Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Samtidig levende bildebehandling av flere insektembryoer i prøvekammerbaserte lysarkfluorescensmikroskoper

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61713
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF - MC), Goethe-Universität
* These authors contributed equally

Summary

Lysarkbasert fluorescensmikroskopi er det mest verdifulle verktøyet i utviklingsbiologi. Et stort problem i komparative studier er omgivelsesvariasjon. Vår protokoll beskriver et eksperimentelt rammeverk for samtidig levende bildebehandling av flere prøver og tar derfor opp dette problemet proaktivt.

Abstract

Lysplatebasert fluorescensmikroskopi tilbyr effektive løsninger for å studere komplekse prosesser på flere biologisk relevante skalaer. Prøvekammerbaserte oppsett, som er spesielt designet for å bevare prøvens tredimensjonale integritet og vanligvis har prøverotasjon, er det beste valget i utviklingsbiologi. For eksempel har de blitt brukt til å dokumentere hele embryonal morfogenese av fruktfluen Drosophila melanogaster og den røde melbillen Tribolium castaneum. Imidlertid gir mange tilgjengelige live bildeprotokoller bare eksperimentelle rammer for enkle embryoer. Spesielt for komparative studier er slike tilnærminger upraktiske, siden sekvensielt avbildet prøver påvirkes av omgivelsesvariasjon. Videre begrenser dette antall prøver som kan analyses innen en gitt tid. Vi tilbyr et eksperimentelt rammeverk for samtidig levende bildebehandling som øker gjennomstrømningen i prøvekammerbaserte oppsett og dermed sikrer lignende omgivelsesforhold for alle prøver. For det første gir vi en kalibreringsretningslinje for lysarkfluorescensmikroskoper. For det andre foreslår vi en monteringsmetode for flere embryoer som er kompatible med prøverotasjon. For det tredje gir vi eksemplariske tredimensjonale live imaging datasett av Drosophila, som vi sammenstiller tre transgene linjer med fluorescerende merket nuklei, samt tribolium, som vi sammenligner ytelsen til tre transgene underlinjer som bærer samme transgene, men på forskjellige genomiske steder. Vår protokoll er spesielt designet for komparative studier da den proaktivt adresserer omgivelsesvarians, som alltid er til stede i sekvensiell levende avbildning. Dette er spesielt viktig for kvantitative analyser og karakterisering av aberrasjonelle fenotyper, som for eksempel skyldes knockout-eksperimenter. Videre øker det den generelle gjennomstrømningen, noe som er svært praktisk når tilgangen til lysarkfluorescensmikroskop er begrenset. Til slutt kan den foreslåtte monteringsmetoden tilpasses andre insektarter og ytterligere modellorganismer, for eksempel sebrafisk, uten optimaliseringsinnsats.

Introduction

Fluorescensmikroskopi er en av de mest essensielle avbildningsteknikkene i biovitenskapen, spesielt i celle- og utviklingsbiologi. I konfekt fluorescensmikroskop1, som er toppmoderne for tredimensjonal fluorescensavbildning siden midten av 1990-tallet, brukes den samme linsen til fluorofordrivelse og utslippslysdeteksjon. Belysningslaserstrålen begeistrer alle fluoroforer langs belysnings-/deteksjonsaksen, og det respektive signalet utenfor fokus diskrimineres før det oppdages av et hull. Derfor, for hvert todimensjonalt bilde, er hele prøven opplyst. Følgelig, for hvert tredimensjonalt bilde, det vil si en stabel med romlig påfølgende todimensjonale bilder, blir hele prøven opplyst flere dusin til noen hundre ganger2, noe som fremmer fotobleaching og fototoksisitet3.

For nesten tjue år siden dukket lysarkbasert teknologi4 opp som et lovende alternativ for tredimensjonal fluorescensavbildning og ble dermed et verdifullt verktøy i utviklingsbiologi5. I denne tilnærmingen blir belysning og deteksjon avkoplet. Belysningslinsen brukes til å generere et lysark med en dybde på bare noen få mikrometer i fokusplanet til det vinkelrett arrangerte deteksjonslinsen. Derfor, for hvert todimensjonale bilde, lyser bare et tynt planmålvolum rundt fokusplanet. Følgelig, for hvert tredimensjonalt bilde, lyser hele prøven bare en gang, noe som sterkt reduserer fotobleaching og fototoksisitet6. Av denne grunn tilbyr lysarkfluorescensmikroskop (LSFMer) effektive løsninger for å studere komplekse prosesser på flere biologisk relevante skalaer og er derfor av særlig verdi i utviklingsbiologi, hvor prøver så store som flere millimeter må analyseres på subcellulært nivå.

Historisk sett har LSFMer vært utvalgskammerbaserte7,8. I disse oppsettene arrangeres belysningsaksene (x) og deteksjonsaksene (z) vanligvis vinkelrett på gravitasjonsaksen (y). Prøvekamre gir rikelig eksperimentell frihet. For det første gir de stor bildebufferkapasitet, noe som igjen letter bruken av et perfusjonssystem for å kontrollere miljøet, for eksempel for å opprettholde en bestemt temperatur9 eller for å bruke biokjemiske stressfaktorer. Videre støtter de tilpassede monteringsmetoder10 som er skreddersydd til de respektive eksperimentelle behovene, samtidig som de bevarer de tredimensjonale, i noen tilfeller dynamisk11, integriteten til prøven. I tillegg er prøvekammerbaserte oppsett vanligvis utstyrt med en rotasjonsfunksjon som brukes til å dreie prøvene rundt y-aksen og dermed bilde dem langs to, fire eller enda flere retninger. Siden embryoer av ofte brukte modellorganismer er, i sammenheng med mikroskopi, gir relativt stor, påfølgende avbildning langs ventral-dorsal, lateral og / eller fremre bakre kroppsakser en mer omfattende representasjon. Dette gjør det for eksempel mulig å spore celler som beveger seg langs komplekse tredimensjonale overføringsbaner12,13.

