Summary
Ljusplåtsbaserad fluorescensmikroskopi är det mest värdefulla verktyget inom utvecklingsbiologi. En viktig fråga i jämförande studier är omgivande varians. Vårt protokoll beskriver ett experimentellt ramverk för samtidig live imaging av flera exemplar och därför tar itu med denna fråga proaktivt.
Abstract
Ljusplåtsbaserad fluorescensmikroskopi erbjuder effektiva lösningar för att studera komplexa processer på flera biologiskt relevanta skalor. Provkammarebaserade inställningar, som är särskilt utformade för att bevara provexemplarets tredimensionella integritet och vanligtvis har provrotation, är det bästa valet inom utvecklingsbiologi. Till exempel har de använts för att dokumentera hela embryonala morfogar i fruktflugan Drosophila melanogaster och den röda mjölbaggen Tribolium castaneum. Många tillgängliga live imaging protokoll ger dock endast experimentella ramar för enskilda embryon. Särskilt för jämförande studier är sådana tillvägagångssätt obekväma, eftersom sekventiellt avbildade exemplar påverkas av omgivande varians. Dessutom begränsar detta antalet exemplar som kan analyseras inom en viss tid. Vi tillhandahåller ett experimentellt ramverk för samtidig live-avbildning som ökar genomströmningen i provkammarebaserade inställningar och därmed säkerställer liknande omgivningsförhållanden för alla exemplar. För det första tillhandahåller vi en kalibreringsriktlinje för fluorescensmikroskop med ljusplåt. För det andra föreslår vi en monteringsmetod för flera embryon som är förenliga med provrotation. För det tredje tillhandahåller vi exemplariska tredimensionella live imaging datasets av Drosophila, för vilka vi jämför tre transgena linjer med fluorescerande märkta atomkärnor, liksom av Tribolium, för vilka vi jämför prestandan hos tre transgena sublines som bär samma transgen, men på olika genomiska platser. Vårt protokoll är speciellt utformat för jämförande studier eftersom det proaktivt behandlar omgivande varians, som alltid finns i sekventiell live-avbildning. Detta är särskilt viktigt för kvantitativa analyser och karakterisering av avvikande fenotyper, vilket resulterar t.ex. från knockoutexperiment. Dessutom ökar det den totala genomströmningen, vilket är mycket bekvämt när tillgången till fluorescensmikroskop är begränsad. Slutligen kan den föreslagna monteringsmetoden anpassas för andra insektsarter och ytterligare modellorganismer, t.ex. zebrafisk, utan i princip ingen optimeringsinsats.
Introduction
Fluorescensmikroskopi är en av de viktigaste bildteknikerna inom biovetenskapen, särskilt inom cell- och utvecklingsbiologi. I konfikala fluorescensmikroskop1, som är toppmoderna för tredimensionell fluorescensavbildning sedan mitten av 1990-talet, används samma lins för fluorforexcitation och detektering av emissionsljus. Belysningslaserstrålen exciterar alla fluorforer längs belysnings-/detekteringsaxeln och respektive signal utanför fokus diskrimineras innan den detekterats av ett pinhole. Därför, för varje tvådimensionell bild, är hela provet upplyst. Följaktligen, för varje tredimensionell bild, dvs. en bunt rumsligt på varandra följande tvådimensionella bilder, lyser hela provet flera dussin till några hundra gånger2, vilket främjar fotoblekning och fototoxicitet3.
För nästan tjugo år sedan framträdde ljusplåtsbaseradteknik 4 som ett lovande alternativ för tredimensionell fluorescensavbildning och blev därmed ett värdefullt verktyg inom utvecklingsbiologi5. I den här metoden frikopps belysning och detektering. Belysningslinsen används för att generera ett ljust ark med ett djup på endast ett fåtal mikrometer i det vinkelrätt arrangerade detektionsobjektivets brännplan. Därför, för varje tvådimensionell bild, är endast en tunn planvolym runt brännplanet upplyst. Följaktligen, för varje tredimensionell bild, är hela provet upplyst endast en gång, vilket starkt minskar fotobleaching och fototoxicitet6. Av denna anledning erbjuder fluorescensmikroskop (LSFMs) effektiva lösningar för att studera komplexa processer på flera biologiskt relevanta skalor och är därför av särskilt värde i utvecklingsbiologi, där exemplar så stora som flera millimeter måste analyseras på subcellulär nivå.
Historiskt sett har LSFMs varit provkammarbaserade7,8. I dessa inställningar är belysningsaxlarna (x) och detekteringsaxlarna (z) vanligtvis vinkelrätt placerade mot gravitationsaxeln (y). Provkammare erbjuder gott om experimentell frihet. För det första tillhandahåller de stor kapacitet för bildbuffertar, vilket i sin tur underlättar användningen av ett perfusionssystem för att kontrollera miljön, t.ex. Vidare stöder de anpassade monteringsmetoder10 som är skräddarsydda för respektive experimentella behov samtidigt som de bevarar provexemplarets tredimensionella, i vissa falldynamiska 11,integritet. Dessutom är provkammarbaserade inställningar vanligtvis utrustade med en rotationsfunktion som används för att rotera proverna runt y-axeln och därmed avbilda dem längs två, fyra eller ännu fler riktningar. Eftersom embryon av vanliga modellorganismer i samband med mikroskopi är relativt stora, på varandra följande avbildning längs ventral-dorsala, laterala och/eller främre-bakre kroppsaxlar ger en mer omfattande representation. Detta möjliggör t.ex. långsiktig spårning av celler som rör sig längs komplexa tredimensionella migreringsbanor12,13.
Ljusplåtsbaserad fluorescensmikroskopi har tillämpats i stor utsträckning för att studera den embryonala morfogenesen hos Drosophila melanogaster,både systematiskt 14,15 samt med ett specifikt fokus på de biofysiska aspekterna av utveckling. Till exempel användes den för att samla in högupplösta morfogenetiska data för att upptäcka en biomekanisk länk mellan endoderm invagination och axelförlängning under bakteriebandsförlängning16 och vidare för att relatera det komplexa cellulära flödet med kraftgenereringsmönster under gastrulation17. Det har också kombinerats med andra toppmoderna tekniker, t.ex. optogenetik för att undersöka regleringen av Wnt-signalering under främre bakre mönstring i epidermis18.
Att studera endast en art ger dock inte insikter om utvecklingen av utvecklingen. För att förstå embryogenes i det fylogenetiska sammanhanget har intensiv forskning bedrivits med alternativa insektsmodellorganismer. En av de mest omfattande undersökta arterna är den röda mjölbaggen Tribolium castaneum, ett ekonomiskt relevant lagrat spannmålsskadedjur19, vars embryonala morfogenes också redan systematiskt har avbildats med LSFM20. Den embryonala morfogenesen hos dessa två arter skiljer sig anmärkningsvärt i flera aspekter, t.ex. segmenteringsläget21, liksom bildandet och nedbrytningen av extra embryonala membran22. Den senare aspekten har redan analyserats i stor utsträckning med LSFMs. Till exempel har det visat sig att serosa, en utom embryonal vävnad som omsluter och skyddar triboliumembryon från olika faror för större delen av embryogenesen23,24, också fungerar som den morfogenetiska "föraren" för sin egen tillbakadragandeprocess under dorsal stängning25. Vidare har det visat sig att under gastrulation förblir en viss region av blastoderm förankrad i vitelline membranet för att skapa asymmetriskavävnadsrörelser 26 och, efter denna observation, att regionaliserad vävnad fluidisering tillåter celler att sekventiellt lämna serosa kanten under serosa fönsterstängning 27.
I alla Drosophila- och Tribolium-associeradestudier som nämns ovan, provkammare-baserade LSFMs har använts. I de flesta fall registrerades embryona längs flera håll med hjälp av provrotationsfunktionen. Även om det inte uttryckligen anges, Kan det antas att de har registrerats individuellt och därmed oberoende av varandra i sekventiella levande bildanalyser, liknande vårt tidigare arbete med Tribolium20,28. I vissa scenarier är ett sådant tillvägagångssätt godtagbart, men särskilt i kvantitativa jämförande metoder kan omgivningsavvikelsen snedvrida resultaten. Till exempel har det länge varit känt att insekternas utvecklingshastighet är temperaturberoende29, men en nyare studie tyder vidare på att temperaturen i Drosophilaockså kan påverka koncentrationen av morfogener30. Om vissa egenskaper hos embryogenes, t.ex. Detta minimerar standardavvikelser och standardfel, vilket i sin tur underlättar juxtaposition med andra, till och med bara marginellt divergerande experimentella tillstånd.
Exempel på kammarbaserade LSFMs är dock främst utformade för högt innehåll snarare än höga data flödes analyser. Till skillnad från konfokala mikroskop, som vanligtvis är utrustade med standardiserade klämmekanismer för mikroskopirutschbanor, petriskålar och brunnsplattor, använder nästan alla provkammarebaserade LSFM:er cylinderbaserade klämmekanismer. Dessa mekanismer är avsedda för skräddarsydda provhållare som är rotationskompatibla samt icke-invasiva10, men vanligtvis inte utformade för mer än ett prov20,31,32. En ram för samtidig live-avbildning av två eller flera embryon, där fördelarna med provkammarbaserade inställningar inte äventyras, tar itu med problemet med omgivande varians och därigenom ökar värdet av LSFM för jämförande studier.
I vårt protokoll presenterar vi ett experimentellt ramverk för jämförande live imaging i provkammare-baserade LSFMs (Figur 1A) där y axeln används som ett alternativ att "stapla" embryon. För det första tillhandahåller vi en fluorescerande mikrosfärbaserad kalibreringsriktlinje för provkammarbaserade LSFMs, vilket är särskilt viktigt för instrument som saknar kalibreringsassistent. För det andra beskriver vi en monteringsmetod för flera embryon baserat på spindelvävshållaren28 (figur 1B) som är kompatibel med provrotation och därmed möjliggör samtidig avbildning av flera exemplar längs flera riktningar (figur 1C). Flera embryon är inriktade ovanpå en tunn agarosafilm och, efter införing i provkammaren, rör sig successivt genom ljusbladet för att förvärva tredimensionella bilder. För det tredje tillhandahåller vi tre exemplariska live imaging data uppsättningar för Drosophila samt för Tribolium. För den förstnämnda sammanar vi transgena linjer med fluorescerande märkta atomkärnor. För den senare jämför vi prestandan hos transgena sublines som bär samma transgen, men på olika genomiska platser. Slutligen diskuterar vi vikten av parallellisering när det gäller jämförande levande avbildning och omgivande varians33, diskuterar genomströmningsgränsen för vårt experimentella ramverk och utvärderar anpassningen av vårt förhållningssätt till andra modellorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedande arbete
- Välj en belysningslins/detekteringslins/kamerakombination för LSFM som passar den vetenskapliga frågan och ställ in mikroskopet. Storleken på synfältet är kvoten för kamerachipstorleken och förstoringen av detekteringslinsen. Belysningslinsen bör väljas så att hela synfältet täcks av ett grovt planljusblad34. Tre rekommenderade kombinationer visas i tabell 1.
- För att förbereda agarose alikvoter och hämtningsfat, tillsätt 2 g lågsmält agarosa till 200 ml autoklaverat kranvatten och värm blandningen i en mikrovågsugn vid 600-800 W tills alla agarosapartiklar är upplösta. Förbered flera 1 ml agarose alikvoter i 1,5 ml eller 2 ml reaktionsrör och fyll sedan flera 90 mm Ø Petri-rätter 3-5 mm höga med agaros. Förvara stelnade alikvoter och rätter vid 4 °C.
- För Drosophila:För att förbereda färska uppfödnings injektionsflaskar, laga en tillräcklig mängd specialtillverkat eller kommersiellt tillgängligt Drosophila medium, överför 5-15 ml till breda injektionsflaska och förvara dem vid 4 °C. För att förbereda äggläggningsfat, tillsätt 1 g lågsmält agarosa till 50 ml autoklaverat kranvatten och värm blandningen i en mikrovågsugn vid 600-800 W tills alla agarosapartiklar löses upp. Låt blandningen svalna till 45 °C, tillsätt sedan 50 ml fruktjuice (helst äpple eller röd druva) och blanda noggrant. Häll blandningen i 35 mm Ø Petri-rätter och förvara stelnade äggläggningsfat vid 4 °C.
- För tribolium: För att förbereda tillväxtmediet, passera fullkornsmjöl samt inaktiv torrjäst genom en 710 μm maskstorlek sikt, komplettera sedan siktade mjölet med 5% (w/ w) siktad jäst. För att förbereda äggläggningsmedium, passera fint vetemjöl samt inaktiv torrjäst genom en 250 μm maskstorlek sikt och komplettera sedan siktade mjölet med 5% (w/ w) siktad jäst.
2. Kalibrering av provkammarebaserade LSFM:er med fluorescerande mikrosfärer
OBS: Syftet med kalibreringen är att justera belysnings- och detekteringslinsernas brännpunkter (figur 2A), eftersom detta är förutsättningen för tydliga bilder. LSFMs bör kalibreras regelbundet, minst en gång var 3-4 veckor.
- Återförväxlas med en agarose alikvot i en torrblocksvärmare/blandare vid 80 °C och låt sedan agarose alikvoten svalna till 35 °C.
- Överför 50 μL agarose till ett reaktionsrör på 1,5 ml och tillsätt 0,5 μL fluorescerande mikrosfärlösning. Blanda vid 1 400 varv/min i 1 minut.
- Fyll spindelvävshållarens slitsade hål med 10 μL agaros/fluorescerande mikrosfärlösningsblandning och aspirera sedan så mycket agarose som möjligt tills endast en tunn agarosfilm återstår. Vänta 30-60 s för stelning.
- Fyll provkammaren med autoklaverat kranvatten. För långsamt in spindelvävshållaren i provkammaren och flytta det slitsade hålet med mikrotranslationsstegen framför detektionslinsen.
- Rotera spindelvävshållaren med rotationssteget till ett 45° läge i förhållande till belysningsaxlar (x) och detekteringsaxlar (z). Spindelvävshållaren ska inte synas i överföringsljuskanalen.
- Byt till respektive fluorescenskanal och justera lasereffekten samt exponeringstiden så att de fluorescerande mikrosfärerna ger rätt signal.
- Ange en vyvolym som täcker den nu tvärgående orienterade agarosafilmen helt. Definiera z-avståndet genom att beräkna maximal möjliga axiella upplösning för respektive belysningslins/detekteringslinskombination34. Alternativt kan 4 gånger den laterala upplösningen användas som en grov approximation.
- Registrera en tredimensionell test z-stapel av de fluorescerande mikrosfärerna och jämför de maximala projektionerna x, y och z med kalibreringsdiagrammet (figur 2). Om mikrosfärerna verkar suddiga, luddiga och/eller förvrängda (figur 2B,C), justera belysnings- och/eller detektionslinsens lägen.
3. Insamling av Drosophila-embryon
- Överför 100-200 vuxna av Drosophila-linjen till en färsk uppfödningsflaska 2-3 dagar före bildanalysen för att etablera en äggsamlingskultur. Om det ännu inte finns, överväg att använda den gamla uppfödningsflaskan för att starta en avkommakultur. För att säkerställa att vuxna inte är mer än två veckor gamla, ersätt embryosamlingskulturen i tid med avkommakulturen.
- Värm en äggläggningsfat till rumstemperatur och tillsätt en droppe jästpasta ovanpå agaren.
- Överför de vuxna från äggsamlingskulturen till en tom smal flaska och placera den ovanpå äggläggningsfatet. Inkubera äggsamlingsinställningarna vid rumstemperatur i 15 minuter. Undvik anestesi (kall, CO2)under detta steg om möjligt.
- Sätt tillbaka de vuxna på uppfödningsflaskan. Inkubera äggläggningsfatet vid en bekväm kombination av temperatur/tid och överför sedan 10-20 embryon med en liten pensel från äggläggningsfatet till en cellsil i 100 μm maskstorlek. Kassera äggläggningsfatet.
- Upprepa steg 3.1 till 3.4 för varje Drosophila-linje.
4. Insamling av tribolembryon
OBS: För enkelhetens skull tillhandahålls ett system för insamlingsförfarandet för triboliumägg (figur 3A) till vilket även siffrorna inom parenteserna i detta steg avser.
- Överför 200-300 vuxna (ca 400-700 mg) av Triboliumlinjen till en tom 1 L glasflaska 2-10 dagar före avbildningsanalysen för att etablera en äggsamlingskultur (Figur 3A_01). Fyll flaskan med 50-100 g färskt tillväxtmedium. Om det ännu inte finns, överväg att starta en avkommakultur med hjälp av tillgängliga larver och puppar. För att säkerställa att vuxna inte är mer än 3 månader gamla, ersätt äggsamlingskulturen i tid med avkommakulturen.
- Passera äggsamlingskulturen genom en 800 μm maskstorlekssikt(figur 3A_02). Återför tillväxtmediet, som innehåller icke-iscensatta embryon, till den ursprungliga flaskan (figur 3A_03) och överför vuxna till en tom 1 L glasflaska (figur 3A_04). Tillsätt 10 g äggläggningsmedium (figur 3A_05 ) ochinkuberaägguppsamlingsinställningen vid rumstemperatur i 1 timme ( figur3A_06,07).
- Passera ägguppsamlingsinställningarna genom 800 μm maskstorlekssiktet (Bild 3A_08). Sätt tillbaka vuxna på den första flaskan (figur 3A_09). Beroende på den utvecklingsprocess som ska avbildas inkuberar du äggläggningsmediet, som nu innehåller cirka 30-100 embryon, vid en bekväm temperatur/tidskombination (figur 3A_10).
- För äggläggningsmediet genom sikten med maskstorleken 300 μm (figur 3A_11) och överför embryona (figur 3A_12) till en cellsil i maskstorlek på 100 μm. Kassera de siktade äggläggningsmedierna (figur 3A_13).
- Upprepa steg 4.1 till 4.4 för varje Tribolium-linje.
5. Natriumhypokloritbaserad avskolning
OBS: Både Drosophila- och Triboliumembryon är täckta av en chorion, ett skyddande och kraftigt ljusspridande proteinskikt som inte är nödvändigt för korrekt utveckling så länge embryona hålls fuktiga efter avlägsnandet. Dechorionation protokollet för embryon av båda arterna är identiska.
- Förbered en 6-brunnsplatta genom att fylla brunnarna A1, A2, A3 och B3 med 8 ml autoklaverat kranvatten och B1- och B2-brunnarna med 7 ml autoklavererat kranvatten och 1 ml natriumhypokloritlösning (NaOCl)(figur 3B). Observera dechorionationsprocessen under ett stereomikroskop, helst i överföringsljus.
VARNING: Natriumhypoklorit är frätande. - För in den embryoinnehållande cellsilen (steg 3.4 och/eller 4.4) i A1-brunnen och tvätta embryona ca 30-60 s under mild omrörning.
- Flytta cellsilen till B1-brunnen och skaka plattorna kraftigt i 30 s, överför den sedan till A2-brunnen och tvätta embryona i 1 min under mild agitation.
- Flytta cellsilen till B2-brunnen och skaka plattan kraftigt tills de flesta embryon är helt decilerade (Figur 3C), överför den sedan till A3-brunnen och tvätta embryona i 1 min under mild agitation.
- Förvara cellsilen i B3-brunnen innan du fortsätter med monteringsproceduren.
- Upprepa steg 5.1 till 5.5 för varje rad.
6. Montering av flera embryon med spindelvävshållaren
- Återförväxlas med en agarose alikvot i en torrblocksvärmare/blandare vid 80 °C och låt sedan agarose alikvoten svalna till 35 °C.
- Rör 10 μL agarose ovanpå spindelvävshållarens slitshål. Med pipettspetsen, sprid agarosen över det slitsade hålet och aspirera sedan så mycket agarose som möjligt tills endast en tunn agarosefilm återstår. Vänta 30-60 s för stelning.
- För varje rad, välj försiktigt ett eller flera embryon med en liten pensel och placera dem på agarosefilmen.
- Ordna embryona längs den långa axeln i det slitsade hålet och rikta sedan också in deras främre bakre axel med det slitsade hålets långa axel (Figur 3D).
- Stabilisera embryona försiktigt genom att pipetting 1-2 μL agarose i gapet mellan embryona och agarosfilmen. Vänta 30-60 s för stelning.
- För långsamt in spindelvävshållaren med de monterade embryona i den bildbuffertfyllda provkammaren.
7. Jämförande live imaging i provkammarbaserade LSFMs
- Flytta ett av embryona med mikrotranslationsstegen framför detektionslinsen. Se till att spindelvävshållaren är i 45°-läge i förhållande till belysningsaxlar (x) och detekteringsaxlar (se figur 1C).
- I överföringsljuskanalen flyttar du embryot in i mitten av synfältet. Spindelvävshållaren ska inte vara synlig.
- Flytta embryot med mikrotranslationsstadierna i z tills embryots mittplan överlappar fokalplanet, dvs. tills konturen verkar skarp. Utan att byta till fluorescenskanalen anger du siktvolymen genom att flytta 250 μm från mittplanet i båda riktningarna.
- Om avbildning längs flera riktningar krävs roterar du embryot på lämpligt sätt och upprepar steg 7.2 och 7.3. Spindelvävshållaren stöder upp till fyra orienteringar i steg om 90°.
- Upprepa steg 7.1-7.3 (eller 7.4) för alla andra embryon monterade på spindelvävshållaren(figur 3E). Se till att det översta embryot inte lämnar bildbufferten när det nedersta embryot är framför detektionslinsen.
- Definiera parametrarna fluorescenskanal (lasereffekt, exponeringstid, detekteringsfilter) och tidsfördröjning (intervall, total varaktighet) och starta avbildningsprocessen. För vägledande värden, se metadatatabellen för exempeldatamängderna(tilläggstabell 1). För analyser som varar i flera dagar, överväg att täcka provkammarens öppning åtminstone delvis för att minska avdunstning.
8. Hämtning och vidare odling av bildade embryon
- När avbildningstestet är avslutat, ta försiktigt bort spindelvävshållaren från provkammaren.
- Lossa embryona från agarosfilmen med en liten pensel och överför dem till en lämpligt märkt mikroskopbild. Placera bilden i en hämtningsform och inkubera under respektive standarduppfostringsförhållanden.
- När det gäller de experimentella metoderna, uppskatta när embryogenes är klar. När kläckningstiden närmar sig, kontrollera hämtningsfaten ofta och överför kläckta Drosophila-larver till enskilda uppfödningsflaskar och Tribolium larver till enskilda brunnar på en 24-brunnsplatta. Fyll brunnarna upp till hälften med tillväxtmedium. Inkubera under respektive standarduppfostringsförhållanden.
- När de observerade individerna är vuxna, ge dem en lämplig parningspartner och kontrollera om det finns avkomma efter flera dagar.
9. Bilddatabehandling och metadatadokumentation
OBS: För bilddatabehandling rekommenderas ImageJ-derivaten FIJI35 (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI kräver ingen installation och 32- såväl som 64-bitarsversioner finns tillgängliga. Ett av de vanligaste formaten för LSFM-data är TIFF (Tagged Image File Format), som gör det möjligt att lagra bildstaplar i form av en TIFF-behållare.
- Beräkna z maximala projektioner för alla z stackar(bild | Staplar | Z Project, välj Max intensitet). Maximala prognoser är metoder för dataförenkling som minskar antalet rumsliga dimensioner från tre till två. Ett FIJI-skript för batchbearbetning tillhandahålls(kompletterande fil 1).
- Sammanfoga respektive z maximala projektioner för att skapa tidsstaplar (t staplar). Spara dessa i en TIFF-behållare. Gör detta för alla inspelade embryon samt respektive riktning och fluorescenskanaler om tillämpligt.
- Rotera z- och t-stacken runt z-axeln för att justera embryonas främre bakre axel med x- eller y-bildaxeln (Bild | Omvandla | Rotera). Beskär z staplar längs alla tre bildaxlar och t-stacken i x- och y-bildaxlar så att endast minimalt buffertutrymme (20-40 pixlar längs x- och y-axlarna, 5-10 bilder längs z-axeln) runt embryot kvarstår (Bild | Justera | Arbetsyta Storlek för x- och y-axlarna, bild | Staplar | Verktyg | Segmenthållare för z-axeln).
- Gör detta individuellt för alla registrerade embryon samt respektive riktning, om tillämpligt. Fluorescenskanaler bör i förekommande fall bearbetas med identiska rotations- och odlingsparametrar.
- Dokumentera metadata så detaljerade som möjligt. Som riktlinje kan metadatatabellen för exempeldatamängderna, som finns i avsnittet Representativa resultat, användas (kompletterande tabell 1).
10. Datavisualisering
OBS: Denna riktlinje för datavisualisering fokuserar främst på skapandet av z maximal projektionsbildmatriser som visar flera inspelade embryon längs flera riktningar och/ eller över tiden. I följande steg beskrivs datavisualiseringsproceduren som tillämpades på exempeldatamängderna för att skapa de siffror som visas och videor som länkats i avsnittet Representativa resultat.
- Kombinera t-staplar med flera riktningar (bild | Staplar | Verktyg | Kombinera) och/eller slå samman flera fluorescenskanaler(bild | Färg | Sammanslagningskanaler) för att visualisera den biologiska strukturen och/eller processen av intresse.
- Justera intensiteterna för t-staplarna (Bild | Justera | Ljusstyrka/kontrast )efter behov med funktionen "Set". Det lägsta visade värdet bör ställas in något ovanför bakgrundssignalen, det maximala visade värdet bör resultera i en bekväm kontrast. Dokumentera båda värdena, eftersom de kan användas för en konsekvent justering av respektive z-staplar. Avtrycksjusteringar med funktionen" Apply". Beroende på de experimentella metoderna, överväga att bearbeta alla registrerade embryon med identiska värden.
- Spara intensitetsjusterade t-staplar som separata filer, åsidosätt inte de icke-justerade t-staplarna. Sammanställ lämpliga understaplar från de justerade t-staplarna med dedikerade bildvalsfunktioner (t.ex. | Staplar | Verktyg | Segmenthållare) och använd montageverktyget(Bild | Staplar | Skapa Montage) för att skapa bildrutnät som kan användas för figurdesign.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vårt protokoll beskriver ett experimentellt ramverk för jämförande fluorescens live imaging i provkammare baserade LSFMs. Ramen kan till exempel användas för att juxtapose i) embryon av två eller flera arter, ii) embryon från linjer där en eller flera gener slås ut plus kontroller av vildtyp, iii) flera embryon av samma transgena linje, iv) embryon från olika transgena linjer, eller v) embryon från underlinjer som bär samma transgena , men på olika genomiska platser. I det här avsnittet ger vi exempel på de två senaste scenarierna.
I vår första exemplariska tillämpning visar vi fluorescenssignaldynamiken hos tre embryon som härrör från olika transgena Drosophila-linjer (tabell 2)under en period av ca 1 dag (Figur 4, Kompletterande film 1). För dessa linjer förväntade vi oss ganska lika fluorescensmönster eftersom alla uttrycker kärntekniskt lokaliserade EGFP/ GFP under kontroll av olika förmodligen allestädes närvarande och konstituerande aktiva förespråkare. Våra jämförande live imaging resultat visar dock att det finns starka spatiotemporal skillnader i uttryck mönster som verkligen inte är sekundära effekter på grund av omgivande varians.
I vårt andra applikationsexempel jämför vi prestandan hos tre embryon som härrör från AGOC{Zen1'#O(LA)-mEmerald} #1, #2 och #3 (Zen1'LA-mE #1, #2 respektive #3) transgena Tribolium-underlinjer 36. Alla dessa bär samma piggyBac-baserade transgene som leder till uttryck av mEmerald-länkade37 Lifeact38 under kontroll av zerknüllt 139 promotorn, en transkriptionsfaktor som är involverad i serosa specifikation. Våra jämförande live imaging resultat, som illustrerar serosa fönster stängningsprocessen under gastrulation, tyder på att subline #2 ger en anmärkningsvärt starkare övergripande signal än de andra två underlinjerna (Figur 5, Kompletterande film 2). Detta indikerar att även i Tribolium, kan det genomiska sammanhanget ha ett starkt inflytande på uttrycksnivån av transgener som bär ett uttryckskassett.
Framgångsrik hämtning av alla sex embryon som visas i detta avsnitt var möjligt som beskrivs i steg 8 i vårt protokoll. Alla utvecklades till fullt fungerande och bördiga vuxna(kompletterande tabell 1, "Hämtning" rad), vilket indikerar att det övergripande förfarandet, från dechorionation över montering till inspelning, var icke-invasiv. Denna nivå av kvalitetskontroll är nödvändig när man förväntas utveckla vilda djur, t.ex.
Alla data uppsättningar som användes för att skapa de representativa resultaten tillhandahålls som resurser som hjälper särskilt LSFM-nybörjare att utvärdera kvaliteten på sitt eget arbete. De digitala objektidentifierarbaserade nedladdningslänkarna finns i metadatatabellen(kompletterande tabell 1, raden" Dataåtkomst").
Figur 1: Översikt över experimentella ramar och monteringsmetoder. (A) Flödesschema för de tio protokollstegen med korta påminnelser och en uppskattning av den tid som krävs. Uppgifter markerade med asterisker behöver inte utföras under varje analys utan beroende på omständigheterna. Gröna rutor anger steg associerade med Drosophila och/eller Tribolium, blå rutor anger steg i samband med mikroskopi. B)Detaljritning av spindelvävshållaren. Den presenterade designen är lämplig för cylinderbaserade klämmekanismer, som vanligtvis används i provkammarebaserade LSFMs. Specifikationerna är i millimeter. Hållaren kan skalas så länge arbetsavståndet för detektionslinsen respekteras. C)Inspelningssekvens för levande avbildning av flera embryon längs flera håll. Först registreras z-staplar av det översta embryot längs upp till fyra orienteringar, dvs. Därefter flyttas embryot nedan framför detektionslinsen och inspelnings-/rotationssekvensen börjar på nytt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Fluorescerande mikrosfärbaserat kalibreringsdiagram för LSFM:er. Diagrammet illustrerar hur fluorescerande mikrosfärer visas i x-, y- och z-maximala projektioner om LSFM är korrekt kalibrerad (A), eller om det finns en belysning (B) eller detekteringsförskjutning (C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Insamling, dechorionation, montering och avbildning av flera embryon. (A) Översikt över insamling av tribolembryon. Illustrationerna citeras i hela steg 4 enligt siffrorna längst upp till vänster. B)Förberedelse- och överföringssystem för den 6-brunnsplatta som används under steg 5. B1- och B2-brunnarna innehöll utspädd natriumhypoklorit (NaOCl), vilket inducerar avskolning. C)Cellsilen på 100 μm, som användes för att överföra embryona från en brunn till en annan, inom B2-brunnen. Den övre detaljbilden visar en närbild av flera Triboliumembryon ovanpå cellsilnätet, den nedre detaljbilden visar en överföringsljusstereomikroskopbild av flera Triboliumembryon med delvis fristående korition. D)Spindelvävshållare med tre monterade Triboliumembryon. Embryona, liksom deras främre bakre axlar, var justerade längs den långa axeln i det slitsade hålet. e)Spindelvävshållarens förflyttning inom LSFM:s provkammare under registreringen av tre embryon. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Jämförande fluorescens live imaging av ett embryo vardera från #01691, #29724 och #24163 transgena Drosophila linjer. Embryon visas längs två (av fyra registrerade) riktningar under en period av 20:00 h (från en total bildperiod på 23:40 h). Ingen korrigering av dynamisk intensitet över tid utfördes. Metadata för Drosophila-datamängderna finns i kompletterande tabell 1. ZA, Z maximal projektion med bildjustering. Skalbar, 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Jämförande fluorescens live imaging av ett embryo vardera från Zen1'LA-mE #1, #2 och #3 transgena triboliumunderlinjer. (A) Embryon visas längs fyra riktningar under gastrulation, strax före serosa fönster stängning. B)Embryon visas ventrally under en period av 01:30 h (från en total avbildningsperiod på 118:00 h). Bildjustering utfördes med identiska minimivärden och maximalt visade värden, ingen dynamisk intensitetskorrigering över tid utfördes. Metadata för Tribolium-datamängderna finns i kompletterande tabell 1. Datamängder synkroniserades med scenen som visas i (A). ZA, Z maximal projektion med bildjustering. Skalbar, 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| kombination | Motivering | Belysningslins | Detekteringslins | kamera | hänvisning |
| #1 | hela embryot på cellnivå, stort pixelavstånd (liten datavolym) | 2.5× förstoring numerär bländare 0.06 (luft) | 10× förstoring numerär bländare 0,3 (vattendippning) | CCD med 1,4 megapixel (1392×1040, 6,45 μm tonhöjd) | denna studie, Drosophila41, Tribolium20,41 |
| #2 | hela embryot på cellulär/subcellulär nivå, litet pixelavstånd (stor datavolym) | 2.5× förstoring numerär bländare 0.06 (luft) | 20× förstoring numerär bländare 0,5 (vattendippning) | sCMOS med 5,5 megapixel (2560×2160, 6,5 μm tonhöjd) | Tribolium9 |
| #3 | specifika områden i embryot på subcellulär nivå eller specialiserade tillämpningar,t.ex. | 5.0× förstoring numerär bländare 0.16 (luft) | 40× förstoring numerär bländare 0,75 (vattendippning) | CCD med 1,4 megapixel (1392×1040, 6,45 μm tonhöjd) | Tribolium44 |
Tabell 1: Rekommenderade lins-/detekteringslinser/kamerakombinationer för levande avbildning av Drosophila- och Triboliumembryon med LSFM. Alla kombinationer har använts framgångsrikt i tidigare studier (se referensrad). Observera att de flesta provkammarbaserade LSFM använder vattendippande linser för detektion, som främst är utformade för bildbuffertar med ett brytningsindex på 1,33 (t.ex. autoklaverat kranvatten eller andra vattenhaltiga medier). Bildbuffertar med andra brytningsindex kan användas40, men detta ändrar vissa egenskaper hos det optiska systemet, t.ex. arbetsavståndet.
| linje | genotyp | Fluorofor uttryck |
| #01691 | y[1] w[67c23]; P{w[+mC]=Ubi-GFP.nls}ID-2; P{Ubi-GFP.nls}ID-3 | NLS-GFP under kontroll av polyubiquitinpromotorn |
| #29724 | w[*]; P{w[+mC]=Tub84B-EGFP.NLS}3 | NLS-GFP under kontroll av alfa-tubulin 84B-promotorn |
| #24163 | w[*]; P{w[+mC]=His2Av-EGFP.C}2/SM6a | EGFP-märkt histon 2A-variant i alla celler |
Tabell 2: De tre transgena Drosophila-linjerna som används i det första applikationsexepelt. Kolumnen "linje" refererar till Bloomington Drosophila Stock Center (bdsc.indiana.edu) lagernummer.
Kompletterande video 1: Jämförande fluorescens live imaging av ett embryo var från #01691, #29724 och #24163 transgena Drosophila linjer. Varje transgen linje uttrycker kärnlokaliserade EGFP/GFP under kontroll av en förmodligen allestädes närvarande och konstituerande aktiv promotor. ZA, Z maximal projektion med bildjustering. Ingen korrigering av dynamisk intensitet över tid utfördes. ZA, Z maximal projektion med bildjustering. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video 2: Jämförande fluorescens live imaging av ett embryo vardera från Zen1'LA-mE #1, #2 och #3 transgena tribolium underlinjer. Varje transgen subline uttrycker mEmerald-märkt Lifeact under kontroll av zerknüllt 1 promotorn, en transkriptionsfaktor som är involverad i serosa specifikation. Observera att Zen1'LA-mE-#1 fyller cirka 90° i serosa direkt efter serosafönstrets stängning. Datamängder synkroniserades med det stadium som visas i figur 4A. Bildjustering utfördes med identiska minimivärden och maximalt visade värden, ingen dynamisk intensitetskorrigering över tid utfördes. Embryon visas ventrally och i samma led under en period av 48:00 h. ZA, Z maximal projektion med bildjustering. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande fil 1: FIJI batch bearbetning skript för automatiserad beräkning av z maximala projektioner från alla z stackar inom en mapp. Skriptet kan öppnas i FIJI via dra-och-släpp. I början ("Kör") måste endast indatamappen anges. Utdataundermappen ("Z Maximum Projections") skapas automatiskt. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell 1: Metadata och parameter för de långsiktiga live imaging-datamängderna DS0001-6. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett av de exklusiva tillämpningsområdena för LSFMs är utvecklingsbiologi. I denna disciplin är det viktigt att titta på levande exemplar, annars kan morfogenetiska processer inte beskrivas på ett dynamiskt sätt. Ett experimentellt ramverk för samtidig live imaging i provkammare-baserade LSFMs, som beskrivs här, är bekvämt av två huvudskäl.
Omgivande varians, som är oundviklig i sekventiell live imaging, kan hanteras proaktivt. Vid insektsembryon-associerad levande avbildning ser vi t.ex. följande mottaglighet. Äggsamlingskulturerna kan ha olika åldrar vid tidpunkten för embryosamlingen. I Drosophilahar det visat sig att detta påverkar avkommans egenskaper45. Även om det är ett alternativ att arbeta med lämpligt desynkroniserade kulturer, är samtidig avbildning med synkroniserade kulturer betydligt bekvämare. Både De Drosophila- och Tribolium-baseraderepresentativa resultaten härrör från synkroniserade äggsamlingskulturer, och vi kan med säkerhet utesluta att de olika fluorescensegenskaperna är en oavsiktlig effekt av föräldrarnas senescens.
Avsväljning är ett avgörande steg eftersom långvarig exponering för natriumhypoklorit minskar embryots livskraft. Obekvämt minskar den joniska styrkan hos natriumhypoklorit med tiden. Mätningar av jonstyrkan är möjliga46, men mödosamma och besvärliga. Vid samtidig live imaging kan en master mix användas för alla linjer och/eller förhållanden under beredningen av dechorionation-associerade 6-brunnsplattorna.
Även i laboratorier med effektivt luftkonditionering är små men oregelbundna temperaturfluktuationer oundvikliga och påverkar äventemperaturkontrollerade 9 provkammarkammarebaserade LSFMs. Teoretiskt sett kan temperaturen i provkammaren loggas, men en exakt upprepning är inte möjlig. Vid samtidig levande avbildning uppstår dessa fluktuationer också, men de påverkar alla embryon på samma sätt.
Ur praktisk synvinkel ökar ett protokoll för samtidig avbildning av flera embryon dataflödet. Vid live-avbildning avgör varaktigheten av utvecklingsprocessen av intresse hur många analyser som kan utföras inom en viss period, vilket är en viktig faktor när tillgången till LSFMs är begränsad. De främsta exemplen för långsiktig inspelning är live-bildanalyser där celler spåras. Sådana experiment sträcker sig vanligtvis över långa utvecklingstider. Medan den embryonala utvecklingen av Drosophila tar bara ungefär en dag vid rumstemperatur47, Tar Tribolium cirka sju dagar48. För denna art är parallellisering därför avgörande för att hålla sig inom en rimlig tidsram, särskilt när det gäller analyser där många förhållanden jämförs.
Genomströmningen, dvs. antalet embryon som avbildas samtidigt, begränsas främst av två faktorer: För det första är utrymmet som finns tillgängligt längs y-axeln i provkammaren. När det nedre embryot är på väg att avbildas, borde det översta embryot inte ha lämnat bildbufferten. Vidare bör spindelvävshållaren och det tillhörande stödsystemet inte vara så långa att den wobbles och / eller darrar märkbart under z stackinspelningsprocessen. För det andra är den avsedda tidsupplösningen. Inspelningstiden per embryo kan approximeras genom att multiplicera exponeringstiden per tvådimensionell bild (vanligtvis 10-200 ms) med antalet plan per z-stapel (vanligtvis flera hundra), antalet kanaler (vanligt mellan ett och tre), antalet riktningar (vanligtvis mellan ett och åtta) och en inställningsberoende faktor för översättnings- och rotationsrörelserna (uppskattad mellan 1,2 och 1,5). Förhållandet mellan den avsedda tidsupplösningen och inspelningstiden per embryo anger det maximala antalet embryon som kan avbildas samtidigt. Sammanfattningsvis är vårt protokoll lämpligt att gå från sekventiell live imaging till medium data flöde, men inte lämplig för vad som allmänt betraktas som hög genomströmning. För den senare kan LSFMs som är lämpliga för mikroskopbilder49,50,51 eller brunnsplattor52 övervägas, men dessa implementeringar har vanligtvis andra begränsningar.
Beroende på den experimentella frågan och därmed kombinationen av belysningslins/detekteringslins/kamera i kombination med bildparametrarna kan samtidigt avbildade LSFM-datamängder kräva stort lagringsutrymme i sitt råa tillstånd. Denna fråga kan bäst illustreras genom att beakta de tillhandahållna Drosophila-exempeldatamängderna (kompletterandetabell 1),dvs. Varje tvådimensionell rå bild hade en datavolym på cirka 2,8 Megabyte, varje rå z-stack bestod av 120 plan och alla tre embryona registrerades längs fyra riktningar totalt 143 gånger. Följaktligen upptog rådataseten ungefär en halv Terabyte. Genom bilddatabehandling, dvs. beskärning längs alla rumsliga dimensioner (steg 9) i samband med ZIP-baserad komprimering, minskades datavolymen till 53,3 Gigabyte, vilket är cirka 10% av den ursprungliga mängden. För att bearbeta datamängder i Terabyte-systemet, BigDataViewer53 plugin, som är förinstallerad i FIJI (Plugins | BigDataViewer), rekommenderas.
Förutom de fem scenarier som beskrivs i avsnittet Representativa resultat kan vårt protokoll också användas för att karakterisera effekten av RNAi knockdown-effekter, vilket är ett populärt tillvägagångssätt i Tribolium54. Det är dock endast av begränsad användning för analys av föreningar (t.ex. insekticider eller andra biokemiska stressfaktorer) om dessa ska appliceras genom bildbufferten – som är det enklaste tillvägagångssättet – eftersom samtidig avbildning av ett kontrollembryon inte är möjligt.
Vi demonstrerade vårt protokoll med ett av våra specialbyggda mikroskop8,55, men det är tillämpligt på alla provkammarebaserade inställningar, t.ex. OpenSPIM56 eller de flesta kommersiella LSFMs. Detta protokoll kompletterar det LSFM-associerade initiativet för resursetablering som syftar till att uppmuntra nybörjare att aktivt integrera lätt arkbaserad teknik i sina forskningsplaner. De flesta universitet och institut driver idag välutrustade fluorescensmikroskopianläggningar57. Dessa ger vanligtvis tillgång till en eller flera kammarbaserade LSFM:er, men personalen kan inte förväntas ha rätt experimentella lösningar för varje vetenskaplig fråga som finns till hands.
Våra resultat visar att vårt experimentella ramverk är lämpligt för Drosophila och Tribolium. Vi är övertygade om att vårt jämförelsefokuserade protokoll kan användas för att studera embryogenes av andra insektsarter. Till exempel har ett LSFM-baserat tillvägagångssätt tillämpats för att jämföra vild-typ och knockdown-utveckling i scuttleflugan Megaselia abdita58, och uppföljningsstudier skulle också dra nytta av vår monteringsmetod. Dessutom finns transgena linjer i den tvåfläckiga cricket Gryllus bimaculatus speciellt utformade för fluorescens live imaging59 tillgängliga, men det enda för närvarande tillgängliga jämförelsefokuserade protokollet60 är avsett för konventionella inverterade mikroskop och tar därför inte upp tredimensionellt bildförvärv eller provrotation. Dessutom har det redan visat sig att spindelvävshållaren är ett bekvämt val för zebrafisk, vars embryon ändrar sin form avsevärt under embryogenes61. En anpassning av vårt protokoll, som i princip inte kräver någon optimeringsinsats, skulle ge ovan beskrivna fördelar även för denna modellorganism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Ernst H. K. Stelzer för möjligheten att använda sina resurser samt hans värdefulla kommentarer om manuskriptet, Anita Anderl för stöd med Tribolium live imaging, Sven Plath för teknisk support samt Ilan Davis, Nicole Grieder och Gerold Schubiger för att dela sina transgena Drosophila-linjer via Bloomington Stock Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100 µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
References
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
- Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
- Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
- Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
- El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
- Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
- Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
- Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
- Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
- Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
- Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
- Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
- Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
- Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
- Mcdonald, J. H. Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , Sparky House Publication. (2013).
- Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
- Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
- Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
- Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
- He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
- Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
- Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , Springer. (1997).
- Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
- McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
- Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
- Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
- Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
- Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).
