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중환자실 유형 장치를 통해 급성 호흡 곤란 증후군의 돼지 모델에서 할로겐화 에이전트 납품

Published: September 24, 2020 doi: 10.3791/61644
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 2, 2, 2, 1, 1,2, 1, 3, 2,4, 1,2,5
1Department of Perioperative Medicine, CHU Clermont-Ferrand, 2GReD, CNRS, INSERM, Université Clermont Auvergne, 3GRC 29, AP-HP, DMU DREAM, Department of Anesthesiology and Critical Care, Pitié-Salpêtrière Hospital, Sorbonne University, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, CHU Clermont-Ferrand, 5Division of Allergy, Pulmonary, and Critical Care Medicine, Vanderbilt University Medical Center

Summary

우리는 흡입 집중 치료 포화에 사용되는 장치를 통해 할로겐화 제, 이소플루란 및 세보플루란으로 체레이션을 받는 돼지에서 염산 유발 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 모델을 설명합니다. 이 모형은 폐 상해 및 수리에 할로겐화한 에이전트의 생물학 기계장치를 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Abstract

급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)은 중증 환자의 저혈 호흡 부전 및 사망의 일반적인 원인이며 효과적인 치료법을 찾아야할 필요성이 있습니다. 전임상 연구에 따르면 흡입한 할로겐화 제는 ARDS의 동물 모델에 유익한 효과가 있을 수 있습니다. 현대 중환자실(ICU) 인공호흡기를 사용하여 할로겐화 한 에이전트를 투여하는 새로운 장치의 개발은 ICU 환자에게 할로겐화 한 제제의 분배를 크게 단순화시켰습니다. 이전 실험 및 임상 연구는 폐 폐포 상피 손상 및 염증, ARDS 동안 확산 폐포 손상의 두 병원 생리적 랜드 마크, 등 할로겐 휘발성의 잠재적 인 이점을 제안하기 때문에, 우리는 폐 손상및 수리에 할로겐화 제의 효과의 메커니즘을 이해하기 위해 동물 모델을 설계. 전신 마취, 기관 삽관 및 기계적 환기의 개시 후, ARDS는 염산내 주입을 통해 돼지에서 유도되었다. 그 후, 돼지는 ICU 형 장치를 사용하여 흡입된 세보플루란 또는 이소플루란으로 진정되었고, 동물들은 4시간 동안 폐 보호 기계 환기로 환기되었다. 연구 기간 동안 혈액 및 폐포 샘플은 동맥 산소화, 폐포 모세관 막의 투과성, 폐포 유체 클리어런스 및 폐 염증을 평가하기 위해 수집되었습니다. 기계적 환기 파라미터도 실험 전반에 걸쳐 수집되었다. 이 모델은 변경 된 폐포 모세관 투과성으로 동맥 산소의 현저한 감소를 유도했지만 재현 할 수 있으며 빠른 발병, 시간이 지남에 따라 좋은 안정성 및 치명적인 합병증이 특징입니다.

우리는 임상 ARDS의 생리적, 생물학적 및 병리학적 특징의 대부분을 재현하는 산 포부의 돼지 모델을 개발했으며, 흡입된 ICU 체조에 사용되는 장치를 통해 전달된 할로겐화 제의 잠재적인 폐 보호 효과에 대한 이해를 증진시키는 데 도움이 될 것입니다.

Introduction

급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)은 중증 환자에서 저산소 호흡 부전 및 사망의 일반적인 원인1이다. 확산폐포상피상피성 및 내피손상이 모두 특징이며, 투과성 및 폐부종, 변경된 폐포유체 통관(AFC), 및 악화된 호흡 곤란2로이어진다. ALVeolar 부종의 재흡수 및 ARDS에서 의 회수는 AFC를 개선하는 치료가 유용 할 수 있음을 시사 폐포를 통해 상피 유체 수송을 필요로3,4. 폐 보호 환기 및 정맥 내 유체 요법을 위한 제한적인 전략이 결과2,5를개선하는 데 유익한 것으로 입증되었지만, 여전히 높은 사망률 및 이환율6과관련이 있다. 따라서 증후군에 대한 효과적인 치료법을 개발하고 그러한 치료법이 효과가있는 정확한 메커니즘을 더 잘 이해할 필요가 있습니다.

이소플루란이나 세보플루란과 같은 할로겐 마취제는 수술실에서 전신 마취에 널리 사용되어 왔습니다. Sevoflurane는 흉부 수술을 받고 ARDS7과같은 수술 후 폐 합병증의 감소와 함께 흉부 수술을 받은 환자의 폐에 염증 감소와 관련이 있습니다. 유사한 결과는 심장 수술 후 환자의 메타 분석에서 발견되었습니다8. 할로겐화 휘발성 물질은 또한 기관지 확장 효과가9,10 및 심장8,11 및 신장12,13,14와같은 여러 장기를 보호하는 일부 특성을 가질 수 있습니다. 최근에는 중환자실(ICU)에서 진정제로 흡입된 마취제의 임상 사용에 대한 관심이 높아지고 있다. 동물과 인간 연구 모두 간15,뇌16또는 심장11의장기간 허혈 전에 할로겐화 한 에이전트로 전처리의 보호 효과를 지원합니다. 할로겐화 한 에이전트는 또한 중요 한 아픈 환자의 체 이션에 대 한 다른 정 맥 에이전트에 비해 잠재적인 약물 동 역학 및 약물 역학 이점을 가지고, 행동의 급속 한 발병을 포함 하 여 및 조직에 작은 축적으로 인해 빠른 오프셋. 흡입할할로겐화제는 심장 수술을 받는 환자의 정맥 내 침전과 비교하여 삽관 시간을감소시다(17). 몇몇 연구는 ICU 환자의 포화에서 할로겐화제의 안전성과 효능을지원한다 18,19,20. ARDS의 실험 모델에서 흡입된 세보플루란은 가스교환(21,22)을개선하고, 폐포부종(21,22)을감소시키고, 폐및 전신염증(23)을모두 감쇠시킨다. 이소플루란은 또한 폐포-모세관 장벽의 무결성을 유지함으로써 부상 후 폐 수리를 개선하며, 키 타이트 접합단백질(24,25,26)의발현을 조절할 수 있다. 또한, 이소플루란으로 배양되고 처리된 마우스 대식세포는이소플루란(27)으로치료되지 않은 대식세포보다 호중구에 더 나은 식세포 효과를 가졌다.