Lysarkbasert fluorescensmikroskopi har blitt brukt mye for å studere den embryonale morfogenesen til Drosophila melanogaster, både systematisk14,15 samt med et spesifikt fokus på de biofysiske aspektene ved utvikling. For eksempel ble den brukt til å samle høyoppløselige morfogenetiske data for å oppdage en biomekanisk kobling mellom endoderm invaginasjon og akseforlengelse under bakteriebåndforlengelse16 og videre for å relatere den komplekse cellulære strømmen med kraftgenereringsmønstre under gastrulation17. Det har også blitt kombinert med andre toppmoderne teknikker, for eksempel optogenetikk for å undersøke reguleringen av Wnt-signalering under fremre-bakre mønster i epidermis18.

Å studere bare en art gir imidlertid ikke innsikt i utviklingens utvikling. For å forstå embryogenese innenfor den fylogenetiske konteksten er det utført intensiv forskning med alternative insektmodellorganismer. En av de mest omfattende undersøkte artene er den røde melbillen Tribolium castaneum, et økonomisk relevant lagret korn19, hvis embryonal morfogenese også allerede er systematisk avbildet med LSFM20. Den embryonale morfogenesen til disse to artene varierer bemerkelsesverdig i flere aspekter, for eksempel segmenteringsmodus21, samt dannelse og nedbrytning av ekstra-embryonale membraner22. Sistnevnte aspekt er allerede grundig analysert ved hjelp av LSFMer. For eksempel har det vist seg at serosa, et ekstra embryonalt vev som omslutter og beskytter Tribolium-embryoet mot ulike farer for den bedre delen av embryogenesen23,24, fungerer også som den morfogenetiske "driveren" for sin egen abstinensprosess under dorsal lukking25. Videre har det blitt demonstrert at under gastrulation forblir en bestemt region av blastodermen forankret til vitellinemembranen for å skape asymmetriske vevsbevegelser26, og etter denne observasjonen tillater regionalisert vevsfluidisering celler å sekvensielt forlate serosakanten under serosa vinduslukking27.

I alle Drosophila- og Tribolium-tilknyttede studier som er nevnt ovenfor, har utvalgskammerbaserte LSFMer blitt brukt. I de fleste ble embryoene registrert langs flere retninger ved hjelp av prøverotasjonsfunksjonen. Selv om det ikke er uttrykkelig angitt, kan det antas at de har blitt registrert individuelt og dermed uavhengig av hverandre i sekvensielle levende bildeanalyser, som ligner vårt tidligere arbeid på Tribolium20,28. I visse scenarier er en slik tilnærming akseptabel, men spesielt i kvantitative komparative tilnærminger kan omgivelsesvariasjon forvrenge resultatene. For eksempel har det lenge vært kjent at insektens utviklingshastighet er temperaturavhengig29, men en nyere studie antyder videre at i Drosophilakan temperaturen også påvirke konsentrasjonen av morfogener30. Følgelig, hvis visse egenskaper ved embryogenese, for eksempel de dynamiske proporsjonene, divisjonsratene og migrasjonshastighetene til celler, bør kvantifiseres nøyaktig, er det nødvendig med tilstrekkelige repetisjoner uten omgivelsesvarians. Dette minimerer standardavvik og standardfeil, noe som igjen letter sammenstilling med andre, selv bare marginalt avvikende eksperimentelle forhold.

Eksempelkammerbaserte LSFMer er imidlertid primært utformet for høyt innhold i stedet for analyser med høy gjennomstrømning. I motsetning til konfektmikroskoper, som vanligvis er utstyrt med standardiserte klemmemekanismer for mikroskopiskred, Petri-retter og brønnplater, bruker nesten alle prøvekammerbaserte LSFMer sylinderbaserte klemmemekanismer. Disse mekanismene er beregnet på skreddersydde prøveholdere som er rotasjonskompatible så vel som ikke-invasive10, men vanligvis ikke designet for mer enn ett eksemplar20,31,32. Et rammeverk for samtidig levende avbildning av to eller flere embryoer, der fordelene ved prøvekammerbaserte oppsett ikke er kompromittert, løser problemet med omgivelsesvariasjon og øker dermed verdien av LSFMer for komparative studier.

I vår protokoll presenterer vi et eksperimentelt rammeverk for komparativ levende avbildning i prøvekammerbaserte LSFMer (figur 1A) der y-aksen brukes som et alternativ for å "stable" embryoer. For det første tilbyr vi en fluorescerende mikrosfærebasert kalibreringsretningslinje for prøvekammerbaserte LSFMer, noe som er spesielt viktig for instrumenter som mangler kalibreringsassistent. For det andre beskriver vi en monteringsmetode for flere embryoer basert på spindelvevholderen28 (figur 1B) som er kompatibel med prøverotasjon og dermed tillater samtidig avbildning av flere prøver langs flere retninger (Figur 1C). Flere embryoer er justert på toppen av en tynn agarosefilm, og etter innsetting i prøvekammeret beveget seg suksessivt gjennom lysarket for å skaffe tredimensjonale bilder. For det tredje tilbyr vi tre eksemplariske live bildedatasett for Drosophila så vel som for Tribolium. For førstnevnte sammenstiller vi transgene linjer med fluorescerende merket kjerner. For sistnevnte sammenligner vi ytelsen til transgene underlinjer som bærer samme transgene, men på forskjellige genomiske steder. Til slutt diskuterer vi viktigheten av parallellisering med hensyn til komparativ levende avbildning og omgivelsesvarians33, debattere gjennomstrømningsgrensen for vårt eksperimentelle rammeverk og evaluere tilpasning av vår tilnærming til andre modellorganismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedende arbeid

