Isolamento de Histone do tecido da folha de sorgo para perfil de espectrometria de massa de top down de potenciais marcadores epigenéticos
Summary
O protocolo foi desenvolvido para extrair efetivamente histonas intactas de materiais de folhas de sorgo para o perfil de modificações pós-translacionais de histona que podem servir como potenciais marcadores epigenéticos para ajudar as culturas resistentes à seca de engenharia.
Abstract
Histones pertencem a uma família de proteínas altamente conservadas em eucariotes. Eles embalam DNA em nucleosósmos como unidades funcionais de cromatina. Modificações pós-translacionais (PTMs) de histones, que são altamente dinâmicas e podem ser adicionadas ou removidas por enzimas, desempenham papéis críticos na regulação da expressão genética. Nas plantas, fatores epigenéticos, incluindo PTMs histonas, estão relacionados às suas respostas adaptativas ao meio ambiente. Compreender os mecanismos moleculares do controle epigenético pode trazer oportunidades sem precedentes para soluções inovadoras de bioengenharia. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar os núcleos e purificar histones do tecido da folha de sorgo. As histonas extraídas podem ser analisadas em suas formas intactas por espectrometria de massa superior para baixo (MS) juntamente com cromatografia líquida de fase invertida on-line (RP) (LC). Combinações e estequiometria de múltiplos PTMs na mesma histona proteoforma podem ser facilmente identificadas. Além disso, o recorte da cauda de histone pode ser detectado usando o fluxo de trabalho LC-MS de cima para baixo, produzindo assim o perfil global PTM de histones centrais (H4, H2A, H2B, H3). Aplicamos este protocolo anteriormente para traçar o perfil de PTMs histítonos a partir de tecido de folha de sorgo coletados de um estudo de campo em larga escala, com o objetivo de identificar marcadores epigenéticos de resistência à seca. O protocolo poderia potencialmente ser adaptado e otimizado para sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina (ChIP-seq), ou para estudar PTMs de histona em plantas semelhantes.
Introduction
Espera-se que a gravidade e a frequência crescentes da seca afetem a produtividade das culturas cereais1,2. O sorgo é uma cultura de alimentos e energia de cereais conhecida por sua excepcional capacidade de suportar condições limitantes da água3,4. Estamos buscando a compreensão mecanicista da interação entre o estresse da seca, o desenvolvimento das plantas e a epigenética das plantas desorgo bicolor (L.) Moench). Nosso trabalho anterior demonstrou fortes conexões entre microbioma vegetal e rizosfera na aclimatação da seca e respostas no nível molecular5,6,7. Esta pesquisa abrirá caminho para a utilização da engenharia epigenética na adaptação das culturas aos cenários climáticos futuros. Como parte dos esforços na compreensão da epigenética, pretendemos estudar marcadores proteicos que impactam a expressão genética dentro do organismo vegetal.
Histones pertencem a uma família altamente conservada de proteínas em eucariotes que embalam DNA em nucleosósmos como unidades fundamentais de cromatina. Modificações pós-translacionais (PTMs) de histones são dinamicamente reguladas para controlar a estrutura da cromatina e influenciar a expressão genética. Como outros fatores epigenéticos, incluindo a metilação do DNA, os PTMs histonas desempenham papéis importantes em muitos processos biológicos8,9. Ensaios baseados em anticorpos, como manchas ocidentais, têm sido amplamente usados para identificar e quantificar PTMs histonas. Além disso, a interação de PTMs histonas e DNA pode ser efetivamente sondada pela imunoprecipitação chromatina – sequenciamento (ChIP-seq)10. Em ChIP-seq, cromatina com histone PTM específico é enriquecida por anticorpos contra esse PTM específico. Então, os fragmentos de DNA podem ser liberados da cromatina enriquecida e sequenciados. Regiões de genes que interagem com o ptm histona-alvo são reveladas. No entanto, todos esses experimentos dependem fortemente de anticorpos de alta qualidade. Para algumas variantes/homólogos de histona ou combinações de PTMs, o desenvolvimento de anticorpos robustos pode ser extremamente desafiador (especialmente para vários PTMs). Além disso, anticorpos só podem ser desenvolvidos se o PTM de histona-alvo for conhecido. 11 Portanto, são necessários métodos alternativos para perfis não-alvos globais de PTMs histonas.
A espectrometria de massa (MS) é um método complementar para caracterizar PTMs histonas, incluindo PTMs desconhecidos para os quais os anticorpos não estão disponíveis11,12. O bem estabelecido fluxo de trabalho “bottom-up” usa proteases para digerir proteínas em pequenos peptídeos antes da separação da cromatografia líquida (LC) e da detecção de ESM. Como as histonas têm um grande número de resíduos básicos (lise e arginina), a digestão de trippsina (protease específica para lysina e arginina) no fluxo de trabalho padrão de baixo para cima corta as proteínas em peptídeos muito curtos. Os peptídeos curtos são tecnicamente difíceis de analisar pela LC-MS padrão, e não preservam as informações sobre a conectividade e estequiometria de múltiplos PTMs. O uso de outras enzimas ou rotulagem química para bloquear a lises gera peptídeos mais longos que são mais adequados para caracterização de PTMs histone13,14.
Alternativamente, o passo de digestão pode ser completamente omitido. Nesta abordagem “de cima para baixo”, íons proteicos intactos são introduzidos no MS por ionização eletrospray (ESI) após a separação on-line da LC, produzindo íons dos proteoformes de histona intactos. Além disso, íons (ou seja, proteoforms) de interesse podem ser isolados e fragmentados no espectrômetro de massa para produzir os íons sequenciais para identificação e localização de PTM. Assim, a MS de cima para baixo tem a vantagem de preservar as informações de nível proteoforme capturar a conectividade de múltiplos PTMs e truncações terminais na mesma proteoforme15,16. Experimentos de cima para baixo também podem fornecer informações quantitativas e oferecer insights de biomarcadores no nível de proteína intactanível 17. Aqui, descrevemos um protocolo para extrair histona da folha de sorgo e analisar as histonas intactas por LC-MS de cima para baixo.
Os dados de exemplo mostrados na Figura 1 e Figura 2 são da folha de sorgo coletada na semana 2 após o plantio. Embora a variação de rendimento seja esperada, este protocolo é geralmente agnóstico para condições amostrais específicas. O mesmo protocolo tem sido usado com sucesso para tecido de folha de plantas de sorgo coletados de 2, 3, 5, 8, 9 e 10 semanas após o plantio.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado descreve como extrair histonas de amostras de folhas de sorgo (ou mais geralmente folha de plantas). Espera-se que o rendimento médio da histona seja de 2 a 20 μg por material de folha de sorgo de 4 a 5 g. Os materiais são suficientemente puros para a análise de histona a jusante por LC-MS (principalmente histones com ~20% de contaminação por proteína ribossômica). O rendimento mais baixo pode ser obtido devido a variações amostrais ou possíveis falhas/falhas ao longo do protocolo. Mant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Ronald Moore e Thomas Fillmore por ajudarem em experimentos de espectrometria em massa, e Matthew Monroe pela deposição de dados. Esta pesquisa foi financiada por subsídios do Departamento de Energia dos EUA (DOE) Pesquisa Biológica e Ambiental através do projeto Controle Epigenético da Resposta à Seca em Sorgo (EPICON) sob o número de premiação DE-SC0014081, do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), e através do Joint BioEnergy Institute (JBEI), uma instalação patrocinada pelo DOE (Contrato DE-AC02-05CH11231) entre o Lawrence Berkeley National Laboratory e o DOE. A pesquisa foi realizada utilizando-se o Laboratório de Ciências Moleculares Ambientais (EMSL) (grid.436923.9), um DoE Office of Science User Facility patrocinado pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental.
Materials
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
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