그러나, 휘발성 마취제의 폐 보호 특성을 차지하는 정확한 생물학적 경로 및 메커니즘은 현재까지 크게 알려지지 않았으며, 추가 조사가필요하다(18). 추가 연구 결과는 또한 폐 상해에 sevoflurane의 정확한 효력을 조사하고 실험적인 기록이 환자에게 번역될 수 있는지 확인하기 위하여 보증됩니다. 우리 팀에서 첫 번째 무작위 대조시험은 ARDS를 가진 환자에서 흡입한 sevoflurane의 투여가 고급 당화 끝 제품 (sRAGE)28에 대한 플라즈마 및 폐포 용해 수용체에 의해 평가된 바와 같이, 프로 염증성 사이토카인과 폐 상피 손상 마커의 산소 화 개선 및 감소 된 수준과 연관되었다는 것을 발견했습니다 28 . sRAGE는 이제 폐포 타입-1 세포 상해 및 폐포 염증의 핵심 중재자의 마커로 고려되기 때문에, 이 결과는 폐경포 상피 상해21,29,30에세보플루란의 몇몇 유익한 효력을 건의할 수 있었습니다.

흡입된 ICU 식재를 위한 할로겐화제의 사용은 오랫동안 수술실 마취 인공호흡기와 가스 기화기를 ICU에 배치해야 했습니다. 그 이후, 현대 중환자실기를 사용한 사용에 적합한 마취 반사경은 ICU31에서특정 용도로 개발되었다. 이 장치는 호흡기 회로의 Y-피스와 엔트라큐어 튜브 사이에 삽입 된 수정 된 열 및 수분 교환 필터를 갖추고 있습니다. 그들은 할로겐화 제의 투여를 허용, 이소플루란과 세보플루란이 가장 자주 사용되는, 그들은 다공성 폴리 프로필렌 증발기 막대로 구성, 있는 액체 에이전트, 특정 주사기 펌프에 의해 전달, 방출된다. 할로겐화제는 장치에 포함된 반사 매체에 의해 만료되는 동안 흡수되며 다음 영감 중에 방출되어 만료된 할로겐화제(31,32)의약 90%를 재순환할 수 있다. 최근에는 소형형 이 장치는 50mL의 기악공간으로 개발되어 ARDS 환자에서 초보호 환기 시 200mL31의낮은 조력부로 사용하기에 더욱 적합하게 되었다. 이러한 소형화 장치는 ARDS의 실험용 새끼 돼지 모델에서 연구된 적이 없습니다.

이전 연구는 ARDS 도중 폐경포 염증 및 상해에 있는 할로겐성 휘발성의 유망한 역할을 지원하기 때문에, 우리는 폐 상해에 할로겐화한 에이전트의 효력의 기계장치의 번역이해를 달성하기 위하여 실험적인 동물 모형을 디자인하고33,34,35. 본 연구에서는, 흡입된 체온이 마취 보존 장치, ICU 형 장치의 소형 버전을 사용하여 전달될 수 있는 돼지에서 염산(HCl)유도 ARDS의 모델을 개발했습니다. ARDS의 이 큰 동물 모형은 흡입한 할로겐화한 에이전트의 잠재적인 폐 보호 효력의 우리의 이해를 더 하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

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Protocol

연구 프로토콜은 프랑스 미니스티에르 드 l'Education Nationale의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다, 드 l'Enseignement Supérieur et de la Recherche (승인 번호 01505.03) preclinicaltrials.eu 등록되기 전에(전 임상 등록 식별자 PCTE00000129). 모든 절차는 동물 연구에 따라 센터 인터내셔널 드 Chirurgie 내도스코피크, 대학 클레르몽 오베르뉴, 클레르몽페란드, 프랑스, 동물 연구에 따라 수행되었다 : 비보 실험 (도착) 가이드 라인36에서보고.