  1. Velg en belysningslinse/deteksjonslinse/kamerakombinasjon for LSFM som passer til det vitenskapelige spørsmålet og setter opp mikroskopet. Størrelsen på synsfeltet er kvotienten til kamerabrikkestørrelsen og forstørrelsen av deteksjonslinsen. Belysningslinsen bør velges slik at hele synsfeltet er dekket av et omtrentlig planarisk lysark34. Tre anbefalte kombinasjoner er oppført i tabell 1.
  2. For å tilberede agarose aliquots og gjenvinningsretter, tilsett 2 g lavsmelting agarose til 200 ml autoklavert vann fra springen og varm blandingen i en mikrobølgeovn ved 600-800 W til alle agarose partikler er oppløst. Forbered flere 1 ml agarose aliquots i 1,5 ml eller 2 ml reaksjonsrør, og fyll deretter flere 90 mm Ø Petri-retter 3-5 mm høye med agarose. Oppbevar størknet aliquots og retter ved 4 °C.
  3. For Drosophila: For å tilberede ferske oppdrettshylser, kok en tilstrekkelig mengde skreddersydd eller kommersielt tilgjengelig Drosophila medium, overfør 5-15 ml til brede hetteglass og oppbevar dem ved 4 °C. For å tilberede eggleggingsretter, tilsett 1 g lavsmelting agarose til 50 ml autoklavert vann fra springen og varm blandingen i en mikrobølgeovn ved 600-800 W til alle agarose partikler er oppløst. La blandingen avkjøles ned til 45 °C, tilsett deretter 50 ml fruktjuice (helst eple eller rød drue) og bland grundig. Hell blandingen i 35 mm Ø Petri-retter og oppbevar størknet eggleggingsretter ved 4 °C.
  4. For Tribolium: For å forberede vekstmediet, send hele hvetemel samt inaktiv tørr gjær gjennom en 710 μm maskestørrelse sikt, og suppler deretter det siktede melet med 5% (m / w) siktet gjær. For å forberede eggleggingsmedium, send fint hvetemel samt inaktiv tørr gjær gjennom en 250 μm maskestørrelsessikte, og suppler deretter det siktede melet med 5% (w / w) siktet gjær.

2. Kalibrering av prøvekammerbaserte LSFMer ved hjelp av fluorescerende mikrosfærer

MERK: Formålet med kalibrering er å justere fokuspunktene til belysnings- og deteksjonslinsene (figur 2A), da dette er premisset for klare bilder. LSFMer bør kalibreres regelmessig, minst en gang hver 3-4 uke.

  1. Liquefy en agarose aliquot i en tørr blokk varmeapparat / mikser ved 80 °C, og la deretter agarose aliquot avkjøles ned til 35 °C.
  2. Overfør 50 μL agarose til et 1,5 ml reaksjonsrør og tilsett 0,5 μL fluorescerende mikrosfæreoppløsning. Bland ved 1400 o/min i 1 min.
  3. Fyll det slissede hullet på spindelvevholderen med 10 μL agarose / fluorescerende mikrosfæreoppløsningsblanding, og aspirer deretter så mye agarose som mulig til bare en tynn agarosefilm gjenstår. Vent 30-60 s for størkning.
  4. Fyll prøvekammeret med autoklavert vann fra springen. Sett spindelvevholderen langsomt inn i prøvekammeret og flytt hullet med sporene med mikrotranslasjonsstadiene foran deteksjonslinsen.
  5. Roter spindelvevholderen med rotasjonstrinnet til en 45° posisjon i forhold til belysningsaksene (x) og deteksjonsaksene (z). Spindelvevholderen skal ikke være synlig i transmisjonslyskanalen.
  6. Bytt til den respektive fluorescenskanalen og juster lasereffekten samt eksponeringstiden slik at de fluorescerende mikrosfærene gir riktig signal.
  7. Angi et visningsvolum som dekker den nå tverrorienterte agarosefilmen fullstendig. Definer z-avstanden ved å beregne maksimal mulig aksialoppløsning for det respektive belysningslinsen/deteksjonslinsekombinasjonen34. Alternativt kan 4 ganger sideoppløsningen brukes som en grov tilnærming.
  8. Registrer en tredimensjonal test z-stabel med fluorescerende mikrosfærer og sammenlign x-, y- og z-maksimumsprojeksjonene med kalibreringsdiagrammet (figur 2). Hvis mikrosfærene ser uskarpe, uklare og/eller forvrengte ut (Figur 2B,C), justerer du posisjonene til belysnings- og/eller deteksjonslinsen.

3. Innsamling av Drosophila embryoer

  1. Overfør 100-200 voksne av Drosophila-linjen du velger til et friskt oppdretts hetteglass 2-3 dager før bildeanalysen for å etablere en eggsamlingskultur. Hvis det ennå ikke eksisterer, bør du vurdere å bruke det gamle oppdrettshettegenet for å starte en avkomkultur. For å sikre at voksne ikke er mer enn to uker gamle, erstatt embryosamlingskulturen i tide med avkomkulturen.
  2. Varm en eggleggende tallerken til romtemperatur og legg til en dråpe gjærpasta på toppen av agaren.
  3. Overfør de voksne fra eggsamlingskulturen til et tomt smalt hetteglass og legg det på toppen av eggleggingsfatet. Inkuber eggsamlingsoppsettet ved romtemperatur i 15 min. Unngå anestesi (kald, CO2) i dette trinnet hvis mulig.
  4. Returner de voksne til hetteglasset som oppdretter. Inkuber eggleggingsfatet ved en praktisk temperatur / tidskombinasjon, og overfør deretter 10-20 embryoer med en liten pensel fra eggleggingsfatet til en 100 μm nettingstørrelse cellesil. Kast eggleggingsfatet.
  5. Gjenta trinn 3.1 til 3.4 for hver Drosophila-linje.

4. Innsamling av Tribolium embryoer

MERK: For enkelhets skyld er det gitt en ordning for Tribolium eggoppsamlingsprosedyren (Figur 3A) som også tallene i brakettene i dette trinnet refererer til.

  1. Overfør 200-300 voksne (ca. 400-700 mg) av Tribolium-serien til en tom 1 L glassflaske 2-10 dager før bildebehandlingsanalysen for å etablere en eggsamlingskultur (Figur 3A_01). Fyll flasken med 50-100 g frisk vekstmedium. Hvis det ennå ikke eksisterer, kan du vurdere å starte en avkomkultur ved hjelp av tilgjengelige larver og pupper. For å sikre at voksne ikke er mer enn 3 måneder gamle, erstatt eggsamlingskulturen i tide med avkomkulturen.
  2. Før eggsamlingskulturen gjennom en 800 μm maskestørrelsessikt (Figur 3A_02). Returner vekstmediet, som inneholder ikke-iscenesatte embryoer, til den første flasken (Figur 3A_03) og overfør voksne til en tom 1 L glassflaske (Figur 3A_04). Tilsett 10 g eggleggingsmedium (Figur 3A_05) og inkuber eggsamlingsoppsettet ved romtemperatur i 1 t (Figur 3A_06,07).
  3. Før eggsamlingsoppsettet gjennom den 800 μm maskestørrelsessikten (Figur 3A_08). Returner voksne til den første flasken (Figur 3A_09). Avhengig av utviklingsprosessen som skal avbildes, inkuberer du eggleggingsmediet, som nå inneholder ca. 30-100 embryoer, ved en praktisk temperatur/ tidskombinasjon (Figur 3A_10).
  4. Før eggleggingsmediet gjennom den 300 μm maskestørrelsessikten (figur 3A_11) og overfør embryoene (figur 3A_12) til en cellesil på 100 μm maskestørrelse. Kast de siktede eggleggingsmediene (Figur 3A_13).
  5. Gjenta trinn 4.1 til 4.4 for hver Tribolium-linje.

