Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von horizontalen Hippocampus-entorhinalen Kortex-Scheiben (HEC) von Mäusen, die eine spontane scharfe Wellenwelligkeit saufen. Slices werden in einer vereinfachten Grenzraum-Haltekammer inkubiert und Aufnahmen werden unter getauchten Bedingungen mit schnell fließender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchgeführt, um die Sauerstoffversorgung des Gewebes und die spontane Entstehung von Netzwerkaktivität zu fördern.
Abstract
Akutes Nagetier-Gehirnschneiden bietet einen belastbaren experimentellen Ansatz, um Einblicke in die Organisation und Funktion neuronaler Schaltkreise mit einzelliger Auflösung mittels Elektrophysiologie, Mikroskopie und Pharmakologie zu gewinnen. Ein wichtiger Aspekt bei der Gestaltung von In-vitro-Experimenten ist jedoch das Ausmaß, in dem verschiedene Scheibenpräparate naturalistische Muster der neuronalen Aktivität rekapitulieren, wie sie in vivo beobachtet werden. Im intakten Gehirn erzeugt das Hippocampus-Netzwerk eine hochsynchronisierte Populationsaktivität, die den Verhaltenszustand des Tieres reflektiert, wie die scharfwelligen Wellenkomplexe (SWRs) am Beispiel der scharfwelligen Wellenkomplexe (SWRs) am Beispiel des Aufwachens oder des Nicht-REM-Schlafs. SWRs und andere Formen der Netzwerkaktivität können unter geeigneten Bedingungen spontan in isolierten Hippocampusscheiben entstehen. Um das leistungsstarke Gehirn-Slice-Toolkit auf die Untersuchung der Hippocampus-Netzwerkaktivität anzuwenden, ist es notwendig, einen Ansatz zu nutzen, der die Gewebegesundheit und die Erhaltung der funktionellen Konnektivität innerhalb des Hippocampus-Netzwerks optimiert. Mäuse werden transkardial mit kalter, auf Saccharose basierender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchlässig. Horizontale Scheiben, die den Hippocampus enthalten, werden mit einer Dicke von 450 m geschnitten, um die synaptische Konnektivität zu erhalten. Slices werden in einer Kammer im Interface-Stil wiederhergestellt und für Aufnahmen in eine untergetauchte Kammer übertragen. Die Aufnahmekammer ist für die doppelte Oberflächensuperfusion von künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit bei hoher Durchflussrate ausgelegt, um die Sauerstoffversorgung der Scheibe zu verbessern. Dieses Protokoll liefert gesundes Gewebe, das für die Untersuchung komplexer und spontaner Netzwerkaktivitäten in vitrogeeignet ist.
Introduction
Die elektrophysiologische Messung von lebenden Hippocampusscheiben in vitro ist ein kraftvoller experimenteller Ansatz mit zahlreichen Vorteilen. Der Experimentator kann ein Mikroskop, Mikromanipulatoren und ein Aufzeichnungssystem verwenden, um Messungen von einzelnen Neuronen im Gewebe direkt zu visualisieren und zu sammeln. Gewebescheiben sind auch sehr zugänglich für Photostimulation oder Arzneimittelabgabe für optogenetische, chemogenetische oder pharmakologische Experimente.
Das Hippocampus-Netzwerk erzeugt eine hochsynchrone Populationsaktivität in vivo, sichtbar als Schwingungen im extrazellulären lokalen Feldpotential1,2,3,4,5. Gehirn-Slice-Methoden wurden genutzt, um Einblicke in die zellulären und Schaltkreis-Mechanismen zu gewinnen, die diesen neuronalen Netzwerk-Oszillationen zugrunde liegen. Grundlagenarbeiten von Maier et al. zeigten, dass scharfe Wellenwellenkomplexe (SWRs) spontan in Scheiben des ventralen Hippocampus entstehen können6,7. Nachfolgende Studien von mehreren Forschern haben nach und nach viele Aspekte von SWRs aufgeklärt, einschließlich der Rolle von Neuromodulatoren bei der Regulierung des Netzwerkzustandes des Hippocampus8,9,10 und der synaptischen Mechanismen, die die In-vitro-Reaktivierung neuronaler Ensembles vorantreiben, die zuvor während des Verhaltens in vivo11aktiv waren. Hirn-Scheibenexperimente haben auch Einblick in die Gamma-Bereichs-Oszillation (30–100 Hz) gegeben, einen ausgeprägten Hippocampus-Netzwerkzustand, von dem angenommen wird, dass er die Speichercodierung und den Rückrufvon 12,13unterstützt. Schließlich haben Forscher, um die zentrale Rolle des Hippocampus und der damit verbundenen Strukturen in der Pathophysiologie der temporalen Lappenepilepsie14,15zu erkennen, Hippocampus-Scheibenpräparate verwendet, um die Erzeugung und Ausbreitung von epiptiformer Aktivität zu untersuchen. Carter et al. zeigten, dass kombinierte hippocampal-entorhinale Kortexscheiben, die von chronisch epileptischen Tieren hergestellt werden, spontan epileptische Einleitungen in vitro16erzeugen können. Anschließend untersuchten die Mittel, die den epileptiforformen Entladungen in Hippocampus-Scheiben zugrunde liegen, die Mechanismen, die den Epileptenableitungen zugrunde liegen, unter Verwendung modifizierter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) mit veränderten Ionenkonzentrationen (reduziert mg2+ oder erhöhte K+) oder zugesetzten Medikamenten (4AP oder Gabazin)17.
Die Forscher haben zahlreiche Hippocampus-Scheibenansätze entwickelt, die sich in schlüsselweisen Unterscheiden: (1) die Region des Hippocampus, die in der Scheibe enthalten ist (dorsal, mittel- oder ventral); (2) das Vorhandensein oder Fehlen von extrahippocampalen Geweben wie dem entorhinalen Kortex; (3) die Ausrichtung, die zum Schneiden von Scheiben (koronal, sagittal, horizontal oder schräg) verwendet wird; und (4) die Bedingungen, unter denen das Gewebe nach dem Schneiden gehalten wird (vollständig in ACSF getaucht oder an der Schnittstelle von ACSF und befeuchteter, autobogenreicher Luft gehalten).
Die Wahl des zu verwendenden Schneidansatzes sollte durch das Versuchsziel bestimmt werden. Zum Beispiel wurden quer- oder koronale Scheiben des dorsalen Hippocampus, die unter getauchten Bedingungen gepflegt werden, sehr effektiv für die Untersuchung von intrahippocampalen Schaltkreisen und synaptischer Plastizität18,19,20verwendet. Solche Präparate erzeugen jedoch nicht spontan Netzwerkschwingungen, so leicht wie Scheiben aus dem ventralen Hippocampus21,22,23. Obwohl ein Zustand anhaltender SWR-Aktivität durch tetanische Stimulation in Querscheiben aus dem dorsalen und ventralen Hippocampus24induziert werden kann, werden spontane SWRs leichter in ventralen Scheiben7,25beobachtet.
Eine inhärente physiologische und anatomische Unterscheidung zwischen dem dorsalen und ventralen Hippocampus wird durch Studien unterstützt, die sowohl in vivo als auch in vitrodurchgeführt werden26. Aufnahmen bei Ratten zeigten stark kohärente Theta-Rhythmen im dorsalen und mittleren Hippocampus, aber eine schlechte Kohärenz zwischen der ventralen Region und dem Rest des Hippocampus27. SWRs in vivo vermehren sich leicht zwischen dem dorsalen und mittleren Hippocampus, während SWRs, die ihren Ursprung im ventralen Hippocampus haben, oft lokal bleiben28. Die Assoziationsprojektionen, die von CA3-Pyramidenneuronen stammen, die sich im dorsalen und mittleren Hippocampus befinden, projizieren große Entfernungen entlang der Längsachse des Hippocampus. CA3-Projektionen aus ventralen Regionen bleiben relativ lokal und werden daher während des Schneidprozesses weniger wahrscheinlich durchtrennt29,30. Ventralslices können daher das wiederkehrende Netzwerk, das zur Erzeugung von Populationssynchronität erforderlich ist, besser erhalten. Die Neigung von ventralen Scheiben, spontane Netzwerkaktivitäten in vitro zu erzeugen, kann auch eine höhere intrinsische Erregbarkeit von pyramidenförmigen Neuronen oder eine schwächere GABAerge Hemmung im ventralen Hippocampus im Vergleich zu mehr dorsalen Regionen widerspiegeln31. Tatsächlich sind ventrale Hippocampusscheiben anfälliger für epilepptrime Aktivität32,33. So haben viele Studien der spontanen physiologischen8,9,11,24 oder pathologischen16,34,35,36 Netzwerkschwingungen traditionell einen horizontalen Schneidansatz verwendet, manchmal mit einem leichten Winkel in fronto-okzipitaler Richtung, der Gewebescheiben parallel zur Querebene des ventralen Hippocampus ergibt.
