Summary
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.
Abstract
מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות מבוססת יריעות אור מציעה פתרונות יעילים לחקר תהליכים מורכבים בכמה קשקשים רלוונטיים ביולוגית. הגדרות מבוססות תא לדוגמה, אשר תוכננו במיוחד כדי לשמר את השלמות התלת מימדית של הדגימה ובדרך כלל כוללות סיבוב מדגם, הן הבחירה הטובה ביותר בביולוגיה התפתחותית. למשל, הם שימשו כדי לתעד את כל מורפוגנזה עוברית של זבוב הפירות Drosophila melanogaster ואת חיפושית הקמח האדום Tribolium castaneum. עם זאת, פרוטוקולי הדמיה חיים זמינים רבים מספקים רק מסגרות ניסיוניות לעוברים בודדים. במיוחד עבור מחקרים השוואתיים, גישות כאלה אינן נוחות, שכן דגימות בתמונה רציפה מושפעות מהשונות הסביבתית. כמו כן, זה מגביל את מספר הדגימות שניתן לציין בתוך זמן נתון. אנו מספקים מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית המגבירה את התפוקה בהגדרות מבוססות תא מדגמי ובכך מבטיחה תנאי סביבה דומים לכל הדגימות. ראשית, אנו מספקים קו מנחה לכיול עבור מיקרוסקופים פלואורסצנטיים של יריעות אור. שנית, אנו מציעים שיטת הרכבה עבור עוברים מרובים התואמת לסיבוב מדגם. שלישית, אנו מספקים מודלים תלת מימדיים למופת של הדמיה חיה של Drosophila, שעבורם אנו ממקמים שלושה קווים מהונדסים עם גרעינים מתויגים פלואורסצנטיים, כמו גם של טריבוליום, שעבורו אנו משווים את הביצועים של שלושה קווי משנה מהונדסים הנושאים את אותו טרנסג'ין, אך במקומות גנומיים שונים. הפרוטוקול שלנו תוכנן במיוחד למחקרים השוואתיים מכיוון שהוא מטפל באופן פעיל בשונות הסביבה, שתמיד קיימת בהדמיה חיה רציפה. זה חשוב במיוחד לניתוחים כמותיים ואפיון של פנוטיפים חריגים, הנובעים למשל מניסויי נוקאאוט. כמו כן, הוא מגדיל את התפוקה הכוללת, וזה מאוד נוח כאשר הגישה למיקרוסקופים פלואורסצנטיים יריעות אור מוגבלת. לבסוף, שיטת ההרכבה המוצעת יכולה להיות מותאמת עבור מיני חרקים אחרים ואורגניזמים מודל נוסף, למשל, זברה, עם בעצם שום מאמץ אופטימיזציה.
Introduction
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היא אחת מטכניקות ההדמיה החיוניות ביותר במדעי החיים, במיוחד בביולוגיה התאית וההתפתחותית. במיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונפוקאליים1, שהם המדינה-of-the-art עבור הדמיית פלואורסצנטיות תלת מימדית מאז אמצע שנות התשעים, אותה עדשה משמשת עבור עירור פלואורופור וזיהוי אור פליטה. קרן הלייזר לתאורה מרגשת את כל הפלואורופורים לאורך ציר התאורה/זיהוי והאות המופרך בהתאמה מופלה לפני הגילוי על ידי חור סיכה. לפיכך, עבור כל תמונה דו מימדית, כל הדגימה מוארת. כתוצאה מכך, עבור כל תמונה תלת מימדית, כלומר, ערימה של תמונות דו מימדיות רצופות, הדגימה כולה מוארת כמה עשרות עד כמה מאות פעמים2, אשר מקדם photobleaching ו phototoxicity3.
לפני כמעט עשרים שנה, טכנולוגיה מבוססת יריעות אור4 התגלתה כחלופה מבטיחה להדמיית פלואורסצנטיות תלת מימדית ובכך הפכה לכלי רב ערך בביולוגיה התפתחותית5. בגישה זו, תאורה וזיהוי הם decoupled. עדשת התאורה משמשת ליצירת יריעת אור בעומק של מיקרומטרים בודדים בלבד במישור המוקד של עדשת הגילוי המאורגמת בניצב. לפיכך, עבור כל תמונה דו מימדית, רק נפח מישורי דק סביב מישור המוקד מואר. כתוצאה מכך, עבור כל תמונה תלת מימדית, הדגימה כולה מוארת רק פעם אחת, אשר מקטין מאוד photobleaching ו phototoxicity6. מסיבה זו, מיקרוסקופים פלואורסצנטיים של יריעות אור (LSFMs) מציעים פתרונות יעילים לחקר תהליכים מורכבים בכמה קשקשים רלוונטיים ביולוגית והם, אם כן, בעלי ערך מיוחד בביולוגיה התפתחותית, שבה דגימות גדולות כמו כמה מילימטרים יש לנתח ברמה התת-תאית.
מבחינה היסטורית, LSFMs כבר מדגם תא מבוסס7,8. בהגדרות אלה, צירי התאורה (x) והזיהוי (z) מסודרים בדרך כלל בניצב לציר הכבידה (y). תאי מדגם מציעים חופש ניסיוני בשפע. ראשית, הם מספקים קיבולות חיץ הדמיה גדולות, אשר בתורו מקל על השימוש במערכת זלוף כדי לשלוט בסביבה, למשל, כדי לשמור על טמפרטורה מסוימת9 או ליישם גורמי לחץ ביוכימיים. כמו כן, הם תומכים בשיטות הרכבה מותאמות אישית10 המותאמות לצרכים הניסיוניים המתאימים תוך שמירה על תלת מימד, במקרים מסוימים דינמי11, שלמות הדגימה. בנוסף, הגדרות מבוססות תא מדגם מצוידות בדרך כלל בפונקציית סיבוב המשמשת לסובב את הדגימות סביב ציר y ובכך לדמות אותם לאורך שניים, ארבעה או אפילו יותר כיוונים. מאז עוברים של אורגניזמים מודל נפוץ הם, בהקשר של מיקרוסקופיה, גדול יחסית, הדמיה רצופה לאורך גחון הגב, לרוחב, ו / או צירי גוף אחוריים מספק ייצוג מקיף יותר. זה מאפשר למשל מעקב ארוך טווח אחר תאים שזזים לאורך נתיבי העברה תלת מימדיים מורכבים12,13.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס גיליון אור יושם בהרחבה כדי לחקור את המורפוגנזה העוברית של Drosophila melanogaster, הן באופן שיטתי14,15, כמו גם עם דגש ספציפי על ההיבטים הביופיזיים של הפיתוח. לדוגמה, הוא שימש לאיסוף נתונים מורפוגנטיים ברזולוציה גבוהה על מנת לזהות קשר ביומכני בין פולשניות אנדודרם והרחבת ציר במהלך התארכות חיידקים16 ועוד כדי לקשר את הזרימה התאית המורכבת עם דפוסי יצירת כוח במהלך gastrulation17. זה גם שולב עם טכניקות המדינה-of-the-art אחרים, למשל, אופטוגנטיקה כדי לחקור את הרגולציה של איתות Wnt במהלך דפוס אחורי-ראשי באפידרמיס18.
עם זאת, לימוד מין אחד בלבד אינו מספק תובנות על התפתחות ההתפתחות. כדי להבין עובריות בהקשר הפילוגנטי, נערך מחקר אינטנסיבי עם אורגניזמים חלופיים של מודל חרקים. אחד המינים הנחקרים ביותר הוא חיפושית הקמח האדום טריבוליום קסטנאום, מזיק תבואה מאוחסן רלוונטי מבחינה כלכלית19, אשר מורפוגנזה עוברית כבר דימוי שיטתי עם LSFM20. המורפוגנזה העוברית של שני מינים אלה שונה להפליא בכמה היבטים, למשל, מצב פילוח21, כמו גם היווצרות והשפלה של ממברנות חוץ-עובריות22. ההיבט האחרון כבר נותח בהרחבה באמצעות LSFMs. לדוגמה, הוכח כי סרוסה, רקמה עוברית נוספת העוטפת ומגנה על עובר הטריבוליום מפני סכנות שונות עבור החלק הטוב יותר של העובר שלה23,24, משמש גם "נהג" מורפוגנטי עבור תהליך הנסיגה שלה במהלך סגירת הגב25. יתר על כן, הוכח כי במהלך gastrulation, אזור מסוים של blastoderm נשאר מעוגן קרום vitelline על מנת ליצור תנועות רקמה אסימטרית26 ו, בעקבות תצפית זו, כי נזילות רקמות אזורית מאפשרת לתאים לעזוב ברצף את קצה הסרוסה במהלך סגירת חלון סרוסה27.
בכל Drosophila- ו טריבוליוםהקשורים מחקרים שצוטטו לעיל, LSFMs מבוססי תא מדגם שימשו. ברוב המקרים, העוברים נרשמו בכיוונים מרובים באמצעות פונקציית הסיבוב לדוגמה. אמנם לא צוין במפורש, ניתן להניח כי הם נרשמו בנפרד ובכך עצמאי אחד את השני מבחני הדמיה חיים רציפים, בדומה לעבודה הקודמת שלנו על Tribolium20,28. בתרחישים מסוימים, גישה כזו מקובלת, אך במיוחד בגישות השוואתיות כמותיות, שונות סביבתית יכולה לעוות את התוצאות. לדוגמה, זה זמן רב ידוע כי המהירות ההתפתחותית של חרקים הוא תלוי טמפרטורה29, אבל מחקר עדכני יותר עולה כי ב Drosophila, הטמפרטורה עשויה להשפיע גם על הריכוז של מורפוגנים30. כתוצאה מכך, אם מאפיינים מסוימים של עובר, למשל, הפרופורציות הדינמיות, שיעורי החלוקה ומהירויות ההגירה של התאים, צריכים להיות מכמתים במדויק, נדרשות חזרות מספיקות ללא שונות סביבתית. זה ממזער סטיות תקן ושגיאות תקן, אשר בתורו מקל על הסמיכות עם תנאים ניסיוניים אחרים, אפילו רק שוליים שונים.
עם זאת, LSFMs מבוססי תא לדוגמה מיועדים בעיקר לתוכן גבוה ולא למאמרי תפוקה גבוהים. שלא כמו מיקרוסקופים קונפוקליים, אשר מצוידים בדרך כלל עם מנגנוני הידוק סטנדרטיים עבור שקופיות מיקרוסקופיה, צלחות פטרי וצלחות היטב, כמעט כל LSFMs מבוססי תא מדגם להשתמש במנגנוני הידוק מבוססי גליל. מנגנונים אלה מיועדים למחזיקי מדגם בהתאמה אישית התואמים לסיבוב כמו גם10לא פולשניים , אך בדרך כלל אינם מיועדים ליותר מדגם אחד20,31,32. מסגרת להדמיה חיה בו זמנית של שני עוברים או יותר, שבה היתרונות של הגדרות מבוססות תא מדגם אינם נפגעים, מטפלת בבעיית השונות הסביבתית ובכך מגדילה את הערך של LSFMs למחקרים השוואתיים.
בפרוטוקול שלנו, אנו מציגים מסגרת ניסיונית להדמיה חיה השוואתית ב- LSFMs מבוססי תא מדגם (איור 1A) שבה ציר y משמש כאפשרות "לערום" עוברים. ראשית, אנו מספקים הנחיית כיול מבוססת מיקרוספרה פלואורסצנטית עבור LSFMs מבוססי תא מדגם, וזה חשוב במיוחד עבור מכשירים שאין להם עוזר כיול. שנית, אנו מתארים שיטת הרכבה לעוברים מרובים המבוססת על מחזיק קורי העכביש28 (איור 1B)התואמת לסיבוב הדגימה ובכך מאפשרת הדמיה בו זמנית של דגימות מרובות בכיוונים מרובים (איור 1C). מספר עוברים מיושרים על גבי סרט agarose דק, ולאחר הכניסה לתוך תא המדגם, עבר ברציפות דרך גיליון האור כדי לרכוש תמונות תלת מימדיות. שלישית, אנו מספקים שלוש ערכות נתונים הדמיה חיה למופת עבור Drosophila, כמו גם עבור טריבוליום. עבור הראשון, אנו ממקסמים קווים מהונדסים עם גרעינים בעלי תווית פלואורסצנטית. עבור האחרון, אנו משווים את הביצועים של קווי משנה מהונדסים הנושאים את אותו טרנסג'ין, אך במקומות גנומיים שונים. לבסוף, אנו דנים בחשיבות ההקבלה ביחס להדמיה חיה השוואתית ושונותסביבתית 33, דנים במגבלת התפוקה של המסגרת הניסיונית שלנו ומעריכים את התאמת הגישה שלנו לאורגניזמים מודל אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עבודת הכנה
- בחר עדשת תאורה / זיהוי עדשה / שילוב מצלמה עבור LSFM שמתאים לשאלה המדעית ולהגדיר את המיקרוסקופ. גודל שדה הראייה הוא המנה של גודל שבב המצלמה והגדלת עדשת הגילוי. יש לבחור בעדשת התאורה כך שכל שדה הראייה יכסה על ידי גיליון אור מישורי גס34. שלושה שילובים מומלצים מפורטים בטבלה 1.
- להכנת aliquots agarose ו מנות אחזור, להוסיף 2 גרם נמוך להמיס agarose כדי 200 מ"ל autoclaved מי ברז לחמם את התערובת במיקרוגל ב 600-800 W עד שכל חלקיקי agarose מומסים. הכן כמה 1 מ"ל agarose aliquots ב 1.5 מ"ל או 2 צינורות תגובה מ"ל, ולאחר מכן למלא כמה מנות Ø פטרי 90 מ"מ 3-5 מ"מ גבוה עם agarose. אחסן aliquots מוצקים ומנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- עבור Drosophila: כדי להכין בקבוקונים גידול טרי, לבשל כמות מספקת של מדיום Drosophila בהתאמה אישית או מסחרית זמין, להעביר 5-15 מ"ל לתוך בקבוקונים רחבים ולאחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס. להכנת מנות הטלת ביצים, הוסיפו 1 גרם של אגרוז נמוך להמסה ל-50 מ"ל של מי ברז אוטוקלאבים ומחממים את התערובת במיקרוגל ב-600-800 ואט עד שכל חלקיקי ההתעוררות מומסים. אפשר לתערובת להתקרר עד 45 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף 50 מ"ל מיץ פירות (רצוי תפוח או ענבים אדומים) ומערבבים ביסודיות. יוצקים את התערובת לתוך 35 מ"מ Ø פטרי מנות ולאחסן מנות מוצקות הטלת ביצים ב 4 מעלות צלזיוס.
- עבור Tribolium: כדי להכין את מדיום הצמיחה, להעביר קמח מחיטה מלאה, כמו גם שמרים יבשים לא פעילים דרך מסננת בגודל רשת 710 מיקרומטר, ולאחר מכן להשלים את הקמח מנופה עם 5% (w / w) שמרים מנופים. כדי להכין מדיום הטלת ביצה, להעביר קמח חיטה דק, כמו גם שמרים יבשים לא פעילים דרך מסננת בגודל רשת 250 מיקרומטר, ולאחר מכן להשלים את הקמח מנופה עם 5% (w / w) שמרים מנופים.
2. כיול של LSFMs מבוססי תא מדגם באמצעות מיקרוספרות פלואורסצנטיות
הערה: מטרת הכיול היא ליישר את נקודות המוקד של עדשות התאורה והזיהוי (איור 2A),שכן זוהי הנחת היסוד לתמונות ברורות. יש לכייל LSFMs באופן קבוע, לפחות פעם אחת בכל 3-4 שבועות.
- ממיסים מחדש aliquot agarose בתנור בלוק יבש / מיקסר ב 80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאפשר aliquot agarose להתקרר עד 35 מעלות צלזיוס.
- העבר 50 μL של agarose לצינור תגובה 1.5 מ"ל ולהוסיף 0.5 μL של פתרון מיקרוספרה פלואורסצנטית. מערבבים ב 1,400 סל"ד במשך דקה.
- מלאו את החור המחורץ של מחזיק קורי העכביש ב-10 μL של תערובת פתרון מיקרוספרה אגרוז/פלואורסצנטית, ואז שאפו כמה שיותר גלאה עד שרק סרט אפרוז דק יישאר. חכה 30-60 שניות להתמצקות.
- ממלאים את תא הדגימה במי ברז אוטומטיים. הכנס את מחזיק קורי העכביש באיטיות לתא הדגימה והזז את החור המחורץ עם שלבי המיקרו-טרנזיציה מול עדשת הגילוי.
- סובב את מחזיק קורי העכביש עם שלב הסיבוב למיקום של 45° יחסית לצירי התאורה (x) והזיהוי (z). מחזיק קורי העכביש לא צריך להיות גלוי בערוץ אור השידור.
- עבור לערוץ הפלואורסצנטי המתאים והתאם את עוצמת הלייזר כמו גם את זמן החשיפה כך שהמיקרוספרות הפלואורסצנטיות יספקו אות מתאים.
- ציין כרך תצוגה המכסה לחלוטין את סרט ההתעוררות בעל הכיוון הרוחבי. הגדר את המרווח z על ידי חישוב הרזולוציה הצירית המקסימלית האפשרית עבור עדשת התאורה המתאימה / שילוב עדשת זיהוי34. לחלופין, 4 פעמים את הרזולוציה לרוחב יכול לשמש קירוב גס.
- רשום מחסנית z תלת-ממדית של המיקרוספרות הפלואורסצנטיות והשווה את התחזיות המרביות x, y ו- z לתרשים הכיול (איור 2). אם המיקרוספרות נראות מטושטשות, מטושטשות ו/או מעוותות (איור 2B,C),כווננו את מיקומי התאורה ו/או עדשת הגילוי.
3. אוסף עוברי דרוזופילה
- העבר 100-200 מבוגרים של קו Drosophila של בחירה בקבוקון גידול טרי 2-3 ימים לפני מבחני ההדמיה כדי להקים תרבות איסוף ביצים. אם עדיין לא קיים, שקול להשתמש בקבוקון גידול הישן כדי להתחיל תרבות צאצאים. כדי להבטיח שמבוגרים אינם בני יותר משבועיים, החלף את תרבות איסוף העוברים בזמן בתרבות הצאצאים.
- מחממים צלחת הטלת ביצה לטמפרטורת החדר ומוסיפים טיפת משחת שמרים על גבי האגר.
- מעבירים את המבוגרים מתרבות איסוף הביצים לבקבוקון צר וריק ומניחים אותו על צלחת הטלת הביצים. דגירה את ההתקנה איסוף הביצים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. הימנע הרדמה (קר, CO2) במהלך שלב זה במידת האפשר.
- החזירו את המבוגרים לבקבוקון גידול. דגירה צלחת הטלת ביצה בשילוב טמפרטורה / זמן נוח, ולאחר מכן להעביר 10-20 עוברים עם מברשת צבע קטנה מן המנה מטיל ביצה מסננת תא בגודל 100 מיקרומטר. השליכו את צלחת הטלת הביצים.
- חזור על שלבים 3.1 עד 3.4 עבור כל קו דרוזופילה.
4. אוסף עוברי טריבוליום
הערה: לנוחותך, תוכנית של הליך איסוף ביצי טריבוליום מסופקת (איור 3A) שאליו מתייחסים גם המספרים בתוך הסוגריים בשלב זה.
- העבר 200-300 מבוגרים (כ-400-700 מ"ג) של קו הטריבוליום הנבחר לבקבוק זכוכית ריק של 1 ל' 2-10 ימים לפני מבחני ההדמיה להקמת תרבות איסוף ביצים(איור 3A_01). ממלאים את הבקבוק ב-50-100 גרם של מדיום צמיחה טרי. אם עדיין לא קיים, לשקול להתחיל תרבות צאצאים באמצעות זחלים זמינים וגומה. כדי להבטיח שמבוגרים אינם בני יותר מ -3 חודשים, החלף את תרבות איסוף הביצים בזמן בתרבות הצאצאים.
- העבירו את תרבות איסוף הביצים דרך מסננת בגודל רשת בגודל 800 מיקרומטר(איור 3A_02). החזירו את מדיום הגדילה, המכיל עוברים שאינם מבוימים, לבקבוק הראשוני (איור 3A_03)והעבירו מבוגרים לבקבוק זכוכית ריק של 1 ליטר(איור 3A_04). הוסיפו 10 גרם של מדיום הטלת ביצים (איור 3A_05)ודגרו את מערך איסוף הביצים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת(איור 3A_06,07).
- העבירו את מערך איסוף הביצים דרך מסננת רשת בגודל 800 מיקרומטר(איור 3A_08). החזירו מבוגרים לבקבוק הראשוני שלהם (איור 3A_09). בהתאם לתהליך ההתפתחותי שיש לדמות, דגירו את המדיום המטילה ביצים, המכיל כיום כ-30-100 עוברים, בשילוב טמפרטורה/זמן נוח(איור 3A_10).
- העבירו את מדיום הטלת הביצים דרך מסננת רשת בגודל 300 מיקרומטר(איור 3A_11)והעבירו את העוברים(איור 3A_12)למסננת תא בגודל רשת של 100 מיקרומטר. השליכו את המדיה המטילה ביצים(איור 3A_13).
- חזור על שלבים 4.1 עד 4.4 עבור כל קו טריבוליום.
5. נתרן היפוכלוריט מבוסס dechorionation
הערה: הן עוברי דרוסופילה והן עוברי טריבוליום מכוסים על ידי כוריון, שכבת חלבון מגן ומפזרת אור בכבדות שאינה חיונית להתפתחות נאותה כל עוד העוברים נשמרים לחים לאחר ההסרה. פרוטוקול ההקלה לעוברים של שני המינים זהה.
- הכינו צלחת של 6 בארות על ידי מילוי בארות A1, A2, A3 ו-B3 ב-8 מ"ל של מי ברז אוטומטיים ובארות B1 ו-B2 עם 7 מ"ל של מי ברז אוטומטיים ופתרון של 1 מ"ל של נתרן היפוכלוריט (NaOCl)(איור 3B). שים לב לתהליך dechorionation תחת מיקרוסקופ סטריאו, באופן אידיאלי באור שידור.
התראה: היפוכלוריט נתרן הוא מאכל. - הכנס את מסננת התא המכילה עובר (שלב 3.4 ו /או 4.4) לתוך הבאר A1 ולשטוף את העוברים על 30-60 s תחת תסיסה עדינה.
- מעבירים את מסננת התאים לבאר B1 ומנערים את הצלחות במרץ במשך 30 שניות, ואז מעבירים אותה לבאר A2 ושוטפים את העוברים במשך דקה תחת תסיסה עדינה.
- מעבירים את מסננת התאים לבאר B2 ומנערים את הצלחת במרץ עד שרוב העוברים מתים לחלוטין(איור 3C),ואז מעבירים אותה לבאר A3 ושוטפים את העוברים למשך דקה תחת תסיסה עדינה.
- לאחסן את מסננת התא B3 הרבה לפני שתמשיך עם הליך ההרכבה.
- חזור על שלבים 5.1 עד 5.5 עבור כל שורה.
6. הרכבה של עוברים מרובים באמצעות מחזיק קורי העכביש
- ממיסים מחדש aliquot agarose בתנור בלוק יבש / מיקסר ב 80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאפשר aliquot agarose להתקרר עד 35 מעלות צלזיוס.
- פיפט 10 μL של agarose על גבי החור המחורץ של מחזיק קורי העכביש. עם קצה פיפטה, להפיץ את agarose מעל החור המחורץ, ואז לשאוף כמה שיותר agarose עד רק סרט agarose דק נשאר. חכה 30-60 שניות להתמצקות.
- עבור כל שורה, בחר בזהירות עובר אחד או יותר עם מברשת צבע קטנה והנח אותם על הסרט agarose.
- מסדרים את העוברים לאורך הציר הארוך של החור המחורץ, ואז גם מיישרים את הציר האחורי-קצר שלהם עם הציר הארוך של החור המחורץ(איור 3D).
- לייצב את העוברים בזהירות על ידי pipetting 1-2 μL של agarose לתוך הפער בין העוברים לבין הסרט agarose. חכה 30-60 שניות להתמצקות.
- הכנס את מחזיק קורי העכביש עם העוברים הרכובים לאט לתוך תא הדגימה מלא מאגר התמונה.
7. הדמיה חיה השוואתית ב- LSFMs מבוססי תא מדגם
- להזיז את אחד העוברים עם שלבי microtranslation מול עדשת הגילוי. ודאו שמחזיק קורי העכביש נמצא במיקום של 45° יחסית לצירי התאורה (x) והזיהוי (z) (cf. איור 1C).
- בערוץ תאורת השידור, הזיזו את העובר למרכז שדה הראייה. מחזיק קורי העכביש לא צריך להיות גלוי.
- להזיז את העובר עם שלבי microtranslation ב z עד המטוס האמצעי של העובר חופף עם מישור המוקד, כלומר עד קווי המתאר נראה חד. מבלי לעבור לערוץ הפלואורסצנטי, ציין את נפח התצוגה על-ידי הזזת 250 מיקרומטר מהמטוס האמצעי לשני הכיוונים.
- לחלופין, אם נדרשת הדמיה בכיוונים מרובים, סובב את העובר כראוי וחזור על שלבים 7.2 ו- 7.3. מחזיק קורי העכביש תומך ב-4 כיוונים במדרגות של 90°.
- חזור על שלבים 7.1 עד 7.3 (או 7.4) עבור כל העוברים האחרים המותקנים על מחזיק קורי העכביש (איור 3E). ודא שהעובר העליון אינו משאיר את מאגר ההדמיה כאשר העובר התחתון נמצא מול עדשת הגילוי.
- הגדר את הפרמטרים של ערוץ הפלואורסצנטיות (עוצמת לייזר, זמן חשיפה, מסנן זיהוי) ופער זמן (מרווח זמן, משך כולל) והתחל את תהליך ההדמיה. לקבלת ערכים אינדיקטיביים, עיין בטבלת המטה-נתונים של ערכות הנתונים לדוגמה (טבלה משלימה 1). עבור מבחנים שנמשכים מספר ימים, שקול לכסות את תא הדגימה שנפתח לפחות באופן חלקי כדי להפחית את האידוי.
8. אחזור וטיפוח נוסף של עוברים בתמונה
- כאשר מבחני ההדמיה מסתיימים, הסר בזהירות את מחזיק קורי העכביש מתא הדגימה.
- נתק את העוברים מסרט האגרוז עם מברשת צבע קטנה והעבר אותם למגלשת מיקרוסקופ המסומנת כראוי. מניחים את השקופית לתוך צלחת אחזור דגירה בתנאי גידול סטנדרטיים בהתאמה.
- לגבי אופני הניסוי, להעריך מתי עוברי הושלם. כאשר נקודת זמן הבקיעה מתקרבת, לבדוק את מנות אחזור לעתים קרובות ולהעביר זחלים Drosophila בקעו בקבוקונים גידול בודדים זחלי טריבוליום לבארות בודדות של צלחת 24-well. מלאו את הבארות עד למחצית במדיום צמיחה. דגירה בתנאי גידול סטנדרטיים בהתאמה.
- לאחר האנשים שנצפו הם מבוגרים, לספק להם שותף הזדווגות מתאים ולבדוק צאצאים לאחר מספר ימים.
9. תיעוד עיבוד ומטה-נתונים של נתוני תמונה
הערה: לעיבוד נתוני תמונה, מומלץ להפיק את IMAGEJ FIJI35 (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI אינה דורשת התקנה וגירסאות 32 סיביות וכן 64 סיביות זמינות. אחת הפורמטים הנפוצים ביותר עבור נתוני LSFM היא תבנית קובץ התמונה המתויגת (TIFF), המאפשרת אחסון של ערימות תמונות בצורה של גורם מכיל TIFF.
- חישוב התחזיות המרביות z עבור כל ערימות z (תמונה | ערימות | פרוייקט Z, בחר בעוצמה מרבית). התחזיות המרביות הן גישות לפישוט נתונים המפחיתות את מספר הממדים המרחביים משלוש לשתיים. סקריפט FIJI לעיבוד אצווה מסופק (קובץ משלים 1).
- שרשור התחזיות המרביות z בהתאמה כדי ליצור ערימות זמן (ערימות t). שמור אותם במיכל TIFF אחד. עשה זאת עבור כל העוברים המוקלטים, כמו גם את הכיוונים ואת ערוצי הפלואורסצנטיות המתאימים במידת הצורך.
- סובב את הערימה z ו- t סביב ציר z כדי ליישר את הציר האחורי-אחורי של העוברים עם ציר התמונה x או y (תמונה | שינוי צורה | סיבוב). חותכים את ערימות z לאורך כל שלושת צירי התמונה ואת מחסנית t בצירי התמונה x ו- y כך שרק שטח חיץ מינימלי (20-40 פיקסלים לאורך צירי x ו- y, 5-10 תמונות לאורך ציר z) סביב העובר נשאר (תמונה | כוונון | גודל בד ציור עבור צירי x ו- y, תמונה | ערימות | כלים | שומר פרוסות לציר z).
- עשה זאת בנפרד עבור כל העוברים המוקלטים, כמו גם את הכיוונים המתאימים, אם רלוונטי. ערוצי פלואורסצנטיות, אם רלוונטי, יש לעבד עם פרמטרים זהים של סיבוב וחיתוך.
- תעד את המטה-נתונים כמפורטים ככל האפשר. כהנחיה, ניתן להשתמש בטבלת המטה-נתונים של ערכות הנתונים לדוגמה, המוצגות במקטע תוצאות מייצגות (טבלה משלימה 1).
10. תצוגה חזותית של נתונים
הערה: קו מנחה זה להמחנאת נתונים מתמקד בעיקר ביצירת מטריצות תמונה של הקרנה מרבית z המציגות מספר עוברים מוקלטים לאורך מספר כיוונים ו/או לאורך זמן. השלבים הבאים מתארים את שגרת הפריטים החזותיים של הנתונים שהוחלה על ערכות הנתונים לדוגמה ליצירת האיורים המוצגים וסרטי הווידאו המקושרים במקטע תוצאות מייצגות.
- שילוב ערימות של כיוונים מרובים (תמונה | ערימות | כלים | שילוב) ו/או מיזוג ערוצי פלואורסצנטיות מרובים (תמונה | | צבע מיזוג ערוצים) כדי לדמיין את המבנה הביולוגי ו / או תהליך של עניין.
- התאמת העוצמות של ערימות t (תמונה | כוונון | בהירות/ניגודיות) לפי הצורך באמצעות הפונקציה "Set". יש להגדיר את הערך המוצג המינימלי מעט מעל אות הרקע, הערך המוצג המרבי אמור לגרום לחדות נוחה. תעד את שני הערכים, מכיוון שניתן להשתמש בהם להתאמה עקבית של ערימות z המתאימות. הדפס התאמות באמצעות הפונקציה "Apply". בהתאם לאופנים הניסיוניים, שקול לעבד את כל העוברים המוקלטים עם ערכים זהים.
- שמרו ערימות t מותאמות עוצמה כקבצים נפרדים, אל תעקפו את ערימות t שאינן מותאמות. קומפילציה ערימות משנה מתאימות מערימות t מותאמות עם פונקציות ייעודיות לבחירת תמונה (למשל, תמונה | ערימות | כלים | Slice Keeper) והשתמש בכלי מונטאז'(תמונה | ערימות | Make Montage) כדי ליצור רשתות תמונה שניתן להשתמש בהן לעיצוב איורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה פלואורסצנטית השוואתית בתא מדגם מבוסס LSFMs. לדוגמה, ניתן להשתמש במסגרת כדי לחבר (i) עוברים משני מינים או יותר, (ii) עוברים של קווים שבהם גנים אחד או יותר מופקים בתוספת פקדים מסוג בר, (iii) עוברים מרובים מאותו קו מהונדס, (iv) עוברים מקווים מהונדסים שונים, או (v) עוברים מקווי משנה הנושאים את אותו טרנסגן אבל במקומות גנומיים שונים. בסעיף זה, אנו מספקים דוגמאות לשני התרחישים האחרונים.
ביישום המופתי הראשון שלנו, אנו מראים את הדינמיקה של אות הפלואורסצנטיות של שלושה עוברים הנובעים מקווי דרוזופילה מהונדסים שונים (טבלה 2) על פני תקופה של יום אחד(איור 4, סרט משלים 1). עבור קווים אלה, ציפינו לדפוסי פלואורסצנטיות דומים למדי, שכן כולם מבטאים EGFP/GFP שעברו לוקליזציה גרעינית תחת שליטה של מקדמים שונים, ככל הנראה בכל מקום ופעילים באופן מכונן. עם זאת, תוצאות ההדמיה החיה ההשוואתית שלנו מראות כי ישנם הבדלים מרחביים חזקים בדפוסי הביטוי שהם בהחלט לא השפעות משניות עקב שונות הסביבה.
בדוגמת #O היישום השניה שלנו, אנו משווים את הביצועים של שלושה עוברים הנובעים #1, #2 #3 (Zen1'LA-mE #1, #2 #3, בהתאמה) משני טריבוליום מהונדסים36. כל אלה נושאים את אותו transgene מבוסס piggyBac שמוביל לביטוי של mEmerald מקושר37 Lifeact38 תחת שליטה של מקדם zerknüllt 139, גורם שעתוק מעורב מפרט סרוסה. תוצאות ההדמיה החיה ההשוואתית שלנו, הממחישות את תהליך סגירת חלון הסרוסה במהלך gastrulation, מצביעות על כך שקווי המשנה #2 מספקים אות כולל חזק בהרבה משתי תתי הקווים האחרים (איור 5, סרט משלים 2). זה מציין כי גם טריבוליום, ההקשר הגנומי עשוי להיות בעל השפעה חזקה על רמת הביטוי של transgenes הנושאים קלטת ביטוי.
אחזור מוצלח של כל ששת העוברים המוצגים בסעיף זה היה אפשרי כמתואר בשלב 8 של הפרוטוקול שלנו. כולם התפתחו למבוגרים פונקציונליים ופוריים לחלוטין(טבלה משלימה 1, שורת "אחזור"), המציין כי ההליך הכולל, מ dechorionation על הרכבה להקלטה, היה לא פולשני. רמה זו של בקרת איכות חיונית בכל פעם שצפויה התפתחות מסוג פראי, למשל, לגבי עוברי בקרה הממוחמים בו זמנית עם עוברים שבהם גנים אחד או יותר מופלים או נופלים.
כל ערכות הנתונים ששימשו ליצירת התוצאות הייצוגיות מסופקות כמשאבים שיסייעו במיוחד למתחילים של LSFM להעריך את איכות העבודה שלהם. קישורי ההורדה המבוססים על מזהה אובייקט דיגיטלי נמצאים בטבלת המטה-נתונים(טבלה משלימה 1, "גישה לנתונים").
איור 1: מבט כולל על מסגרת ניסיונית ושיטת הרכבה. (A)תרשים זרימה של עשרת שלבי הפרוטוקול עם תזכורות קצרות והערכת הזמן הנדרש. משימות המסומנות בכוכביות אינן חייבות להתבצע במהלך כל מבחנה, אלא בהתאם לנסיבות. תיבות ירוקות מציינות שלבים הקשורים Drosophila ו/או טריבוליום, תיבות כחולות לציין צעדים הקשורים מיקרוסקופיה. (B)ציור מפורט של מחזיק קורי העכביש. העיצוב המוצג מתאים למנגנוני הידוק מבוססי צילינדר, המשמשים בדרך כלל ב- LSFMs מבוססי תא לדוגמה. ניתן לשנות את קנה המידה של המחזיק כל עוד מרחק העבודה של עדשת הגילוי מכובד. (C) רישום רצף להדמיה חיה של עוברים מרובים לאורך כיוונים מרובים. בהתחלה, ערימות z של העובר העליון נרשמות לאורך עד ארבעה כיוונים, כלומר 0°, 90°, 180° ו 270°. לאחר מכן, העובר שלהלן מועבר מול עדשת הגילוי ורצף ההקלטה/סיבוב מתחיל מחדש. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תרשים כיול מבוסס מיקרוספרה פלואורסצנטית עבור LSFMs. התרשים מדגים כיצד מיקרוספרות פלואורסצנטיות מופיעות בהקרנות x, y ו- z מרביות אם ה- LSFM מכויל כראוי (A), או אם יש תאורה (B) או היסט זיהוי (C). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: איסוף, פירוק, הרכבה והדמיה של עוברים מרובים. (A)סקירה כללית של אוסף עוברי טריבוליום. האיורים מצוטטים לאורך שלב 4 בהתאם למספרים בפינה השמאלית העליונה. (B)ערכת הכנה והעברה עבור צלחת 6 באר בשימוש במהלך שלב 5. בארות B1 ו- B2 הכילו היפוכלוריט נתרן מדולל (NaOCl), אשר גורם dechorionation. (C)מסננת התא 100 מיקרומטר, אשר שימש להעברת העוברים מבאר אחת לאחרת, בתוך באר B2. תמונת הפירוט העליון מראה תקריב של מספר עוברי טריבוליום על גבי רשת מסננת התא, תמונת הפירוט התחתון מראה תמונת מיקרוסקופ סטריאו אור שידור של כמה עוברי טריבוליום עם chorion מנותק חלקית. (D)מחזיק קורי עכביש עם שלושה עוברי טריבוליום רכובים. העוברים, כמו גם הצירים האחוריים-קדוריים שלהם, היו מיושרים לאורך הציר הארוך של החור המחורץ. (ה)תנועה של מחזיק קורי העכביש בתוך תא הדגימה של LSFM במהלך ההקלטה של שלושה עוברים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיה חיה של פלואורסצנטיות השוואתית של עובר אחד כל אחד מקווי #01691, #29724 #24163 דרוזופילה מהונדסים. העוברים מוצגים לאורך שני כיוונים (מתוך ארבעה מוקלטים) על פני תקופה של 20:00 שעות (מתקופת הדמיה כוללת של 23:40 שעות). לא בוצע תיקון אינטנסיביות דינמי לאורך זמן. מטה-נתונים עבור ערכות הנתונים של דרוזופילה ניתן למצוא בטבלה משלימה 1. ZA, הקרנה מרבית Z עם התאמת תמונה. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.
איור 5: הדמיה חיה של פלואורסצנטיות השוואתית של עובר אחד כל אחד #1 Zen1'LA-mE, #2 וקווי המשנה #3 טריבוליום מהונדסים. (A)עוברים מוצגים לאורך ארבעה כיוונים במהלך gastrulation, רק לפני סגירת חלון סרוסה. (B)עוברים מוצגים דרך האוורור על פני תקופה של 01:30 שעות (מתקופת הדמיה כוללת של 118:00 שעות). התאמת תמונה בוצעה עם ערכי מינימום ומקסימום זהים המוצגים, לא בוצע תיקון עוצמת דינמי לאורך זמן. מטה-נתונים עבור ערכות הנתונים של טריבוליום ניתן למצוא בטבלה משלימה 1. ערכות נתונים סונכרנו לבמה המוצגת ב- (A). ZA, הקרנה מרבית Z עם התאמת תמונה. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.
| שילוב | רציונל | עדשת תאורה | עדשת זיהוי | מצלמה | הפניה |
| #1 | העובר כולו ברמה התאית, מרווח פיקסלים גדול (נפח נתונים קטן) | צמצם מספרי הגדלה ×2.5 × 0.06 (אוויר) | 10× צמצם מספרי הגדלה 0.3 (טבילה במים) | CCD עם 1.4 מגה פיקסל (1392×1040, גובה 6.45 מיקרומטר) | מחקר זה, דרוזופילה41, טריבוליום20,41 |
| #2 | העובר כולו ברמה התאית/תת-תאית, מרווח פיקסלים קטן (נפח נתונים גדול) | צמצם מספרי הגדלה ×2.5 × 0.06 (אוויר) | 20× צמצם מספרי הגדלה 0.5 (טבילה במים) | sCMOS עם 5.5 מגה פיקסל (2560×2160, גובה 6.5 מיקרומטר) | טריבוליום9 |
| #3 | אזורים ספציפיים של העובר ברמה התת-תאית או יישומים מיוחדים למשל הדמיה חיה של חיידקים מנותח42,43 | 5.0× צמצם מספרי הגדלה 0.16 (אוויר) | 40× צמצם מספרי הגדלה 0.75 (טבילת מים) | CCD עם 1.4 מגה פיקסל (1392×1040, גובה 6.45 מיקרומטר) | טריבוליום44 |
טבלה 1: עדשת תאורה מומלצת / זיהוי עדשה / שילובי מצלמה להדמיה חיה של עוברי דרוסופילה וטריבוליום באמצעות LSFM. כל השילובים הועסקו בהצלחה במחקרים קודמים (ראה שורת הפניה). שים לב שרוב ה-LSFMs מבוססי התאים לדוגמה משתמשים בעדשות טבילה במים לגילוי, המיועדות בעיקר למאגרי דימות עם אינדקס שבירה של 1.33 (כגון מי ברז אוטומטיים או מדיה מימית אחרת). מאגרי דימות עם מדדי שבירה אחרים ניתן להשתמש40, אבל זה משנה מאפיינים מסוימים של המערכת האופטית, למשל מרחק העבודה.
| קו | גנוטיפ (גנוטיפ) | ביטוי פלואורופור |
| #01691 | y[1] w[67c23]; P{w[+mC]=Ubi-GFP.nls}מזהה-2; P{Ubi-GFP.nls}מזהה-3 | NLS-GFP תחת שליטה של מקדם פוליוביקוויטין |
| #29724 | w[*]; P{w[+mC]=Tub84B-EGFP.NLS}3 | NLS-GFP תחת שליטה של מקדם אלפא-טובולין 84B |
| #24163 | w[*]; P{w[+mC]=His2Av-EGFP.C}2/SM6a | משתנה histone 2A בעל תווית EGFP בכל התאים |
טבלה 2: שלושת הקווים הדרוסופיים המהונדסים המשמשים בדוגמת היישום הראשונה. העמודה "line" מתייחסת למספר המניה של מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה (bdsc.indiana.edu).
וידאו משלים 1: הדמיה חיה פלואורסצנטית השוואתית של עובר אחד כל אחד מקווי #01691, #29724 #24163 דרוזופילה מהונדסים. כל קו מהונדס מבטא EGFP/GFP שעבר לוקליזציה גרעינית תחת שליטה של מקדם פעיל ככל הנראה בכל מקום. ZA, הקרנה מרבית Z עם התאמת תמונה. לא בוצע תיקון אינטנסיביות דינמי לאורך זמן. ZA, הקרנה מרבית Z עם התאמת תמונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו משלים 2: הדמיה חיה פלואורסצנטית השוואתית של עובר אחד כל אחד #1 Zen1'LA-mE, #2 וקווי המשנה של טריבוליום מהונדסים #3. כל קו משנה מהונדס מבטא את Lifeact בעל התווית mEmerald תחת שליטה של מקדם zerknüllt 1, גורם שעתוק המעורב במפרט סרוסה. אנא שימו לב כי העובר #1 Zen1'LA-mE מסתובב כ-90° בתוך הסרוסה מיד לאחר סגירת חלון הסרוסה. ערכות נתונים סונכרנו לשלב המוצג באיור 4A. התאמת תמונה בוצעה עם ערכי מינימום ומקסימום זהים המוצגים, לא בוצע תיקון עוצמת דינמי לאורך זמן. העוברים מוצגים באופן ventrally ולרוחב על פני תקופה של 48:00 h. ZA, הקרנה מקסימלית Z עם התאמת תמונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
קובץ משלים 1: סקריפט עיבוד אצווה FIJI לחישוב אוטומטי של z הקרנות מרביות מכל ערימות z בתוך תיקיה אחת. ניתן לפתוח את קובץ ה- Script ב- FIJI באמצעות גרירה ושחרור. בהתחלה ("הפעל") יש לציין רק את תיקיית הקלט. תיקיית המשנה של הפלט ("Z הקרנות מרביות") נוצרת באופן אוטומטי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: מטה-נתונים ופרמטרים עבור ערכות נתוני ההדמיה החיה לטווח ארוך DS0001-6. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אחד מאזורי היישום הבלעדיים של LSFMs הוא ביולוגיה התפתחותית. במשמעת זו, יש חשיבות להסתכל על דגימות חיות, אחרת לא ניתן לתאר תהליכים מורפוגנטיים באופן דינמי. מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית ב- LSFMs מבוססי תא מדגם, כמתואר כאן, נוחה משתי סיבות עיקריות.
ניתן לטפל בשונות הסביבה, שהיא בלתי נמנעת בהדמיה חיה רציפה, באופן פרו-אקטיבי. בהדמיה חיה הקשורה לעובר חרקים, אנו רואים למשל את הרגישות הבאה. תרבויות איסוף הביצים עשויות להיות בגילאים שונים בזמן איסוף העוברים. ב Drosophila, הוכח כי זה משפיע על התכונות של הצאצאים45. למרות שעבודה עם תרבויות שעברו עריכה בסנכרון מתאים היא אופציה, הדמיה בו זמנית עם תרבויות מסונכרנות היא הרבה יותר נוחה. הן התוצאות הייצוגיות של דרוסופילהוהן התוצאות הייצוגיות המבוססות על טריבוליוםנובעות מתרבויות איסוף ביצים מסונכרנות, ואנו יכולים לשלול בביטחון שמאפייני הפלואורסצנטיות השונים הם השפעה לא מכוונת של רגישות הורית.
Dechorionation הוא צעד מכריע כמו חשיפה ממושכת hypochlorite נתרן מקטין את הכדאיות העובר. באופן לא נוח, הכוח היוני של hypochlorite נתרן פוחת עם הזמן. מדידות של הכוח היוני אפשריות46, אבל מייגע ומסורבל. בהדמיה חיה בו זמנית, ניתן להשתמש בתמהיל הורים עבור כל הקווים ו/או התנאים במהלך הכנת לוחות 6-well הקשורים לדקורציה.
אפילו במעבדות עם מזגן יעיל, תנודות טמפרטורה קטנות אך לא סדירות הן בלתי נמנעות ומשפיעות גם עלLSFMs מבוססי תא מדגם 9 מבוקרי טמפרטורה. בהדמיה חיה בו זמנית, תנודות אלה מתרחשות גם, אך הן משפיעות גם על כל העוברים.
מנקודת המבט המעשית, פרוטוקול להדמיה בו זמנית של עוברים מרובים מגביר את התפוקה. בהדמיה חיה, משך התהליך ההתפתחותי של עניין קובע כמה מבחנים ניתן לבצע בתוך תקופה נתונה, וזה שיקול חשוב כאשר הגישה LSFMs מוגבלת. דוגמאות עיקריות להקלטה ארוכת טווח הן מבחני הדמיה חיים שבהם מתבצע מעקב אחר תאים. ניסויים כאלה נעים בדרך כלל על פני תקופות פיתוח ארוכות. בעוד ההתפתחות העוברית של Drosophila לוקח רק על יום אחד בטמפרטורת החדר47, טריבוליום לוקח בערך שבעה ימים48. לפיכך, עבור מין זה, הקבלה חיונית כדי להישאר בתוך מסגרת זמן סבירה, במיוחד לגבי מבחנים שבהם תנאים רבים מושווים.
התפוקה, כלומר מספר העוברים הממוקמים בו זמנית, מוגבלת בעיקר על ידי שני גורמים: הראשון הוא השטח הזמין לאורך ציר y בתוך תא הדגימה. כאשר העובר התחתון עומד להיות בתמונה, העובר העליון לא היה צריך לעזוב את מאגר ההדמיה. יתר על כן, מחזיק קורי העכביש ומערכת התמיכה הקשורה לא צריך להיות כל כך ארוך כי זה מתנדנד ו / או עצבנות באופן ניכר במהלך תהליך הקלטת מחסנית z. השני הוא הרזולוציה הזמנית המיועדת. זמן ההקלטה לכל עובר יכול להיות משוער על ידי הכפלת זמן החשיפה לתמונה דו מימדית (בדרך כלל 10-200 אלפיות השנייה) עם מספר המישורים לכל מחסנית z (בדרך כלל כמה מאות), מספר הערוצים (רגיל בין אחד לשלוש), מספר הכיוונים (בדרך כלל בין אחד לשמונה) וגורם תלוי התקנה עבור תנועות התרגום והסבב (מוערך בין 1.2 ל -1.5). היחס בין הרזולוציה הזמנית המיועדת וזמן ההקלטה לעובר מציין את המספר המרבי של עוברים שניתן לדמיין בו זמנית. לסיכום, הפרוטוקול שלנו מתאים להתקדם מהדמיה חיה רציפה לתפוקה בינונית, אך אינו מתאים למה שנחשב בדרך כלל לתפוקה גבוהה. עבור האחרון, LSFMs מתאים שקופיות מיקרוסקופ49,50,51 או טובצלחות 52 ניתן לשקול, אבל יישומים אלה בדרך כלל יש מגבלות אחרות.
בהתאם לשאלה הניסיונית ומכאן עדשת התאורה / זיהוי עדשה / שילוב המצלמה בשילוב עם הפרמטרים הדמיה, בו זמנית תמונות LSFM datasets עשוי לדרוש שטח אחסון עצום במצב הגולמי שלהם. בעיה זו יכולה להיות מודגמת בצורה הטובה ביותר על ידי התחשבותערכות נתונים לדוגמה Drosophila שסופקו (טבלה משלימה 1), כלומר, DS0001-3. לכל תמונה גולמית דו מימדית היה נפח נתונים של כ-2.8 מגה-בתים, כל ערימת z גולמית כללה 120 מטוסים, וכל שלושת העוברים נרשמו בארבעה כיוונים בסך הכל 143 פעמים. כתוצאה מכך, ערכות הנתונים הגולמיות כבשו כחצי טרה-בייט. באמצעות עיבוד נתוני תמונה, כלומר חיתוך לאורך כל הממדים המרחביים (שלב 9) בשילוב עם דחיסה מבוססת ZIP, נפח הנתונים הופחת ל- 53.3 ג'יגה-בית, המהווה כ- 10% מהכמות הראשונית. כדי לעבד ערכות נתונים במשטר טרה בייט, תוסף BigDataViewer53, אשר מותקן מראש ב FIJI (תוספים | BigDataViewer), מומלץ.
בנוסף לחמשת התרחישים המתוארים בסעיף תוצאות מייצגות, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש גם כדי לאפיין את ההשפעה של אפקטים להפיל RNAi, שהיא גישה פופולרית טריבוליום54. עם זאת, זה רק שימוש מוגבל לניתוח של תרכובות (למשל, קוטלי חרקים או לחצים ביוכימיים אחרים) אם אלה צריכים להיות מיושמים באמצעות מאגר ההדמיה – שהיא הגישה הפשוטה ביותר – כמו הדמיה בו זמנית של עובר שליטה אינו אפשרי.
הדגמנו את הפרוטוקול שלנו באמצעות אחד המיקרוסקופים שנבנו בהתאמה אישית שלנו8,55, אבל זה ישים לכל התקנה מבוססת תא מדגם, למשל, OpenSPIM56 או רוב LSFMs מסחרי. פרוטוקול זה משלים את היוזמה להקמת משאבים הקשורים ל- LSFM שמטרתה לעודד טירונים לשלב באופן פעיל טכנולוגיה מבוססת גיליונות אור בתוכניות המחקר שלהם. ברוב האוניברסיטאות והמכונים פועלים כיום מתקני מיקרוסקופיה פלואורסצנטיים מאובזרים היטב57. אלה מספקים בדרך כלל גישה ל- LSFMs אחד או יותר המבוססים על תאים, אך לא ניתן לצפות מהצוות לקבל את הפתרונות הניסיוניים המתאימים לכל שאלה מדעית בהישג יד.
התוצאות שלנו מראות כי המסגרת הניסיונית שלנו מתאימה לדרוסופילה וטרבוליום. אנו בטוחים שניתן להשתמש בפרוטוקול ממוקד ההשוואה שלנו כדי לחקור את העוברים של מיני חרקים אחרים. לדוגמה, גישה מבוססת LSFM הוחלה כדי להשוות סוג פראי ופיתוח נוקאאוט בזבוב scuttle Megaselia abdita58, ומחקרי מעקב ייהנו גם משיטת ההרכבה שלנו. בנוסף, קווים מהונדסים של קריקט שני מנוקד Gryllus bimaculatus שתוכנן במיוחד עבור הדמיה חיה פלואורסצנטי59 זמינים, אבל רק כרגע זמין השוואה ממוקד פרוטוקול60 מיועד מיקרוסקופים הפוכים קונבנציונלי ולכן אינו מתייחס רכישת תמונה תלת מימדית או סיבוב מדגם. בנוסף, כבר הוכח כי מחזיק קורי העכביש הוא בחירה נוחה עבור זברה, אשר עוברים לשנות את צורתם במידה ניכרת במהלך עוברי61. התאמה של הפרוטוקול שלנו, אשר דורש בעצם שום מאמץ אופטימיזציה, יספק את היתרונות שתוארו לעיל גם עבור אורגניזם מודל זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לארנסט ה. ק. סטלייזר על ההזדמנות להשתמש במשאביו, כמו גם להערותיו החשובות בנוגע לכתב היד, אניטה אנדרול על תמיכתה בהדמיה החיה של טריבוליום, סוון פלאת' על התמיכה הטכנית, כמו גם לאילן דייוויס, ניקול גריידר וג'רולד שוביגר על שיתוף קווי הדרוסופלה המהונדסים שלהם דרך מרכז המניות בלומינגטון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100 µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
References
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
- Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
- Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
- Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
- El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
- Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
- Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
- Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
- Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
- Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
- Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
- Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
- Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
- Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
- Mcdonald, J. H. Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , Sparky House Publication. (2013).
- Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
- Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
- Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
- Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
- He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
- Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
- Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , Springer. (1997).
- Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
- McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
- Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
- Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
- Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
- Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).