5. Natriumhypoklorittbasert dechorionation

MERK: Både Drosophila og Tribolium embryoer er dekket av en korion, et beskyttende og tungt lysspredningsproteinlag som ikke er avgjørende for riktig utvikling så lenge embryoene holdes fuktige etter fjerning. Dechorionation protokollen for embryoer av begge arter er identisk.

  1. Forbered en 6-brønnsplate ved å fylle brønnene A1, A2, A3 og B3 med 8 ml autoklavert vann fra springen og B1- og B2-brønnene med 7 ml autoklavert vann fra springen og 1 ml natriumhypokloritt (NaOCl)-løsning (figur 3B). Vær oppmerksom på dechorionation prosessen under et stereomikroskop, ideelt i transmisjonslys.
    FORSIKTIG: Natriumhypokloritt er etsende.
  2. Sett den embryoholdige cellesilen (trinn 3,4 og/eller 4,4) inn i A1-brønnen og vask embryoene ca. 30-60 s under skånsom agitasjon.
  3. Flytt cellesilen til B1-brønnen og rist platene kraftig i 30 s, overfør den deretter til A2-brønnen og vask embryoene i 1 min under mild agitasjon.
  4. Flytt cellesilen til B2-brønnen og rist platen kraftig til de fleste embryoer er helt dechorionated (Figur 3C), overfør den deretter til A3-brønnen og vask embryoene i 1 min under mild agitasjon.
  5. Oppbevar cellesilen i B3-brønnen før du fortsetter med monteringsprosedyren.
  6. Gjenta trinn 5.1 til 5.5 for hver linje.

6. Montering av flere embryoer ved hjelp av spindelvevholderen

  1. Liquefy en agarose aliquot i en tørr blokk varmeapparat / mikser ved 80 °C, og la deretter agarose aliquot avkjøles ned til 35 °C.
  2. Pipet 10 μL agarose på toppen av det slissede hullet på spindelvevholderen. Med pipettespissen sprer du agarose over det slissede hullet, og aspirerer deretter så mye agarose som mulig til bare en tynn agarosefilm gjenstår. Vent 30-60 s for størkning.
  3. For hver linje, velg forsiktig ett eller flere embryoer med en liten pensel og legg dem på agarosefilmen.
  4. Ordne embryoene langs den lange aksen til det slissede hullet, og juster deretter også deres fremre bakre akse med den lange aksen til det slissede hullet (Figur 3D).
  5. Stabiliser embryoene forsiktig ved å pipettere 1-2 μL agarose inn i gapet mellom embryoene og agarosefilmen. Vent 30-60 s for størkning.
  6. Sett spindelvevholderen langsomt inn i det bildebufferfylte prøvekammeret.

7. Komparativ levende bildebehandling i prøvekammerbaserte LSFMer

  1. Flytt et av embryoene med mikrotranslasjonsstadiene foran deteksjonslinsen. Påse at spindelvevholderen står i 45° stilling i forhold til belysningsaksene (x) og deteksjonsaksene (jf. figur 1C).
  2. I overføringslyskanalen flytter du embryoet inn i midten av synsfeltet. Spindelvevholderen skal ikke være synlig.
  3. Flytt embryoet med mikrotranslasjonsstadiene i z til embryoets midtplan overlapper med brennplanet, det vil si til omrisset ser skarpt ut. Uten å bytte til fluorescenskanalen, spesifiser visningsvolumet ved å flytte 250 μm bort fra midtplanet i begge retninger.
  4. Hvis det kreves avbildning langs flere retninger, roterer du embryoet på riktig måte og gjentar trinn 7.2 og 7.3. Spindelvevholderen støtter opptil fire retninger i trinn på 90°.
  5. Gjenta trinn 7.1 til 7.3 (eller 7.4) for alle andre embryoer montert på spindelvevholderen (Figur 3E). Pass på at det øverste embryoet ikke forlater bildebufferen når det nederste embryoet er foran deteksjonslinsen.
  6. Definer fluorescenskanalen (lasereffekt, eksponeringstid, deteksjonsfilter) og parametere for tidsforløp (intervall, total varighet) og start bildebehandlingsprosessen. For veiledende verdier, se metadatatabellen for eksempeldatasettene (Supplerende tabell 1). For analyser som varer i flere dager, bør du vurdere å dekke prøvekammeråpningen i det minste delvis for å redusere fordampning.

8. Gjenfinning og videre dyrking av avbildet embryoer

  1. Når bildeanalysen er avsluttet, fjerner du spindelvevholderen forsiktig fra prøvekammeret.
  2. Løsne embryoene fra agarosefilmen med en liten pensel og overfør dem til et passende merket mikroskopsklie. Plasser gliden i en oppfinningsfat og inkuber under de respektive standard oppdrettsforholdene.
  3. Når det gjelder eksperimentelle modaliteter, estimer når embryogenesen er fullført. Når klekketidspunktet nærmer seg, sjekk gjenfinningsrettene ofte og overfør klekkede Drosophila larver til individuelle oppdretts hetteglass og Tribolium larver til individuelle brønner av en 24-brønns tallerken. Fyll brønnene opp til halvparten med vekstmedium. Inkuber under de respektive standard oppdrettsforholdene.
  4. Når de observerte personene er voksne, gi dem en passende parringspartner og se etter avkom etter flere dager.

9. Dokumentasjon for behandling av bildedata og metadata

MERK: For behandling av bildedata anbefales ImageJ derivate FIJI35 (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI krever ikke installasjon, og 32- og 64-biters versjoner er tilgjengelige. Et av de mest brukte formatene for LSFM-data er tiff-formatet (Tagged Image File Format), som gjør det mulig å lagre bildestakker i form av en TIFF-beholder.