Die Netzwerkkonnektivität wird durch das Schneidverfahren unweigerlich beeinträchtigt, da viele Zellen im Slice getrennt werden. Der Winkel und die Dicke der Scheibe und das in der Zubereitung zurückgehaltene Gewebe sollten berücksichtigt werden, um die Konnektivität in den von Interesse interessierten Schaltkreisen zu optimieren. Viele Studien haben horizontale kombinierte Hippocampus-entorhinale Kortexscheiben (HEC) verwendet, um Wechselwirkungen zwischen den beiden Strukturen im Kontext physiologischer oder pathologischer Netzwerkschwingungen zu untersuchen. Roth et al. führten zwei Aufnahmen aus dem CA1-Unterfeld des Hippocampus und der Schicht V des medialen entorhinalen Kortex durch, um die Ausbreitung der SWR-Aktivität durch die HEC-Scheibe37zu demonstrieren. Viele Studien der epileppitischen Aktivität haben die HEC-Scheibenpräparation verwendet, um zu untersuchen, wie sich epileptische Entladungen durch das kortikohippocampale Netzwerk16,35,36,38ausbreiten. Es ist wichtig zu beachten, dass die Erhaltung der intakten Kortokhippocampalschleife keine Voraussetzung für spontane SWRs, epileptiforme Entladungen oder Gamma-Oszillationen ist; Netzwerkschwingungen können in Querscheiben des dorsalen oder ventralen Hippocampus ohne angehängte parahippocampale Gewebe21,22,23, 25,39,40,41erzeugt werden. Ein wichtigerer Faktor für die spontane Erzeugung von Netzwerkschwingungen in Hippocampus-Scheiben kann die Dicke jeder Scheibe sein, da eine dickere Scheibe (400–550 m) mehr Konnektivität im wiederkehrenden CA2/CA3-Netzwerk21,22,25erhalten wird.
Obwohl abgewinkelte horizontale HEC-Scheiben (mit einem ca. 12° Winkel in Front-Okzipital-Richtung geschnitten) verwendet wurden, um die funktionelle Konnektivität der Kortikohippocampal-Schleife11,16,34,35,42, solche abgewinkelten Präparate sind nicht erforderlich für spontane Netzwerkaktivität43,44,45. Die Verwendung einer abgewinkelten Schnittebene ermöglicht es dem Prüfer jedoch, selektiv Scheiben herzustellen, die die quer ausgerichtete Lamellen des ventralen oder mittleren Hippocampus am besten erhalten, je nachdem, ob ein Abwärts- oder ein Aufwärtswinkel angewendet wird (Abbildung 1). Dieser Ansatz ähnelt konzeptionell dem von Papatheodoropoulos et al., 2002, der jeden Hippocampus frei sezierte und dann einen Gewebechopper verwendete, um Querscheiben entlang der gesamten dorsal-ventralen Achse21zu erstellen. Angesichts der oben genannten funktionellen Unterscheidungen zwischen dem ventralen und dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus sollten die Forscher den anatomischen Ursprung von Scheiben bei der Gestaltung von Experimenten oder bei der Interpretation von Ergebnissen berücksichtigen. Die Verwendung einer Agarrampe während des Schneidvorgangs ist eine einfache Möglichkeit, bevorzugt Scheiben aus dem mittleren oder ventralen Hippocampus herzustellen.
Hippocampalscheiben können entweder in einer untergetauchten Kammer (mit vollständig empfänglichem Gewebe in ACSF) oder in einer Kammer im Interface-Stil (z. B. Oslo- oder Haas-Kammer, mit Scheiben, die nur von einem dünnen Film fließender Medien bedeckt sind) aufbewahrt werden. Die Schnittstellenpflege verbessert die Sauerstoffversorgung des Gewebes, was das neuronale Überleben fördert und eine anhaltend hohe intereuronale Aktivität ermöglicht. Traditionell verwenden die Bedingungen für die untergetauchte Aufzeichnung eine langsamere ACSF-Durchflussrate, die keine ausreichende Gewebesauerstoffversorgung für eine stabile Expression von Netzwerk-Level-Oszillationen bietet. In untergetauchten Hippocampusscheiben werden Carbachol-induzierte Gamma-Oszillationen nur vorübergehend46,47beobachtet, während sie in Schnittstellenaufnahmekammern10,48,49stabil gehalten werden können. Als solche haben sich viele Studien komplexer spontaner Aktivität in vitro auf Schnittstellenaufzeichnungskammern verlassen, um scharfwellige Wellenkomplexe6,7,8,9,10,25,37, Gamma-Oszillationen10,13und epileptiforme Aktivität16,38,45,47zu untersuchen.
In einer Aufnahmekammer im Untergetauchtstil kann ein Tauchmikroskopobjektiv verwendet werden, um einzelne Zellen zu visualisieren und gezielt gesund aussehende Zellen für Aufnahmen zu zielen. Das untergetauchte Präparat ermöglicht auch eine feine Kontrolle über das zelluläre Milieu, da das Tauchen eine schnelle Diffusion von Medikamenten oder anderen Verbindungen in das Gewebe erleichtert. Eine modifizierte Methodik, bei der stabile Netzwerkschwingungen unter unter Getauchtbedingungen aufrechterhalten werden, stellt somit einen starken experimentellen Ansatz dar. Ein Beispiel für diesen Ansatz ist die Arbeit von H.jos et al., bei der sich Hippocampusscheiben in einer vereinfachten Haltekammer im Grenzflächenstil für mehrere Stunden erholen, bevor sie in eine modifizierte Unterbrennkammer mit einer hohen Durchflussrate von ACSF (ca. 6 ml/min) übertragen werden, um die Sauerstoffversorgung des Gewebes zu verbessern12,48,49. Unter diesen Bedingungen können in einer untergetauchten Aufnahmekammer ein hohes Niveau der interneuronen Aktivität und stabile spontane Netzwerkschwingungen aufrechterhalten werden. Dieser modifizierte Ansatz ermöglicht es den Forschern, visuell geführte Ganzzell-Patchklemmenaufzeichnungen durchzuführen und den Beitrag morphologisch identifizierter Zelltypen zu Carbachol-induzierten Gammaoszillationen12zu charakterisieren. SWRs können auch spontan in untergetauchten Hippocampus-Scheiben mit einer schnellen Durchflussrate von ACSF11,48,49auftreten. Maier et al. zeigten, dass Hippocampus-Scheiben, die sich vor der Übertragung in eine untergetauchte Aufnahmekammer in einer Grenzkammer erholten, zuverlässig spontane SWRs zeigten, während Scheiben, die sich vor der Übertragung in eine untergetauchte Aufnahmekammer in ein Becherglas zurückzogen, kleinere evokierte Feldreaktionen, niedrigere Konzentrationen spontaner synaptischer Ströme zeigten und nur sehr selten spontane SWRs43zeigten. Schlingloff et al. nutzten diese verbesserte Methodik, um die Rolle von parvalbumin-exezierenden Korbzellen bei der Erzeugung spontaner WW44zu demonstrieren.
Das folgende Protokoll stellt eine Schneidmethode vor, mit der spontan aktive Neuronen in horizontalen Hippocampusscheiben unter Schnittstellenbedingungen zurückgewonnen und anschließend in einer untergetauchten Aufnahmekammer aufbewahrt werden können, die für pharmakologische oder optogenetische Manipulationen und visuell geführte Aufnahmen geeignet ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere Schritte in diesem Schneideprotokoll entwickelt, um die Gesundheit des Gewebes zu fördern und die Entstehung von spontanen naturalistischen Netzwerkaktivität zu fördern: die Maus ist transkardial durchlässig mit gekühlten Saccharose Schneiden Lösung; horizontal-entorhinale Kortex-Scheiben (HEC) werden mit einer Dicke von 450 m aus dem mittleren oder ventralen Hippocampus geschnitten; Scheiben erholen sich an der Schnittstelle von erwärmter ACSF und befeuchteter, autobogenreicher Luft; Während der …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor bedankt sich bei Steve Siegelbaum für die Unterstützung. Die Finanzierung erfolgt durch 5R01NS106983-02 sowie 1 F31 NS113466-01.
Materials
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
| beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
| calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| camera | Olympus | OLY-150 | |
| compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
| constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22×50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
| data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer – any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
| disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
| dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
| dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
| equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filter paper | Whatman | 1004 070 | |
| fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
| light source | Olympus | TH4-100 | |
| magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
| micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscope | Olympus | BX51WI | |
| microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
| nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platinum wire | World Precision | PT0203 | |
| polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| razor blades | VWR | 55411-050 | |
| roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
| scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
| sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
| stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
| stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
| support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
| vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| warm water bath | VWR | 1209 |
References
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