1. 동물 제제 및 마취

  1. 새끼 돼지 모드
    1. 실험 프로토콜이 3R 원칙(교체, 감소 및 개선) 및 국내/국제 규정을 포함한 동물 실험 지침과 일치하는지 확인합니다.
    2. 프로토콜을 시작하기 전에 관련 기관에서 실험 동물의 치료 및 사용에 대한 윤리위원회의 승인을 얻습니다.
    3. 남성 흰색 랜드 레이스 새끼 돼지를 사용 하 여 (2-4 개월; 무게 10-15 kg).
    4. 근육 내 아자페론을 사용하여 예약 후 척추 위치에 돼지를 놓습니다 (1.2.2에 설명).
  2. 마취 유도
    1. 동물은 하룻밤 동안 음식을 먹는 것을 제한하면서 물에 무료로 접근할 수 있습니다.
    2. 귀 뒤에 근육 내 아자페론(2 mg.kg-1)을 사용하여양방에 항리액 전약을 투여한다.
    3. 내측 및 측면 오리알 혈관 정맥을 식별하기 위해 돼지의 소변기 의 연조직에 손가락 압력을 가하십시오.
    4. 양두구의 내측 또는 측면 유리혈관 정맥에 주변 정맥 내 22 G 카테터를 삽입합니다. 피부를 통해 45°의 얕은 각도로 카테터를 따라 카테터를 통해 혈액이 나타날 때까지 진행하십시오.
    5. 정맥 내 프로포폴(3 mg.kg-1) 및수펜타닐(0.3 μ g.kg-1)37로전신 마취를 유도한다. 페달 반사에 대한 반응부족으로 마취의 깊이를 확인하십시오.
  3. 기관 관관38,39
    1. 크기 4 직선 밀러 후두경 블레이드를 사용하여 후두를 준비합니다.
    2. 후두경을 인두 구멍에 넣고 후두반 칼로 혀를 우울시켜 후두를 볼 수 있습니다.
    3. 오로트라세이션 관충 전에 돼지의 후두 개구부를 시각화합니다.
    4. 6mm 내지름 커프스 내트라큐리 튜브를 삽입합니다.
    5. 20-30cmH2O주위의 커프 압력에 도달하기 위해 내장관 커프스를 팽창시다.
    6. 내막튜브를 미세포어 수술 용 테이프로 돼지의 코에 고정하십시오.
    7. 인공호흡기에 연결하고 섹션 3에 설명된 설정에 따라 기계 환기를 시작합니다.
  4. 식기 유지 보수
    1. 산 유발 폐 손상 전에 프로포폴 (5 mg.kg-1.h-1)의지속적인 정맥 주입으로 마취를 유지합니다. 할로겐화 제가 시작되는 경우 프로포폴의 주입이 중단됩니다.
    2. 통증 관리를 위해 remifentanil (10-20 μ g.kg-1.h−1 = 0.15-0.33 μ g.kg-1.min-1)의지속적인 정맥 주입을 추가하십시오.
    3. 신경 근육 봉쇄를 위해 시사트라쿠리움(0.2 mg.kg-1.h-1)의지속적인 정맥 주입을 추가합니다.
    4. 따뜻한 담요를 사용하여 돼지의 체온을 약 38 °C로 유지하십시오.
    5. 외부 모니터를 지속적으로 사용하여 심전도 활성, 말초 산소 포화도(SpO2)및 동맥 압력을 모니터링합니다.
  5. 외과
    1. 오른쪽 내부 경정맥의 외과적 노출과 셀딩거 방법을 사용하여 중앙 정맥 접근을 삽입하여 3루멘 카테터(7 프랑스어, 16cm)를 삽입합니다.
      1. 목의 복부 측면에 경골 중간선 절개를, 기관에서 2cm 측면으로 만듭니다. 조직을 해부하기 위해 외과 용 집게를 사용합니다.
      2. 내부 경정맥(깊이 약 1~2cm, 내부 경동맥에 측면)을 국소화하고 바늘(18G, 6.35cm)을 사용하여 두개골 방향 방향으로 구멍을 만듭니다.
      3. 손으로 바늘을 통해 "J" 가이드와이어(직경 0.81mm, 60cm)를 삽입합니다. 바늘을 부드럽게 제거하고 "J" 가이드와이어를 따라 내부 경정맥에 3줄이 있는 정맥 카테터를 빠르게 삽입합니다. 정맥 카테터를 제자리에 유지하면서 "J" 가이드와이어를 제거합니다.
      4. 정맥 카테터의 각 라인을 통해 혈액을 흡인하여 서로 다른 선으로부터 공기를 제거하고 식염수 용액(0.9% NaCl)으로 플러시하여 세 줄을 헹구는다.
      5. 지속적인 렘버트 패턴에 따라 3.0 흡수되지 않는 봉합사실로 피부를 봉합하고 중앙 정맥 카테터의 각 측면 천공에 하나의 스티치와 트리플 매듭으로 피부에 카테터를 고정시합니다.
    2. 오른쪽 대퇴 동맥의 외과 적 노출을 통해 동맥 라인을 삽입하고 셀딩거 방법을 사용하여 열 희석 카테터 (3-5 프랑스어, 20cm)를 삽입하십시오.
      1. 새끼 돼지의 오른쪽 앞다리를 확장에 놓습니다.
      2. 새끼 돼지의 오른쪽 사타구니 영역에 상처 절개를합니다. 피하 및 근육 조직을 해부하기 위해 외과 용 집게를 사용합니다.
      3. 대퇴펄스(약 3~4cm 깊이)를 만지작시면 올바른 대퇴동맥을 국소화하고 바늘(19G, 54mm)을 사용하여 코도카네 방향 방향으로 구멍을 만듭니다.
      4. 바늘을 통해 "J"가이드 와이어를 삽입합니다. 바늘을 부드럽게 제거하고 동맥 카테터를 가이드와이어를 따라 대퇴 동맥에 빠르게 삽입합니다. 카테터를 제자리에 유지하면서 가이드와이어를 제거합니다.
      5. 동맥 카테터에서 공기를 제거하고 식염수 용액으로 씻어 라인을 헹구습니다.
      6. 지속적인 렘버트 패턴에 따라 3.0 흡수되지 않는 봉합사실로 피부를 봉합하고, 동맥 카테터의 각 측면 천포에 하나의 스티치와 트리플 매듭으로 피부에 카테터를 고정시다.
      7. 맥박 윤곽 심장 출력 모니터 장치와 함께 직렬 혈액 샘플 및 연속 혈역학 모니터링 (동맥 압력, 심장 지수 및 천체 폐 수)을 검색 할 수 있도록 동맥 라인 튜브에 카테터를 연결합니다.