  1. Beregne z maksimale projeksjoner for alle z-stakker (Bilde | Stabler | Z-prosjekt, velger du Maksimal intensitet). Maksimumsprojeksjoner er dataforenklingsmetoder som reduserer antall romlige dimensjoner fra tre til to. Det finnes et FIJI-skript for satsvis behandling (Tilleggsfil 1).
  2. Sett sammen de respektive z maksimale projeksjonene for å opprette tidsstakker (t stabler). Lagre disse i én TIFF-beholder. Gjør dette for alle registrerte embryoer så vel som de respektive retningene og fluorescenskanalene hvis det er aktuelt.
  3. Roter z- og t-stabelen rundt z-aksen for å justere den fremre posterioraksen for embryoene etter x- eller y-bildeaksen (Bilde | Transformere | Roter). Beskjær z-stakkene langs alle tre bildeaksene og t-stakken i x- og y-bildeaksene, slik at bare minimal bufferplass (20-40 piksler langs x- og y-aksene, 5-10 bilder langs z-aksen) rundt embryoet forblir (Bilde | Juster | Lerretsstørrelse for x- og y-aksene, bilde | Stabler | Verktøy | Skiveholder for z-aksen).
    1. Gjør dette individuelt for alle registrerte embryoer så vel som de respektive retningene, hvis aktuelt. Fluorescenskanaler, hvis aktuelt, bør behandles med identiske rotasjons- og beskjæringsparametere.
  4. Dokumenter metadataene så detaljerte som mulig. Som en retningslinje kan metadatatabellen for eksempeldatasettene, som er omtalt i delen Representative resultater , brukes (Supplerende tabell 1).

10. Datavisualisering

MERK: Denne retningslinjen for datavisualisering fokuserer hovedsakelig på opprettelsen av z maksimale projeksjonsbildematriser som viser flere registrerte embryoer langs flere retninger og / eller over tid. Trinnene nedenfor beskriver datavisualiseringsprosedyren som ble brukt på eksempeldatasettene for oppretting av tallene som vises, og videoer som er koblet i delen Representative resultater.

  1. Kombinere t stabler med flere retninger (Bilde | Stabler | Verktøy | Kombiner)og/eller slå sammen flere fluorescenskanaler (Bilde | Farge | Slå sammen kanaler) for å visualisere den biologiske strukturen og/eller interesseprosessen.
  2. Justere intensitetene for t-stakkene (Bilde | Juster | Lysstyrke/kontrast) etter behov ved hjelp av "Set" -funksjonen. Minimumsverdien som vises, bør stilles litt over bakgrunnssignalet, den maksimale visningsverdien bør resultere i en praktisk kontrast. Dokumenter begge verdiene, da de kan brukes til en konsekvent justering av de respektive z-stakkene. Avtrykksjusteringer ved hjelp av bruk-funksjonen. Avhengig av eksperimentelle modaliteter, bør du vurdere å behandle alle registrerte embryoer med identiske verdier.
  3. Lagre intensitetsjusterte t-stakker som separate filer, ikke overstyr de ikke-justerte t-stakkene. Kompiler egnede understakker fra de justerte t-bunkene med dedikerte bildevalgfunksjoner (f.eks |. Stabler | Verktøy | Slice Keeper) og bruk montasjeverktøyet (Bilde | Stabler | Lag Montasje) for å opprette bilderutenett som kan brukes til figurutforming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vår protokoll beskriver et eksperimentelt rammeverk for komparativ fluorescens levende bildebehandling i prøvekammerbaserte LSFMer. For eksempel kan rammeverket brukes til å sammenstille (i) embryoer av to eller flere arter, (ii) embryoer av linjer der ett eller flere gener blir slått ut pluss ville kontroller, (iii) flere embryoer av samme transgene linje, (iv) embryoer fra forskjellige transgene linjer, eller (v) embryoer fra underlinjer som bærer samme transgene , men på forskjellige genomiske steder. I denne delen gir vi eksempler på de to siste scenariene.

I vår første eksemplariske anvendelse viser vi fluorescenssignaldynamikken til tre embryoer som kommer fra forskjellige transgene Drosophila-linjer (tabell 2) over en periode på ca. 1 dag (Figur 4, Tilleggsfilm 1). For disse linjene forventet vi ganske like fluorescensmønstre siden alle uttrykker kjernefysisk lokalisert EGFP / GFP under kontroll av forskjellige antagelig allestedsnærværende og konstituerende aktive promotører. Våre komparative live bilderesultater viser imidlertid at det er sterke romlige forskjeller i uttrykksmønstrene som absolutt ikke er sekundære effekter på grunn av omgivelsesvariasjon.

I vårt andre programeksempel sammenligner vi ytelsen til tre embryoer som kommer fra AGOC{Zen1'#O(LA)-mEmerald} #1, #2 og #3 (Henholdsvis Zen1'LA-mE #1, #2 og #3) transgene Tribolium-underlinjer 36. Alle disse har samme piggyBac-baserte transgene som fører til uttrykk for mEmerald-koblet37 Lifeact38 under kontroll av zerknüllt 139 promotør, en transkripsjonsfaktor involvert i serosa spesifikasjon. Våre komparative live bilderesultater, som illustrerer serosa-vinduets lukkingsprosess under gastrulation, antyder at underlinje #2 gir et bemerkelsesverdig sterkere samlet signal enn de to andre underlinjene (Figur 5, Tilleggsfilm 2). Dette indikerer at også i Triboliumkan den genomiske konteksten ha en sterk innflytelse på uttrykksnivået til transgenes som bærer en uttrykkskassett.

Vellykket gjenfinning av alle de seks embryoene som er vist i denne delen var mulig som beskrevet i trinn 8 i vår protokoll. Alle utviklet seg til fullt funksjonelle og fruktbare voksne (Supplementary Table 1, "Retrieval" -raden), noe som indikerer at den generelle prosedyren, fra dechorionation over montering til opptak, ikke var invasiv. Dette nivået av kvalitetskontroll er avgjørende når villtypeutvikling forventes, for eksempel når det gjelder kontrollembryoer som er avbildet samtidig med embryoer der ett eller flere gener blir slått ned eller slått ut.

Alle datasett som ble brukt til å skape de representative resultatene, leveres som ressurser som vil hjelpe spesielt LSFM-nybegynnere til å evaluere kvaliteten på sitt eget arbeid. Du finner de identifikatorbaserte nedlastingskoblingene for digitale objekter i metadatatabellen (Tilleggstabell 1, "Datatilgang" -raden).

