Summary
Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.
Abstract
Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi, karmaşık süreçleri biyolojik olarak ilgili birden fazla ölçekte incelemek için verimli çözümler sunar. Numunenin üç boyutlu bütünlüğünü korumak için özel olarak tasarlanmış ve genellikle numune rotasyonu özelliğine sahip numune odası bazlı kurulumlar, gelişimsel biyolojide en iyi seçimdir. Örneğin, meyve sineği Drosophila melanogaster ve kırmızı un böceği Tribolium castaneum'untüm embriyonik morfogenezini belgelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, mevcut birçok canlı görüntüleme protokolü tek embriyolar için sadece deneysel çerçeveler sağlar. Özellikle karşılaştırmalı çalışmalar için, bu tür yaklaşımlar sakıncalıdır, çünkü ardışık olarak görüntülenmiş örnekler ortam varyansı tarafından etkilenir. Ayrıca, bu, belirli bir süre içinde test edilebilen numune sayısını sınırlar. Numune odası tabanlı kurulumlarda verimi artıran ve böylece tüm numuneler için benzer ortam koşulları sağlayan eşzamanlı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve sunuyoruz. İlk olarak, ışık tabakası floresan mikroskopları için bir kalibrasyon kılavuzu sunuyoruz. İkincisi, birden fazla embriyo için örnek rotasyonu ile uyumlu bir montaj yöntemi öneriyoruz. Üçüncü olarak, drosophilaörnek üç boyutlu canlı görüntüleme veri kümeleri sağlar Floresan etiketli çekirdekleri ile üç transgenik çizgi yan yana, yanı sıra Tribolium, hangi aynı transgene taşıyan üç transgenik alt çizginin performansını karşılaştırırız, ancak farklı genomik konumlarda. Protokolümüz, sıralı canlı görüntülemede her zaman mevcut olan ortam farkını pro-aktif olarak ele aldığı için karşılaştırmalı çalışmalar için özel olarak tasarlanmıştır. Bu, özellikle, örneğin nakavt deneylerinden kaynaklanan anormal fenotiplerin nicel analizleri ve karakterizasyonu için önemlidir. Ayrıca, ışık tabakası floresan mikroskoplarına erişim sınırlı olduğunda son derece uygun olan genel verimi arttırır. Son olarak, önerilen montaj yöntemi, temel olarak optimizasyon çabası olmadan diğer böcek türleri ve zebra balığı gibi diğer model organizmalar için uyarlanabilir.
Introduction
Floresan mikroskopi, yaşam bilimlerinde, özellikle hücre ve gelişim biyolojisinde en temel görüntüleme tekniklerinden biridir. 1990'larınortalarından beri üç boyutlu floresan görüntüleme için son teknoloji ürünü olan konfokal floresan mikroskoplar 1'de, florofor ekscitasyonu ve emisyon ışığı algılama için aynı lens kullanılır. Aydınlatma lazer ışını, aydınlatma/algılama ekseni boyunca tüm floroforları heyecanlandırır ve ilgili odak dışı sinyal bir iğne deliği tarafından algılanmadan önce ayırt edilir. Bu nedenle, her iki boyutlu görüntü için, tüm örnek aydınlatılır. Sonuç olarak, her üç boyutlu görüntü için, yani, mekansal olarak ardışık iki boyutlu görüntüler yığını, tüm örnek birkaç düzine ila birkaç yüz kez aydınlatılır2, bu da fotobleaching ve fototoksikliği teşvik eder3.
Neredeyse yirmi yıl önce, ışık tabakası tabanlı teknoloji4, üç boyutlu floresan görüntüleme için umut verici bir alternatif olarak ortaya çıktı ve böylece gelişim biyolojisinde değerli bir araç haline geldi5. Bu yaklaşımda aydınlatma ve algılama ayrılmıştır. Aydınlatma lensi, dik olarak düzenlenmiş algılama lensinin odak düzleminde sadece birkaç mikrometre derinliğe sahip bir ışık tabakası oluşturmak için kullanılır. Bu nedenle, her iki boyutlu görüntü için, odak düzleminin etrafında yalnızca ince bir düzlemsel hacim yanar. Sonuç olarak, her üç boyutlu görüntü için, tüm örnek sadece bir kez aydınlatılır, bu da fotobleaching ve fototoksikliği kuvvetle azaltır6. Bu nedenle, ışık tabakası floresan mikroskopları (LSFM'ler) karmaşık süreçleri biyolojik olarak ilgili birden fazla ölçekte incelemek için etkili çözümler sunar ve bu nedenle, birkaç milimetre kadar büyük örneklerin hücre altı düzeyde analiz edilmesi gereken gelişim biyolojisinde özel bir değere sahiptir.
Tarihsel olarak, LSFM'ler örnek oda bazlıolmuştur 7,8. Bu kurulumlarda, aydınlatma (x) ve algılama (z) eksenleri genellikle yerçekimi eksenine (y) dik olarak düzenlenir. Örnek odalar geniş deneysel özgürlük sunar. İlk olarak, çevreyi kontrol etmek için, örneğin belirli bir sıcaklık9'u korumak veya biyokimyasal stresörler uygulamak için bir perfüzyon sisteminin kullanımını kolaylaştıran büyük görüntüleme tampon kapasiteleri sağlarlar. Ayrıca, numunenin üç boyutlu, bazı durumlarda dinamik11 , bütünlüğünü korurken ilgili deneysel ihtiyaçlara göre uyarlanmış özelleştirilmiş montaj yöntemleri10'udesteklerler. Ek olarak, numune odası tabanlı kurulumlar genellikle numuneleri y ekseni etrafında döndürmek ve böylece iki, dört veya daha fazla yön boyunca görüntülemek için kullanılan bir döndürme işlevi ile donatılmıştır. Yaygın olarak kullanılan model organizmaların embriyoları mikroskopi bağlamında, ventral-dorsal, lateral ve/veya ön-arka vücut eksenleri boyunca nispeten büyük, ardışık görüntüleme daha kapsamlı bir temsil sağlar. Bu, örneğin, karmaşık üç boyutlu geçiş yolları12,13boyunca hareket eden hücrelerin uzun süreliizlenmesinisağlar.
Işık tabakası bazlı floresan mikroskopi, Drosophila melanogasterembriyonik morfogenezini incelemek için hem sistematik olarak14,15 hem de gelişimin biyofizik yönlerine özel bir odakla kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır. Örneğin, mikrop bandı uzaması16 ve daha fazla sırasında endoderm invaginasyonu ile eksen uzantısı arasında biyomekanik bir bağlantı tespit etmek için yüksek çözünürlüklü morfogenetik verileri toplamak için kullanıldı, karmaşık hücresel akışı gastrülasyon sırasında kuvvet oluşturma desenleri ile ilişkilendirmek için17. Ayrıca, epidermis18'dekiön-arka desenleme sırasında Wnt sinyalinin düzenlenmesini araştırmak için optogenetik gibi diğer son teknoloji tekniklerle birleştirilmiştir.
