Neuroscience

Systemanalys av det neuroinflammatoriska och hemodynamiska svaret på traumatisk hjärnskada

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/61504

Rowan O. Brothers*¹, Sara Bitarafan*^2,3, Alyssa F. Pybus^1,3, Levi B. Wood*^1,2,3, Erin M. Buckley*^1,4,5

¹Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, ²George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, ³Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, ⁴Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, ⁵Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta

* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll presenterar metoder för att karakterisera det neuroinflammatoriska och hemodynamiska svaret på mild traumatisk hjärnskada och för att integrera dessa data som en del av en multivariat systemanalys med partiell minsta kvadratregression.

Abstract

Milda traumatiska hjärnskador (mTBI) är ett betydande folkhälsoproblem. Upprepad exponering för mTBI kan leda till kumulativa, långvariga funktionella underskott. Många studier av vår grupp och andra har visat att mTBI stimulerar cytokinuttryck och aktiverar mikroglia, minskar cerebralt blodflöde och metabolism och försämrar cerebrovaskulär reaktivitet. Dessutom har flera verk rapporterat en koppling mellan störningar i dessa neuroinflammatoriska och hemodynamiska markörer och kognitiva funktionsnedsättningar. Här beskriver vi metoder för att karakterisera det neuroinflammatoriska och hemodynamiska vävnadssvaret på mTBI hos möss. Specifikt beskriver vi hur man utför en viktminskningsmodell av mTBI, hur man i längdriktningen mäter cerebralt blodflöde med hjälp av en icke-invasiv optisk teknik som kallas diffus korrelationsspektroskopi och hur man utför en Luminex multiplexerad immunanalys på hjärnvävnadsprover för att kvantifiera cytokiner och immunmodulerande fosfoproteiner (t.ex. inom MAPK- och NFκB-vägarna) som svarar på och reglerar aktiviteten hos mikroglia och andra neurala immunceller. Slutligen beskriver vi hur man integrerar dessa data med hjälp av en multivariat systemanalysmetod för att förstå relationerna mellan alla dessa variabler. Att förstå relationerna mellan dessa fysiologiska och molekylära variabler kommer i slutändan att göra det möjligt för oss att identifiera mekanismer som är ansvariga för mTBI.

Introduction

Överblick
Milda traumatiska hjärnskador (mTBI) påverkar ~ 1.6-3.8 miljoner idrottare årligen¹. Dessa skador, inklusive sub-hjärnskakning och hjärnskakningsskador, kan lämna patienter med övergående fysiska, emotionella, psykologiska och kognitiva symtom². Dessutom kan repetitiv mTBI (rmTBI) som upprätthålls inom ett "sårbarhetsfönster" leda till kumulativ svårighetsgrad och varaktighet av kognitiva konsekvenser som varar längre än effekterna av en enda mTBI ensam³, och i slutändan även till permanent funktionsförlust ^4,5,6. Även om många patienter återhämtar sig inom en relativt kort tidsram (<1 vecka), lider 10-40% av patienterna av långvariga effekter av mTBI under > 1 månad, med några som varar upp till 1 år 3,7,8,9. Trots den höga förekomsten och de varaktiga konsekvenserna av dessa skador är skademekanismerna dåligt förstådda och inga effektiva behandlingsstrategier finns.

Med tanke på den höga variationen i resultat efter mTBI /rmTBI är en utmaning när det gäller att identifiera molekylära triggers i tidigt stadium från vävnad erhållen i terminala mTBI/rmTBI-studier bristen på longitudinella data som visar definitiva "akuta molekylära länkar" av dessa molekylära triggers till långsiktiga resultat. För att övervinna denna utmaning har vår grupp upptäckt att akut minskat cerebralt blodflöde mätt akut med hjälp av ett optiskt verktyg som kallas diffus korrelationsspektroskopi (DCS), starkt korrelerar med långsiktigt kognitivt resultat i en musmodell av rmTBI¹⁰. Med hjälp av denna hemodynamiska biomarkör visade vi att möss med akut lågt cerebralt blodflöde (och i förlängningen sämre förutsagt långsiktigt resultat) har samtidiga akuta ökningar av neuronal fosfosignalering inom både MAPK- och NFκB-vägar, ökningar i neuronalt uttryck av proinflammatoriska cytokiner och ökningar i uttrycket av fagocyten /mikrogliamarkören Iba1¹¹ . Dessa data tyder på en möjlig roll för neuronal fosfo-signalering, cytokinuttryck och mikrogliaaktivering i både akut reglering av cerebralt blodflöde efter skada samt för att utlösa en signalkaskad som leder till neuronal dysfunktion och sämre kognitivt resultat. Här beskriver vi vårt tillvägagångssätt för att samtidigt undersöka både den hemodynamiska och neuroinflammatoriska miljön efter rmTBI och hur man integrerar dessa komplexa dataset. Specifikt beskriver vi förfaranden för fyra viktiga steg i detta övergripande tillvägagångssätt: (1) en viktminskningsmodell av mild traumatisk hjärnskada, (2) bedömning av cerebralt blodflöde med diffus korrelationsspektroskopi, (3) kvantifiering av den neuroinflammatoriska miljön och (4) dataintegration (figur 1). Nedan ger vi en kort introduktion till vart och ett av dessa viktiga steg för att hjälpa läsarna genom motiveringen bakom våra metoder. Resten av manuskriptet ger ett detaljerat protokoll för vart och ett av dessa nyckelsteg.

Viktminskningsmodell av mild traumatisk hjärnskada
Även om många utmärkta prekliniska modeller av repetitiv mild TBI finns 12,13,14,15,16,17,18, använder vi en väletablerad och kliniskt relevant viktfallsmodell för sluten huvudskada. Viktiga funktioner i denna modell inkluderar (1) trubbig påverkan av den intakta skallen / hårbotten följt av obegränsad rotation av huvudet runt nacken, (2) ingen öppen strukturell hjärnskada, ödem, blod-hjärnbarriärskador, akut celldöd eller kronisk hjärnvävnadsförlust och (3) ihållande (upp till 1 år) kognitiva underskott som uppstår först efter flera träffar¹⁹ (Figur 2).

Bedömning av cerebralt blodflöde med diffus korrelationsspektroskopi
Diffus korrelationsspektroskopi (DCS) är en icke-invasiv optisk teknik som mäter blodflödet ^5,20,21. I DCS placeras en nära infraröd ljuskälla på vävnadsytan. En detektor placeras på ett fast avstånd från källan på vävnadsytan för att detektera ljus som har förökat sig genom vävnaden (Figur 3). Spridning av rörliga röda blodkroppar gör att den detekterade ljusintensiteten fluktuerar med tiden. En enkel analytisk modell som kallas korrelationsdiffusionsteori används för att relatera dessa intensitetsfluktuationer till ett index för blodflödet (CBF_i, figur 4). Även om enheterna av CBF_i (cm² / s) inte är de traditionella flödesenheterna (ml / min / 100 g), har en tidigare studie på möss visat att CBF_i starkt korrelerar med cerebralt blodflöde mätt med arteriell spin märkt MRI²¹.

Som referens byggdes DCS-instrumentet som används här internt och består av en 852 nm lång koherenslängdslaser, en uppsättning av 4 fotonräknande lavinfotodioder och ett hårdvaruautokorrelatorkort (enkel tau, 8 kanal, 100 ns minsta provtid)^21,22. Data förvärvas med hemlagad programvara skriven i LabView. Djurgränssnittet för enheten består av en 400 μm multimode källfiber (400-2200 nm våglängdsområde, ren kiseldioxidkärna, TECS Hard Cladding) och en 780 nm enkellägesdetektorfiber (780-970 nm våglängdsområde, ren kiseldioxidkärna, TECS Hard Cladding, 730 ± 30 nm andra lägesavstängning) åtskilda 6 mm från varandra och inbäddade i en svart 3D-tryckt sensor (4 mm x 8 mm, Figur 3).

Kvantifiering av den neuroinflammatoriska miljön
Även om neuroinflammation regleras av olika cellulära processer, är två viktiga relevanta mekanismer extracellulär signalering av cytokiner / kemokiner och intracellulär signalering av fosfoproteiner. För att undersöka hjärnans neuroinflammatoriska miljö efter skada extraheras hjärnor från möss, mikrodissekeras och cytokiner / kemokiner och fosfoproteiner kvantifieras med luminex (figur 5, figur 6, figur 7). Luminex multiplexerade immunanalyser möjliggör samtidig kvantifiering av en mångsidig samling av dessa proteiner genom att koppla enzymbundna immunosorbentanalyser (ELISA) till fluorescerande märkta magnetiska pärlor. Distinkta fluorescerande taggar används för varje protein av intresse, och pärlor av varje tagg funktionaliseras med en fångstantikropp mot det specifika proteinet. Hundratals pärlor för att fånga varje protein blandas ihop, placeras i en 96 brunnsplatta och inkuberas med prov. Efter provinkubation används en magnet för att fånga pärlorna i brunnen medan provet tvättas ut. Därefter binder biotinylerad detektionsantikropp till analyten av intresse för att bilda en antikropps-antigensmörgås som liknar en traditionell ELISA, men med ELISA för varje protein som förekommer på en annan fluorescerande märkt pärla. Tillsats av fykoerytrinkonjugerad streptavidin (SAPE) fullbordar varje reaktion. Luminex-instrumentet läser sedan pärlorna och separerar signalen enligt varje fluorescerande tagg / protein.

Dataintegrering
På grund av det stora antalet analyter (t.ex. cytokiner) som mäts i Luminex-analysen kan dataanalys vara svår att tolka om varje kvantifierat protein analyseras individuellt. För att förenkla analysen och fånga trender som observerats bland analyter använder vi en multivariat analysmetod som kallas partiell minsta kvadratregression (PLSR, figur 8)²³. PLSR fungerar genom att identifiera en viktaxel som motsvarar varje uppmätt protein (dvs. cytokiner eller fosfoproteiner, kallade "prediktorvariabler") som tillsammans optimalt förklarar samvariansen mellan de uppmätta proteinerna med en svarsvariabel (t.ex. cerebralt blodflöde). Vikterna kallas "lastningar" och monteras i en vektor som kallas en latent variabel (LV). Genom att projicera (kallad "scoring") de uppmätta proteindata på var och en av två LV kan data ritas om i termer av dessa LV. Efter beräkning av PLSR använder vi en varimaxrotation för att identifiera en ny LV som maximerar kovariansen mellan provprojektionerna på LV och prediktorvariabeln²⁴. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att definiera LV1 som den axel för vilken variansen för svarsvariabeln bäst förklaras. LV2 maximerar samvariansen mellan responsvariabeln och LV1-restdata, vilket kan vara förknippat med biologisk eller teknisk variation mellan prover. Slutligen genomför vi en Leave One Out Cross Validation (LOOCV) för att säkerställa att PLSR-modellen inte är starkt beroende av något prov²³.

I detta protokoll beskriver vi metoder för att karakterisera det neuroinflammatoriska och hemodynamiska vävnadssvaret på mTBI. Det allmänna arbetsflödet beskrivs i figur 1. I detta protokoll utsätts möss för en eller flera mTBI med hjälp av en viktfallsmodell med sluten huvudskada. Cerebralt blodflöde mäts i längdriktningen före och vid flera tidpunkter efter skada. Vid tidpunkten för intresse för förhör av neuroinflammatoriska förändringar avlivas djuret och hjärnan extraheras. Hjärnregioner av intresse isoleras via mikrodissektion och lyseras sedan för att extrahera protein. Lysater används sedan för både Luminex multiplexerade immunanalyser av cytokin och fosfo-proteinuttryck samt Western blot. Slutligen integreras denna holistiska datauppsättning med hjälp av en partiell regressionsanalys med minsta kvadrat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurprocedurer är godkända av Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och följde NIH: s riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur.

1. Viktminskningsmodell av mild traumatisk hjärnskada

Förbered viktfallsinställningen. Montera ett lys på en plan yta med ett 1 m styrrör (2,54 cm innerdiameter) inriktat vertikalt (kontrollera med en nivå). Använd en bult på 54 g (0,95 cm grundläggande kroppsdiameter, 2 cm huvuddiameter, 10,2 cm längd) för stöten.
Kort bedöva musen. Inducera musen med 4,5% isofluran i 100% syre i 45 sekunder. Bekräfta tillräckligt med anestesidjup genom bristen på ett tåklämsvar.
Framkalla skada.
1. Ta snabbt bort musen från anestesi och placera musen benägen på mitten av ett tunt membran (11,2 cm x 21,3 cm vävnad).
2. Använd båda händerna för att hålla vävnaden spänd med musen benägen i mitten. Fäst musens svans under en tumme. Placera mushuvudet under styrröret (figur 2).
3. Släpp bulten från toppen av styrröret på den dorsala aspekten av musens huvud, med sikte på påverkan mellan baksidan av ögonen och framsidan av öronen. Vid stötar kommer musen att tränga in i vävnaden, vilket möjliggör snabb acceleration av huvudet runt nacken (Figur 2).
Återhämtning
1. Efter stötar, placera musen liggande på en 37 ° C värmedyna i rumsluften. Övervaka återhämtningen i 1 timme efter skadan. Inom 1 timme ska möss kunna ambulera normalt, hitta mat och vatten och inte uppvisa grovmotoriska underskott.
  OBS: Analgesi används inte per godkännande av Institutional Animal Care and Use Committee, vilket är motiverat på grund av den förvirrande påverkan av analgesi på parametrarna av intresse (dvs. cerebralt blodflöde, markörer för inflammation). Medvetslöshet, definierad som tiden från avlägsnande från anestesi till tiden för att återfå rättande reflex, förväntas och varar vanligtvis från 20 s till 3 minuter (kompletterande tabell 1). Korta (<30 s) episoder av apné och / eller anfallsliknande aktivitet kan observeras, särskilt efter repetitiva huvudskador fördelade en gång dagligen.
Upprepa efter behov. Denna skada kan upprepas en gång dagligen, veckovis eller månadsvis. Antalet och avståndet mellan skador beror på önskad skadans svårighetsgrad. Vanligtvis använder vi fem träffar fördelade en gång dagligen för att inducera robusta underskott i rumslig inlärning och minne.
OBS: Tidigare studier har visat att fem träffar fördelade en gång dagligen är tillräckliga för att inducera underskott i rumslig inlärning och minne som varar över 1 år efter skada utan ödem, blödning eller synlig strukturell skada på hjärnan¹⁹. Möss vägs dagligen och övervakas noggrant för tecken på uttorkning, motoriska underskott och aptitlöshet. Om dehydreras ges möss fuktig chow och en subkutan injektion av 1 ml saltlösning en gång dagligen. För att förhindra onödigt lidande och för att säkerställa ett humant effektmått avlivas möss om: uttorkning kvarstår eller förvärras >24 timmar efter subkutan saltlösning, kroppsvikten minskar med mer än 20% från baslinjen före skadan, motoriska underskott som cirklande eller tassdragning uppträder och kvarstår >1 timme efter skada.

2. Bedömning av cerebralt blodflöde med diffus korrelationsspektroskopi

Datainsamling för DCS
1. Ta bort hår i hårbotten. Eftersom DCS fungerar bäst i frånvaro av hår är det nödvändigt att ta bort päls på huvudet innan experimenten påbörjas. Vanligtvis görs hårborttagning 1-3 dagar före studiens början.
  1. Inducera möss med 4,5% isofluran i 100% syre i 45 sekunder och behåll med 1-2% isofluran i 100% syre.
  2. Raka huvudet mellan ögonen och öronen. Använd sedan hårborttagningskräm för att ta bort päls på huvudet som i figur 3.
  3. Låt djuret återhämta sig från anestesi på en värmeplatta och återgå sedan till buret.
2. Mät cerebralt blodflöde med DCS. För att minimera rörelseartefakter under mätning, studera möss under kort isoflurananestesi.
  OBS: Visuellt övervaka andning och tå klämrespons under mätningar och justera isoflurankoncentrationen efter behov för att säkerställa konsekvent anestesidjup. Signifikanta variationer i anestesidjupet kan förändra blodflödet med tanke på de kända vasomodulerande effekterna av isofluran²⁵.
  1. Inducera med 4,5% isofluran i 100% syre i 45 sekunder och behåll sedan med 1,0-1,75% isofluran i 100% syre. Bekräfta tillräckligt med anestesidjup genom frånvaro av ett tåklämsvar och normal andning (mellan ~ 60-80 andetag per minut).
  2. Efter en 2 minuters stabiliseringsperiod vilar du försiktigt DCS-sensorn över den högra halvklotet så att den optiska sensorns övre kant ligger i linje med ögats baksida och sensorns sida ligger längs mittlinjen (figur 3). Kupa en hand över sensorn för att skydda mot rumsljus. Hämta 5 sekunders data (1 Hz förvärv).
  3. Flytta sensorn över vänster halvklot och hämta 5 sekunders data.
  4. Upprepa 3 gånger / halvklot för att ta hänsyn till lokala heterogeniteter under vävnadsytan.
3. Återhämtning
  1. Ta bort musen från anestesi och lägg på en värmeplatta.
  2. När musen återfår sin rättningsreflex, återför den till buret.
DCS-dataanalys
1. Utför inledande kvalitetskontroll. Varje bildruta med DCS-data består av en uppmätt autokorrelationsfunktion med normaliserad intensitet (figur 4A) och fotonantalshastighet (kHz).
  1. För att ta bort dataramar med betydande rörelseartefakt, kassera dataramar för vilka medelvärdet av kurvans svans (dvs . ) är > 1.005.
  2. Om du vill ta bort dataramar med dåligt signal-brusförhållande kasserar du dataramar om den detekterade fotonantalshastigheten är < 20 kHz.
2. Extrahera cerebralt blodflödesindex. Använd fminsearch i Matlab, passa varje i^th uppmätt dataram för CBF_i (i). Begränsa passformer till , och hitta värdet på_{CBF i} som minimerar följande kostnadsfunktion:
  
  Om summan är över alla uppmätta fördröjningstider, och är den halvoändbara homogena lösningen av korrelationsdiffusionsekvationen (figur 4B):
  
  Här är β en koherensfaktor bestämd av den experimentella uppsättningen, , , , , R_eff = 0,493 för ett antaget vävnadsindex för brytning på 1,4, ρ är 6 mm och μ_a och μ är vävnadens absorptions- och reducerade _{spridningskoefficient} (antas vara 0,25 respektive 9,4 / cm^{, 10,26,27}).
  OBS: Eftersom β kan variera ~ 10% över tiden, passa varje dataram för β och CBF_i samtidigt.
3. Utför sekundär kvalitetskontroll. Inom varje repetition (som består av 5 dataramar), kassera avvikande värden. Extremvärden definieras som de CBF_i-värden som faller utanför 1,5 standardavvikelser från medelvärdet CBF_i för den upprepningen. Om mer än 1 datapunkt identifieras som ett avvikande objekt ignorerar du hela upprepningen.
4. Uppskatta genomsnittligt cerebralt blodflödesindex: Uppskatta ett genomsnittligt CBF_i per halvklot genom att ta medelvärdet över alla dataramar för alla repetitioner (Figur 4C). Om inga signifikanta halvsfäriska skillnader observeras, genomsnitt över halvklotet för att få en uppskattning av genomsnittlig global CBF_i.

3. Multiplexerad kvantifiering av cytokiner och fosfoproteiner med hjälp av luminexanalyser

Vävnad extraktion
OBS: Kvantifiering av hjärncytokiner och fosfosignalerande proteiner med Luminex kräver vävnadsextraktion.
1. Bedöva musen med 4,5% isofluran i 100% syre i 1-2 min. Kontrollera om det finns ett djupt anestesiplan via bristen på ett tåklämsvar. Avliva via halshuggning.
2. Skörda vävnaden.
  1. Ta bort hjärnan. Vanligtvis fixar du vänster halvklot för histologi och mikrodissekerar flera regioner från höger halvklot inom cortex och hippocampus (Figur 5).
  2. Placera dissekerade prover i mikrocentrifugrör, blixtfrys i flytande kväve. För analys av fryskänsliga proteiner är det optimalt att dela upp vävnadssektioner före blixtfrysning för att undvika senare frys-tina.
    OBS: Protokollet kan pausas och vävnadsprover kan förvaras vid -80 ° C tills de är redo att lysa prover. Alternativt kan prover lysas och sedan förvaras vid -80 °C.
3. Lysprover.
  1. Förbered lysbufferten genom att tillsätta proteashämmare och 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid till lysbufferten.
  2. Tillsätt 150 μL av den blandade lysbufferten per cirka 3 μg djurvävnad. Som referens är musens visuella cortexvävnadsprover cirka 3 μg.
  3. För att homogenisera vävnaden, triturera vävnaden mekaniskt genom att pipettera upp och ner ~ 15-20 gånger med en 1000 μL pipett. För optimal provtrianturering kan en homogenisatorstöt användas.
  4. Placera provrören på en rotator i 30 minuter vid 4 °C.
  5. Centrifugera proverna vid 4 ° C i 10 minuter vid cirka 15 000 x g och samla supernatanten. Prover får behandlas omedelbart eller lagras vid -80 °C för vidare analys.
    OBS: Provlysat framställda med hjälp av detta protokoll är kompatibla med Western blot, från vilken fagocyten / mikrogliamarkören Iba1 och / eller astrocytaktiveringsmarkören GFAP kan analyseras för att komplettera cytokin- och fosfoproteinanalys för neuroinflammationsstudier¹¹.
Multiplex immunanalysprotokoll för cytokiner och fosfoproteiner
OBS: Även om det är liknande totalt sett finns det några mindre skillnader i protokollen för cytokin och fosfoproteinsatser. Skillnader noteras i varje steg. Stegen för att förbereda prover för Luminex-analysen beskrivs nedan.
1. Framställning av reagenser (dag 1, samma för cytokiner och fosfoproteiner)
  1. Låt reagenserna värmas till rumstemperatur (~ 30 min).
  2. Sonicate multiplex magnetiska pärlor flaska i 30 sekunder följt av 1 min virvel. Se till att multiplexmagnetiska pärlor är skyddade från ljus med aluminiumfolie eller använd medföljande ljusskyddande flaskor.
  3. Förbered tvättbufferten genom att blanda 0,1% Tween20 i 1xPBS eller alternativt använda tvättbufferten i satsen.
2. Beredning av lyserade vävnadsprover (dag 1, samma för cytokiner och fosfoproteiner)
  1. Om det tidigare frysts, ta bort lyserade vävnadsprover från frysen och låt tina på is (~ 20 min). Centrifugprover i 10 min vid 9 167 x g för att avlägsna fällning.
  2. Förbered 25 μL prov vid den optimala proteinkoncentrationen som bestäms genom linjär intervallanalys (se avsnitt 3.3). För att normalisera den totala volymen för alla prover, späd ut prover i analysbuffert som finns i satsen.
3. Beredning av 96 brunnsplattor (dag 1, samma för cytokiner och fosfoproteiner)
  1. Använd 96 brunnsplattan som ingår i satsen eller en med en tunn botten (t.ex. Brand Tech).
  2. Tillsätt 200 μL tvättbuffert (eller 1x PBS, 0,1% Tween) i varje brunn och blanda på tallriksskakare i 10 min vid 750 rpm.
  3. Dekantera tvättbufferten och knacka på plattan på en pappershandduk för att ta bort rester.
4. Immunanalysförfarande för cytokiner (dag 1)
  1. Lägg till följande till varje brunn i ordning.
    1. Tillsätt 25 μL analysbuffert till alla brunnar.
      1. Tillsätt 25 μL ytterligare analysbuffert ENDAST till bakgrundsbrunnar. För varje experimentell körning, ha minst två bakgrundsbrunnar. Bakgrundsbrunnar har inget prov laddat och definierar den fluorescerande intensiteten som läses av instrumentet utan prov.
      2. Tillsätt 25 μL av varje utspätt prov till motsvarande provbrunnar.
      3. Tillsätt 25 μL 1x multiplexmagnetiska pärlor till alla brunnar (Figur 6). Var noga med att virvla pärlor i 1 min innan du lägger till brunnar.
  2. Försegla plattan med plattförseglare och täck plattan med aluminiumfolie. Inkubera över natten (12-16 h) vid 2-8 ° C.
5. Immunanalysförfarande för cytokiner (dag 2)
  1. Placera 96 brunnsplattan på magnetisk separator och se till att brunnarna är i linje med magneterna. Låt sitta i 2 min. Dekantera brunnsinnehållet medan plattan fortfarande är fäst vid magnetavskiljaren.
  2. Tvätta plattan 2 gånger med följande steg.
    1. Tillsätt 200 μL tvättbuffert till varje brunn och lägg på shaker i 2 min vid rumstemperatur.
    2. Placera brunnsplattan på magnetavskiljaren i 2 minuter vid rumstemperatur.
    3. Dekantera brunnsinnehållet medan brunnsplattan fortfarande är fäst vid magnetisk separator.
  3. Tillsätt 25 μL detektionsantikropp per brunn (Figur 6). Täck med folie. Inkubera i 1 timme på en plattskakare (750 rpm) vid rumstemperatur.
  4. Lämna detektionsantikroppen i och tillsätt 25 μL streptavidin-fykoerytrin (SAPE) till varje brunn (figur 6). Täck med folie. Inkubera i 30 min på plattskakaren (750 rpm) vid rumstemperatur.
  5. Placera brunnsplattan på en magnetisk separator och låt sitta i 2 min. Dekantera brunnsinnehållet och lossna från magnetisk separator.
  6. Tvätta brunnsplattan två gånger (se steg 3.2.5.2).
  7. Tillsätt 75 μL Luminex Drive Fluid (om du använder MAGPIX-instrument) till varje brunn eller analysbuffert (om du använder 200 eller FlexMap 3D-instrument). Häng upp pärlorna på tallriksskakaren igen i 5 min vid rumstemperatur.
  8. Läs vidare Luminex Instrument (MAGPIX, 200 eller FlexMap 3D), med hänvisning till användarhandboken för korrekt drift (Figur 6).
6. Immunanalysförfarande för fosfoproteiner (dag 1)
  1. Lägg till följande till varje brunn i ordning.
    1. Tillsätt 25 μL analysbuffert till alla brunnar.
      1. Tillsätt 25 μL ytterligare analysbuffert ENDAST till bakgrundsbrunnar. För varje experimentell körning rekommenderas att du har minst två bakgrundsbrunnar. Bakgrundsbrunnar har inget prov laddat och definierar den fluorescerande intensiteten som läses av instrumentet utan prov.
      2. Tillsätt 25 μL av varje utspätt prov till varje provbrunn.
      3. Tillsätt 25 μL 1x multiplexmagnetiska pärlor till alla brunnar (Figur 6).
        OBS: Luminex analyssats ger multiplex magnetisk pärla i 20x lagerlösning. Var noga med att virvla 20x lager multiplex magnetisk pärllösning i 2 min och späd den sedan i analysbuffert till 1x lösning. Vortex 1x multiplex magnetisk pärlsuspension i 1 min innan den läggs till brunnar.
    2. Försegla plattan med plattförseglare och täck plattan med aluminiumfolie. Inkubera över natten (12-16 timmar) vid 2-8 °C.
7. Immunanalysförfarande för fosfoproteiner (dag 2)
  1. Placera brunnsplattan på en magnetisk separator och se till att brunnsplattan är helt i linje med magnetavskiljaren. Låt sitta i 2 min. Dekantera brunnsinnehållet medan brunnsplattan fortfarande är fäst vid magnetavskiljaren.
  2. Tvätta plattan 2 gånger (se steg b i cytokinets immunanalysprocedur dag 2).
  3. Späd 20x lagerdetekteringsantikroppen till 1x lösning i analysbuffert. Tillsätt 25 μL 1x detektionsantikropp per brunn (Figur 6). Täck med folie. Inkubera i 1 timme på plattskakare (750 rpm) vid rumstemperatur.
  4. Placera 96-brunnsplattan på magnetavskiljaren och låt sitta i 2 minuter. Dekantera brunnsinnehållet, lossna från magnetavskiljaren.
  5. Späd ut 25x lager SAPE i analysbuffert till 1x buffert. Tillsätt 25 μL 1x SAPE (figur 6). Täck med folie och inkubera i 15 min på plattskakaren (750 rpm) vid rumstemperatur.
  6. Lämna SAPE i brunnar och tillsätt 25 μL förstärkningsbuffert till varje brunn. Täck med folie.
  7. Inkubera i 15 min på plattskakare (750 rpm) vid rumstemperatur.
  8. Placera brunnsplattan på magnetavskiljaren i 2 min. Dekantera brunnsinnehållet och lossa från magnetavskiljaren.
  9. Tillsätt 75 μL Luminex Drive Fluid (om du använder MAGPIX-instrument) eller analysbuffert (om du använder 200- eller FlexMap 3D-instrument). Häng upp pärlorna på en tallrikskakare i 5 minuter vid rumstemperatur.
  10. Läs vidare Luminex-instrumentet (MAGPIX, 200 eller FlexMap 3D), med hänvisning till användarhandboken för korrekt drift (figur 6).
Linjäritet av provutspädningskurva
1. Beredning av prover: Seriellt utspädda testprover med olika koncentration av totalt protein. För bulk hjärnvävnader, ladda seriella utspädningar från 0-25 μg för cytokiner och 0-12 μg för fosfoproteiner. Total proteinkoncentration kan mätas med hjälp av bicinchoninsyra (BCA) analys.
2. Multiplex immunanalys: Utför Luminex-analysen (se avsnitt 3.2) på utvalda prover.
3. Dataanalys
  1. Plotta fluorescerande intensitet för varje protein kontra mängden protein som laddas (Figur 7).
  2. För varje analyt, identifiera intervallet av totalt protein laddat för vilket förhållandet mellan totalt protein och fluorescerande intensitetsavläsning är linjärt (Figur 7).
  3. För att bestämma mängden totalt protein som ska laddas för hela analyskörningen, identifiera den linjära delen av kurvan för varje analyt och välj sedan en proteinkoncentration som faller inom det linjära intervallet för majoriteten av analyterna.
    OBS: Även om de flesta proteiner delar ett liknande linjärt intervall, kan de linjära intervallen inte överlappa för alla proteiner. Om så är fallet kan det vara nödvändigt att köra varje prov flera gånger med olika mängder totalt protein laddat. Alternativt kan icke-linjära prover utelämnas från analysen. Dessutom kan vissa proteiner inte ha ett linjärt intervall alls.

4. Partiell regression med minsta kvadrat

OBS: Exempel på R-kod och ett exempeldatakalkylblad tillhandahålls för att utföra den partiella minsta kvadratanalysen.

Förberedelse av data: Formatera data enligt det angivna kalkylbladet för exempeldata, "MyData". Inkludera variabelnamn på rad 1, exempelnamn i kolumn A, svarsvariabeln i kolumn B och alla prediktorvariabler i kolumnerna C+. Fyll i de två sista raderna med bakgrundsdata och ange båda exempelnamnen till "Bakgrund".
Delvis minsta kvadratregression i RStudio
1. Installera R från www.r-project.org (gratis, öppen källkod).
2. Installera RStudio Desktop från www.rstudio.com (gratis licens med öppen källkod).
3. Ladda ned R-exempelkoden som medföljer den här publikationen, "PLSR_Sample_Code.R" och spara den i samma mapp som innehåller datakalkylbladet. Öppna kodfilen i RStudio.
4. I avsnittet Användarinmatning ändrar du "dataFileName" till namnet på datakalkylbladet.
5. Utför följande steg genom att markera det kodavsnitt som ska köras och klicka på Kör i det övre högra hörnet av skriptet.
  1. Ladda nödvändiga R-paket, funktioner, arbetskatalogadressen och användarinmatningsvärden i RStudio (underavsnitt "Förberedelser").
  2. Ladda data i RStudio och förbered rådata för bearbetning genom att subtrahera genomsnittlig bakgrundssignal från alla mätningar och z-poängsätta varje analyt (underavsnitt "Läs data och subtrahera bakgrund")(Figur 8A).
  3. Utför partiell regression av minsta kvadrater i RStudio med hjälp av plsRglm-paketet v1.2.5²⁸ som finns tillgängligt på Comprehensive R Archive Network (CRAN). Utför en varimaxrotation (statistikpaket v3.6.2)²³ i LV1-LV2-planet för att identifiera en ny horisontell axel som bäst separerar prover med svarsvariabeln (underavsnitt "PLS")(Figur 8B).
  4. Utför en Leave One Out Cross Validation (LOOCV) där ett prov iterativt utelämnas från data och PLSR-modellen beräknas om. Beräkna standardavvikelse för analytinläsningar över alla LOOCV-körningar (underavsnitt "LOOCV").
Skapa representativa diagram: Kör den angivna exempelkoden enligt ovan för att skapa representativa diagram som automatiskt exporteras som pdf-filer till arbetskatalogen (mappen som innehåller data- och kodfilerna).
1. Skapa en värmekarta över bearbetade data som visas i figur 8A (underavsnitt "PLS"). Färglägg varje post längs ett spektrum som definieras av z-poäng. Sortera analyter efter den ordning som beräknas i den latenta variabeln av intresse.
2. Skapa ett poängdiagram med LV1-poäng ritade längs den horisontella axeln och LV2-poäng ritade längs den vertikala axeln, som visas i figur 8B (underavsnitt "PLS"). Färglägg varje datapunkt enligt dess svarsvariabelmätning för att visualisera förhållandet mellan varje latent variabel och svarsvariabeln.
3. Skapa ett stapeldiagram som visar inläsningar för var och en av dina prediktorvariabler för att visualisera hur varje analyt bidrar till de latenta variablerna, som visas i figur 8C (underavsnitt "LOOCV").
4. Skapa ett diagram som regresserar LV1-poäng mot din svarsvariabel för att visualisera hur väl PLSR-modellen separerar proverna, som visas i figur 8D (underavsnitt "PLS").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidigare insamlade data togs från tidigare arbete där en grupp på åtta C57BL/6-möss utsattes för tre slutna huvudskador (figur 2) fördelade en gång dagligen¹¹. I detta arbete mättes cerebralt blodflöde med diffus korrelationsspektroskopi 4 timmar efter den senaste skadan (figur 3, figur 4). Efter CBF-bedömning efter skada avlivades djuren och hjärnvävnad extraherades för kvantifiering av cytokiner och fosfoproteiner via immunanalys (figur 5). Vi kvantifierade också fagocyten/mikrogliaaktiveringsmarkören Iba1 via Western blot (metoder som beskrivs i¹¹). Hjärnvävnad från varje mus lysades och den totala proteinkoncentrationen mättes med hjälp av en BCA-analys. Multiplexerad cytokinkvantifiering utfördes med hjälp av Milliplex MAP Mouse Cytokine/Chemokine 32-Plex, som lästes med hjälp av ett Luminex MAGPIX-system (Figur 6). En linjär intervallanalys genomfördes för att bestämma en lämplig proteinbelastning (12 μg protein per 12,5 μL lysat) (figur 7) innan data från alla prover samlades in.

Cytokindata förbereddes för analys genom att subtrahera bakgrundsmätningar från provdata och sedan z-poängdata för varje analyt (figur 8A). En värmekarta genererades från z-poängade data för att visualisera skillnader i cytokinuttryck bland djur. Partial Least Squares Regression (PLSR) utfördes med hjälp av fagocyten/mikrogliaaktiveringsmarkören Iba1 som svarsvariabel och cytokinmätningar som prediktorvariabler (figur 8B). En varimaxrotation utfördes för att maximera samvariansen av data på LV1 med Iba1-mätningarna (figur 8D). Höga belastningsvikter i LV1 (figur 8C) motsvarar det cytokinuttryck som är mest förknippat med högt uttryck av Iba1. Linjära regressioner mellan Iba1 och cytokiner visar att de cytokiner med de största belastningsvikterna i LV1 också var statistiskt signifikanta (figur 8E).

Bild 1: Typiskt arbetsflöde. Först genomgår möss en viktfall stängd huvudskada, och sedan mäts cerebralt blodflöde (CBF) med diffus korrelationsspektroskopi. Därefter samlas hjärnor, regioner av intresse mikrodissekeras och fryses med flytande kväve. Som förberedelse för Luminex-immunanalysen lyseras proteiner och den totala proteinkoncentrationen mäts genom bicinkoninsyraanalys. Lysater används för western blot av proteiner av intresse och Luminex-analyser för cytokiner och fosfoproteiner. Data från CBF, Western blot och Luminex integreras med hjälp av partiell minsta kvadratregression (PLSR). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Viktfallsmodell med slutet huvud av mild traumatisk hjärnskada. (A) Den sövda musen grips av svansen och placeras på ett spänt offermembran under ett styrrör. En vikt på 54 g sjunker från 1 m till huvudets dorsala aspekt. (B) Inom ~ 1 ms efter stöten har musens huvud snabbt roterat runt halsen när det bryter igenom offermembranet. (C) Inom ~ 5 ms efter kollisionen har hela musen fallit och hänger i sin greppade svans. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Mätning av cerebralt blodflöde med diffus korrelationsspektroskopi. (A) En optisk sensor hålls försiktigt manuellt över höger halvklot för att mäta blodflödet i en sövd mus. (B) Representativ sensorplacering på höger halvklot. Sensorns kontur representeras som en streckad svart rektangel, och placeringen av käll- och detektorfibrerna är i röda respektive blå cirklar. Sensorn är placerad så att sensorns korta kant ligger i linje med ögats baksida och sensorns långa kant är i linje med mittlinjen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Diffus korrelationsspektroskopi dataanalys. (A) Representativa autokorrelationskurvor med uppmätt intensitet, g₂(τ), vid baseline, baslinjen före skada (grön) och 4 timmar efter 5 slutna huvudskador fördelade en gång dagligen (lila). Den högra förskjutningen i kurvan från före till efter skada återspeglar en minskning av blodflödet. (B) g Equation (τ)-data förvärvas vid 1 Hz i 5 s per halvklot och upprepad 3x/halvklot. Varje uppmätt g (τ) kurva är lämplig för den halvoändligt lösningen till korrelationsdiffusionsekvationen för ett cerebralt blodflödesindex (CBF_i). (C) CBF_i-värden över alla ramar och repetitioner är i genomsnitt för att erhålla medelvärdet för cerebralt blodflödesindex för varje halvklot (betecknat med horisontell svart stapel). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Mikrodissektion av mushjärnan. (A) Efter att hjärnan har extraherats från musen skärs den längs den streckade linjen. Den vänstra halvklotet är fixerad för histologi, och den högra halvklotet är mikrodissekerad för patologi. (B) Sagittal syn på cortex på höger halvklot. Den högra halvklotet mikrodissekeras i motsvarande färgkodade regioner. För analys av fryskänsliga proteiner är det optimalt att dela upp vävnadssektioner före blixtfrysning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Illustration av Luminex-proceduren. (A) Tillsätt prover till fluorescerande märkta pärlor. Pärlor är förbelagda med en specifik infångningsantikropp för varje protein av intresse. (B) Tillsätt biotinylerade detektionsantikroppar. Biotindetektionsantikroppar binder till analyterna av intresse och bildar en antikropps-antigensmörgås. (C) Tillsätt fykoerytrin (PE)-konjugerat streptavidin (SAPE). SAPE binder till de biotinylerade detektionsantikropparna och fullbordar reaktionen. För fosfoproteiner tillsätts en amplifieringsbuffert (endast för fosfoproteinanalyser) efter tillsatsen till SAPE för att förbättra analyssignalen. (D) Luminex-instrumentet (MAGPIX, 200 eller FlexMap 3D) läser av reaktionen på varje fluorescerande taggad pärla via en kombination av röd/grön belysning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7: Illustration av provutspädningskurvan för att identifiera det linjära intervallet. Proteinkoncentration av seriellt utspädda prover jämfört med fluorescerande intensitet mätt från Luminex-analysen. Det linjära intervallet definieras som proteinkoncentrationsområdet för vilket förhållandet mellan proteinkoncentrationen och fluorescerande intensitet är linjärt (pil). I vissa analyter kan ökning av proteinkoncentrationen utöver en viss gräns minska antikroppsbindningen så att utspädningskurvan blir icke-linjär eller inverterad (Hook-effekt). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 8: Representativ partiell MINSTA KVADRATREGRESSIONSANALYS (PLSR). (A) Panelcytokinproteinuttryck (vänster kolumner) tillsammans med Iba1-uttryck (höger kolumn) i 3xCHI-möss (n = 8, z-poäng). (B) PLSR tilldelar vikter (belastningar) till uppmätta cytokiner för varje latent variabel. Vikter tillämpas på uppmätta data för att beräkna poäng för varje prov på varje latent variabel. (C) PLSR för 3xCHI-prover mot Iba1 identifierade en viktad profil av cytokiner, LV1, som utmärkte prover av Iba1. Cytokiner med negativa vikter uppreglerades i prover med låg Iba1 medan cytokiner med positiva vikter uppreglerades i prover med hög Iba1 (medelvärde ± SD med användning av en LOOCV). (D) Linjär regression av LV1-poäng för varje prov mot Iba1. R²_PLS mäter passformens godhet mellan Iba1 och LV1. (E) Individuella regressioner av Iba1 mot var och en av de cytokiner som har de största vikterna i LV1 i C. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi metoder för bedömning av det hemodynamiska och neuroinflammatoriska svaret på repetitiv mild traumatisk hjärnskada. Vidare har vi visat hur man integrerar dessa data som en del av en multivariat systemanalys med partiell minsta kvadratregression. I texten nedan kommer vi att diskutera några av de viktigaste stegen och begränsningarna i samband med protokollet samt fördelarna / nackdelarna med metoderna jämfört med befintliga metoder.

Viktminskningsmodell av mild traumatisk hjärnskada. Denna metod för traumatisk hjärnskadeinduktion är fördelaktig eftersom den har trubbig påverkan följt av snabb främre-bakre rotationsacceleration som vanligtvis ses vid sportrelaterade huvudskador^10,19. Visst, den lissencefaliska mushjärnan rekapitulerar inte helt komplexiteten i den gyrocephaliska mänskliga hjärnan; Ändå inducerar denna modell många av samma kliniska och beteendemässiga följder av mänsklig mTBI, inklusive ihållande underskott i rumsligt lärande och minne med upprepade skador. Dessutom, medan påverkan är mild till sin natur (ingen strukturell / neuronal skada, ingen blodhjärnbarriärpermeabilitet, kognitiva underskott som uppstår först efter flera träffar, ^etc.19), inducerar den betydande medvetslöshet, i motsats till människor där medvetslöshet är mindre vanligt. Denna ökade medvetslöshet kan bero på en interaktion med anestesin som ges omedelbart före påverkan, även om den exakta orsaken inte är väl förstådd. Slutligen noterar vi att det är kritiskt att anpassa styrröret så att bulten påverkar mellan koronala och lamdoidsuturer. Vi har observerat att effekter som är mer bakre kan orsaka betydande motoriska underskott som kräver eutanasi.

Bedömning av cerebralt blodflöde med diffus korrelationsspektroskopi. Icke-invasiva, longitudinella mätningar av cerebralt blodflöde (CBF) med traditionella modaliteter som används i studier på människa /stora djur, såsom perfusionsmagnetisk resonanstomografi eller transkraniell dopplerultraljud, är utmanande hos möss av olika skäl, inklusive liten hjärnstorlek och total blodvolym²⁹. Diffus korrelationsspektroskopi är väl lämpad hos möss och erbjuder de extra fördelarna med att vara icke-invasiv och relativt billig jämfört med andra modaliteter^20,30. Eftersom DCS är känsligt för rörelseartefakter måste möss kort bedövas eller begränsas³¹ för bedömning. Vi använder vanligtvis isoflurananestesi på grund av dess snabba induktion och återhämtning; Isofluran är dock en cerebral vasodilatator, och blodflödesuppskattningar under isofluran bör tolkas med försiktighet. Minskningar i blodflödet som ses efter skada jämfört med skamskadade djur kan förväxlas av att den skadade cerebrala vaskulaturen misslyckas med vasodilat som svar på isofluran. Slutligen har vi tidigare visat utmärkt repeterbarhet inom användaren av blodflödesmätningar med DCS hos möss men endast rättvis repeterbarhet inom användaren²¹. Av denna anledning rekommenderar vi att samma operatör förvärvar DCS-mätningar för experiment som kräver longitudinell bedömning av cerebralt blodflöde.

Multiplexerad kvantifiering av cytokiner och fosfoproteiner med användning av Luminex-analyser. En viktig utmaning med någon ELISA är Hook-effekten, varigenom ökad proteinkoncentration kan minska antikroppsaffiniteten för målproteinet, vilket leder till minskad analyssignal som svar på ökat protein³² (Figur 7). Denna effekt kan förvärras vid analys av hela vävnader, där bulkproteiner på samma sätt kan störa. Således är det första steget i att använda Luminex-analyser att avgöra om det finns en rad proteinkoncentrationer laddade för vilka analysen läses ut linjärt varierar med mängden protein som laddas. Analyter som inte har ett sådant linjärt intervall (figur 7) bör uteslutas från analysen. Vi noterar också att cytokinnivåerna i hjärnan vanligtvis är mycket låga och uppträder nära den nedre detektionsgränsen som bedöms via standardkurvor som levereras med Luminex-satsen. Av denna anledning är det viktigt att genomföra linjär avståndsanalys för att avgöra om instrumentavläsningen verkligen återspeglar mängden prov som laddas. För nyckelproteiner av intresse kan denna linjära intervallanalys kompletteras med en spikåtervinningsanalys där rekombinant protein spikas in i ett prov och linjäriteten i instrumentavläsningen utvärderas³³.

Eftersom neuroinflammation regleras av olika intracellulära fosfoproteiner och extracellulära cytokiner är det viktigt att samtidigt mäta ett brett spektrum av dessa proteiner för att förstå hjärnans neurala immunsvar mot mTBI. Luminex multiplexerade immunanalyser möjliggör samtidig kvantifiering av dussintals cytokiner och fosfoproteiner från ett enda prov, vilket ger en helhetsbild av vävnadens immunsvar efter skada. Även om dessa analyser ger en bred bild av cytokiner/kemokiner samt fosfoproteiner, kvantifierar analysen den totala mängden av varje protein från ett vävnadshomogenat. Således ger det inte celltypsspecifika data. Celltypsspecificitet kan bestämmas genom uppföljande immunohistokemi för att identifiera lokalisering av toppproteiner av intresse med markörer för celltyper (t.ex. neuroner, mikroglia, astrocyter etc.) ¹¹.

Partiell regressionsanalys med minsta kvadrat för dataintegrering. Vävnadssvaret på mTBI är multifaktoriellt, bestående av fysiologiska förändringar i blodflödet tillsammans med förändringar i fagocyten/mikrogliaaktiveringsmarkören Iba1, olika cytokiner och fosfoproteiner, bland andra¹¹. På grund av den multiplexerade karaktären hos de insamlade uppgifterna behövs en systematisk metod för att redogöra för multidimensionaliteten i relationerna mellan de olika prediktorvariablerna. PLSR ger en lämplig lösning på detta problem genom att identifiera LV som maximalt identifierar samvariansen mellan prediktorvariablerna och utfallsvariabeln (t.ex. Iba1 i figur 8). Viktigt är att de proteiner som visat sig starkt korrelera med prediktorvariabeln (dvs. de med höga belastningar på LV1) ofta korrelerar också i den univariata regressionsanalysen (figur 8E). Eftersom PLSR ofta används för att anpassa ett stort antal prediktorvariabler till ett mindre antal prover som i figur 8, är det viktigt att få en förståelse för känsligheten hos vikterna på LV1 för enskilda prover. För ett litet antal prover (<10) är LOOCV användbart för att bedöma vikternas känslighet (anges via SD-felstaplar i figur 8C). För ett större antal prover kommer det att vara viktigt att bedöma känsligheten genom att lämna flera prover åt gången med hjälp av en Monte Carlo-delprovtagningsmetod³⁴. Vi hänvisar läsaren till Multi and Megavariate Data Analysis²⁴ för en djupgående diskussion om PLSR-metoder och användningsområden. Slutligen noterar vi att en viktig begränsning av denna typ av analys är att den är rent korrelativ. PLSR bevisar inte ett mekanistiskt förhållande mellan prediktorvariabler och utfallsvariabeln. Vi ser PLSR som ett värdefullt hypotesgenererande tillvägagångssätt som används för att föreslå dragbara mål för att modulera i framtida experiment som etablerar orsakssamband.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Detta projekt stöddes av National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) och R01 NS115994 (LBW / EB) och Children's Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Detta arbete stöddes också av det amerikanska försvarsdepartementet genom congressionally Directed Medical Research Programs under Award No. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Åsikter, tolkningar, slutsatser och rekommendationer är författarens och stöds inte nödvändigtvis av försvarsdepartementet. Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. 1937971. Alla åsikter, resultat och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis National Science Foundations åsikter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable pipettes			any adjustable pipette
Aluminum foil	VWR	89107-726
Bio-Plex cell lysis kit	C Bio-Rad	171304012
BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile	BrandTech	781602 96
Complete mini protease inhibitor tablet	Sigma-Aldrich	11836153001
Depilatory cream	Amazon	Nair
DiH2O	VWR	VWRL0200-1000
Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates	Millipore Sigma Catalogue	40-285
Hardware Autocorrelator Board	www.correlator.com	Flex05-8ch
Isoflurane 250 mL	MED-VET INTERNATIONAL	RXISO-250
Kimwipe (11.2 x 21.3 cm)	VWR	21905-026
Laboratory vortex mixer	VWR	10153-838
LabView	National Instruments	LabVIEW
Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software	Luminex Corporation
Luminex Drive Fluid	Luminex	MPXDF-4PK
Luminex sheath fluid	EMD Millipore	SHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay	Millipore Sigma	MCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay	Millipore Sigma	48-660MAG
Mini LabRoller rotator	VWR	10136-084
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626-1G
Phosphate-buffered Saline (PBS)	VWR	97064-158
Plate Sealer	VWR	82050-992
Polypropylene microfuge tubes	VWR	20901-547
Mini LabRoller	Millipore Sigma	Z674591
Reagent Reservoirs	VWR	89094-668
R Programming Language
RStudio	www.rstudio.com
Sonicator
Titer plate shaker	VWR	12620-926
Tween20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
1 m acrylic guide tube	McMaster-Carr	49035K85
4 photon counting avalanche photodiode	Perkin-Elmer	SPCM-AQ4C-IO
400 um multimode source fiber	Thorlabs Inc.	FT-400-EMT
54 g bolt	Ace Hardware		0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length
780 nm single mode detector fiber	Thorlabs Inc.	780HP
852 nm long-coherence length laser	TOPTICA Photonics	iBeam smart

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , National Academies Press (US). Washington (DC). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169016/ (2014).
Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).
Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury--part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).
Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).
Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).
Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
Bertrand, F., Maumy-Bertrand, M. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019).
White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322 (2011).
Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).
Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).

Neuroscience

Systemanalys av det neuroinflammatoriska och hemodynamiska svaret på traumatisk hjärnskada

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.