2. 산으로 인한 급성 폐 부상

주의: 이 단계에서 장갑과 안경을 사용하여 피부 또는 눈과 산이 접촉할 위험을 방지하십시오)

  1. 0.05M및 pH 1.4에서 HCl 100mL를 만드십시오.
  2. 흉골의 마지막 부분의 해부학 적 랜드 마크를 사용하여, 내막 관의 끝과 돼지의 카리나 사이의 거리를 측정합니다.
  3. Ch14 흡입 카테터에 검은 펜으로 이 거리를 표시합니다.
  4. 흡입 카테터를 엔타락 튜브를 통해 검은 색 랜드마크까지 삽입합니다.
  5. 흡입 카테터를 통해 산의 mL.kg -1(체중)을 부드럽게 3분 이상 주입합니다.
  6. 흡입 카테터를 제거합니다.

3. 기계 환기

  1. 집중 치료 인공호흡기에 볼륨 조절 환기를 사용하십시오.
  2. 6 mL.kg-1의조수 부피를 사용하고, 5cmH2O의양수 종기 기만 압력 (PEEP)과 40 %의 영감을 받은 산소 분획 (FiO2)을사용합니다.
  3. 35 mmHg 사이 말조 이산화탄소를 유지하기 위하여 호흡 속도를 조정합니다.
    참고: 이전 연구에 따르면37,40,41,폐 손상은 동맥 산소 장력(PaO2)-대FiO2 비율이 기준선에서 25%로 감소할 때 확립된 것으로 간주되며, 기도 HCl 주입 후 약 1시간 후.

4. 할로겐 마취제

참고: 산으로 인한 폐 손상이 발생하면 할로겐 마취제(세보플루란 또는 이소플루란)를 사용하여 식기 착전을 시작합니다. 그런 다음 propofol을 사용한 정맥 내 침전을 중단해야 합니다.

  1. 주사기를 채우는(도 1A): 제조 업체가 제공하는 충전 어댑터를 할로겐화 제의 250 mL 병과 충전 어댑터에 60 mL 주사기를 부착합니다. 병을 거꾸로 뒤집어 플런저를 밀고 당겨 주사기를 채웁니다. 병을 똑바로 세워 주사기를 제거합니다.
  2. 청소(그림 1B)
    1. 할로겐화 탄화수소 마취 가스를 환기기 가까이에 제거하는 데 사용되는 숯 필터를 놓습니다.
    2. 숯 필터에서 보호 캡을 제거합니다.
    3. 숯 필터를 환기기의 만료 밸브에 플렉스 튜브와 연결합니다.
  3. 아래에 설명된 바와 같이 마취 보존 장치(흡입된 ICU 세이션에 사용되는 장치)(도1C)를사용한다.
    1. 이오노머 멤브레인 건조기 라인을 마취 보존 장치의 가스 샘플링 포트에 연결합니다.
    2. 가스 샘플링 라인의 한쪽면을 이오노머 멤브레인 건조기 라인에 연결합니다.
    3. 가스 샘플링 라인의 다른 면을 가스 분석기와 연결합니다.
    4. 호흡기 회로의 Y-피스와 내트라세이클 튜브 사이에 마취 보존 장치를 삽입합니다.
    5. 마취 보존 장치가 검은 면을 위로 하고 돼지쪽으로 기울어지도록 하십시오.
  4. 마취 보존 장치를 통해 흡입 된 식착을 전달합니다(그림 2).
    1. 주사기 펌프에 특정 주사기를 놓습니다.
    2. 마취제 라인을 주사기에 연결합니다.
    3. 할로겐화 제의 1.5 mL의 볼러스와 에이전트 라인을 프라임.
    4. mL.h-1의 초기 펌프 속도(이소플루란과 세보플루란의 초기 주사기 펌프 속도 설정은 각각 3mL/h) 또는 만료된 이소플루란 분획(FEiso) 값에 적용하여 가스 분석기에서 표시된다.
    5. 가스 분석기가 FEsevo %-FEISO % 또는 0보다 큰 동등한 최소 폐포 농도값을 표시하도록 합니다. 필요한 경우 할로겐화 제의 0.3 mL의 추가 볼러스를 제공합니다.
    6. 분부및 표적 농도에 따라 특정 농도에 도달하는 데 필요한 주사기 펌프 속도를 조정하여 2-7 mL.h-1 및 4-10 mL.h-1의 비율로 일반적으로 0.2%-0.7%와 0.5%-1.4% 이소플루란42및 sofran,433의경우 0.2%-0.7%와 0.5%-1.4%의 유효분수와 관련이 있습니다.
    7. 실험 중, FE세보 및 FE이소 표적을 각각 0.8-1.1 및 0.5-0.8로 할로겐화한 제제의 투여를 계속한다.

5. 측정

  1. 모니터링
    1. 외부 모니터에 의해 측정된 것과 다른 매개변수를 수집합니다: 심박수, 혈압 및 말초 산소 포화.
    2. 인공호흡기에 의해 측정된 매개변수기록: 조수부피, 호흡속도, PEEP 설정, 자동 PEEP(환기기에 5s의 만료 홀드 기동적용), 호흡기 시스템의 규정 준수, 기도 저항, 피증 고원 압력(환기기 압기2의 피증 보류 기동을 적용함), 피크압력.
    3. 환기에 통합된 경우 질소 세척/세척 방법을 사용하여 폐 기능잔류 용량을 계산합니다.
    4. 이전에 대퇴동맥에 삽입된 열 지표를 사용하여 폐, 심장 지수 및 전신 혈관 저항의 화분 부피를 측정합니다.
  2. 순 AFC 속도를 측정하기 위해 희석되지 않은 폐 부종 유체 샘플링.
    1. 부드러운 14 Fr 흡입 카테터를 엔트라큐리 튜브를 통해 낙후 기관지의 쐐기 위치에 삽입합니다.
    2. 부드러운 흡입을 적용하여 흡입 트랩에 부종 유체를 샘플링합니다.
    3. 원심분리기는 냉장 원심분리기에서 10분 동안 4°C에서 240 x g의 모든 샘플을 채취한다.
    4. 초월체를 수집합니다.
      참고: 희석되지 않은 폐 부종액의 총 단백질 농도는 색을 측정하는 방법으로 측정됩니다. 폐포 공간으로부터 부종 액의 침전율은 단백질 제거 속도보다 훨씬 빠르기 때문에, 순 AFC 비율은 100× [1-(초기 부종 단백질/최종 부종 총 단백질)로 계산되었고 그 후 %/h37로보고되었다. 원액폐 부종 유체 샘플은 이전에 설명된 바와 같이 기준선 및 4시간 후, 동물로부터 수집되며, 이전에 설명된 바와 같이34,44,45,46,47,48, 49.
  3. 미니 기관지 알팔포라 라베이시 샘플링.
    1. 부드러운 14 Fr 흡입 카테터를 엔트라큐리 튜브를 통해 단상 기관지에서 쐐기 위치에 삽입합니다.
    2. 흡입 카테터에 염화 나트륨 용액0.9%의 50mL를 주입한다.
    3. 즉시 흡입 트랩에 유체를 샘플링합니다.
    4. 미니 기관지 알러지 라베이지를 수집합니다.
      참고: 미니 BAL의 총 단백질 농도는 색법으로 측정되며, 예를 들어 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 IL-18과 같은 염증성 사이토카인의 수준은 멀티플렉스 면역분석 방법을 사용하여 측정된다. 시료는 산 유발 폐 손상 후 4시간 후에 수집됩니다.
  4. 혈액 가스 분석
    1. 기준선BD 루어록 팁이 있는 3mL BD 프리셋 주사기에서 동맥 혈액 가스를 수집합니다. 즉시 PaO2/FiO2,PaCO2,pH, 혈청 락테이트 및 혈청 크레아티닌을 치료 지점 혈액 가스 분석기를 사용하여 측정합니다.
    2. 산 발화 후 4 시간 동안 매시간이 단계를 반복하십시오.
  5. 폐 샘플링
    1. 실험 종료 시 펜토바르비탈(150 mg.kg-1)의정맥 주사로 새끼 돼지를 희생한다(산 유발 폐 손상 후 4시간).
    2. 전체 폐를 해부하고 제거합니다. 알코올 아세티포르말린으로 수정하십시오.
    3. 파라핀에 포함시키고 10 μm 두께로 슬라이스합니다.
    4. 헤마톡슬린과 에신을 곁들인 얼룩.
      참고: 폐 상해의 조직학적 증거는 표준화된 조직학 상해 점수50을사용하여 평가될 수 있다.

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Representative Results

이 실험을 위해, 25마리의 새끼돼지는 치료되지 않은 군(SHAM 군)에 있는 돼지 12개와 산성 부상군(HCl 단)에 있는 13마리의 돼지를 2개의 그룹으로 마취하고 분할하였다. 실험이 끝나기 전에 새끼 돼지가 죽지 않았습니다. 분산(RM-ANOVA)의 양방향 반복 측정 분석은 AO 2/FiO2에HCl 유도 ARDS의 해로운 효과와 함께 그룹 상호작용(P <10-4)에의해 상당한 시간을 나타내며, ARDS가 없는 가짜 동물에 비해(도 3). 기계적 환기의 4 시간 후에 측정된 총 단백질의 희석되지 않은 폐 부종 유체 수준에서 중요한 그룹 간 차이가 지적되었다(P <10-4). HCl 유도 ARDS는 샴동물(도 4)에비해 BAL 단백질 증가와 연관되었다. 양방향 RM-ANOVA는 HCl 유도 ARDS와 그룹 상호작용(P <10-4)에의해 상당한 시간을 나타내며, ARDS가 없는 토끼 동물에 비해 증가된 항암폐수와 연관되었다(도5A). 심장 출력 및 전신 혈관 저항 값은 각각 도 5B 및 도 5C로보고된다. 모든 동물에서 측정된 세보플루란의 피의 및 만료 분획은 도 6에서보고되며, 히스토로지성 폐 손상의 거시적 증거는 도 7에도시된다.

Figure 1
그림 1: 마취 보존 장치를 사용하여 할로겐 휘발성 제제로 체연을 관리하는 데 필요한 설정의 그림입니다. (A)병 어댑터로 특정 주사기를 채웁니다. (B)청소 숯 필터를 사용하여 할로겐화 된 에이전트를 청소. (C)주사기 펌프와 가스 분석기를 마취 보존 장치와 함께 조립하여 인공호흡기와 함께 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 마취 보존 장치의 연결에 대한 회로적 표현이 인공호흡기의 호흡 회로에 연결됩니다. 여기에는 폐 기능 잔류 용량을 측정하는 모듈의 통합이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 동맥 산소의 변경 측정. (A)4시간 동안 치료되지 않은 돼지(SHAM 군, N=12) 및 산성 부상 돼지(HCl 그룹, N=13)에서 영감을 받은 산소 분획(FiO 2)에 대한 동맥 산소 장력(PaO2)의진화. (B)처리되지 않은 돼지(SHAM 군, N=12) 및 산성 부상 돼지(HCl 그룹, N=13)에서 H0에서 PaO2/FiO2의 특정 시점 및 H0에서 PaO2/FiO2의 델타의 진화. 값은 mmHg로 표현되고 수단으로 표현되며, 오류 막대는 수단의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 폐포 모세관 막 투과성에서의 변경 측정. 치료되지 않은 돼지 (SHAM 그룹, N = 12) 및 산성 부상 돼지 (HCl 그룹, N = 13)에서 총 단백질의 미니 기관지 (BAL) . 값은g.L-1로 표현되고 수단의 표준 오류를 나타내는 오류 막대와 함께 수단으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 폐 열량에 의해 제공된 측정. (A)폐 부종, 사치스러운 폐물에 의해 평가. (B)심장 출력. (C)전신 혈관 저항. 폐열열량은 맥박 윤곽 심장 출력 모니터를 이용하여 처리되지 않은 돼지(SHAM 그룹, N =12) 및 산성 부상 돼지(HCl 그룹, N=13)에서 수행되었다. 값은 mL.kg-1,L.min-1,dynes.s.cm-5로표현되며, 수단의 표준 오류를 나타내는 오류 막대와 함께 수단으로 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 할로게네란 및 이소플루란의 만료된 분획측정. (A)4-h 연구 기간 동안 만료 (FEsevoflurane) 및 영감 (FIsevoflurane) 세보플루란 분획. (B)4-h 연구 기간 동안 만료 (FEisoflurane) 및 영감 (FIisoflurane) 이소플루란 분획. 값은 %로 표현되고 수단으로 표현되며, 오류 막대는 수단의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
도 7: 4h 연구 기간 후 전체 폐의 거시적 평가. (A)치료되지 않은 돼지(SHAM 군)의 전체 폐. (B)산성 부상 돼지 (HCl 그룹)의 전체 폐. 눈에 보이는 출혈과 혼잡을 가진 매크로 경폐 손상은 폐의 붉은 부분 (흰색 화살표)에서 두드러지않습니다. 4h 연구 기간 후 폐의 조직학적평가. (C)치료되지 않은 돼지(SHAM group)의 폐의 조직학적 조각. (D)산성 손상 돼지(HCl 군)의 폐의 조직학적 조각. 폐 상해의 조직학적 증거는 주로 호중구 (검은 화살촉)로 구성된 더 큰 세포성이었고, 더 많은 부위의 폐포 및 증가 된 폐포 중단, hyaline 막, 단백질 파편, 출혈 (흰색 화살표), 폐포 벽 (검은 화살)의 두껍게. 배율 막대는 100 μm에 해당합니다.

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Discussion

이 문서는 마취 보존 장치를 사용하여 전달된 세보플루란 또는 이소플루란과 같은 할로겐휘발성의 폐 보호 효과를 조사하기 위해 돼지에 HCl의 내내 주입에 의해 유도된 ARDS의 재현 가능한 실험 모델을 설명합니다.

이 연구의 주요 목표는 휘발성 에이전트가 ICU 환자에 사용된 것과 같은 마취 보존 장치에 의해 전달될 수 있는 ARDS의 실험 모형을 개발하는 것이었습니다. 할로겐화 제의 일부 효과는 이전에 동물 모델에서 연구되었지만, 우리의 모델의 강점은 이러한 효과에 대한 우리의 이해를 높이기 위해 임상적으로 관련이있는 번역 모델이라는 것입니다. 이 모형의 또 다른 이점은 상당한 폐 상해가 시간이 지남에 따라 낮은 사망률을 가진 마우스 보다는 더 큰 동물에서 유도될 수 있다는 것입니다. 실제로, ARDS의 동물 모델의 선택에 중요한 고려 사항은51을해결해야 실험 적 질문이어야합니다. 마우스 모델에서 정맥 내올레산(52)및 라베이지 유도 계면활성제고갈(40)및 고스트레스트기계환기(53)와같은 폐 손상을 유도하는 실험 기술은 시간부터 며칠까지 시간 동안 집중적인 부상을 유발할 수 있지만 폐 손상 수리/해상도에 대한 조사를 허용하지 않는다. 더욱이, 동물 모델의 일부 도전 (예를 들어, 인공 호흡기 유도 폐 부상의 특정 모델에서 매우 큰 조수 볼륨) 극단적 일 수있다, 이러한 그들은 ARDS와 인간에 존재하는 조건의 범위를 대표하지 않습니다. 반대로, 장내내독소(54)와 같은 모델은 임상 ARDS에 따라 발생할 수 있는 염증 및 섬유성 과정의 해결의 특정 양상을 조사할 수 있지만, 증후군51의진단을 위한 전제조건인 실질적인 저혈당을 생성하지 는 않는다. 그들의 특정 효력을 더 잘 특성화하기 위하여는, 아무도 충분히 ARDS55의이질성을 재현하지 않기 때문에, 다중 모형에서 아마 시험되어야 합니다.

우리의 모델에는 몇 가지 고유한 제한이 있습니다. 첫째, 실험적인 ARDS 발병 후 4시간 후에 동물을 안락사시켰기 때문에 ARDS의 초기 단계에서만 매개변수를 수집했습니다. "동물 ICUS"와 같은 보다 정교한 시설은 돼지에서 ARDS의 후반 단계를 조사해야합니다. 둘째, 현재 실험 중, 우리는 단지 PaO 2/FiO2와같은 동맥 산소의 인덱스를 사용하여 폐 손상의 정도를 평가했다. 그러나, 실험ARDS의 대부분의 특징은 우리가 이전에 이 산 유도 ARDS모델(37)의사용을 보고했을 때 존재하였다. 우리의 모형을 향상하기 위하여는, 예를 들면, 전기 임피던스 단층 촬영 또는 폐 초음파 를 사용하여 결정된 폐 상해의 정도의 비침습적 측정을 추가하는 것이 흥미로할 수 있었다56. 셋째, 돼지에서 폐 손상을 유도하기 위한 "원히트 모델"의 사용만 보고하고, 폐 손상에 대한 1개 이상의 선동 자극이 유도되는 모델은 단일 선동 자극이 거의 존재하지 않는 병리학적 인간 상황을 더 반영할 가능성이 높으며("2히트 가설")51. 이러한 관점에서 볼 때, 인공호흡기 유발 폐 손상은 예를 들어, 추가 히트를 생성하기 위해 모델에 첨가될 수 있으며, 이 모델은 폐 내피 손상, 폐모 대식절 활성화 및 세포 프리 헤인모그모그(57)의 효과와 같은 ARDS병리 생리학의 여러 특징을 포함하는 보다 복잡한 임상 시나리오를 조사하는 데 필요한 경우 다른 해로운 "안타"와 결합될 수 있습니다. 다른 사람의 사이에서58. 넷째, 데플루란과 같은 다른 할로겐화 한 제제를 테스트하지 않았습니다. 실제로, 우리는 적어도 유럽과 세계의 몇몇 다른 지역에서 임상 ICU 사례에서 가장 자주 이용되기 때문에 돼지에 있는 흡입한 착취를 위해 isoflurane 및 sevoflurane를 이용했습니다.

돼지 모델은 지난 수십 년 동안 실험 연구에서 상당한 발전에 기여했으며 전통적인 작은 실험실 동물 모델과 인간 의학 사이의 번역 다리가 점점 더 중요해졌습니다. 큰 동물에서 실험 모델을 사용하는 주요 장점은 시간이 지남에 따라 동물의 환기를 포함하는 조사를 허용하는 것입니다. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 모델은 매우 비쌀 수 있습니다., 그리고 그들은 때때로 동물 ICU의 가용성을 요구할 수 있습니다. 또한 돼지에서 일부 분자 시약의 제한된 가용성은 중요한 제한입니다. 쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 작은 동물에 대한 연구는 개별 경로를 연구하는 데 매우 유용하지만 인간에게 결과의 일반화성은59로제한된 것으로 보입니다. 더 큰 동물 연구 결과는 중요한 생리학 및 분자 통로의 집중한 평가를 제공할 수 있고 할로겐화한 에이전트를 가진 진정과 같은 인간에 있는 새로운 치료를 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다. 또한, 동물의 크기는 임상적으로 사용되는 카테터, 내트라큐어 튜브, 인공호흡기 및 모니터의 사용을 지원하며, 작은 포유류에서 완전히 사용할 수 없습니다. 실제로, 큰 동물을 가진 실험 모형을 사용하는 중요한 이점은 다중 세로 혈액 견본을 취하고 시간이 지남에 따라 혈액 가스 분석을 능력을 포함합니다. 또한, 침습적 혈역학 모니터링은 펄스 윤곽 심장 출력 모니터 장치로 폐열열량으로 사용될 수 있으며, 아구슬(ARDS51)동안 폐포-모세혈관 장벽의 변경에 있어 관련성이 높은 파라미터인 외래 폐수를 측정하여 폐포 부종의 정도를 연구할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 크기 이외에 데이터가 동물 성 모델에서 해석 될 때주의가 필요합니다, 중요한 해부학적, 생리적, 면역학적 차이는 동물 종 사이에 존재하기 때문에. 동물 모델은 연구와 인간에 대한 번역에 영향을 미칠 해부학적 차이가 있을 수 있습니다. 실제로, 마우스 또는 토끼와 같은 많은 동물은 불완전한 내막과 얇은 내장 막을 가지고 있으며, 예를 들어, 대조기 흉막의 사용을 대조군으로 사용하는 것을 금지합니다. 그러나, 더 큰 동물(예를 들어, 양 또는 돼지)에는 각 폐 주위에 흉막 구멍이 하나 있고 인간60을닮은 두꺼운 내장 흉막이 있다.

ICU 환자에게 휘발성 마취제의 투여는 반사 또는 원 시스템에 근거를 둔 전용 장치의 발달 때문에, 지난 10 년간 점점 공부되고 있습니다. 이러한 장치는 ICU 설정, 세보플루란 및이소플루란(61)에서가장 자주 사용되는 두 가지 제제를 관리하기 위해 임의의 기계적 환기 회로에 삽입될 수 있다. 최면, 기관지 확장제 및 항 경련제 특성으로 인해 할로겐화 제는 ICU에서 난치성 상태 천식, 상태 간질 및 화상, 만성 통증, 고위험 수술 또는 약물 남용 의 역사와 같은 높은 섭취 요구 사항을 가진 복잡한 섭취 시나리오를 관리하는 데 오랫동안 사용되어 왔습니다. 최근 국제 지침은 절차적 통증 관리에 휘발성 에이전트를 사용하는 것이 권장하지 않지만62,할로겐 마취제는 유럽에서 점점 더 인기가 있으며, 특히 짧은 기상 시간이 필요한 경우 2015 독일 지침63에서체임에 대한 실행 가능한 옵션으로 간주됩니다. 잠재적인 치료 말기 장기 보호 특성 사이토 보호 및 항 염증메커니즘64 휘발성 마취제는 연구원과 의사의 관심을 끌고있다. 사실, IcUs에 있는 그들의 새로운 사용은 ARDS를 가진 환자에 있는 그들의 잠재적인 이득의 연구 결과에 도로를 포장했습니다. ARDS는 폐 장기 기능 장애의 궁극적이고 가장 심각한 형태를 나타냅니다, 뿐만 아니라 환자, 그들의 가족을위한 주요 도전, 다양한 분야의 의료 제공자, 및 의료 시스템은 중증 환자를 돌볼 때, 특히 현재 COVID-19 전염병65,66,67 동안과같은 몇 가지 예외적 인 상황에서 . 특정 항바이러스 요법을 찾기 위한 현재의 노력을 넘어, COVID-19 관련 ARDS를 가진 환자를 위한 지원 치료 및 치료 선택권을 향상시키는 것은, 따라서, 중요한중요성의 65,68,69입니다. 이러한 관점에서, 폐 상피 투과성을 개선하고, 염증 반응을 감소시키고, 잠재적으로 환자 결과를 개선하기 위한 방법으로 세보플루란 또는 이소플루란을 사용하여 흡입된 식기를 지원하는 근거가 강하다. 또한, 몇몇 비인간적 모델은 흡입된 세보플루란과 같은 휘발성 마취제가 가스 교환21,70,71을개선하고 폐포부종(22)을감소시키고, 프로 염증성사이토카인(72)및73의수준을 감소시킨다는 것을 보여주었다. 이러한 효과는 복원된 폐 상피 기능및 할로겐화제의 면역 조절 효과에 의해 설명될 수 있다. 이전 파일럿 무작위 대조군 시험에서, Sevoflurane와 같은 할로겐화 제의 사용은, ICU에서 ARDS 환자를 진정시키기 위하여 폐 상피 상해및 몇몇 프로 염증성 사이토카인의 마커의 감소된 수준을 향상했습니다 (interleukin [IL]-1β, IL-6, 및 IL-8 및 종양 괴사에 비교된 il-8 및 종양 α 괴사호르몬에 비교된28의 종양 . 이러한 결과는 혈장 sRAGE34에의해 평가된 바와 같이 염증및 감소된 상피 손상 또는 향상된 AFC에 세보플루란의 보호 효과를 강화한다.

급성 폐 손상에 관여하는 생물학적 메커니즘및 병리학적 경로와 할로겐화 제의 흡입 된 식감 하에서의 해상도를 이해하려면 실험 및 전임상 모델의 사용이 필요합니다. 시험관 내 연구는 이러한 메커니즘을 설명하는 중요한 단계를 나타냅니다74,생체 내 실험은 결과가 임상 설정에 추정 될 수 있기 전에 기본입니다. 더욱이, 이 큰 동물 모형에서, 할로겐화한 에이전트는 인간에서와 같이 동일 마취 보존 장치를 사용하여 관리될 수 있었습니다. 사실, 일부 국가에서 환자를 위해 둘 다 유효한 반사 또는 원 시스템에 근거를 둔 장치는, 마우스, 쥐, 또는 토끼와 같은 작은 동물에 사용할 수 있는 특정 등가물을 가지고 있지 않습니다. 따라서, 연구원이 동물에게 할로겐화 한 에이전트를 투여할 때, 그들은 할로겐화 한 에이전트에 대한 사전 노출 또는 후 노출 중 사이에서 선택해야합니다, 일반적으로이 기간 동안 특정 기계적 환기없이 다소 긴 시간 동안 마취 챔버 유도를 통해75. 이 돼지 모델은 ARDS를 가진 ICU 환자, 즉 세보플루란과 같은 할로겐화 제의 투여와 낮은 조수 부피 및 엿포를 가진 폐 보호 기계 환기를 전달하는 것과 동일한 치료 조건의 특정 재생을 허용합니다. 흥미롭게도, 우리의 모델은 돼지에서 처음으로 세보플루란을 투여하기 위해 마취 보존 장치의 최근 소형 버전의 사용을보고, 따라서 작은 조수 볼륨과 장치의 이전 버전에 비해 설정 될 더 악기 죽은 공간을 허용. 더욱이, 할로겐휘발성을 투여하는 것 외에도, 산 유발 ARDS의 이 모델은 폐 상피 손상 및 그수리(37)에관여하는 것과 같은 특정 경로를 연구하는 데 유용할 수 있다.

결론적으로, 돼지에 있는 ARDS의 이 실험 모형은 기존 에 비해 중요한 이점을 가지고 있습니다. 여기에는 급속한 발병(일반적으로 1h 이내), 시간이 지남에 따라 좋은 재현성과 안정성, 사망률이 낮으며, 더 중요한 것은 흡입된 ICU 세이디션을 전달하기 위해 임상적으로 관련된 장치를 사용하여 ARDS의 할로겐화 제제의 효과에 대한 새로운 번역 적 접근을 허용합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 그레드, 유니버시테 클레르몽 오베르뉴, 센터 인터내셔널 드 키루기 엔도스코피크(프랑스 클레르몽 페랑의 모든)의 직원들에게 감사를 표하고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tracheal intubation
Endotracheal tube 6-mm Covidien 18860
Animal preparation
Central venous catheter 3-lumens catheter (7 French - 16 cm) Arrow CV-12703
Pulse contour cardiac output monitor PiCCO catheter (3-5 French - 20 cm) Getinge Pulsion Medical System catheter
Warm blankets WarmTouch5300 MedTronic 5300
Monitoring
External monitor IntelliVue MP40 Phillips MNT 142
Point-of-care blood gas analyzer Epoc® Blood Analysis System Siemens 20093
Pulse contour cardiac output monitor PiCCO Device PulsioFlex Monitor Getinge Pulsion Medical System PulsioFlex
Mechanical ventilation
Ventilator Engström Carestation General Electrics Engström
Halogenated anesthetics
Anaconda Syringe SedanaMedical 26022
Anesthetic conserving device AnaConDa-S SedanaMedical 26050
Charcoal filter FlurAbsorb SedanaMedical 26096
Filling Adaptaters SedanaMedical 26042
Ionomer membrane dryer line Nafion SedanaMedical 26053
Products
Propofol Mylan 66617123
Isoflurane Virbac QN01AB06
Cisatracurium Mylan 69252651
Pentobarbital PanPharma 68942457
Sevoflurane Abbvie N01AB08
Sufentanil Mylan 62404996

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