Bununla birlikte, sadece bir türü incelemek, gelişimin evrimi hakkında fikir vermez. Filogenetik bağlamda embriyogenez anlamak için alternatif böcek modeli organizmalarla yoğun araştırmalar yapılmıştır. En kapsamlı olarak araştırılan türlerden biri kırmızı un böceği Tribolium castaneum, ekonomik olarak ilgili bir depolanmış tahıl zararlısı19Embriyonik morfogenez de LSFM20ile sistematik olarak görüntülenmiştir. Bu iki türün embriyonik morfogenezleri, segmentasyon modu21gibi çeşitli yönlerden ve ekstra embriyonik membranların oluşumu ve bozulması22. İkinci yön zaten LSFM'ler kullanılarak kapsamlı bir şekilde analiz edilmiştir. Örneğin, Tribolium embriyosunu embriyogenezinin daha iyi kısmı için çeşitli tehlikelerden koruyan ekstra embriyonik bir doku olan serosanın23,24, ayrıca dorsal kapatma sırasında kendi çekilme işlemi için morfogenetik "sürücü" görevi aldığı gösterilmiştir25. Ayrıca, gastrülasyon sırasında, blastoderm'in belirli bir bölgesinin asimetrik doku hareketleri oluşturmak için vitellin zarı bağlı kaldığı gösterilmiştir26 ve bu gözlemin ardından, bölgeselleştirilmiş doku akışkanlaştırması, hücrelerin serosa pencere kapanması sırasında sırayla serosa kenarından ayrılmasına izin verir27.
Yukarıda belirtilen tüm Drosophila- ve Triboliumile ilişkili çalışmalarda, örnek oda bazlı LSFM'ler kullanılmıştır. Çoğu zaman, embriyolar örnek dönüş fonksiyonu kullanılarak birden fazla yönde kaydedildi. Açıkça belirtilmemiş olsa da, Tribolium20,28'deki önceki çalışmalarımıza benzer şekilde, sıralı canlı görüntüleme testlerinde tek tek ve böylece birbirlerinden bağımsız olarak kaydedildikleri varsayılabilir. Bazı senaryolarda, böyle bir yaklaşım kabul edilebilir, ancak özellikle nicel karşılaştırmalı yaklaşımlarda ortam varyansı sonuçları bozabilir. Örneğin, böceklerin gelişim hızının sıcaklığa bağlı olduğu uzun zamandır bilinmektedir29, ancak daha yeni bir çalışma drosophila'da sıcaklığın morfojenlerin konsantrasyonu30' u da etkileyebileceğini göstermektedir. Sonuç olarak, embriyogenezin belirli özellikleri, örneğin hücrelerin dinamik oranları, bölünme oranları ve göç hızları tam olarak ölçülmelidir, ortam varyansı olmadan yeterli tekrarlar gereklidir. Bu, standart sapmaları ve standart hataları en aza indirir, bu da diğer, hatta marjinal olarak farklı deneysel koşullarla yan yana gelmeyi kolaylaştırır.
Ancak, örnek oda tabanlı LSFM'ler öncelikle yüksek aktarım hızı tahlilleri yerine yüksek içerik için tasarlanmıştır. Tipik olarak mikroskopi slaytları, Petri kapları ve kuyu plakaları için standart kelepçe mekanizmaları ile donatılmış konfokal mikroskopların aksine, neredeyse tüm numune odası tabanlı LSFM'ler silindir bazlı kelepçe mekanizmaları kullanır. Bu mekanizmalar, rotasyon uyumlu ve invaziv olmayan10olan özel yapım numune tutucular için tasarlanmıştır, ancak genellikle birden fazla örnek20,31,32için tasarlanmamıştır. Örnek oda bazlı kurulumların avantajlarından ödün verilmeyen iki veya daha fazla embriyonun eşzamanlı canlı görüntülenmesi için bir çerçeve, ortam farkı sorununu ele alarak karşılaştırmalı çalışmalar için LSFM'lerin değerini artırır.
Protokolümüzde, embriyoları "istiflemek" için bir seçenek olarak y ekseninin kullanıldığı örnek oda bazlı LSFM'lerde (Şekil 1A)karşılaştırmalı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve sunuyoruz. İlk olarak, özellikle kalibrasyon asistanı olmayan cihazlar için önemli olan numune odası tabanlı LSFM'ler için floresan mikrokürez bazlı kalibrasyon kılavuzu sunuyoruz. İkinci olarak, örümcek ağı tutucusu28 'e (Şekil 1B) dayanan ve numune rotasyonu ile uyumlu olan ve böylece birden fazla numunenin birden fazla yönde eşzamanlı görüntülenmesine izin veren birden fazla embriyo için bir montaj yöntemi açıklıyoruz (Şekil 1C). Birkaç embriyo ince bir agarose filminin üzerine hizalanır ve örnek odaya yerleştirildikten sonra, üç boyutlu görüntüler elde etmek için ışık tabakasında art arda hareket eder. Üçüncü olarak, Drosophila ve Triboliumiçin üç örnek canlı görüntüleme veri kümesi sunuyoruz. İlki için, transgenik çizgileri floresan etiketli çekirdeklerle yan yana alıyoruz. İkincisi için, aynı transgeneyi taşıyan transgene, ancak farklı genomik konumlarda transgene alt çizgilerinin performansını karşılaştırıyoruz. Son olarak, karşılaştırmalı canlı görüntüleme ve ortam varyansı ile paralelleşmenin önemini tartışıyoruz33Deneysel çerçevemizin aktarım hızı sınırını tartışıyor ve yaklaşımımızın diğer model organizmalara adaptasyonunu değerlendiriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hazırlık çalışmaları
- LSFM için bilimsel soruya uygun bir aydınlatma lensi/algılama lensi/kamera kombinasyonu seçin ve mikroskobu ayarlayın. Görüş alanının boyutu, kamera yongası boyutunun bölümü ve algılama lensinin büyüttürüdür. Aydınlatma lensi seçilmelidir, böylece tüm görüş alanı kabaca düzlemsal bir ışık levhası ile kaplanır34. Önerilen üç kombinasyon Tablo 1'de listelenmiştir.
- Agarose aliquots ve alma yemekleri hazırlamak için, 200 mL otomatik kapalı musluk suyuna 2 g düşük eriyik agarose ekleyin ve karışımı tüm agarose parçacıkları çözünene kadar mikrodalga fırında 600-800 W'da ısıtın. 1,5 mL veya 2 mL reaksiyon tüplerinde birkaç 1 mL agarose aliquot hazırlayın, ardından 3-5 mm yüksekliğinde birkaç 90 mm Ø Petri kabını agarose ile doldurun. Katılaştırılmış aliquots ve yemekleri 4 °C'de saklayın.
- Drosophilaiçin : Taze yetiştirme şişeleri hazırlamak için, yeterli miktarda özel yapım veya ticari olarak mevcut Drosophila ortamını pişirin, 5-15 mL'yi geniş şişelere aktarın ve 4 ° C'de saklayın. Yumurtlama yemekleri hazırlamak için, 50 mL otomatik kapatılmış musluk suyuna 1 g düşük eriyik agarose ekleyin ve karışımı tüm agarose parçacıkları çözünene kadar mikrodalga fırında 600-800 W'da ısıtın. Karışımın 45 °C'ye kadar soğumasını bekleyin, ardından 50 mL meyve suyu (tercihen elma veya kırmızı üzüm) ekleyin ve iyice karıştırın. Karışımı 35 mm Ø Petri kaplarına dökün ve katılaşmış yumurtlama kaplarını 4 °C'de saklayın.
- Triboliumiçin : Büyüme ortamını hazırlamak için, tam buğday ununun yanı sıra aktif olmayan kuru mayayı 710 μm örgü büyüklüğünde bir elekten geçirin, ardından elenmiş unu% 5 (w / w) elenmiş maya ile tamamlayın. Yumurtlama ortamını hazırlamak için, ince buğday ununun yanı sıra aktif olmayan kuru mayayı 250 μm örgü büyüklüğünde bir elekten geçirin, ardından elenmiş unu% 5 (w / w) elenmiş maya ile tamamlayın.
2. Floresan mikroküreçler kullanılarak numune odası bazlı LSFM'lerin kalibrasyonu
NOT: Kalibrasyonun amacı, aydınlatma ve algılama lenslerinin odak noktalarını hizalamaktır (Şekil 2A), net görüntüler için öncüldür. LSFM'ler düzenli olarak, en az 3-4 haftada bir kalibre edilmelidir.
- Bir agarose aliquot'u 80 °C'de kuru blok ısıtıcı / karıştırıcıda yeniden sıvılandır, ardından agarose aliquot'un 35 ° C'ye kadar soğumasını bekleyin.
- 50 μL agarose'yi 1,5 mL reaksiyon tüpüne aktarın ve 0,5 μL floresan mikrokürez çözeltisi ekleyin. 1 dakika boyunca 1.400 rpm'de karıştırın.
- Örümcek ağı tutucusunun oluklu deliğini 10 μL agarose / floresan mikrokürez çözeltisi karışımı ile doldurun, ardından sadece ince bir agarose filmi kalana kadar mümkün olduğunca çok agarose emiş edin. Katılaşma için 30-60 s bekleyin.
- Numune haznesini otomatik kapatılmış musluk suyu ile doldurun. Örümcek ağı tutucusunu yavaşça numune odasına yerleştirin ve oluklu deliği algılama lensinin önündeki mikrotransilasyon aşamalarıyla hareket ettinin.
- Örümcek ağı tutucusunu döndürme aşamasıyla aydınlatma (x) ve algılama (z) eksenlerine göre 45° konuma getirin. Örümcek ağı tutucusu iletim ışığı kanalında görünmemelidir.
- İlgili floresan kanalına geçin ve lazer gücünü ve pozlama süresini floresan mikrokürecilerin uygun sinyali sağlaması için ayarlayın.
- Şimdi enine yönelimli agarose filmini tamamen kapsayan bir görüş hacmi belirtin. İlgili aydınlatma lensi/algılama lens kombinasyonu34için mümkün olan maksimum eksenel çözünürlüğü hesaplayarak z aralığını tanımlayın. Alternatif olarak, yanal çözünürlüğün 4 katı kaba bir yaklaşım olarak kullanılabilir.
- Floresan mikrokürelerin üç boyutlu test z yığınını kaydedin ve x, y ve z maksimum projeksiyonlarını kalibrasyon grafiğiyle karşılaştırın (Şekil 2). Mikroküreler bulanık, bulanık ve/veya bozuk görünüyorsa (Şekil 2B,C), aydınlatma ve/veya algılama lensinin konumlarını ayarlayın.
3. Drosophila embriyolarının toplanması
- Drosophila serisinin 100-200 yetişkinini, bir yumurta toplama kültürü oluşturmak için görüntüleme testten 2-3 gün önce taze bir yetiştirme şişesine aktarın. Henüz mevcut değilse, bir soy kültürü başlatmak için eski yetiştirme şişesini kullanmayı düşünün. Yetişkinlerin en fazla iki haftalık olmasını sağlamak için embriyo toplama kültürünü zamanla soy kültürü ile değiştirin.
- Bir yumurtlama kabını oda sıcaklığına ısıtın ve agarın üzerine bir damla maya ezmesi ekleyin.
- Yetişkinleri yumurta toplama kültüründen boş bir dar şişeye aktarın ve yumurtlama kabının üzerine yerleştirin. Yumurta toplama kurulumunu oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Mümkünse bu adım sırasında anesteziden (soğuk, CO2)kaçının.
- Yetişkinleri yetiştirme şişesine geri döndürün. Yumurtlama kabını uygun bir sıcaklık / zaman kombinasyonunda kuluçkaya yatırın, ardından yumurta döşeme kabından küçük bir boya fırçası ile 10-20 embriyoyu 100 μm örgü büyüklüğünde bir hücre süzgecine aktarın. Yumurtlama kabını atın.
- Her Drosophila satırı için 3,1 ile 3,4 olan adımları yineleyin.
4. Tribolium embriyolarının toplanması
NOT: Kolaylık sağlamak için, tribolium yumurta toplama prosedürünün bir şeması sağlanmaktadır (Şekil 3A) bu adımdaki braketlerdeki sayıların da atıfta bulunduğu.
- Tribolium hattının 200-300 yetişkinini (yaklaşık 400-700 mg) bir yumurta toplama kültürü oluşturmak için görüntüleme testten 2-10 gün önce boş bir 1 L cam şişeye aktarın(Şekil 3A_01). Şişeyi 50-100 g taze büyüme ortamı ile doldurun. Henüz mevcut değilse, mevcut larvaları ve pupaları kullanarak bir soy kültürü başlatmayı düşünün. Yetişkinlerin en fazla 3 aylık olmasını sağlamak için, yumurta toplama kültürünü zamanla soy kültürü ile değiştirin.
- Yumurta toplama kültürünü 800 μm örgü boyutunda bir elekten geçirin(Şekil 3A_02). Sahnelenmemiş embriyolar içeren büyüme ortamını ilk şişeye(Şekil 3A_03)iade edin ve yetişkinleri boş bir 1 L cam şişeye aktarın (Şekil 3A_04). 10 g yumurtlama ortamı ekleyin (Şekil 3A_05) ve yumurta toplama kurulumunu oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın (Şekil 3A_06,07).
- Yumurta toplama kurulumunu 800 μm örgü boyutu elekten geçirin(Şekil 3A_08). Yetişkinleri ilk şişelerine geri döndürün (Şekil 3A_09). Görüntülenecek gelişimsel sürece bağlı olarak, şu anda yaklaşık 30-100 embriyo içeren yumurtlama ortamını uygun bir sıcaklık / zaman kombinasyonunda kuluçkayayatırın(Şekil 3A_10 ).
- Yumurtlama ortamını 300 μm örgü boyutunda elekten geçirin (Şekil 3A_11) ve embriyoları (Şekil 3A_12) 100 μm örgü büyüklüğünde bir hücre süzgecine aktarın. Elenmiş yumurtlama medyasını atın (Şekil 3A_13).
- Her Tribolium hattı için 4,1 ile 4,4 olan adımları yineleyin.
5. Sodyum hipoklorit bazlı dekonsiyon
NOT: Hem Drosophila hem de Tribolium embriyoları, embriyolar çıkarıldıktan sonra nemli tutulduğu sürece uygun gelişim için gerekli olmayan koruyucu ve ağır ışık saçan bir protein tabakası olan bir koroyon ile kaplıdır. Her iki türün embriyoları için dekonsiyon protokolü aynıdır.
- A1, A2, A3 ve B3 kuyularını 8 mL otoklavlı musluk suyu ve B1 ve B2 kuyularını 7 mL otoklavlı musluk suyu ve 1 mL sodyum hipoklorit (NaOCl) çözeltisi ile doldurarak 6 kuyulu bir plaka hazırlayın (Şekil 3B). İzlenme sürecini stereo mikroskop altında, ideal olarak iletim ışığında gözlemleyin.
DİkKAT: Sodyum hipoklorit aşındırıcıdır. - Embriyo içeren hücre süzgecini (Adım 3.4 ve/veya 4.4) A1 kuyusuna yerleştirin ve embriyoları hafif ajitasyon altında yaklaşık 30-60 s yıkayın.
- Hücre süzgecini B1 kuyusuna taşıyın ve plakaları 30 s boyunca kuvvetlice sallayın, ardından A2 kuyusuna aktarın ve embriyoları hafif ajitasyon altında 1 dakika yıkayın.
- Hücre süzgecini B2 kuyusuna taşıyın ve çoğu embriyo tamamen dekonsiyon olana kadar plakayı kuvvetlice sallayın (Şekil 3C), daha sonra A3 kuyusuna aktarın ve embriyoları nazik ajitasyon altında 1 dakika yıkayın.
- Montaj prosedürüne devam etmeden önce hücre süzgecini B3'te saklayın.
- Her satır için 5,1 ile 5,5 olan adımları yineleyin.
6. Örümcek ağı tutucusu kullanılarak birden fazla embriyonun montajı
- Bir agarose aliquot'u 80 °C'de kuru blok ısıtıcı / karıştırıcıda yeniden sıvılandır, ardından agarose aliquot'un 35 ° C'ye kadar soğumasını bekleyin.
- Örümcek ağı tutucusunun oluklu deliğinin üzerine pipet 10 μL agarose. Pipet ucuyla, agarose'yi oluklu deliğin üzerine yayın, ardından sadece ince bir agarose filmi kalana kadar mümkün olduğunca agarose epire edin. Katılaşma için 30-60 s bekleyin.
- Her satır için, küçük bir boya fırçası ile bir veya daha fazla embriyoyu dikkatlice seçin ve agarose filmine yerleştirin.
- Embriyoları oluklu deliğin uzun ekseni boyunca düzenleyin, ardından ön-arka eksenlerini oluklu deliğin uzun ekseniyle hizalayın (Şekil 3D).
- Embriyolar ve agarose filmi arasındaki boşluğa 1-2 μL agarose pipetleyerek embriyoları dikkatlice stabilize edin. Katılaşma için 30-60 s bekleyin.
- Monte edilmiş embriyoları olan örümcek ağı tutucusunu yavaşça görüntü tampon dolu numune odasına yerleştirin.
7. Örnek oda bazlı LSFM'lerde karşılaştırmalı canlı görüntüleme
- Mikrotransilasyon aşamaları olan embriyolardan birini algılama merceği önünde hareket ettirin. Örümcek ağı tutucusuna aydınlatma (x) ve algılama (z) eksenlerine (cf. Şekil 1C)göre 45° konumda olduğundan emin olun.
- İletim ışığı kanalında embriyoyu görüş alanının ortasına taşıyın. Örümcek ağı tutucusu görünmemelidir.
- Embriyonun orta düzlemi odak düzlemi ile örtüşünceye kadar, yani ana hat keskin görünene kadar, mikrotransilasyon aşamaları ile embriyoyu z içinde hareket ettirin. Floresan kanalına geçmeden, orta düzlemden 250 μm uzağa her iki yöne de hareket ettirerek görüş hacmini belirtin.
- İsteğe bağlı olarak, birden fazla yönde görüntüleme gerekiyorsa, embriyoyu uygun şekilde döndürün ve 7.2 ve 7.3 adımlarını tekrarlayın. Örümcek ağı tutucusu 90° adımlarda dört oryantasyona kadar destekler.
- Örümcek ağı tutucusuna monte edilen diğer tüm embriyolar için 7,1 ila 7,3 (veya 7,4) adımlarını yineleyin (Şekil 3E). En alttaki embriyo algılama merceği önündeyken en üstteki embriyonun görüntüleme tamponundan ayrılmadığından emin olun.
- Floresan kanal (lazer gücü, pozlama süresi, algılama filtresi) ve zaman atlamalı (aralık, toplam süre) parametreleri tanımlayın ve görüntüleme işlemini başlatın. Gösterge değerleri için, örnek veri kümelerinin meta veri tablosuna başvurun (Tamamlayıcı Tablo 1). Birkaç gün süren tahliller için, buharlaşmayı azaltmak için numune odası açıklığı en azından kısmen kapatmayı düşünün.
8. Görüntülenmiş embriyoların geri alınması ve daha fazla yetiştirilmesi
- Görüntüleme tahlili sona erdiğinde, örümcek ağı tutucusunu numune odasından dikkatlice çıkarın.
- Embriyoları agarose filminden küçük bir boya fırçasıyla ayırın ve uygun şekilde etiketlenmiş bir mikroskop kaydırağı ile aktarın. Slaydı bir alma kabına yerleştirin ve ilgili standart yetiştirme koşulları altında kuluçkaya yatırın.
- Deneysel yöntemlerle ilgili olarak, embriyogenezin ne zaman tamamlandığını tahmin edin. Kuluçka zaman noktası yaklaştıkça, alma yemeklerini sık sık kontrol edin ve yumurtadan çıkan Drosophila larvalarını bireysel yetiştirme şişelerine ve Tribolium larvalarını 24 kuyulu bir plakanın bireysel kuyularına aktarın. Kuyuları yarıya kadar büyüme ortamı ile doldurun. İlgili standart yetiştirme koşulları altında kuluçkaya yatırın.
- Gözlemlenen bireyler yetişkin olduktan sonra, onlara uygun bir çiftleşme ortağı sağlayın ve birkaç gün sonra soyları kontrol edin.
9. Görüntü veri işleme ve meta veri belgeleri
NOT: Görüntü veri işleme için ImageJ türevi FIJI35 önerilir (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI kurulum gerektirmez ve 32 ve 64 bit sürümleri mevcuttur. LSFM verileri için en sık kullanılan biçimlerden biri, görüntü yığınlarının TIFF kapsayıcısı şeklinde depolanmasını sağlayan etiketli görüntü dosyası biçimidir (TIFF).
- Tüm z yığınları için z maksimum projeksiyonlarını hesaplama (Resim | Yığınlar | Z Projesi, Maksimum Yoğunluk 'useçin. Maksimum projeksiyonlar, uzamsal boyut sayısını üçten ikiye düşüren veri basitleştirme yaklaşımlarıdır. Toplu işleme için bir FIJI komut dosyası sağlanır (Tamamlayıcı Dosya 1).
- Zaman yığınları (t yığınları) oluşturmak için ilgili z maksimum projeksiyonlarını bir araya getirmek. Bunları tek bir TIFF kapsayıcısında kaydedin. Bunu tüm kayıtlı embriyoların yanı sıra varsa ilgili yönler ve floresan kanalları için yapın.
- Embriyoların ön-arka eksenini x veya y görüntü ekseniyle hizalamak için z ekseninin etrafında z ve t yığınını döndürün (Görüntü | | Dönüştür Döndür). Üç görüntü ekseni boyunca z yığınlarını ve x ve y görüntü eksenlerindeki t yığınını kırpın, böylece embriyonun etrafında yalnızca minimum tampon alanı (x ve y eksenleri boyunca 20-40 piksel, z ekseni boyunca 5-10 görüntü) kalır (Görüntü | | ayarlama x ve y eksenleri için Tuval Boyutu, Görüntü | Yığınlar | Araçlar | z ekseni için Dilim Koruyucu).
- Varsa, tüm kayıtlı embriyolar ve ilgili yönler için bunu ayrı ayrı yapın. Varsa floresan kanalları aynı döndürme ve kırpma parametreleri ile işlenmelidir.
- Meta verileri mümkün olduğunca ayrıntılı olarak belgele. Kılavuz olarak, Temsili Sonuçlar bölümünde yer alan örnek veri kümelerinin meta veri tablosu kullanılabilir (Tamamlayıcı Tablo 1).
10. Veri görselleştirme
NOT: Bu veri görselleştirme kılavuzu öncelikle birden fazla yön boyunca ve/veya zaman içinde kaydedilmiş birkaç embriyoyu gösteren z maksimum projeksiyon görüntü matrislerinin oluşturulmasına odaklanmaktadır. Aşağıdaki adımlarda, Temsili Sonuçlar bölümünde gösterilen şekillerin ve bağlı videoların oluşturulması için örnek veri kümelerine uygulanan veri görselleştirme yordamı açıklanmaktadır.
- Birden çok yön yığınını birleştirme (Resim | Yığınlar | Araçlar | Birden fazla floresan kanallarını birleştirme ve/veya birleştirme (Resim | Renk | Kanalları Birleştir) biyolojik yapıyı ve/veya ilgi sürecini görselleştirmek için.
- T yığınlarının yoğunluklarını ayarlama (Resim | | ayarlama Parlaklık/Kontrast) "Set" işlevini kullanarak gerektiği gibi. Görüntülenen minimum değer arka plan sinyalinin biraz üzerinde ayarlanmalıdır, görüntülenen maksimum değer uygun bir kontrastla sonuçlanmalıdır. İlgili z yığınlarının tutarlı bir şekilde ayarlanmasında kullanılabilecekleri için her iki değeri de belgeleyin. "Uygula" işlevini kullanarak baskı ayarlamaları. Deneysel modalitelere bağlı olarak, kaydedilen tüm embriyoları aynı değerlerde işlemeyi düşünün.
- Yoğunluk ayarlı t yığınlarını ayrı dosyalar olarak kaydedin, ayarlanmamış t yığınlarını geçersiz kılmayın. Özel görüntü seçim işlevleriyle ayarlanmış t yığınlarından uygun alt yığınları derleyin (ör. Görüntü | Yığınlar | Araçlar | Dilim Koruyucu) ve montaj aracını kullanın (Resim | Yığınlar | Make Montage) şekil tasarımı için kullanılabilecek görüntü ızgaraları oluşturmak için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolümüz, örnek oda bazlı LSFM'lerde karşılaştırmalı floresan canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeveyi tanımlamaktadır. Örneğin, çerçeve (i) iki veya daha fazla türün embriyolarını, (ii) bir veya daha fazla genin nakavt edildiği çizgilerin embriyolarını ve vahşi tip kontrolleri, (iii) aynı transgenik çizgideki birden fazla embriyoyu, (iv) farklı transgenik çizgilerden embriyoları veya (v) aynı transjeni taşıyan alt hatlardan embriyoları yan yana getirmek için kullanılabilir. ama farklı genomik yerlerde. Bu bölümde, son iki senaryo için örnekler sunuyoruz.
İlk örnek uygulamamızda, farklı transgenik Drosophila çizgilerinden türeyen üç embriyonun floresan sinyal dinamiklerini(Tablo 2)yaklaşık 1 günlük bir süre içinde gösteriyoruz (Şekil 4, Tamamlayıcı Film 1). Bu hatlar için, hepsi nükleer lokalize EGFP / GFP'yi farklı muhtemelen her yerde bulunan ve tam olarak aktif organizatörlerin kontrolü altında ifade ettiği için benzer floresan desenleri bekliyorduk. Bununla birlikte, karşılaştırmalı canlı görüntüleme sonuçlarımız, ortam varyansı nedeniyle kesinlikle ikincil etkileri olmayan ifade kalıplarında güçlü mekansal farklılıklar olduğunu göstermektedir.
İkinci uygulama örneğimizde, AGOC{Zen1'#O(LA)-mEmerald} #1, #2 ve #3 (Sırasıyla Zen1'LA-mE #1, #2 ve #3) transgenik Tribolium alt çizgilerinden türeyen üç embriyonun performansını karşılaştırıyoruz36. Tüm bunlar, serosa spesifikasyonunda yer alan bir transknüllt 139 promotörünün kontrolü altında mEmerald bağlantılı37 Lifeact38'in ifadesine yol açan aynı piggyBac tabanlı transgeneyi taşır. Gastrülasyon sırasında serosa pencere kapatma işlemini gösteren karşılaştırmalı canlı görüntüleme sonuçlarımız, alt çizgi #2 diğer iki alt çizgiden(Şekil 5, Tamamlayıcı Film 2)çok daha güçlü bir genel sinyal sağladığını göstermektedir. Bu da gösterir Tribolium' da genomik bağlam, bir ifade kaseti taşıyan transgenes ifade seviyesi üzerinde güçlü bir etkiye sahip olabilir.
Bu bölümde gösterilen altı embriyonun da başarılı bir şekilde alınması, protokolümüzün 8. Hepsi tamamen işlevsel ve verimli yetişkinlere dönüştü(Tamamlayıcı Tablo 1, "Alma" satırı), dekonsiyondan montaja ve kayda kadar genel prosedürün invaziv olmadığını gösteriyor. Bu kalite kontrol seviyesi, vahşi tip gelişimi beklendiğinde, örneğin, bir veya daha fazla genin yıkıldığı veya nakavt edildiği embriyolarla aynı anda görüntülenen kontrol embriyoları ile ilgili olarak gereklidir.
Temsili sonuçları oluşturmak için kullanılan tüm veri kümeleri, özellikle LSFM acemilerinin kendi çalışmalarının kalitesini değerlendirmelerine yardımcı olacak kaynaklar olarak sağlanır. Dijital nesne tanımlayıcı tabanlı karşıdan yükleme bağlantıları meta veri tablosunda bulunabilir (Tamamlayıcı Tablo 1, "Veri Erişimi" satırı).
Şekil 1: Deneysel çerçeve ve montaj yöntemine genel bakış. (A) Kısa anımsatıcılar ve gerekli sürenin tahmini ile on protokol adımının akış çizelgesi. Yıldız işaretiyle işaretlenmiş görevlerin her test sırasında ancak koşullara bağlı olarak gerçekleştirilmesi gerekir. Yeşil kutular Drosophila ve/veya Triboliumile ilişkili adımları gösterir, mavi kutular mikroskopi ile ilişkili adımları gösterir. (B) Örümcek ağı tutucusunun detay çizimi. Sunulan tasarım, numune odası tabanlı LSFM'lerde yaygın olarak kullanılan silindir bazlı kelepçe mekanizmaları için uygundur. Algılama lensinin çalışma mesafesine uyuldununkça tutucu ölçeklendirilebilir. (C) Birden fazla embriyonun birden fazla yönde canlı görüntülenmesi için kayıt sırası. İlk başta, en üstteki embriyonun z yığınları dört oryantasyona kadar kaydedilir, yani 0 °, 90°, 180° ve 270°. Daha sonra, aşağıdaki embriyo algılama lensinin önüne taşınır ve kayıt/dönme dizisi yeniden başlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: LSFM'ler için floresan mikrokürez bazlı kalibrasyon grafiği. Grafik, LSFM doğru kalibre edilmişse (A) veya bir aydınlatma (B) veya algılama uzaklığı (C) varsa, floresan mikrokürecilerin x, y ve z maksimum projeksiyonlarında nasıl göründüğünü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Birden fazla embriyonun toplanması, kaynatılması, montajı ve görüntülenmesi. (A) Tribolium embriyo koleksiyonuna genel bakış. Resimler, sol üstteki sayılara göre Adım 4 boyunca belirtilmiştir. (B) Adım 5 sırasında kullanılan 6 kuyu plakası için hazırlık ve transfer şeması. B1 ve B2 kuyuları, kaynatma başlatan seyreltilmiş sodyum hipoklorit (NaOCl) içeriyordu. (C) Embriyoları bir kuyudan diğerine aktarmak için kullanılan 100 μm hücre süzgeci, B2 kuyusu içinde. Üst ayrıntı görüntüsü hücre süzgeç örgüsunun üstünde birkaç Tribolium embriyosunun yakın çekimini gösterir, alt ayrıntı görüntüsü, kısmen kopuk korozyona sahip birkaç Tribolium embriyosunun iletim ışığı stereo mikroskop görüntüsünü gösterir. (D) Üç monte tribolium embriyosu ile örümcek ağı tutucusu. Embriyolar ve ön-arka eksenleri, oluklu deliğin uzun ekseni boyunca hizalandı. (E) Üç embriyonun kaydedilme sırasında örümcek ağı tutucusunun LSFM'nin örnek odasında hareketi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Transgenik Drosophila çizgilerinden #01691, #29724 ve #24163 bir embriyonun karşılaştırmalı floresan canlı görüntülenmesi. Embriyolar 20:00 saat boyunca (toplam görüntüleme süresi olan 23:40 saat) iki (kaydedilen dört) yön boyunca gösterilir. Zaman içinde dinamik yoğunluk düzeltmesi yapılmadı. Drosophila veri kümelerinin meta verileri Ek Tablo 1'de bulunabilir. ZA, görüntü ayarı ile Z maksimum projeksiyon. Ölçek çubuğu, 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Zen1'LA-mE #1, #2 ve #3 transgenik Tribolium alt hatlarından her biri bir embriyonun karşılaştırmalı floresan canlı görüntülenmesi. (A) Embriyolar, serosa pencere kapanmasından hemen önce, gastrülasyon sırasında dört yön boyunca gösterilir. (B) Embriyolar 01:30 saat boyunca (toplam görüntüleme süresi 118:00 saat) ventral olarak gösterilir. Görüntü ayarı aynı minimum ve maksimum görüntülenen değerlerle gerçekleştirildi, zaman içinde dinamik yoğunluk düzeltmesi yapılmadı. Tribolium veri kümeleri için meta veriler Ek Tablo 1'de bulunabilir. Veri kümeleri (A) içinde gösterilen aşamaya eşitlendi. ZA, görüntü ayarı ile Z maksimum projeksiyon. Ölçek çubuğu, 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| kombinasyon | Mantığı | Aydınlatma lensi | Algılama merceği | kamera | referans |
| #1 | hücresel düzeyde tüm embriyo, büyük piksel aralığı (küçük veri hacmi) | 2.5× büyütme sayısal diyafram açıklığı 0.06 (hava) | 10× büyütme sayısal diyafram açıklığı 0.3 (suya batırma) | 1,4 megapiksel (1392×1040, 6,45 μm pitch) ile CCD | Bu çalışma, Drosophila41, Tribolium20,41 |
| #2 | hücresel/hücre altı düzeydeki embriyonun tamamı, küçük piksel aralığı (büyük veri hacmi) | 2.5× büyütme sayısal diyafram açıklığı 0.06 (hava) | 20× büyütme sayısal diyafram açıklığı 0,5 (suya batırma) | 5,5 megapiksel (2560×2160, 6,5 μm aralığı) ile sCMOS | Tribolium9 |
| #3 | embriyonun hücre altı düzeydeki belirli bölgeleri veya özel uygulamalar, örneğin parçalanmış mikrop bantlarının canlı görüntülenmesi42,43 | 5.0× büyütme sayısal diyafram açıklığı 0.16 (hava) | 40× büyütme sayısal diyafram açıklığı 0,75 (suya batırma) | 1,4 megapiksel (1392×1040, 6,45 μm pitch) ile CCD | Tribolium44 |
Tablo 1: LSFM kullanılarak Drosophila ve Tribolium embriyolarının canlı görüntülenmesi için önerilen aydınlatma lensi/algılama lensi/kamera kombinasyonları. Tüm kombinasyonlar önceki çalışmalarda başarıyla bunların içinde edilmiştir (bkz. Referans satırı). Örnek oda bazlı LSFM'lerin çoğunun algılama için su daldırma lensleri kullandığını ve bunların öncelikle kırılma indisi 1,33 olan (otomatik kapatılmış musluk suyu veya diğer sulu ortamlar gibi) görüntüleme tamponları için tasarlandığını lütfen unutmayın. Diğer kırılma indeksleri ile görüntüleme tamponlarıkullanılabilir 40, ancak bu optik sistemin belirli özelliklerini değiştirir, örneğin çalışma mesafesi.
| satır | Genotip | Florofor ifadesi |
| #01691 | y[1] w[67c23]; P{w[+mC]=Ubi-GFP.nls}ID-2; P{Ubi-GFP.nls}ID-3 | NLS-GFP poliubiquitin promotörünün kontrolü altında |
| #29724 | w[*]; P{w[+mC]=Tub84B-EGFP.NLS}3 | NLS-GFP alfa-tübulin 84B organizatörünün kontrolü altında |
| #24163 | w[*]; P{w[+mC]=His2Av-EGFP.C}2/SM6a | Egfp etiketli histone 2A varyantı tüm hücrelerde |
Tablo 2: İlk uygulama örneğinde kullanılan üç transgenik Drosophila çizgisi. "Satır" sütunu Bloomington Drosophila Stock Center (bdsc.indiana.edu) hisse senedi numarasını ifade eder.
Ek Video 1: Transgenik Drosophila çizgilerinden #01691, #29724 ve #24163 bir embriyonun karşılaştırmalı floresan canlı görüntülenmesi. Her transgenik hat, muhtemelen her yerde bulunan ve tam olarak aktif bir organizatörün kontrolü altında nükleer lokalize EGFP/GFP'yi ifade eder. ZA, görüntü ayarı ile Z maksimum projeksiyon. Zaman içinde dinamik yoğunluk düzeltmesi yapılmadı. ZA, görüntü ayarı ile Z maksimum projeksiyon. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Video 2: Zen1'LA-mE #1, #2 ve #3 transgenik Tribolium alt çizgilerinden her biri bir embriyonun karşılaştırmalı floresan canlı görüntülemesi. Her transgenik alt çizgi, serosa spesifikasyonunda yer alan bir transkripsiyon faktörü olan zerknüllt 1 promotörünün kontrolü altındaki mEmerald etiketli Lifeact'i ifade eder. Zen1'LA-mE #1 embriyosunda serosa pencere kapanmasından hemen sonra serosa içinde yaklaşık 90° döndüğünü lütfen unutmayın. Veri kümeleri Şekil 4A'dagösterilen aşamaya eşitlenmiştir. Görüntü ayarı aynı minimum ve maksimum görüntülenen değerlerle gerçekleştirildi, zaman içinde dinamik yoğunluk düzeltmesi yapılmadı. Embriyolar 48:00 h. ZA, Z maksimum projeksiyonu ile görüntü ayarı ile ventral ve yanal olarak gösterilir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Dosya 1: Fiji toplu işleme komut dosyası, bir klasör içindeki tüm z yığınlarından z maksimum projeksiyonlarının otomatik olarak hesaplanması için. Komut dosyası FIJI'de sürükle ve bırak yoluyla açılabilir. Başlangıçta ("Çalıştır") yalnızca giriş klasörü belirtilmelidir. Çıkış alt klasörü ("Z Maksimum Projeksiyonlar") otomatik olarak oluşturulur. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Tablo 1: DS0001-6 uzun süreli canlı görüntüleme veri kümeleri için meta veriler ve parametre. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LSFM'lerin münhasır uygulama alanlarından biri gelişimsel biyolojidir. Bu disiplinde, canlı örneklere bakmak önemlidir, aksi takdirde morfogenetik süreçler dinamik bir şekilde tarif edilemez. Örnek oda bazlı LSFM'lerde eşzamanlı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve, burada açıklandığı gibi, iki ana nedenden dolayı uygundur.
Sıralı canlı görüntülemede kaçınılmaz olan ortam varyansı pro-aktif olarak ele alınabiliyor. Böcek embriyosu ile ilişkili canlı görüntülemede, örneğin aşağıdaki duyarlılıkları görüyoruz. Embriyo toplama zamanında yumurta toplama kültürleri farklı yaşlara sahip olabilir. Drosophila'da, bunun soyun niteliklerini etkilediği gösterilmiştir45. Uygun şekilde eşitsizleştirilmiş kültürlerle çalışmak bir seçenek olsa da, senkronize kültürlerle eşzamanlı görüntüleme önemli ölçüde daha uygundur. Hem Drosophila- hem de Triboliumtabanlı temsili sonuçlar senkronize yumurta toplama kültürlerinden türemiştir ve farklı floresan özelliklerinin ebeveyn duyarlılığının istenmeyen bir etkisi olduğunu güvenle dışlayabiliriz.
Sodyum hipoklorite uzun süre maruz kalma embriyo canlılığını azalttığı için dekonsiyon çok önemli bir adımdır. Sakıncalı olarak, sodyum hipokloritin iyonik gücü zamanla azalır. İyonik mukavemet ölçümleri mümkündür46, ancak zahmetli ve hantal. Eşzamanlı canlı görüntülemede, azil ile ilişkili 6 kuyu plakalarının hazırlanması sırasında tüm çizgiler ve/veya koşullar için bir ana karışım kullanılabilir.
Verimli klimaya sahip laboratuvarlarda bile, küçük ama düzensiz sıcaklık dalgalanmaları kaçınılmazdır ve aynı zamanda sıcaklık kontrollü9 numune odası bazlı LSFM'leri etkiler. Teorik olarak, numune odasındaki sıcaklık kaydedilebilir, ancak kesin bir tekrar mümkün değildir. Eşzamanlı canlı görüntülemede, bu dalgalanmalar da meydana gelir, ancak tüm embriyoları aynı şekilde etkiler.
Pratik açıdan, birden fazla embriyonun eşzamanlı görüntülenmesi için bir protokol verimi arttırır. Canlı görüntülemede, gelişimsel ilgi sürecinin süresi, belirli bir süre içinde kaç tahlil yapılabileceğini belirler, bu da LSFM'lere erişimin sınırlı olduğu durumlarda önemli bir husustur. Uzun süreli kayıt için başlıca örnekler, hücrelerin izlendiği canlı görüntüleme testleridir. Bu tür deneyler genellikle uzun gelişim dönemlerinde değişir. Drosophila'nın embriyonik gelişimi oda sıcaklığında sadece bir gün sürerken47, Tribolium yaklaşık yedi günsürer 48. Bu nedenle, bu tür için, özellikle birçok koşulun karşılaştırıldığı tahlillerle ilgili olarak, paralelleştirmenin makul bir zaman dilimi içinde kalması esastır.
Verim, yani aynı anda görüntülenen embriyo sayısı, öncelikle iki faktörle sınırlıdır: Birincisi, örnek odanın içindeki y ekseni boyunca mevcut alandır. En alt embriyo görüntülenmek üzereyken, en üstteki embriyo görüntüleme tamponundan ayrılmamalıydı. Ayrıca, örümcek ağı tutucusu ve ilgili destek sistemi, z yığını kayıt işlemi sırasında gözle görülür şekilde sallanacak ve / veya titreyecek kadar uzun olmamalıdır. İkincisi, amaçlanan zamansal çözünürlüktir. Embriyo başına kayıt süresi, iki boyutlu görüntü başına pozlama süresinin (genellikle 10-200 ms) z yığını başına düzlem sayısı (genellikle birkaç yüz), kanal sayısı (normal bir ile üç arasında), yön sayısı (genellikle bir ila sekiz arasında) ve çeviri ve döndürme hareketleri için kuruluma bağımlı bir faktörle (tahmini olarak 1,2 ila 1,5) çarpılmasıyla yaklaşık olarak tahmin edilebilir. Amaçlanan zamansal çözünürlüğün oranı ve embriyo başına kayıt süresi, aynı anda görüntülenebilen maksimum embriyo sayısını gösterir. Özetle, protokolümüz sıralı canlı görüntülemeden orta aktarım hızına ilerlemek için uygundur, ancak genellikle yüksek aktarım hızı olarak kabul edilenler için uygun değildir. İkincisi için, mikroskop slaytları49,50,51veya kuyu plakaları52 için uygun LSFM'ler düşünülebilir, ancak bu uygulamalar genellikle başka sınırlamalara sahiptir.
Deneysel soruya ve dolayısıyla aydınlatma lensi/algılama lensi/kamera kombinasyonuna ve görüntüleme parametrelerine bağlı olarak, aynı anda görüntülenmiş LSFM veri kümeleri ham durumlarında geniş depolama alanı gerektirebilir. Bu sorun en iyi sağlanan Drosophila örnek veri kümeleri (Tamamlayıcı Tablo 1), yani DS0001-3 göz önünde bulundurularak gösterilebilir. Her iki boyutlu ham görüntünün veri hacmi yaklaşık 2,8 Megabayttı, her ham z yığını 120 düzlemden oluşuyordu ve üç embriyo da dört yön boyunca toplam 143 kez kaydedildi. Sonuç olarak, ham veri kümeleri yaklaşık yarım Terabayt'ı işgal etti. Görüntü veri işleme, yani ZIP tabanlı sıkıştırma ile birlikte tüm uzamsal boyutlar (Adım 9) boyunca kırpma yoluyla, veri hacmi başlangıç miktarının yaklaşık% 10'u olan 53,3 Gigabayta düşürüldü. Terabayt rejimindeki veri kümelerini işlemek için, FIJI'de önceden yüklenmiş olan BigDataViewer53 eklentisi (Eklentiler | BigDataViewer), önerilir.
Temsili Sonuçlar bölümünde özetlenen beş senaryoya ek olarak, protokolümüz tribolium54'tepopüler bir yaklaşım olan RNAi nakavt etkilerinin etkisini karakterize etmek için de kullanılabilir. Bununla birlikte, bir kontrol embriyosunun eşzamanlı olarak görüntülenmesi mümkün olmadığı için görüntüleme tamponu aracılığıyla uygulanması gerekiyorsa , bileşiklerin (örneğin insektisitler veya diğer biyokimyasal stresörler) analizi için sınırlı bir kullanımdır.
Protokolümüzü özel yapım mikroskoplarımızdan biriolan 8,55kullanarak gösterdik, ancak OpenSPIM56 veya çoğu ticari LSFM gibi örnek oda tabanlı kurulumlar için geçerlidir. Bu protokol, acemileri ışık sayfası tabanlı teknolojiyi araştırma planlarına aktif olarak entegre etmeye teşvik etmeyi amaçlayan LSFM ile ilişkili kaynak kuruluş girişimini tamamlamaktedir. Günümüzde çoğu üniversite ve enstitü iyi donanımlı floresan mikroskopi tesisleri işletmektedir57. Bunlar genellikle bir veya daha fazla oda tabanlı LSFM'ye erişim sağlar, ancak personelin eldeki her bilimsel soru için uygun deneysel çözümlere sahip olması beklenemez.
Sonuçlarımız deneysel çerçevemizin Drosophila ve Triboliumiçin uygun olduğunu göstermektedir. Karşılaştırma odaklı protokolümüzün diğer böcek türlerinin embriyogenezini incelemek için kullanılabileceğinden eminiz. Örneğin, Scuttle fly Megaselia abdita58'dekivahşi tip ve devirme gelişimini karşılaştırmak için LSFM tabanlı bir yaklaşım uygulanmıştır ve takip çalışmaları da montaj yöntemimizden yararlanacaktır. Ek olarak, floresan canlı görüntüleme59 için özel olarak tasarlanmış iki benekli kriket Gryllus bimaculatus'un transgenik çizgileri mevcuttur, ancak şu anda mevcut olan tek karşılaştırma odaklı protokol60 geleneksel ters mikroskoplar için tasarlanmıştır ve bu nedenle üç boyutlu görüntü alımını veya örnek dönüşünü ele almaz. Ek olarak, örümcek ağı tutucusuna embriyogenez61sırasında embriyoları şekillerini önemli ölçüde değiştiren zebra balığı için uygun bir seçim olduğu gösterilmiştir. Protokolümüzün temelde optimizasyon çabası gerektirmeyen bir uyarlaması, bu model organizma için de yukarıda açıklanan avantajları sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Ernst H. K. Stelzer'e, kaynaklarını kullanma fırsatının yanı sıra el yazması ile ilgili değerli yorumları için, Tribolium canlı görüntüleme desteği için Anita Anderl'e, teknik destek için Sven Plath'a ve Bloomington Stock Center aracılığıyla transgenik Drosophila hatlarını paylaştıkları için Ilan Davis, Nicole Grieder ve Gerold Schubiger'e teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100 µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
References
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
- Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
- Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
- Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
- El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
- Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
- Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
- Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
- Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
- Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
- Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
- Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
- Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
- Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
- Mcdonald, J. H. Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , Sparky House Publication. (2013).
- Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
- Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
- Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
- Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
- He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
- Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
- Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , Springer. (1997).
- Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
- McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
- Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
- Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
- Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
- Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).
