Summary
المجهر الفلوري القائم على الورقة الخفيفة هو الأداة الأكثر قيمة في علم الأحياء التنموي. ومن القضايا الرئيسية في الدراسات المقارنة التباين المحيط. يصف بروتوكولنا إطارا تجريبيا للتصوير الحي المتزامن لعينات متعددة ، وبالتالي ، يعالج هذه المشكلة بشكل نشط.
Abstract
يوفر المجهر الفلوري القائم على الورق الخفيف حلولا فعالة لدراسة العمليات المعقدة على نطاقات متعددة ذات صلة بيولوجيا. نماذج الأجهزة القائمة على غرفة، والتي تم تصميمها خصيصا للحفاظ على سلامة ثلاثية الأبعاد للعينة وعادة ما ميزة دوران العينة، هي الخيار الأفضل في علم الأحياء التنموية. على سبيل المثال ، تم استخدامها لتوثيق التكوين الجنيني الكامل لذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster وخنفساء الدقيق الأحمر Tribolium castaneum. ومع ذلك، فإن العديد من بروتوكولات التصوير الحي المتاحة توفر أطرا تجريبية فقط للأجنة المفردة. خاصة بالنسبة للدراسات المقارنة ، فإن مثل هذه النهج غير مريحة ، لأن العينات المصورة بالتتابع تتأثر بالتباين المحيط. علاوة على ذلك ، يحد هذا من عدد العينات التي يمكن فحصها في غضون وقت معين. نحن نقدم إطارا تجريبيا للتصوير الحي المتزامن الذي يزيد من الإنتاجية في الأجهزة القائمة على غرفة العينة وبالتالي يضمن ظروفا محيطة مماثلة لجميع العينات. أولا، نحن نقدم إرشادات المعايرة للمجاهر الفلورية ذات الورقة الخفيفة. ثانيا، نقترح طريقة تركيب للأجنة المتعددة التي تتوافق مع دوران العينة. ثالثا، نحن نقدم نموذجية ثلاثية الأبعاد مجموعات بيانات التصوير الحي من Drosophila، والتي نحن الجمع بين ثلاثة خطوط المعدلة وراثيا مع نواة المسمى fluorescently، وكذلك من Tribolium، والتي نقارن أداء ثلاثة خطوط فرعية المعدلة وراثيا التي تحمل نفس الجين، ولكن في مواقع الجينوم المختلفة. تم تصميم بروتوكولنا خصيصا للدراسات المقارنة لأنه يعالج بشكل نشط التباين المحيط ، والذي يكون موجودا دائما في التصوير الحي التسلسلي. وهذا مهم بشكل خاص للتحليلات الكمية وتوصيف الأنماط الظاهرية الشاذة، والتي تنتج على سبيل المثال، عن تجارب خروج المغلوب. علاوة على ذلك ، فإنه يزيد من الإنتاجية الإجمالية ، والتي هي مريحة للغاية عندما يكون الوصول إلى مجاهر مضان الصفائح الخفيفة محدودا. وأخيرا، يمكن تكييف طريقة التركيب المقترحة لأنواع الحشرات الأخرى والكائنات الحية النموذجية الأخرى، مثل سمك الحمار الوحشي، مع عدم بذل أي جهد للتحسين.
Introduction
يعد الفحص المجهري الفلوري أحد أهم تقنيات التصوير في علوم الحياة، وخاصة في بيولوجيا الخلايا والتطور. في المجاهر الفلورية confocal1، والتي هي دولة من بين الفن للتصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد منذ منتصف 1990s ، وتستخدم نفس العدسة لإثارة الفلوروفور والكشف عن ضوء الانبعاثات. شعاع ليزر الإضاءة يثير جميع الفلوروفور على طول محور الإضاءة / الكشف ويتم التمييز بين إشارة خارج التركيز المعنية قبل الكشف عن طريق ثقب. وبالتالي ، لكل صورة ثنائية الأبعاد ، يتم إضاءة العينة بأكملها. وبالتالي ، لكل صورة ثلاثية الأبعاد ، أي كومة من الصور ثنائية الأبعاد المتتالية مكانيا ، يتم إضاءة العينة بأكملها عدة عشرات إلى بضع مئات من المرات2، مما يعزز photobleaching والسمية الضوئية3.
منذ ما يقرب من عشرين عاما ، ظهرت التكنولوجيا المستندة إلى ورقة الضوء4 كبديل واعد للتصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد ، وبالتالي أصبحت أداة قيمة في علم الأحياء التنموي5. وفي هذا النهج، يتم فصل الإضاءة والكشف. تستخدم عدسة الإضاءة لتوليد ورقة ضوئية بعمق لا يتجاوز بضعة ميكرومترات داخل المستوى البؤري لعدسة الكشف المرتبة عموديا. وبالتالي ، لكل صورة ثنائية الأبعاد ، يتم إضاءة حجم مستو رفيع فقط حول المستوى البؤري. وبالتالي ، لكل صورة ثلاثية الأبعاد ، يتم إضاءة العينة بأكملها مرة واحدة فقط ، مما يقلل بقوة من الbleaching الضوئي والسمية الضوئية6. ولهذا السبب، توفر المجاهر الفلورية ذات الصفائح الخفيفة حلولا فعالة لدراسة العمليات المعقدة على نطاقات متعددة ذات صلة بيولوجيا، وبالتالي فهي ذات قيمة خاصة في البيولوجيا التنموية، حيث يجب تحليل عينات كبيرة مثل عدة ملليمترات على المستوى دون الخلوي.
تاريخيا، وقد LSFMs عينة على أساس غرفة7،8. في هذه الاجهزة، عادة ما يتم ترتيب الإضاءة (س) والكشف (ض) محاور عموديا على محور الجاذبية (ص). غرف العينة توفر حرية تجريبية وافرة. أولا، أنها توفر قدرات التخزين المؤقت التصوير كبيرة، والتي بدورها يخفف من استخدام نظام التشوه للسيطرة على البيئة، على سبيل المثال، للحفاظ على درجة حرارة محددة9 أو لتطبيق الضغوطات الكيميائية الحيوية. علاوة على ذلك ، فإنها تدعم أساليب التركيب المخصصة10 المصممة لتلبية الاحتياجات التجريبية ذات الصلة مع الحفاظ على الأبعاد الثلاثة ، في بعض الحالاتالديناميكية 11، سلامة العينة. بالإضافة إلى ذلك، عادة ما تكون مجهزة نماذج غرفة القائم على وظيفة دوران التي تستخدم لتدور العينات حول محور ص وبالتالي صورة لهم على طول اثنين، أربعة أو أكثر من الاتجاهات. وبما أن أجنة الكائنات النموذجية الشائعة الاستخدام هي، في سياق المجهر، فإن التصوير الكبير نسبيا والمتعاقب على طول محاور الجسم البطنية الظهرية والجانبية و/أو الأمامية الخلفية يوفر تمثيلا أكثر شمولا. وهذا يسمح على سبيل المثال، تتبع طويل الأجل للخلايا التي تتحرك على طول مسارات الهجرة ثلاثية الأبعاد المعقدة12،13.
وقد تم تطبيق المجهر المضان على أساس ورقة الضوء على نطاق واسع لدراسة التكوين المورفوجيني الجنيني من الميلانوغاستر Drosophila، وكلاهما بشكل منهجي14،15 وكذلك مع التركيز بشكل خاص على الجوانب الفيزيائية الحيوية للتنمية. على سبيل المثال، تم استخدامه لجمع بيانات مورفوجينية عالية الدقة من أجل الكشف عن وجود صلة ميكانيكية حيوية بين إندورفينيشن إندوديرم وتمديد المحور أثناء استطالة الفرقة الجرثومية16 وبالإضافة إلى ذلك لربط التدفق الخلوي المعقد بأنماط توليد القوة أثناء التجويف17. كما تم دمجها مع تقنيات أخرى حديثة ، على سبيل المثال ، optogenetics للتحقيق في تنظيم إشارات WNT أثناء النقش الأمامي الخلفي في البشرة18.
ومع ذلك، فإن دراسة نوع واحد فقط لا يوفر رؤى حول تطور التنمية. لفهم تكوين الأجنة في السياق النباتي ، تم إجراء أبحاث مكثفة مع كائنات نموذج الحشرات البديلة. واحدة من الأنواع الأكثر شمولا التحقيق هو خنفساء الدقيق الأحمر Tribolium كاستانيوم، وهي آفة الحبوب المخزنة ذات الصلة اقتصاديا19، والتي تم أيضا تصويرها بشكل منهجي مع تكوين المورفوجين الجنيني مع LSFM20. يختلف التكوين الجنيني لهذين النوعين بشكل ملحوظ في عدة جوانب ، على سبيل المثال ، وضع التقسيم21، وكذلك تكوين وتدهور الأغشية الجنينية22. وقد تم بالفعل تحليل هذا الجانب الأخير على نطاق واسع باستخدام LSFMs. على سبيل المثال، فقد ثبت أن سيروسا، وهو نسيج خارج الجنين الذي يغلف ويحمي جنين تريبوليوم من المخاطر المختلفة للجزء الأفضل من تكوين الجنين23،24، يعمل أيضا ك "سائق" مورفوجيني لعملية الانسحاب الخاصة به أثناء الإغلاق الظهري25. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أنه خلال gastrulation ، لا تزال منطقة معينة من blastoderm راسية في الغشاء الهوتيلي من أجل إنشاء حركات الأنسجة غير المتماثلة26 ، وبعد هذه الملاحظة ، أن سيولة الأنسجة الإقليمية تسمح للخلايا بمغادرة حافة سيروسا بشكل متسلسل أثناء إغلاق نافذة serosa27.
في جميع Drosophila- والدراسات المرتبطة Triboliumالمذكورة أعلاه، وقد استخدمت عينات LSFMs القائمة على غرفة. في معظم, وسجلت الأجنة على طول اتجاهات متعددة باستخدام وظيفة دوران العينة. على الرغم من أن لم يذكر صراحة, يمكن افتراض أن تم تسجيلها بشكل فردي، وبالتالي مستقلة عن بعضها البعض في مقايسات التصوير الحية متتابعة, مماثلة لعملنا السابق على Tribolium20,28. وفي بعض السيناريوهات، يكون هذا النهج مقبولا، ولكن على وجه الخصوص في النهج المقارنة الكمية، يمكن أن يشوه التباين المحيط النتائج. على سبيل المثال ، كان من المعروف منذ فترة طويلة أن سرعة نمو الحشرات تعتمد على درجة الحرارة29، ولكن دراسة أحدث تشير إلى أنه في Drosophila، قد تؤثر درجة الحرارة أيضا على تركيز المورفوجينات30. وبالتالي، إذا كان ينبغي تحديد خصائص معينة لنشأة الجنين، مثل النسب الدينامية ومعدلات التقسيم وسرعات الهجرة للخلايا، على وجه التحديد، يلزم تكرار كاف دون تباين محيط. وهذا يقلل من الانحرافات المعيارية والأخطاء المعيارية، والتي بدورها تسهل التجاور مع غيرها، حتى مجرد ظروف تجريبية متباينة هامشيا.
ومع ذلك، تم تصميم نموذج LSFMs المستندة إلى غرفة أساسا لمحتوى عالي بدلا من المقايسات الإنتاجية العالية. على عكس المجاهر confocal ، والتي عادة ما تكون مجهزة بآليات المشبك الموحدة لشرائح المجهر ، وأطباق بيتري ولوحات الآبار ، تستخدم جميع أجهزة LSFMs القائمة على غرفة العينة تقريبا آليات المشبك المستندة إلى الأسطوانات. وتهدف هذه الآليات لأصحاب العينة حسب الطلب التي هي التناوب متوافقة وكذلك غير الغازية10، ولكن عادة لا صمم لأكثر من عينة واحدة20،31،32. ويتناول إطار التصوير الحي المتزامن لأجنة أو أكثر، حيث لا تتعرض مزايا الأجهزة القائمة على غرفة العينة للخطر، مسألة التباين المحيط وبالتالي زيادة قيمة LSFMs للدراسات المقارنة.
في بروتوكولنا، نقدم إطارا تجريبيا للتصوير الحي المقارن في عينات LSFMs القائمة على غرفة(الشكل 1A)حيث يتم استخدام محور ص كخيار ل "كومة" الأجنة. أولا، نحن نقدم مبادئ توجيهية للمعايرة الفلورية القائمة على الميكروسفيرات لآليات LSFMs القائمة على غرفة العينة، وهو أمر مهم بشكل خاص للأجهزة التي تفتقر إلى مساعد المعايرة. ثانيا، نحن نصف طريقة تركيب للأجنة متعددة على أساس حامل خيوط العنكبوت28 (الشكل 1B)التي تتوافق مع دوران العينة، وبالتالي يسمح التصوير المتزامن لعينات متعددة على طول اتجاهات متعددة(الشكل 1C). يتم محاذاة العديد من الأجنة فوق فيلم أغاروز رقيقة، وبعد إدراجها في غرفة العينة، انتقلت تباعا من خلال ورقة الضوء للحصول على صور ثلاثية الأبعاد. ثالثا، نحن نقدم ثلاث مجموعات بيانات تصوير حي مثالية ل Drosophila وكذلك لتريبوليوم. بالنسبة للأول ، فإننا نخلط بين الخطوط المعدلة وراثيا مع نواة تحمل علامة fluorescently. وبالنسبة لهذا الأخير، فإننا نقارن أداء الخطوط الفرعية المعدلة وراثيا التي تحمل نفس المتحولين جنسيا، ولكن في مواقع الجينوم المختلفة. وأخيرا، نناقش أهمية التوازي فيما يتعلق بالتصوير الحي المقارن والتباين المحيط33،ونناقش الحد الإنتاجي لإطارنا التجريبي ونقيم تكييف نهجنا مع الكائنات الحية النموذجية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الأعمال التحضيرية
- اختر عدسة إضاءة/عدسة كشف/تركيبة كاميرا ل LSFM تناسب السؤال العلمي وإعدادات المجهر. حجم مجال الرؤية هو حاصل حجم رقاقة الكاميرا وتكبير عدسة الكشف. يجب اختيار عدسة الإضاءة بحيث يتم تغطية مجال الرؤية بأكمله بورقة ضوء مستو تقريبا34. يتم سرد ثلاث مجموعات الموصى بها في الجدول 1.
- لإعداد agarose aliquots واسترجاع الأطباق، إضافة 2 غرام من الآغاروز منخفضة الذوبان إلى 200 مل ماء الصنبور autoclaved وتسخين الخليط في فرن الميكروويف في 600-800 واط حتى يتم حل جميع جزيئات الآجيروز. إعداد عدة 1 مل agarose aliquots في 1.5 مل أو 2 مل أنابيب رد الفعل، ثم ملء عدة أطباق 90 ملم Ø بيتري 3-5 مم عالية مع agarose. يخزن اليكوتات الصلبة والأطباق عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- ل Drosophila: لإعداد قوارير تربية طازجة، طهي كمية كافية من العرف أو المتاحة تجاريا Drosophila المتوسطة، ونقل 5-15 مل في قوارير واسعة وتخزينها في 4 درجة مئوية. لإعداد أطباق وضع البيض، أضف 1 غرام من الآغروز منخفض الذوبان إلى 50 مل من ماء الصنبور المعبئ وتسخين الخليط في فرن ميكروويف 600-800 واط حتى يتم إذابة جميع جزيئات الآغروز. السماح للخليط لتبرد إلى 45 درجة مئوية، ثم إضافة عصير الفاكهة 50 مل (ويفضل التفاح أو العنب الأحمر) وتخلط جيدا. صب الخليط في أطباق بيتري 35 ملم وتخزين أطباق وضع البيض الصلبة في 4 درجة مئوية.
- لTribolium: لإعداد المتوسطة النمو، وتمرير دقيق القمح الكامل وكذلك الخميرة الجافة غير نشط من خلال 710 ميكرومتر حجم شبكة منخل، ثم تكملة الدقيق منخل مع 5٪ (ث / ث) خميرة منخل. لإعداد البيض وضع المتوسطة، وتمرير دقيق القمح غرامة وكذلك الخميرة الجافة غير نشطة من خلال منخل حجم شبكة 250 ميكرومتر، ثم تكملة الدقيق منخل مع 5٪ (ث / ث) الخميرة منخل.
2. معايرة غرفة عينة تستند LSFMs باستخدام ميكروسفيرات الفلورسنت
ملاحظة: الغرض من المعايرة هو محاذاة النقاط المحورية لعدسات الإضاءة والكشف(الشكل 2A)،لأن هذا هو فرضية للصور واضحة. يجب معايرة LSFMs بانتظام، مرة واحدة على الأقل كل 3-4 أسابيع.
- إعادة تسييل agarose aliquot في سخان كتلة جافة / خلاط في 80 درجة مئوية، ثم السماح للaliquot agarose لتهدئة إلى 35 درجة مئوية.
- نقل 50 ميكرولتر من الآغاروز إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل وإضافة 0.5 ميكرولتر من محلول ميكروسفير فلوري. تخلط في 1400 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة.
- ملء ثقب مشقوق من حامل خيوط العنكبوت مع 10 ميكروغرام من خليط محلول agarose / الفلورسنت المجهرية، ثم يستنشق أكبر قدر ممكن من الآغاروز حتى يبقى سوى فيلم أغاروز رقيقة. انتظر 30-60 ق لالتصلب.
- ملء غرفة العينة مع ماء الصنبور autoclaved. أدخل حامل خيوط العنكبوت ببطء في غرفة العينة وحرك الثقب المشقوق مع مراحل النقل الدقيق أمام عدسة الكشف.
- تدوير حامل خيوط العنكبوت مع مرحلة الدوران إلى موضع 45 درجة بالنسبة إلى الإضاءة (س) والكشف (ض) محاور. يجب ألا يكون حامل خيوط العنكبوت مرئيا في قناة ضوء الإرسال.
- قم بالتبديل إلى قناة الفلورسينس المعنية وضبط طاقة الليزر وكذلك وقت التعرض بحيث توفر الميكروسفيرات الفلورية إشارة مناسبة.
- حدد حجم الرؤية التي تغطي الآن فيلم agarose الموجه بشكل عرضي تماما. حدد التباعد z عن طريق حساب الدقة المحورية الممكنة إلى أقصى حد لعدسة الإضاءة / تركيبة عدسة الكشف34. بدلا من ذلك، يمكن استخدام 4 مرات الدقة الجانبية كتقريب تقريبي.
- سجل ثلاثي الأبعاد اختبار z كومة من ميكروسفيرس الفلورسنت ومقارنة x و y و z أقصى التوقعات إلى مخطط المعايرة(الشكل 2). إذا كانت المجهرية تبدو ضبابية ، غامض ، و / أو مشوهة(الشكل 2باء ، جيم)، وضبط مواقف الإضاءة و / أو عدسة الكشف.
3. مجموعة من الأجنة Drosophila
- نقل 100-200 من البالغين من خط Drosophila الاختيار إلى قارورة تربية جديدة 2-3 أيام قبل الفحص التصوير لإنشاء ثقافة جمع البيض. إذا لم تكن موجودة بعد، والنظر في استخدام قارورة تربية القديمة لبدء ثقافة ذرية. لضمان أن البالغين لا يزيد عمرهم عن أسبوعين، استبدل ثقافة جمع الأجنة في الوقت المناسب بثقافة السلف.
- قم بتدفئة طبق وضع البيض إلى درجة حرارة الغرفة وأضف قطرة من عجينة الخميرة فوق الأجار.
- نقل البالغين من ثقافة جمع البيض إلى قارورة ضيقة فارغة ووضعها على رأس طبق وضع البيض. احتضان إعداد مجموعة البيض في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. تجنب التخدير (بارد، CO2)خلال هذه الخطوة إذا كان ذلك ممكنا.
- إعادة البالغين إلى قارورة تربية. احتضان طبق وضع البيض في تركيبة مريحة درجة الحرارة / الوقت، ثم نقل 10-20 الأجنة مع فرشاة طلاء صغيرة من طبق وضع البيض إلى 100 ميكرومتر شبكة حجم مصفاة الخلية. تجاهل طبق وضع البيض.
- كرر الخطوات من 3.1 إلى 3.4 لكل خط Drosophila.
4. جمع أجنة التريبوليوم
ملاحظة: للراحة، يتم توفير مخطط إجراء جمع البيض Tribolium (الشكل 3A)الذي أيضا الأرقام داخل الأقواس في هذه الخطوة الرجوع.
- نقل 200-300 الكبار (حوالي 400-700 ملغ) من خط تريبوليوم من اختيار لزجاجة فارغة 1 L 2-10 أيام قبل التصوير المقايسة لإنشاء ثقافة جمع البيض (الشكل 3A_01). ملء زجاجة مع 50-100 غرام من متوسط النمو الطازج. إذا لم تكن موجودة بعد ، ففكر في بدء ثقافة ذرية باستخدام اليرقات والجراء المتاحة. لضمان البالغين لا يزيد عمرها عن 3 أشهر، استبدل ثقافة جمع البيض في الوقت المناسب بثقافة ذرية.
- تمرير ثقافة جمع البيض من خلال منخل حجم شبكة 800 ميكرومتر (الشكل 3A_02). إعادة متوسط النمو الذي يحتوي على أجنة غير مرحلية إلى الزجاجة الأولية (الشكل 3A_03) ونقل البالغين إلى زجاجة فارغة 1 لتر (الشكل 3A_04). إضافة 10 غرام من البيض زرع المتوسطة (الشكل 3A_05) واحتضان إعداد جمع البيض في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة (الشكل 3A_06,07).
- تمرير إعداد مجموعة البيض من خلال 800 ميكرومتر حجم شبكة منخل (الشكل 3A_08). إعادة البالغين إلى زجاجة الأولية (الشكل 3A_09). اعتمادا على عملية النمو التي ينبغي تصويرها، واحتضان المتوسطة زرع البيض، والذي يحتوي الآن على حوالي 30-100 الأجنة، في درجة حرارة مريحة / مزيج الوقت (الشكل 3A_10).
- تمرير المتوسطة وضع البيض من خلال 300 ميكرومتر حجم شبكة منخل (الشكل 3A_11) ونقل الأجنة (الشكل 3A_12) إلى 100 ميكرومتر شبكة حجم الخلية مصفاة. تجاهل وسائط البيض المنخل(الشكل 3A_13).
- كرر الخطوات من 4.1 إلى 4.4 لكل خط تريبوليوم.
5. التخلص من الديووريونات القائمة على هيبوكلوريت الصوديوم
ملاحظة: يتم تغطية كل من أجنة دروسوفيلا وتروبوليوم من قبل المشيمة، وهي طبقة بروتين واقية وخفيفة التشتت بشكل كبير ليست ضرورية للتنمية السليمة طالما يتم الاحتفاظ بالأجنة رطبة بعد إزالتها. بروتوكول إزالة المشيمة للأجنة من كلا النوعين متطابق.
- إعداد لوحة 6-جيدا عن طريق ملء A1، A2، A3 و B3 الآبار مع 8 مل من ماء الصنبور autoclaved وB1 و B2 الآبار مع 7 مل من ماء الصنبور autoclaved و 1 مل من هيبوكلوريت الصوديوم (NaOCl) حل (الشكل 3B). مراقبة عملية dechorionation تحت مجهر ستيريو، من الناحية المثالية في ضوء انتقال.
تنبيه: هيبوكلوريت الصوديوم هو تآكل. - أدخل مصفاة الخلايا المحتوية على الجنين (الخطوة 3.4 و/أو 4.4) في بئر A1 واغسل الأجنة حوالي 30-60 ثانية تحت هياج لطيف.
- نقل مصفاة الخلية إلى بئر B1 ويهز لوحات بقوة لمدة 30 ق، ثم نقله إلى بئر A2 وغسل الأجنة لمدة 1 دقيقة تحت التحريض لطيف.
- نقل مصفاة الخلية إلى B2 جيدا ويهز لوحة بقوة حتى يتم dechorionated معظم الأجنة تماما (الشكل 3C)، ثم نقله إلى بئر A3 وغسل الأجنة لمدة 1 دقيقة تحت التحريض لطيف.
- تخزين مصفاة الخلية في B3 جيدا قبل الشروع في إجراء تصاعد.
- كرر الخطوات من 5.1 إلى 5.5 لكل سطر.
6. تركيب أجنة متعددة باستخدام حامل خيوط العنكبوت
- إعادة تسييل agarose aliquot في سخان كتلة جافة / خلاط في 80 درجة مئوية، ثم السماح للaliquot agarose لتهدئة إلى 35 درجة مئوية.
- Pipet 10 ميكرولتر من agarose على رأس ثقب مشقوق من حامل خيوط العنكبوت. مع طرف ماصة، ونشر agarose على ثقب مشقوق، ثم يستنشق أكبر قدر ممكن من الآغاروز حتى يبقى سوى فيلم أغاروز رقيقة. انتظر 30-60 ق لالتصلب.
- لكل سطر، اختر بعناية جنينا واحدا أو أكثر باستخدام فرشاة طلاء صغيرة ووضعها على فيلم الآجروز.
- ترتيب الأجنة على طول المحور الطويل للثقب مشقوق، ثم أيضا محاذاة محورها الأمامي الخلفي مع محور طويل من ثقب مشقوق(الشكل 3D).
- استقرار الأجنة بعناية عن طريق الأنابيب 1-2 ميكرولتر من الآغروز في الفجوة بين الأجنة وفيلم الآغروز. انتظر 30-60 ق لالتصلب.
- أدخل حامل خيوط العنكبوت مع الأجنة المركبة ببطء في غرفة عينة الصورة المليئة بالمخزن المؤقت.
7. التصوير الحي المقارنة في غرفة عينة المستندة إلى LSFMs
- نقل أحد الأجنة مع مراحل النقل الدقيق أمام عدسة الكشف. تأكد من أن حامل خيوط العنكبوت في وضع 45 درجة بالنسبة للإضاءة (س) وفؤوس الكشف (ض) (راجع الشكل 1C).
- في قناة ضوء الإرسال، حرك الجنين إلى مركز مجال الرؤية. يجب ألا يكون حامل شبكة العنكبوت مرئيا.
- تحريك الجنين مع مراحل النقل المجهري في z حتى تتداخل الطائرة الوسطى للجنين مع المستوى البؤري ، أي حتى يظهر المخطط التفصيلي حادا. دون التحول إلى قناة الفلورسينس، حدد حجم الرؤية عن طريق تحريك 250 ميكرومتر بعيدا عن الطائرة المتوسطة في كلا الاتجاهين.
- اختياريا، إذا كان التصوير على طول اتجاهات متعددة مطلوبا، قم بتدوير الجنين بشكل مناسب وكرر الخطوتين 7.2 و7.3. يدعم حامل خيوط العنكبوت ما يصل إلى أربعة اتجاهات في خطوات 90 درجة.
- كرر الخطوات من 7.1 إلى 7.3 (أو 7.4) لجميع الأجنة الأخرى المثبتة على حامل خيوط العنكبوت(الشكل 3E). تأكد من أن الجنين الأعلى لا يترك المخزن المؤقت للتصوير عندما يكون الجنين في أقصى القاع أمام عدسة الكشف.
- حدد معلمات القناة الفلورية (طاقة الليزر ووقت التعرض وفلتر الكشف) وفاصل الوقت (الفاصل الزمني والمدة الإجمالية) وابدأ عملية التصوير. للحصول على قيم إرشادية، راجع جدول بيانات التعريف لمجموعات البيانات المثال(الجدول التكميلي 1). بالنسبة للمقاايسات التي تستمر لعدة أيام ، فكر في تغطية فتح غرفة العينة جزئيا على الأقل للحد من التبخر.
8. استرجاع وزراعة الأجنة المصورة
- عند انتهاء فحص التصوير، قم بإزالة حامل خيوط العنكبوت بعناية من غرفة العينة.
- فصل الأجنة من فيلم الآجروز مع فرشاة طلاء صغيرة ونقلها إلى شريحة المجهر المسمى بشكل مناسب. ضع الشريحة في طبق استرجاع واحتضنها في ظل ظروف التربية القياسية المعنية.
- فيما يتعلق بالطرائق التجريبية، قم بتقدير متى يتم الانتهاء من تكوين الجنين. مع اقتراب نقطة وقت الفقس ، تحقق من أطباق الاسترجاع بشكل متكرر ونقل يرقات Drosophila المفقسة إلى قوارير التربية الفردية ويرقات Tribolium إلى الآبار الفردية من لوحة من 24 بئرا. ملء الآبار تصل إلى النصف مع متوسط النمو. احتضان تحت ظروف التربية القياسية ذات الصلة.
- بمجرد أن يكون الأفراد الملاحظون بالغين ، قم بتزويدهم بشريك تزاوج مناسب وتحقق من وجود ذرية بعد عدة أيام.
9. معالجة بيانات الصور ووثائق البيانات الوصفية
ملاحظة: بالنسبة لمعالجة بيانات الصور، يوصى باستخدام ImageJ في فيجي35 (imagej.net/Fiji/Downloads). فيجي لا تتطلب التثبيت و32- فضلا عن إصدارات 64 بت متوفرة. واحدة من التنسيقات الأكثر استخداما لبيانات LSFM هو تنسيق ملف الصورة الموسومة (TIFF) ، والذي يسمح بتخزين أكوام الصور في شكل حاوية TIFF.
- حساب الإسقاطات z الأقصى لكافة مكدسات z (صورة | | المكدسات Z Project, اختر الحد الأقصى للكثافة). والإسقاطات القصوى هي نهج تبسيط البيانات التي تقلل عدد الأبعاد المكانية من ثلاثة أبعاد إلى بعدين. يتم توفير برنامج نصي فيجي لمعالجةالدفعة (ملف تكميلي 1).
- قم بتكثيف الإسقاطات القصوى ل z لإنشاء مداخن زمنية (ر مكدسات). حفظ هذه في حاوية TIFF واحد. القيام بذلك لجميع الأجنة المسجلة وكذلك الاتجاهات المعنية وقنوات الفلورسينس إذا كان ذلك ممكنا.
- تدوير المكدس z و t حول محور z لمحاذاة المحور الأمامي الخلفي للأجنة مع محور الصورة س أو ص(صورة | تحويل | تدوير). اقتصاص مداخن ض على طول محاور الصور الثلاثة وكومة ر في محاور الصور س و ص بحيث تبقى فقط مساحة التخزين المؤقت الدنيا (20-40 بكسل على طول محاور س و ص، 5-10 صور على طول محور ض) حول الجنين (صورة | ضبط | حجم قماش لمحاور س و ص، صورة | | المكدسات أدوات | شريحة حارس للمحور ض).
- القيام بذلك بشكل فردي لجميع الأجنة المسجلة وكذلك الاتجاهات المعنية، إذا كان ذلك ممكنا. وينبغي معالجة قنوات الفلورسينس، إن وجدت، بمعلمات تناوب واقتصاص متطابقة.
- توثيق بيانات التعريف مفصلة قدر الإمكان. وكمبدأ توجيهي، يمكن استخدام جدول البيانات الوصفية لمجموعات البيانات على سبيل المثال، والتي ترد في قسم النتائج التمثيلية (الجدول التكميلي 1).
10. تصور البيانات
ملاحظة: يركز هذا المبدأ التوجيهي تصور البيانات في المقام الأول على إنشاء مصفوفات الصورة الإسقاط الأقصى z التي تظهر العديد من الأجنة المسجلة على طول اتجاهات متعددة و / أو مع مرور الوقت. تصف الخطوات التالية إجراء تصور البيانات الذي تم تطبيقه على مجموعات بيانات المثال لإنشاء الأرقام المعروضة ومقاطع الفيديو المرتبطة في قسم نتائج الممثل.
- الجمع بين ر أكوام من اتجاهات متعددة (صورة | | المكدسات أدوات | الجمعبين ) و / أو دمج قنوات متعددة مضان (صورة | | الألوان دمج القنوات) لتصور البنية البيولوجية و / أو عملية الاهتمام.
- ضبط كثافة ر مكدسات (صورة | ضبط | السطوع / التباين) حسب الحاجة باستخدام"تعيين"وظيفة. يجب تعيين الحد الأدنى للقيمة المعروضة أعلى قليلا من إشارة الخلفية ، يجب أن تؤدي القيمة القصوى المعروضة إلى تباين مناسب. قم بتوثيق القيمتين، حيث يمكن استخدامهما لتعديل متناسق لمداخن z المعنية. تعديلات البصمة باستخدام"تطبيق"الدالة. اعتمادا على الطرائق التجريبية، فكر في معالجة جميع الأجنة المسجلة بقيم متطابقة.
- حفظ كثافة ضبط ر مكدسات كملفات منفصلة، لا تتجاوز ر مكدسات غير معدلة. تجميع مداخن فرعية مناسبة من ر مكدسات ضبطها مع وظائف مخصصة لتحديد الصورة (على سبيل المثال، صورة | | المكدسات أدوات | شريحة حارس) واستخدام أداة المونتاج (صورة | | المكدسات جعل المونتاج) لإنشاء شبكات الصور التي يمكن استخدامها لتصميم الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف بروتوكولنا إطارا تجريبيا للتصوير الحي المضان المقارن في أجهزة LSFMs القائمة على غرفة العينة. فعلى سبيل المثال، يمكن استخدام الإطار للتقريب بين '1' أجنة لنوعين أو أكثر، '2' أجنة الخطوط التي يتم فيها إسقاط جين واحد أو أكثر بالإضافة إلى ضوابط من النوع البري، '3' أجنة متعددة من نفس الخط المعدل وراثيا، '4' أجنة من خطوط معدلة وراثيا مختلفة، أو '5' أجنة من خطوط فرعية تحمل نفس الجين المعدل وراثيا ، ولكن في مواقع الجينوم المختلفة. في هذا القسم، نقدم أمثلة للسيناريوين الأخيرين.
في أول تطبيق مثالي لنا، نعرض ديناميكيات إشارة الفلورسينس لثلاثة أجنة مشتقة من خطوط Drosophila المعدلة وراثيا(الجدول 2)على مدى فترة حوالي يوم واحد(الشكل 4، الفيلم التكميلي 1). وبالنسبة لهذه الخطوط، كنا نتوقع أنماطا مفلورة مماثلة إلى حد ما لأن جميعها تعبر عن سيطرة مختلف المروجين النشطين في كل مكان وا التأسيسيين على الصعيد النووي. ومع ذلك ، تظهر نتائج التصوير الحي المقارنة لدينا أن هناك اختلافات قوية في الصدغية في أنماط التعبير التي هي بالتأكيد ليست تأثيرات ثانوية بسبب التباين المحيط.
في مثال التطبيق الثاني، نقارن أداء ثلاثة أجنة مشتقة من #O (LA)-mEmerald} من #1 #2 #3 (Zen1'LA-mE #1 #2 #3، على التوالي) الخطوط الفرعية المعدلة وراثيا Tribolium 36. كل هذه تحمل نفس piggyBac القائم على transgene الذي يؤدي إلى التعبير عن mEmerald المرتبطة37 Lifeact38 تحت سيطرة zerknüllt 139 المروج ، وهو عامل النسخ المشاركة في مواصفات serosa. تشير نتائج التصوير الحي المقارنة لدينا ، والتي توضح عملية إغلاق نافذة serosa أثناء الاختراق ، إلى أن #2 الفرعي يوفر إشارة إجمالية أقوى بشكل ملحوظ من الخطين الفرعيين الآخرين(الشكل 5، الفيلم التكميلي 2). وهذا يشير إلى أنه أيضا في Tribolium، قد يكون للسياق الجينومي تأثير قوي على مستوى التعبير عن المتحولات التي تحمل كاسيت التعبير.
كان من الممكن استرجاع جميع الأجنة الستة التي تظهر في هذا القسم بنجاح كما هو موضح في الخطوة 8 من بروتوكولنا. كل منهم تطورت إلى البالغين وظيفية بالكامل وخصبة (الجدول التكميلي 1، "استرجاع" الصف)، مشيرا إلى أن الإجراء العام، من dechorionation أكثر من تصاعد لتسجيل، كان غير الغازية. هذا المستوى من مراقبة الجودة ضروري كلما كان من المتوقع تطور البرية، على سبيل المثال، فيما يتعلق بالأجنة السيطرة التي يتم تصويرها في وقت واحد مع الأجنة التي يتم إسقاط واحد أو أكثر من الجينات أو ضرب بها.
يتم توفير جميع مجموعات البيانات التي تم استخدامها لإنشاء النتائج التمثيلية كموارد من شأنها أن تساعد خاصة المبتدئين LSFM لتقييم نوعية عملهم. يمكن العثور على ارتباطات التنزيل المستندة إلى معرف الكائن الرقمي في جدول بيانات التعريف(الجدول التكميلي 1،"الوصول إلى البيانات"الصف).
الشكل 1: الإطار التجريبي ونظرة عامة على طريقة التركيب. (أ)مخطط انسيابي لخطوات البروتوكول العشرة مع تذكيرات قصيرة وتقدير للوقت المطلوب. المهام التي تم وضع علامة عليها علامات نجمية لا يلزم تنفيذها أثناء كل عملية فحص ولكن اعتمادا على الظروف. تشير المربعات الخضراء إلى الخطوات المرتبطة بالدروزوفيلا و/أو التريسوليوم، وتشير المربعات الزرقاء إلى الخطوات المرتبطة بالفحص المجهري. (ب) رسم تفصيلي لحامل خيوط العنكبوت. التصميم المعروض مناسب لآليات المشبك المستندة إلى الأسطوانات ، والتي تستخدم عادة في عينات LSFMs المستندة إلى الغرفة. يمكن قياس حامل طالما يتم احترام مسافة العمل للعدسة الكشف. (ج)تسجيل تسلسل للتصوير الحي لأجنة متعددة على طول اتجاهات متعددة. في البداية، يتم تسجيل مداخن z من الجنين العلوي على طول ما يصل إلى أربعة اتجاهات، أي 0°و 90°و 180° و 270°. في وقت لاحق ، يتم نقل الجنين أدناه أمام عدسة الكشف ويبدأ تسلسل التسجيل / الدوران من جديد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط المعايرة الفلورية القائمة على الميكروسفيرات ل LSFMs. يوضح الرسم البياني كيف تظهر الميكروسفيرات الفلورية في الإسقاطات القصوى ل x و y و z إذا تم معايرة LSFM بشكل صحيح (A) ، أو إذا كان هناك إضاءة (B) أو إزاحة كشف (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: جمع الأجنة المتعددة وإزالة الكورونات وتركيبها وتصويرها. (أ) نظرة عامة على جمع جنين تريبوليوم. يتم ذكر الرسوم التوضيحية في جميع أنحاء الخطوة 4 وفقا للأرقام الموجودة في أعلى اليسار. (ب)إعداد ونقل مخطط لوحة 6-جيدا المستخدمة خلال الخطوة 5. تحتوي آبار B1 و B2 على هيبوكلوريت الصوديوم المخفف (NaOCl) ، مما يؤدي إلى إزالة الكور. (ج) مصفاة الخلية 100 ميكرومتر، التي استخدمت لنقل الأجنة من بئر إلى آخر، داخل بئر B2. تظهر صورة التفاصيل العلوية صورة عن قرب للعديد من أجنة التيبونيوم فوق شبكة مصفاة الخلايا ، وتظهر صورة التفاصيل السفلية صورة مجهر ستيريو ضوء انتقال للعديد من أجنة تريبوليوم مع المشيمة المنفصلة جزئيا. (D) حامل خيوط العنكبوت مع ثلاثة أجنة تريبوليوم محمولة. تم محاذاة الأجنة ، وكذلك محاورها الأمامية الخلفية ، على طول المحور الطويل للثقب المشقوق. (ه)حركة حامل خيوط العنكبوت داخل غرفة العينة في LSFM أثناء تسجيل ثلاثة أجنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التصوير الحي المفلور المقارن لجنين واحد لكل جنين من خطوط دروسوفيليا #01691 #29724 #24163 المعدلة وراثيا. تظهر الأجنة على طول اتجاهين (من أربعة اتجاهات مسجلة) على مدى 20:00 ساعة (من إجمالي فترة التصوير 23:40 ساعة). لم يتم إجراء تصحيح كثافة ديناميكية مع مرور الوقت. يمكن العثور على البيانات الوصفية لمجموعات بيانات Drosophila في الجدول التكميلي 1. ZA، Z الإسقاط الأقصى مع تعديل الصورة. شريط المقياس، 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التصوير الحي المفلور المقارن لجنين واحد لكل جنين من #1 Zen1'LA-mE #2 #3 الخطوط الفرعية ثلاثية التريبوليوم المعدلة وراثيا. (أ)تظهر الأجنة على طول أربعة اتجاهات أثناء الاختراق، قبل إغلاق نافذة سيروسا مباشرة. (ب)تظهر الأجنة في حالة تهوية على مدى 01:30 ساعة (من إجمالي فترة التصوير 118:00 ساعة). تم إجراء تعديل الصورة مع القيم المعروضة الحد الأدنى والحد الأقصى متطابقة، لم يتم تنفيذ تصحيح كثافة ديناميكية مع مرور الوقت. يمكن العثور على بيانات التعريف لمجموعات بيانات Tribolium في الجدول التكميلي 1. تمت مزامنة مجموعات البيانات مع المرحلة الموضحة في (A). ZA، Z الإسقاط الأقصى مع تعديل الصورة. شريط المقياس، 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تركيبه | الاساس المنطقي | عدسة الإضاءة | عدسة الكشف | كاميرا | مرجع |
| #1 | جنين كامل على المستوى الخلوي، تباعد كبير للبكسل (حجم بيانات صغير) | 2.5× فتحة التكبير العددية 0.06 (الهواء) | 10× فتحة التكبير العددية 0.3 (غمس المياه) | CCD بدقة 1.4 ميجابكسل (1392×1040، 6.45 ميكرومتر في الملعب) | هذه الدراسة، دروسوفيلا41، تريبوليوم20،41 |
| #2 | جنين كامل على المستوى الخلوي/دون الخلوي، تباعد صغير للبكسل (حجم بيانات كبير) | 2.5× فتحة التكبير العددية 0.06 (الهواء) | 20× فتحة التكبير العددية 0.5 (غمس المياه) | sCMOS بدقة 5.5 ميجابكسل (2560×2160، 6.5 ميكرومتر في الملعب) | تريبوليوم9 |
| #3 | مناطق محددة من الجنين على المستوى دون الخلوي أو التطبيقات المتخصصة مثل التصوير الحي للعصابات الجرثومية المتشريحة42,43 | 5.0× فتحة التكبير العددية 0.16 (الهواء) | 40× فتحة التكبير العددية 0.75 (غمس المياه) | CCD بدقة 1.4 ميجابكسل (1392×1040، 6.45 ميكرومتر في الملعب) | تريبوليوم44 |
الجدول 1: عدسة الإضاءة الموصى بها / عدسة الكشف / مجموعات الكاميرا للتصوير الحي لأجنة دروسوفيلا وتيبونيوم باستخدام LSFM. وقد استخدمت جميع المجموعات بنجاح في الدراسات السابقة (انظر الصف المرجعي). يرجى ملاحظة أن معظم أجهزة LSFMs القائمة على غرفة العينة تستخدم عدسات غمس المياه للكشف عنها ، والتي تم تصميمها في المقام الأول لمخازن التصوير المؤقتة ذات مؤشر الانكسار 1.33 (مثل مياه الصنبور المعبؤة تلقائيا أو غيرها من الوسائط المائية). يمكن استخدام مخازن التصوير المؤقتة مع المؤشرات الانكسارية الأخرى40، ولكن هذا يغير خصائص معينة للنظام البصري ، على سبيل المثال مسافة العمل.
| سطر | الجيني | تعبير الفلوروفور |
| #01691 | y[1] ث [67c23]; P{w[+mC]=يوبي-GFP.nls}معرف-2; P{يوبي-GFP.nls}معرف-3 | NLS-GFP تحت سيطرة المروج البوليبيكيتين |
| #29724 | ث [*]؛ P{w [+mC]=Tub84B-EGFP.NLS}3 | NLS-GFP تحت سيطرة المروج ألفا توبولين 84B |
| #24163 | ث [*]؛ P{w [+mC]=His2Av-EGFP.C}2/SM6a | EGFP المسمى هيستون 2A البديل في جميع الخلايا |
الجدول 2: خطوط دروسوفيلا المعدلة وراثيا الثلاثة المستخدمة في مثال التطبيق الأول. يشير عمود "الخط" إلى رقم سهم مركز بلومينغتون دروسوفيلا للأسهم (bdsc.indiana.edu).
فيديو تكميلي 1: تصوير حي مضان مقارن لجنين واحد لكل من خطوط دروسوفيليا #01691 #29724 #24163 المعدلة وراثيا. ويعبر كل خط معدل وراثيا عن الشراكة بين الوكالات/الجهات الحكومية ذات الطابع النووي الخاضعة لسيطرة مروج يفترض أنه منتشر في كل مكان ونشط من الناحية التأسيسية. ZA، Z الإسقاط الأقصى مع تعديل الصورة. لم يتم إجراء تصحيح كثافة ديناميكية مع مرور الوقت. ZA، Z الإسقاط الأقصى مع تعديل الصورة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو تكميلي 2: التصوير الحي المفلور المقارن لجنين واحد لكل من #1 Zen1'LA-mE #2 #3 الخطوط الفرعية ثلاثية البوليوم المعدلة وراثيا. يعبر كل خط فرعي معدل وراثيا عن Lifeact المسمى mEmerald تحت سيطرة مروج zerknüllt 1 ، وهو عامل نسخ يشارك في مواصفات serosa. يرجى ملاحظة أن جنين Zen1'LA-mE #1 يتحول إلى حوالي 90 درجة داخل سيروسا مباشرة بعد إغلاق نافذة سيروسا. تمت مزامنة مجموعات البيانات مع المرحلة الموضحة في الشكل 4A. تم إجراء تعديل الصورة مع القيم المعروضة الحد الأدنى والحد الأقصى متطابقة، لم يتم تنفيذ تصحيح كثافة ديناميكية مع مرور الوقت. تظهر الأجنة بشكل بطني وجندي على مدى فترة 48:00 ساعة ZA، Z الإسقاط الأقصى مع تعديل الصورة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
ملف تكميلي 1: فيجي دفعة معالجة البرنامج النصي للحساب الآلي من التوقعات z الحد الأقصى من جميع مداخن ض داخل مجلد واحد. يمكن فتح البرنامج النصي في فيجي عن طريق السحب والإفلات. في البداية ("تشغيل") يجب تحديد مجلد الإدخال فقط. يتم إنشاء المجلد الفرعي الإخراج ("Z Maximum Projections") تلقائيا. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: البيانات الوصفية والمعلمة لمجموعات بيانات التصوير الحية طويلة الأجل DS0001-6. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واحدة من مجالات التطبيق الحصري ل LSFMs هو علم الأحياء التنموي. في هذا التخصص ، من المهم النظر إلى العينات الحية ، وإلا لا يمكن وصف العمليات المورفوجينية بطريقة ديناميكية. إطار تجريبي للتصوير الحي المتزامن في عينات LSFMs المستندة إلى غرفة ، كما هو موضح هنا ، مناسب لسببين رئيسيين.
يمكن معالجة التباين المحيط ، الذي لا يمكن تجنبه في التصوير الحي التسلسلي ، بشكل نشط. في التصوير الحي المرتبط بجنين الحشرات ، نرى على سبيل المثال ، الحساسيات التالية. قد يكون لثقافة جمع البويضات أعمار مختلفة في وقت جمع الأجنة. في Drosophila، وقد ثبت أن هذا يؤثر على صفات ذرية45. على الرغم من أن العمل مع الثقافات غير المتزامنة بشكل مناسب هو خيار ، إلا أن التصوير المتزامن مع الثقافات المتزامنة أكثر ملاءمة بكثير. كل من Drosophila- والنتائج التمثيلية المستندة إلى تريبوليوممستمدة من ثقافات جمع البيض المتزامنة، ويمكننا أن نستبعد بثقة أن الخصائص الفلورية المختلفة هي تأثير غير مقصود للسينة الأبوية.
Dechorionation هو خطوة حاسمة كما التعرض لفترات طويلة لهيبوكلوريت الصوديوم يقلل من صلاحية الجنين. بشكل غير مريح ، تنخفض القوة الأيونية لهيبوكلوريت الصوديوم بمرور الوقت. قياسات القوة الأيونيةممكنة 46، ولكن شاقة ومرهقة. في التصوير الحي المتزامن ، يمكن استخدام مزيج رئيسي لجميع الخطوط و / أو الظروف أثناء إعداد لوحات 6-well المرتبطة ب dechorionation.
حتى في المختبرات ذات الحالة الهوائية الفعالة ، لا مفر من تقلبات درجة الحرارة الصغيرة ولكن غير المنتظمة وتؤثر أيضا على9 عينات من LSFMs تعتمد على غرفة التحكم في درجة الحرارة. في التصوير الحي المتزامن ، تحدث هذه التقلبات أيضا ، ولكنها تؤثر على جميع الأجنة بالمثل.
من الناحية العملية، بروتوكول للتصوير المتزامن لأجنة متعددة يزيد من الإنتاجية. في التصوير الحي، تحدد مدة العملية التنموية المثيرة للاهتمام عدد المقايسات التي يمكن إجراؤها في غضون فترة معينة، وهو اعتبار مهم عندما يكون الوصول إلى LSFMs محدودا. الأمثلة الرئيسية للتسجيل على المدى الطويل هي مقايسات التصوير الحية التي يتم فيها تتبع الخلايا. وتتراوح هذه التجارب عادة على مدى فترات طويلة من التطوير. في حين أن التطور الجنيني للدروزوفيلا يستغرق حوالي يوم واحد فقط في درجة حرارة الغرفة47، فإن Tribolium يستغرق حوالي سبعة أيام48. وبالتالي، بالنسبة لهذا النوع، فإن التوازي ضروري للبقاء ضمن إطار زمني معقول، خاصة فيما يتعلق بالتقييسات التي تتم فيها مقارنة العديد من الشروط.
الإنتاجية، أي عدد الأجنة التي يتم تصويرها في وقت واحد، محدودة في المقام الأول بعاملين: الأول هو المساحة المتاحة على طول محور ص داخل غرفة العينة. عندما يكون الجنين الأعلى على وشك أن يتم تصويره، لم يكن ينبغي أن يترك الجنين العلوي المخزن المؤقت للتصوير. علاوة على ذلك، يجب ألا يكون حامل خيوط العنكبوت ونظام الدعم المقترن به طويلا لدرجة أنه يتذبذب و/أو التوتر بشكل ملحوظ أثناء عملية تسجيل مكدس z. والثاني هو الدقة الزمنية المقصودة. يمكن تقريب وقت التسجيل لكل جنين عن طريق ضرب وقت التعرض لكل صورة ثنائية الأبعاد (عادة 10-200 مللي ثانية) بعدد الطائرات لكل مكدس z (عادة عدة مئات)، وعدد القنوات (عادة بين واحد وثلاثة)، وعدد الاتجاهات (عادة بين واحد وثمانية) وعامل يعتمد على الإعداد لحركات الترجمة والتناوب (المقدرة بين 1.2 و 1.5). تشير نسبة الدقة الزمنية المقصودة ووقت التسجيل لكل جنين إلى الحد الأقصى لعدد الأجنة التي يمكن تصويرها في وقت واحد. باختصار، بروتوكولنا مناسب للتقدم من التصوير الحي المتتابع إلى الإنتاجية المتوسطة، ولكنه غير مناسب لما يعتبر عموما إنتاجية عالية. بالنسبة لهذا الأخير ، يمكن النظر في LSFMs مناسبة للشرائح المجهر49،50،51 أو لوحات البئر52 ، ولكن هذه التطبيقات عادة ما يكون لها قيود أخرى.
اعتمادا على السؤال التجريبي ، وبالتالي عدسة الإضاءة / عدسة الكشف / تركيبة الكاميرا بالتزامن مع معلمات التصوير ، قد تتطلب مجموعات بيانات LSFM المصورة في وقت واحد مساحة تخزين واسعة في حالتها الخام. ويمكن توضيح هذه المسألة على أفضل وجه من خلال النظر في مجموعات البيانات المقدمة من أمثلة دروسوفيلا (الجدول التكميلي 1)، أي DS0001-3. وكان لكل صورة خام ثنائية الأبعاد حجم بيانات يبلغ حوالي 2.8 ميغابايت، ويتألف كل كومة z خام من 120 طائرة، وتم تسجيل جميع الأجنة الثلاثة على طول أربعة اتجاهات ما مجموعه 143 مرة. ونتيجة لذلك، احتلت مجموعات البيانات الخام حوالي نصف تيرابايت. من خلال معالجة بيانات الصور، أي الاقتصاص على طول جميع الأبعاد المكانية (الخطوة 9) بالتزامن مع الضغط القائم على ZIP، تم تخفيض حجم البيانات إلى 53.3 غيغابايت، وهو حوالي 10٪ من المبلغ الأولي. لمعالجة مجموعات البيانات في نظام تيرابايت ، فإن البرنامج المساعد BigDataViewer53 ، الذي تم تثبيته مسبقا في فيجي(الإضافات | BigDataViewer)، ويوصى.
بالإضافة إلى السيناريوهات الخمسة المبينة في قسم النتائج التمثيلية ، يمكن استخدام بروتوكولنا أيضا لوصف تأثير آثار الضربة القاضية ل RNAi ، وهو نهج شائع في Tribolium54. ومع ذلك، فإنه لا يكون إلا ذات فائدة محدودة لتحليل المركبات (مثل المبيدات الحشرية أو غيرها من الضغوطات الكيميائية الحيوية) إذا كان ينبغي تطبيقها من خلال العازلة التصوير - وهو النهج الأكثر مباشرة - والتصوير المتزامن للجنين السيطرة غير ممكن.
لقد أثبتنا بروتوكولنا باستخدام أحد المجاهر المصممة خصيصا8،55، ولكنه ينطبق على أي إعداد قائم على غرفة العينة ، على سبيل المثال ، OpenSPIM56 أو معظم LSFMs التجارية. يكمل هذا البروتوكول مبادرة إنشاء الموارد المرتبطة ب LSFM والتي تهدف إلى تشجيع المبتدئين على دمج التكنولوجيا المستندة إلى الورق الخفيف بنشاط في خططهم البحثية. معظم الجامعات والمعاهد في الوقت الحاضر تعمل مجهزة تجهيزا جيدا مضان مرافق المجهر57. وعادة ما توفر هذه التدابير إمكانية الوصول إلى واحد أو أكثر من تدابير الدعم الطبي القائمة على الغرف، ولكن لا يمكن توقع أن يكون لدى الموظفين الحلول التجريبية المناسبة لكل مسألة علمية في متناول اليد.
تظهر نتائجنا أن إطارنا التجريبي مناسب ل Drosophila و Tribolium. ونحن واثقون من أن بروتوكولنا الذي يركز على المقارنة يمكن استخدامه لدراسة تكوين الأجنة لأنواع الحشرات الأخرى. على سبيل المثال ، تم تطبيق نهج قائم على LSFM لمقارنة تطوير البرية من النوع والضربات القاضية في ذبابة scuttle Megaselia abdita58، وستستفيد دراسات المتابعة أيضا من طريقتنا المتصاعدة. وبالإضافة إلى ذلك، تتوفر خطوط معدلة وراثيا من لعبة الكريكيت التي رصدت اثنين غريلوس bimaculatus مصممة خصيصا للتصوير الحي الفلوري59، ولكن البروتوكول الوحيد المتاح حاليا تركز على المقارنة60 يهدف إلى المجاهر المقلوبة التقليدية، وبالتالي لا يعالج الحصول على صورة ثلاثية الأبعاد أو دوران العينة. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت بالفعل أن حامل خيوط العنكبوت هو خيار مناسب لسمك الحمار الوحشي ، الذي تغير أجنته شكلها بشكل كبير أثناء تكوين الجنين61. ومن شأن تكييف بروتوكولنا، الذي لا يتطلب أساسا أي جهد للتحسين، أن يوفر المزايا المذكورة أعلاه أيضا لهذا الكائن الحي النموذجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر إرنست ه. ك. ستيلزر على الفرصة المتاحة له لاستخدام موارده وكذلك تعليقاته القيمة فيما يتعلق بالمخطوطة، وأنيتا أندرل لدعمها التصوير الحي لتريبونيوم، وسفين بلاث للحصول على الدعم الفني، وكذلك إيلان ديفيس ونيكول غريغدر وجيرولد شوبيغر لتقاسم خطوط دروسوفيلا المعدلة وراثيا عبر مركز بلومينغتون للأسهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100 µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
References
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
- Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
- Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
- Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
- El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
- Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
- Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
- Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
- Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
- Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
- Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
- Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
- Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
- Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
- Mcdonald, J. H. Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , Sparky House Publication. (2013).
- Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
- Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
- Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
- Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
- He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
- Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
- Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , Springer. (1997).
- Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
- McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
- Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
- Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
- Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
- Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).