Figure 1
Figur 1: Oversikt over eksperimentell rammeverk og monteringsmetode. (A) Flytskjema for de ti protokolltrinnene med korte påminnelser og en estimering av den nødvendige tiden. Oppgaver som er merket med stjerner, trenger ikke utføres under hver analyse, men avhengig av omstendighetene. Grønne bokser angir trinn knyttet til Drosophila og/eller Tribolium, blå bokser angir trinn knyttet til mikroskopi. (B) Detaljtegning av spindelvevholderen. Den presenterte designen er egnet for sylinderbaserte klemmemekanismer, som ofte brukes i prøvekammerbaserte LSFMer. Spesifikasjoner er i millimeter. Holderen kan skaleres så lenge arbeidsavstanden til registreringslinsen respekteres. (C) Opptakssekvens for levende avbildning av flere embryoer langs flere retninger. I begynnelsen registreres z-stabler av det øverste embryoet langs opptil fire retninger, det vil si 0°, 90°, 180° og 270°. Deretter flyttes embryoet nedenfor foran deteksjonslinsen, og opptaks-/rotasjonssekvensen begynner på nytt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fluorescerende mikrosfærebasert kalibreringsdiagram for LSFMer. Diagrammet illustrerer hvordan fluorescerende mikrosfærer vises i x-, y- og z-maksimumsprojeksjonene hvis LSFM er riktig kalibrert (A), eller hvis det er en belysning (B) eller deteksjonsforskyvning (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Innsamling, dechorionation, montering og avbildning av flere embryoer. (A) Oversikt over tribolium embryosamling. Illustrasjonene er sitert i trinn 4 i henhold til tallene øverst til venstre. (B) Klargjørings- og overføringsordning for 6-brønnsplaten som brukes i trinn 5. B1- og B2-brønnene inneholdt fortynnet natriumhypokloritt (NaOCl), som induserer dechorionation. (C) 100 μm cellesil, som ble brukt til å overføre embryoene fra en brønn til en annen, innenfor B2-brønnen. Bildet med øvre detalj viser et nærbilde av flere Tribolium-embryoer på toppen av cellesilnettet, det nedre detaljbildet viser et transmisjonslys stereomikroskopbilde av flere Tribolium-embryoer med delvis løsrevet korion. (D) Spindelvevholder med tre monterte Tribolium embryoer. Embryoene, så vel som deres fremre bakre akser, ble justert langs den lange aksen til det slottede hullet. (E) Bevegelse av spindelvevholderen i prøvekammeret til LSFM under registrering av tre embryoer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Komparativ fluorescens levende avbildning av ett embryo hver fra #01691, #29724 og #24163 transgene Drosophila-linjer.  Embryoer vises langs to (av fire registrerte) retninger over en periode på 20:00 h (fra en total bildeperiode på 23:40 h). Ingen dynamisk intensitetskorrigering over tid ble utført. Metadata for Drosophila-datasettene finnes i Supplerende tabell 1. ZA, Z maksimal projeksjon med bildejustering. Skalalinje, 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Komparativ fluorescens levende avbildning av ett embryo hver fra Zen1'LA-mE-#1, #2 og #3 transgene Tribolium-underlinjer.  (A) Embryoer vises langs fire retninger under gastrulation, like før serosa vindu lukking. (B) Embryoer vises ventralt over en periode på 01:30 h (fra en total bildeperiode på 118:00 h). Bildejustering ble utført med identiske minimums- og maksimumsverdier, ingen dynamisk intensitetskorrigering over tid ble utført. Metadata for Tribolium-datasettene finnes i Supplerende tabell 1. Datasett ble synkronisert med stadiet som vises i (A). ZA, Z maksimal projeksjon med bildejustering. Skalalinje, 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

kombinasjon Begrunnelsen Belysning linse Deteksjonslinse kamera referanse
#1 hele embryoet på cellenivå, stor pikselavstand (lite datavolum) 2,5× forstørrelse numerisk blenderåpning 0,06 (luft) 10× forstørrelse numerisk blenderåpning 0,3 (vanndipping) CCD med 1,4 megapiksler (1392×1040, 6,45 μm dybde) denne studien, Drosophila41, Tribolium20,41
#2 hele embryoet på celle-/subcellulært nivå, liten pikselavstand (stort datavolum) 2,5× forstørrelse numerisk blenderåpning 0,06 (luft) 20× forstørrelse numerisk blenderåpning 0,5 (vanndipping) sCMOS med 5,5 megapiksler (2560×2160, 6,5 μm dybde) Tribolium9
#3 spesifikke områder av embryoet på subcellulært nivå eller spesialiserte applikasjoner, for eksempel levende avbildning av dissekerte bakteriebånd42,43 5,0× forstørrelse numerisk blenderåpning 0,16 (luft) 40× forstørrelse numerisk blenderåpning 0,75 (vanndipping) CCD med 1,4 megapiksler (1392×1040, 6,45 μm dybde) Tribolium44

Tabell 1: Anbefalt belysningslinse/deteksjonslinse/kamerakombinasjoner for levende bildebehandling av Drosophila- og Tribolium-embryoer ved hjelp av LSFM. Alle kombinasjoner har vært vellykket brukt i tidligere studier (se Referanserad). Vær oppmerksom på at de fleste prøvekammerbaserte LSFMer bruker vanndippende linser for deteksjon, som hovedsakelig er designet for bildebuffere med en brytningsindeks på 1,33 (for eksempel autoklavert vann fra springen eller andre vandige medier). Bildebuffere med andre brytningsindekser kan brukes40, men dette endrer visse egenskaper til det optiske systemet, for eksempel arbeidsavstanden.

linje Genotype Fluorofor uttrykk
#01691 y[1] w[67c23]; P{w[+mC]=Ubi-GFP.nls}ID-2; P{Ubi-GFP.nls}ID-3 NLS-GFP under kontroll av polyubiquitinpromotoren
#29724 w[*]; P{w[+mC]=Badekar84B-EGFP.NLS}3 NLS-GFP under kontroll av alfa-tubulin 84B-promotoren
#24163 w[*]; P{w[+mC]=His2Av-EGFP.C}2/SM6a EGFP-merket histone 2A-variant i alle celler

Tabell 2: De tre transgene Drosophila-linjene som ble brukt i det første applikasjonseksemplet. "Linje"-kolonnen refererer til Bloomington Drosophila Stock Center (bdsc.indiana.edu) aksjenummer.

Supplerende video 1: Komparativ fluorescens levende avbildning av ett embryo hver fra #01691, #29724 og #24163 transgene Drosophila linjer. Hver transgen linje uttrykker kjernefysisk lokalisert EGFP/GFP under kontroll av en antagelig allestedsnærværende og konstituerende aktiv promotor. ZA, Z maksimal projeksjon med bildejustering. Ingen dynamisk intensitetskorrigering over tid ble utført. ZA, Z maksimal projeksjon med bildejustering. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Ekstra video 2: Komparativ fluorescens levende avbildning av ett embryo hver fra Zen1'LA-mE #1, #2 og #3 transgene Tribolium-underlinjer. Hver transgene underlinje uttrykker mEmerald-merket Lifeact under kontroll av zerknüllt 1-promotoren, en transkripsjonsfaktor involvert i serosa-spesifikasjonen. Vær oppmerksom på at Zen1'LA-mE #1 embryoet blir ca. 90° inne i serosaen rett etter at serosavinduet er stengt. Datasett ble synkronisert til stadiet som vises i Figur 4A. Bildejustering ble utført med identiske minimums- og maksimumsverdier, ingen dynamisk intensitetskorrigering over tid ble utført. Embryoer vises ventralt og lateralt over en periode på 48:00 h. ZA, Z maksimal projeksjon med bildejustering. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsfil 1: FIJI batchbehandlingsskript for automatisk beregning av z maksimale projeksjoner fra alle z-stabler i en mappe. Skriptet kan åpnes i FIJI via dra-og-slipp. Ved starten ("Kjør") må bare inndatamappen angis. Utdataundermappen ("Z Maximum Projections") opprettes automatisk. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 1: Metadata og parameter for de langsiktige live bildedatasettene DS0001-6. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et av de eksklusive bruksområdene til LSFMer er utviklingsbiologi. I denne disiplinen er det viktig å se på levende prøver, ellers kan morfogenetiske prosesser ikke beskrives på en dynamisk måte. Et eksperimentelt rammeverk for samtidig levende bildebehandling i prøvekammerbaserte LSFMer, som beskrevet her, er praktisk av to hovedårsaker.

Omgivelsesvariasjon, som er uunngåelig ved sekvensiell levende avbildning, kan håndteres proaktivt. I insekt embryo-assosiert levende avbildning ser vi for eksempel følgende følsomheter. Eggsamlingskulturene kan ha forskjellige aldre på tidspunktet for embryosamling. I Drosophilahar det vist seg at dette påvirker egenskapene tilavkommet 45. Selv om det er et alternativ å arbeide med riktig desynkroniserte kulturer, er samtidig avbildning med synkroniserte kulturer betydelig mer praktisk. Både Drosophila- og Tribolium-baserte representative resultater kommer fra synkroniserte eggsamlingskulturer, og vi kan trygt utelukke at de forskjellige fluorescensegenskapene er en utilsiktet effekt av foreldres senescence.

Dechorionation er et avgjørende skritt da langvarig eksponering for natriumhypokloritt reduserer embryoets levedyktighet. Ubeleilig reduseres ionstyrken til natriumhypokloritt over tid. Målinger av ionstyrken er mulig46, men arbeidskrevende og tungvint. Ved samtidig levende avbildning kan en masterblanding brukes til alle linjer og/eller forhold under utarbeidelsen av dechorionation-tilknyttede 6-brønnsplater.

Selv i laboratorier med effektiv klimaanlegg er små, men uregelmessige temperatursvingninger uunngåelige og påvirker også temperaturkontrollerte9 prøvekammerbaserte LSFMer. Teoretisk sett kan temperaturen i prøvekammeret logges, men en nøyaktig repetisjon er ikke mulig. Ved samtidig levende avbildning forekommer disse svingningene også, men de påvirker alle embryoer på samme måte.

Fra det praktiske synspunktet øker en protokoll for samtidig avbildning av flere embryoer gjennomstrømningen. I levende bildebehandling bestemmer varigheten av utviklingsprosessen av interesse hvor mange analyser som kan gjennomføres innen en gitt periode, noe som er et viktig hensyn når tilgangen til LSFMer er begrenset. Hovedeksempler for langsiktig opptak er live bildeanalyser der celler spores. Slike eksperimenter varierer vanligvis over lange utviklingsperioder. Mens den embryonale utviklingen av Drosophila tar bare omtrent en dag ved romtemperatur47, tar Tribolium omtrent syv dager48. Derfor, for denne arten, er parallellisering viktig å forbli innenfor en rimelig tidsramme, spesielt når det gjelder analyser der mange forhold sammenlignes.

Gjennomstrømningen, det vil si antall embryoer som er avbildet samtidig, er først og fremst begrenset av to faktorer: Først er plassen som er tilgjengelig langs y-aksen i prøvekammeret. Når det nederste embryoet er i ferd med å bli avbildet, bør det øverste embryoet ikke ha forlatt bildebufferen. Videre bør spindelvevholderen og det tilknyttede støttesystemet ikke være så lange at det slingrer og / eller jitters merkbart under z-stakkopptaksprosessen. For det andre er den tiltenkte temporale oppløsningen. Opptakstiden per embryo kan tilnærmes ved å multiplisere eksponeringstiden per todimensjonalt bilde (vanligvis 10-200 ms) med antall plan per z-stabel (vanligvis flere hundre), antall kanaler (vanlig mellom en og tre), antall retninger (vanligvis mellom en og åtte) og en oppsettavhengig for oversettelses- og rotasjonsbevegelsene (estimert mellom 1,2 og 1,5). Forholdet mellom den tiltenkte temporale oppløsningen og opptakstiden per embryo indikerer maksimalt antall embryoer som kan avbildes samtidig. Oppsummert er vår protokoll hensiktsmessig å gå videre fra sekvensiell levende avbildning til middels gjennomstrømning, men ikke egnet for det som generelt anses som høy gjennomstrømning. For sistnevnte kan LSFMs egnet for mikroskop lysbilder49,50,51 eller brønnplater52 vurderes, men disse implementeringene har vanligvis andre begrensninger.

Avhengig av det eksperimentelle spørsmålet og dermed belysningslinsen /deteksjonslinsen/kamerakombinasjonen i forbindelse med bildeparameterne, kan samtidig avbildede LSFM-datasett kreve stor lagringsplass i rå tilstand. Dette problemet kan best illustreres ved å vurdere de medfølgende Drosophila-eksempeldatasettene (Supplerende tabell 1), det vil si DS0001-3. Hvert todimensjonale råbilde hadde et datavolum på ca. 2,8 megabyte, hver rå z-stabel besto av 120 plan, og alle tre embryoene ble registrert langs fire retninger totalt 143 ganger. Følgelig okkuperte rådatasettene omtrent en halv Terabyte. Gjennom behandling av bildedata, det vil si beskjæring langs alle romlige dimensjoner (trinn 9) i forbindelse med ZIP-basert komprimering, ble datavolumet redusert til 53,3 Gigabyte, som er omtrent 10% av den opprinnelige mengden. For å behandle datasett i Terabyte-regimet, BigDataViewer53-plugin, som er forhåndsinstallert i FIJI (Plugins | BigDataVieweranbefales.

I tillegg til de fem scenariene som er skissert i representative resultater-delen, kan vår protokoll også brukes til å karakterisere effekten av RNAi knockdown-effekter, som er en populær tilnærming i Tribolium54. Det er imidlertid bare av begrenset bruk for analyse av forbindelser (f.eks. insektmidler eller andre biokjemiske stressorer) hvis disse skal påføres gjennom bildebufferen - som er den mest enkle tilnærmingen - da samtidig avbildning av et kontrollembryo ikke er mulig.

Vi demonstrerte protokollen vår ved hjelp av et av våre spesialbygde mikroskoper8,55, men den gjelder for alle prøvekammerbaserte oppsett, for eksempel OpenSPIM56 eller de fleste kommersielle LSFMer. Denne protokollen utfyller det LSFM-tilknyttede ressursetablissementsinitiativet som tar sikte på å oppmuntre nybegynnere til aktivt å integrere lysarkbasert teknologi i forskningsplanene sine. De fleste universiteter og institutter opererer i dag velutstyrte fluorescensmikroskopianlegg57. Disse gir vanligvis tilgang til en eller flere kammerbaserte LSFMer, men de ansatte kan ikke forventes å ha de riktige eksperimentelle løsningene for hvert vitenskapelig spørsmål.

Våre resultater viser at vårt eksperimentelle rammeverk passer for Drosophila og Tribolium. Vi er sikre på at vår sammenligningsfokuserte protokoll kan brukes til å studere embryogenesen til andre insektarter. For eksempel har en LSFM-basert tilnærming blitt brukt til å sammenligne villtype- og knockdown-utvikling i scuttle fly Megaselia abdita58, og oppfølgingsstudier vil også dra nytte av vår monteringsmetode. I tillegg er transgene linjer av den toflekkede cricket Gryllus bimaculatus spesielt designet for fluorescens levende bildebehandling59 tilgjengelig, men den eneste tilgjengelige sammenligningsfokuserte protokollen60 er beregnet på konvensjonelle inverterte mikroskoper og adresserer derfor ikke tredimensjonalt bildeanskaffelse eller prøverotasjon. I tillegg har det allerede blitt vist at spindelvevholderen er et praktisk valg for sebrafisk, hvis embryoer endrer form betydelig under embryogenese61. En tilpasning av vår protokoll, som i utgangspunktet ikke krever noen optimaliseringsinnsats, vil gi de ovenfor beskrevne fordelene også for denne modellorganismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Ernst H. K. Stelzer for muligheten til å bruke sine ressurser så vel som hans verdifulle kommentarer angående manuskriptet, Anita Anderl for støtte med Tribolium live imaging, Sven Plath for teknisk støtte samt Ilan Davis, Nicole Grieder og Gerold Schubiger for å dele sine transgene Drosophila-linjer via Bloomington Stock Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plate Orange Scientific 4430500  
24-well plate Orange Scientific 4430300 Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dish Fisher Scientific 153066 Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dish Fisher Scientific L9004575
100 µm mesh size cell strainer BD Biosciences 352360
250 µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-038 Only for live imaging involving Tribolium
300 µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-040 Only for live imaging involving Tribolium
710 µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-050 Only for live imaging involving Tribolium
800 µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-051 Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flour Demeter e.V. SP061006 Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila medium Genesee Scientific 66-115 Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø Thermo Fisher Scientific T7282
inactive dry yeast Genesee Scientific 62-108
low-melt agarose Carl Roth 6351.2
narrow vials Genesee Scientific 32-109 Only for live imaging involving Drosophila
small paint brush VWR International 149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl Carl Roth 9062.3 Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flour Demeter e.V. SP061036 Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vials Genesee Scientific 32-110 Only for live imaging involving Drosophila

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
  2. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
  3. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
  4. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
  5. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
  6. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
  7. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  8. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  9. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
  10. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
  11. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
  12. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
  13. Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
  14. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  15. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
  16. Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
  17. Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
  18. Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
  19. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  20. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
  21. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
  22. Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
  23. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
  24. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
  25. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
  26. Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
  27. Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
  28. Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
  29. Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
  30. Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
  31. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
  32. Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
  33. Mcdonald, J. H. Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , Sparky House Publication. (2013).
  34. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
  35. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  36. Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
  37. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
  38. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
  39. vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
  40. Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
  41. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
  42. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  43. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
  44. He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
  45. Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
  46. Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
  47. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , Springer. (1997).
  48. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
  49. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
  50. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
  51. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
  52. Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
  53. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  54. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  55. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
  56. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
  57. Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
  58. Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
  59. Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
  60. Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
  61. Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).

Tags

Biologi Utgave 163 komparativ levende bildebehandling samtidig levende bildebehandling tredimensjonal lysmikroskopi lysarkbasert fluorescensmikroskopi LSFM spindelvevholder insektutvikling embryonal morfogenese embryogenese Drosophila melanogaster Tribolium castaneum omgivelsesvariasjon
Samtidig levende bildebehandling av flere insektembryoer i prøvekammerbaserte lysarkfluorescensmikroskoper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ratke, J., Krämer, F., Strobl,… More

Ratke, J., Krämer, F., Strobl, F. Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes. J. Vis. Exp. (163), e61713, doi:10.3791/61713 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter