитокинов, LV1, который отличал образцы Iba1. Цитокины с отрицательным весом были повышены в образцах с низким Iba1, в то время как цитокины с положительным весом были повышены в образцах с высоким Iba1 (средняя ± SD с использованием LOOCV). (D) Линейная регрессия баллов LV1 для каждой выборки против Iba1. R2PLS измеряет хорошую посадку между Iba1 и LV1. (E) Индивидуальные регрессии Iba1 против каждого из цитокинов с наибольшим весом в LV1 в C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы подробно описываем методы оценки гемодинамической и нейровоспалительной реакции на повторяющуюся легкую черепно-мозговую травму. Кроме того, мы показали, как интегрировать эти данные в рамках многомерного системного анализа с использованием частичной регрессии наименьших квадратов. В тексте ниже мы обсудим некоторые из ключевых шагов и ограничений, связанных с протоколом, а также преимущества / недостатки методов по сравнению с существующими методами.

Модель снижения веса легкой черепно-мозговой травмы. Этот метод индукции черепно-мозговой травмы является преимуществом в том, что он имеет тупой удар с последующим быстрым передне-задним ускорением вращения, обычно наблюдаемым при спортивных травмах головы10,19. Конечно, лиссенцефальный мозг мыши не полностью повторяет сложность гироцефального человеческого мозга; Тем не менее, эта модель вызывает многие из тех же клинических и поведенческих последствий человеческой МЧТ, включая устойчивый дефицит пространственного обучения и памяти с повторными травмами. Кроме того, хотя воздействие носит мягкий характер (нет структурного / нейронного повреждения, нет проницаемости гематоэнцефалического барьера, когнитивный дефицит, возникающий только после нескольких ударов и т. Д.19), оно вызывает значительную потерю сознания, в отличие от людей, где потеря сознания встречается реже. Эта повышенная потеря сознания может быть связана с взаимодействием с анестезией, данной непосредственно перед ударом, хотя точная причина не совсем понятна. Наконец, отметим, что выравнивание направляющей трубки таким образом, чтобы болт воздействовал между корональным и ламдоидным швами, имеет решающее значение. Мы заметили, что более задние удары могут вызвать значительный двигательный дефицит, требующий эвтаназии.

Оценка мозгового кровотока с помощью диффузной корреляционной спектроскопии. Неинвазивные, продольные измерения мозгового кровотока (CBF) с традиционными методами, используемыми в исследованиях на людях / крупных животных, таких как перфузионная магнитно-резонансная томография или транскраниальное допплеровское ультразвуковое исследование, являются сложными у мышей по разным причинам, включая небольшой размер мозга и общий объем крови29. Диффузная корреляционная спектроскопия хорошо подходит для мышей и предлагает дополнительные преимущества неинвазивности и относительно недорогих по сравнению с другими модальностями20,30. Поскольку DCS чувствителен к артефактам движения, мышей необходимо кратковременно обезболить или удерживать31 для оценки. Мы обычно используем изофлурановую анестезию из-за ее быстрой индукции и восстановления; однако изофлуран является церебральным сосудорасширяющим средством, и оценки кровотока под изофлураном следует интерпретировать с осторожностью. Снижение кровотока, наблюдаемое после травмы, по сравнению с животными с фиктивными травмами, может быть смешано с отказом поврежденной сосудистой системы головного мозга вазодилата в ответ на изофлуран. Наконец, ранее мы продемонстрировали отличную внутрипользовательскую повторяемость измерений кровотока с DCS у мышей, но только справедливую повторяемость внутри пользователя21. По этой причине мы рекомендуем одному и тому же оператору получить измерения DCS для экспериментов, требующих продольной оценки мозгового кровотока.

Мультиплексированная количественная оценка цитокинов и фосфопротеинов с использованием анализов Luminex. Ключевой проблемой при любом ИФА является эффект Хука, при котором повышенная концентрация белка может снизить сродство антител к белку-мишени, что приводит к снижению сигнала анализа в ответ на увеличение белка32 (рисунок 7). Этот эффект может усугубляться при анализе целых тканей, при этом объемные белки могут аналогичным образом мешать. Таким образом, первым шагом в использовании анализов Luminex является определение того, существует ли диапазон загруженных концентраций белка, для которых показания анализа линейно изменяются в зависимости от количества загруженного белка. Аналиты, не имеющие такого линейного диапазона (рисунок 7), должны быть исключены из анализа. Мы также отмечаем, что уровни цитокинов в мозге, как правило, очень низкие и появляются вблизи нижнего предела обнаружения, оцениваемого с помощью стандартных кривых, поставляемых с комплектом Luminex. По этой причине важно провести линейный анализ диапазона, чтобы определить, действительно ли показания прибора отражают количество загруженного образца. Для ключевых белков, представляющих интерес, этот линейный анализ диапазона может быть дополнен анализом восстановления шипов, в котором рекомбинантный белок помещается в образец, а линейность в показаниях прибора оценивается33.

Поскольку нейровоспаление регулируется разнообразными внутриклеточными фосфо-белками и внеклеточными цитокинами, важно одновременно измерить широкий спектр этих белков, чтобы понять нейронный иммунный ответ мозга на MTBI. Мультиплексированные иммуноанализы Luminex позволяют одновременно количественно оценивать десятки цитокинов и фосфо-белков из одного образца, обеспечивая целостное представление об иммунном ответе тканей после травмы. Хотя эти анализы дают широкое представление о цитокинах / хемокинах, а также фосфо-белках, анализ количественно определяет общее количество каждого белка из тканевого гомогената. Таким образом, он не дает специфических для клеток данных. Специфичность клеточного типа может быть определена с помощью последующей иммуногистохимии для выявления локализации верхних белков, представляющих интерес, маркерами для типов клеток (например, нейроны, микроглия, астроциты и т. Д.). 11.

Частичный регрессионный анализ наименьших квадратов для интеграции данных. Тканевый ответ на mTBI является многофакторным, состоящим из физиологических изменений кровотока вместе с изменениями в маркере активации фагоцитов / микроглий Iba1, различных цитокинов и фосфо-белков, среди прочих11. Из-за мультиплексированного характера собранных данных необходим систематический метод для учета многомерности отношений между различными предикторными переменными. PLSR обеспечивает подходящее решение этой проблемы путем идентификации LV, которые максимально идентифицируют кодисперацию между предикторными переменными и переменной результата (например, Iba1 на рисунке 8). Важно отметить, что те белки, которые, как было установлено, сильно коррелируют с предикторной переменной (т.е. белки с высокой нагрузкой на LV1), часто коррелируют и в одномерном регрессионном анализе (рисунок 8E). Поскольку PLSR часто используется для подгонки большого количества предикторных переменных к меньшему числу выборок, как показано на рисунке 8, крайне важно получить представление о чувствительности весов на LV1 к отдельным образцам. Для небольшого количества образцов (<10) LOOCV полезен для оценки чувствительности весов (показан через полосы ошибок SD на рисунке 8C). Для большего числа образцов будет важно оценить чувствительность, оставляя несколько образцов одновременно с использованием подхода Монте-Карло к суб-выборке34. Мы отсылаем читателя к Multi and Megavariate Data Analysis24 для углубленного обсуждения подходов и применений PLSR. Наконец, мы отмечаем, что ключевым ограничением этого типа анализа является то, что он является чисто коррелятивным. PLSR не доказывает механистическую связь между предикторными переменными и переменной результата. Мы рассматриваем PLSR как ценный подход, генерирующий гипотезы , который используется для предложения разрешимых целей для модуляции в будущих экспериментах, которые устанавливают причинно-следственные связи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Никакой.

Acknowledgments

Этот проект был поддержан Национальными институтами здравоохранения R21 NS104801 (EMB) и R01 NS115994 (LBW / EB) и детской медицинской премией Атланты Junior Faculty Focused Award (EMB). Эта работа также была поддержана Министерством обороны США через программы медицинских исследований, направляемые Конгрессом под номером премии. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Мнения, интерпретации, выводы и рекомендации принадлежат автору и не обязательно одобряются Министерством обороны. Этот материал основан на работе, поддерживаемой Программой стипендий для аспирантов Национального научного фонда в рамках гранта No 1937971. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат авторам и не обязательно отражают взгляды Национального научного фонда.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adjustable pipettes any adjustable pipette
Aluminum foil VWR 89107-726
Bio-Plex cell lysis kit C Bio-Rad 171304012
BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile BrandTech 781602 96
Complete mini protease inhibitor tablet Sigma-Aldrich 11836153001
Depilatory cream Amazon Nair
DiH2O VWR VWRL0200-1000
Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates Millipore Sigma Catalogue 40-285
Hardware Autocorrelator Board www.correlator.com Flex05-8ch
Isoflurane 250 mL MED-VET INTERNATIONAL RXISO-250
Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) VWR 21905-026
Laboratory vortex mixer VWR 10153-838
LabView National Instruments LabVIEW
Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software Luminex Corporation
Luminex Drive Fluid Luminex MPXDF-4PK
Luminex sheath fluid EMD Millipore SHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay Millipore Sigma MCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay Millipore Sigma 48-660MAG
Mini LabRoller rotator VWR 10136-084
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
Phosphate-buffered Saline (PBS) VWR 97064-158
Plate Sealer VWR 82050-992
Polypropylene microfuge tubes VWR 20901-547
Mini LabRoller Millipore Sigma Z674591
Reagent Reservoirs VWR 89094-668
R Programming Language
RStudio www.rstudio.com
Sonicator
Titer plate shaker VWR 12620-926
Tween20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
1 m acrylic guide tube McMaster-Carr 49035K85
4 photon counting avalanche photodiode Perkin-Elmer SPCM-AQ4C-IO
400 um multimode source fiber Thorlabs Inc. FT-400-EMT
54 g bolt Ace Hardware 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length
780 nm single mode detector fiber Thorlabs Inc. 780HP
852 nm long-coherence length laser TOPTICA Photonics iBeam smart

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
  2. Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
  3. Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
  4. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  5. Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , National Academies Press (US). Washington (DC). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169016/ (2014).
  6. Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
  7. McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
  8. Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
  9. Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).
  10. Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
  11. Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
  12. Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
  13. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
  14. Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
  15. Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
  16. Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
  17. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury--part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
  18. Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
  19. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
  20. Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
  21. Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).
  22. Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).
  23. Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
  24. Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
  25. Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
  26. Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).
  27. Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
  28. Bertrand, F., Maumy-Bertrand, M. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019).
  29. White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322 (2011).
  30. Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).
  31. Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
  32. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
  33. Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
  34. Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).

Tags

Неврология Выпуск 183 Легкая черепно-мозговая травма мозговой кровоток нейровоспаление мультиплексированная ИФА частичная регрессия наименьших квадратов цитокины фосфо-белки
Системный анализ нейровоспалительного и гемодинамического ответа на черепно-мозговую травму
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brothers, R. O., Bitarafan, S.,… More

Brothers, R. O., Bitarafan, S., Pybus, A. F., Wood, L. B., Buckley, E. M. Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (183), e61504, doi:10.3791/61504 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter