Method Article

التصوير الحي المتزامن للأجنة الحشرية المتعددة في مجاهر فلورسينس ورقة الضوء المستندة إلى غرفة العينة

DOI:

10.3791/61713

⸱

September 9th, 2020

 ,  , 
1Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF - MC), Goethe-Universität

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجهر الفلوري القائم على الورقة الخفيفة هو الأداة الأكثر قيمة في علم الأحياء التنموي. ومن القضايا الرئيسية في الدراسات المقارنة التباين المحيط. يصف بروتوكولنا إطارا تجريبيا للتصوير الحي المتزامن لعينات متعددة ، وبالتالي ، يعالج هذه المشكلة بشكل نشط.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر المجهر الفلوري القائم على الورق الخفيف حلولا فعالة لدراسة العمليات المعقدة على نطاقات متعددة ذات صلة بيولوجيا. نماذج الأجهزة القائمة على غرفة، والتي تم تصميمها خصيصا للحفاظ على سلامة ثلاثية الأبعاد للعينة وعادة ما ميزة دوران العينة، هي الخيار الأفضل في علم الأحياء التنموية. على سبيل المثال ، تم استخدامها لتوثيق التكوين الجنيني الكامل لذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster وخنفساء الدقيق الأحمر Tribolium castaneum. ومع ذلك، فإن العديد من بروتوكولات التصوير الحي المتاحة توفر أطرا تجريبية فقط للأجنة المفردة. خاصة بالنسبة للدراسات المقارنة ، فإن مثل هذه النهج غير مريحة ، لأن العينات المصورة بالتتابع تتأثر بالتباين المحيط. علاوة على ذلك ، يحد هذا من عدد العينات التي يمكن فحصها في غضون وقت معين. نحن نقدم إطارا تجريبيا للتصوير الحي المتزامن الذي يزيد من الإنتاجية في الأجهزة القائمة على غرفة العينة وبالتالي يضمن ظروفا محيطة مماثلة لجميع العينات. أولا، نحن نقدم إرشادات المعايرة للمجاهر الفلورية ذات الورقة الخفيفة. ثانيا، نقترح طريقة تركيب للأجنة المتعددة التي تتوافق مع دوران العينة. ثالثا، نحن نقدم نموذجية ثلاثية الأبعاد مجموعات بيانات التصوير الحي من Drosophila، والتي نحن الجمع بين ثلاثة خطوط المعدلة وراثيا مع نواة المسمى fluorescently، وكذلك من Tribolium، والتي نقارن أداء ثلاثة خطوط فرعية المعدلة وراثيا التي تحمل نفس الجين، ولكن في مواقع الجينوم المختلفة. تم تصميم بروتوكولنا خصيصا للدراسات المقارنة لأنه يعالج بشكل نشط التباين المحيط ، والذي يكون موجودا دائما في التصوير الحي التسلسلي. وهذا مهم بشكل خاص للتحليلات الكمية وتوصيف الأنماط الظاهرية الشاذة، والتي تنتج على سبيل المثال، عن تجارب خروج المغلوب. علاوة على ذلك ، فإنه يزيد من الإنتاجية الإجمالية ، والتي هي مريحة للغاية عندما يكون الوصول إلى مجاهر مضان الصفائح الخفيفة محدودا. وأخيرا، يمكن تكييف طريقة التركيب المقترحة لأنواع الحشرات الأخرى والكائنات الحية النموذجية الأخرى، مثل سمك الحمار الوحشي، مع عدم بذل أي جهد للتحسين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الفحص المجهري الفلوري أحد أهم تقنيات التصوير في علوم الحياة، وخاصة في بيولوجيا الخلايا والتطور. في المجاهر الفلورية confocal1، والتي هي دولة من بين الفن للتصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد منذ منتصف 1990s ، وتستخدم نفس العدسة لإثارة الفلوروفور والكشف عن ضوء الانبعاثات. شعاع ليزر الإضاءة يثير جميع الفلوروفور على طول محور الإضاءة / الكشف ويتم التمييز بين إشارة خارج التركيز المعنية قبل الكشف عن طريق ثقب. وبالتالي ، لكل صورة ثنائية الأبعاد ، يتم إضاءة العينة بأكملها. وبالتالي ، لكل صورة ثلاثية الأبعاد ، أي كومة من الصور ثنائية الأبعاد المتتالية مكانيا ، يتم إضاءة العينة بأكملها عدة عشرات إلى بضع مئات من المرات2، مما يعزز photo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الأعمال التحضيرية

  1. اختر عدسة إضاءة/عدسة كشف/تركيبة كاميرا ل LSFM تناسب السؤال العلمي وإعدادات المجهر. حجم مجال الرؤية هو حاصل حجم رقاقة الكاميرا وتكبير عدسة الكشف. يجب اختيار عدسة الإضاءة بحيث يتم تغطية مجال الرؤية بأكمله بورقة ضوء مستو تقريبا34. يتم سرد ثلاث مجموعات الموصى بها في الجدول 1.
  2. لإعداد agarose aliquots واسترجاع الأطباق، إضافة 2 غرام من الآغاروز منخفضة الذوبان إلى 200 مل ماء الصنبور autoclaved وتسخين الخليط في فرن الميكروويف في 600-800 واط حتى يتم حل جميع جزيئات الآجيروز. إعداد عدة 1 مل agarose aliquots في 1.5 مل أو 2 مل أنابيب رد الفعل، ثم ملء عدة أطباق 90 ملم Ø بيتري 3-5 مم عالية مع agarose. ي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف بروتوكولنا إطارا تجريبيا للتصوير الحي المضان المقارن في أجهزة LSFMs القائمة على غرفة العينة. فعلى سبيل المثال، يمكن استخدام الإطار للتقريب بين '1' أجنة لنوعين أو أكثر، '2' أجنة الخطوط التي يتم فيها إسقاط جين واحد أو أكثر بالإضافة إلى ضوابط من النوع البري، '3' أجنة متعددة من نفس الخط المعدل وراثيا، '4' أجنة من خطوط معدلة وراثيا مختلفة، أو '5' أجنة من خطوط فرعية تحمل نفس الجين المعدل وراثيا ، ولكن في مواقع الجينوم المختلفة. في هذا القسم، نقدم أمثلة للسيناريوين الأخيرين.

في أول تطبيق مثالي لن.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحدة من مجالات التطبيق الحصري ل LSFMs هو علم الأحياء التنموي. في هذا التخصص ، من المهم النظر إلى العينات الحية ، وإلا لا يمكن وصف العمليات المورفوجينية بطريقة ديناميكية. إطار تجريبي للتصوير الحي المتزامن في عينات LSFMs المستندة إلى غرفة ، كما هو موضح هنا ، مناسب لسببين رئيسيين.

يمكن معالجة التباين المحيط ، الذي لا يمكن تجنبه في التصوير الحي التسلسلي ، بشكل نشط. في التصوير الحي المرتبط بجنين الحشرات ، نرى على سبيل المثال ، الحساسيات التالية. قد يكون لثقافة جمع البويضات أعمار مختلفة في وقت جمع .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر إرنست ه. ك. ستيلزر على الفرصة المتاحة له لاستخدام موارده وكذلك تعليقاته القيمة فيما يتعلق بالمخطوطة، وأنيتا أندرل لدعمها التصوير الحي لتريبونيوم، وسفين بلاث للحصول على الدعم الفني، وكذلك إيلان ديفيس ونيكول غريغدر وجيرولد شوبيغر لتقاسم خطوط دروسوفيلا المعدلة وراثيا عبر مركز بلومينغتون للأسهم.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6 آبار لوحةبرتقالية علمية4430500<قوي>  لوحة < / قوية >
24 بئربرتقالية علمية4430300فقط للتصوير الحي الذي يتضمن Tribolium< / em>
35-mm & Oslash; طبق بتريفيشر العلمي153066فقط للتصوير الحي الذي يتضمن <م >ذبابة الفاكهة < / م >.
90 ملم & أوسلاش. طبق بتريفيشرL9004575
100 & مصفاة خلية بحجم شبكةm BD Biosciences352360
250 & micro ؛ م حجم شبكة غربالVWR الدولية200.025.222-038فقط للتصوير الحي الذي يتضمن Tribolium< / em>
300 & micro ؛ م حجم شبكة غربالVWR الدولية200.025.222-040فقط للتصوير الحي الذي يتضمن Tribolium< / em>
710 & micro; m حجم شبكة غربالVWR الدولية200.025.222-050فقط للتصوير الحي الذي يتضمن Tribolium< / em>
800 & micro ؛ منخل بحجم شبكةm VWR International200.025.222-051فقط للتصوير المباشر الذي يتضمن Tribolium< / em>
405 دقيق القمح الناعمDemeter e.V.SP061006فقط للتصوير الحي الذي يتضمن Tribolium< / em>
ذبابة الفاكهة المتوسطةالمتاحة تجاريا Genesee Scientific66-115فقط للتصوير الحي الذي يتضمن ذبابة الفاكهة< / em> / حسب الطلب ذبابة الفاكهة< / em> يمكن أيضا استخدام الكرة
المجهرية الفلورية ، 1.0 & micro ؛ م & أوسلاش;Thermo Fisher ScientificT7282
الخميرة الجافة غير النشطةGenesee Scientific62-108
الاغاروز منخفض الذوبانكارل روث6351.2
قوارير ضيقةGenesee Scientific32-109فقط للتصوير الحي الذي يتضمن ذبابة الفاكهة < / em >
فرشاة طلاء صغيرةVWR International149-2121
هيبوكلوريت الصوديوم (NaOCl) ، ~ 12٪ نشط ClCarl Roth9062.3تحذير: هيبوكلوريت الصوديوم هو
دقيق القمح الكاملللتآكل Demeter e.V.SP061036فقط للتصوير الحي الذي يتضمن Tribolium< / em> / المملكة المتحدة: قوارير واسعة من دقيق القمح
الكامل Genesee Scientific32-110فقط للتصوير الحي الذي يتضمن ذبابة الفاكهة< / em>
العلمي المسبب

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
  2. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Light Sheet MicroscopySample Chamber SetupSimultaneous Embryo ImagingCobweb Holder MountingFluorescent Microsphere CalibrationDrosophila Embryo ImagingTribolium Embryo ImagingEmbryo Dechorionation ProtocolAgarose Film EmbeddingComparative Live Imaging

Related Articles