Summary
A microscopia de fluorescência à base de folha de luz é a ferramenta mais valiosa na biologia do desenvolvimento. Um grande problema em estudos comparativos é a variância ambiente. Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas de múltiplos espécimes e, portanto, aborda essa questão de forma pró-ativa.
Abstract
A microscopia de fluorescência baseada em folha de luz oferece soluções eficientes para estudar processos complexos em múltiplas escalas biologicamente relevantes. As configurações baseadas em câmaras de amostra, que são especificamente projetadas para preservar a integridade tridimensional do espécime e geralmente apresentam rotação de amostras, são a melhor escolha em biologia do desenvolvimento. Por exemplo, eles têm sido usados para documentar toda a morfogênese embrionária da mosca-das-frutas Drosophila melanogaster e do besouro de farinha vermelha Tribolium castaneum. No entanto, muitos protocolos de imagem ao vivo disponíveis fornecem apenas estruturas experimentais para embriões únicos. Especialmente para estudos comparativos, tais abordagens são inconvenientes, uma vez que espécimes sequencialmente imagens são afetados pela variância ambiente. Além disso, limita o número de espécimes que podem ser testados dentro de um determinado tempo. Fornecemos uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas que aumenta o throughput em configurações baseadas em câmaras de amostra e, portanto, garante condições ambientais semelhantes para todos os espécimes. Em primeiro lugar, fornecemos uma diretriz de calibração para microscópios de fluorescência de folha de luz. Em segundo lugar, propomos um método de montagem para múltiplos embriões compatível com a rotação de amostras. Em terceiro lugar, fornecemos conjuntos de dados de imagem ao vivo tridimensionais exemplares de Drosophila, para os quais justapõem três linhas transgênicas com núcleos fluorescentes rotulados, bem como de Tribolium,para os quais comparamos o desempenho de três sublines transgênicas que carregam o mesmo transgênico, mas em diferentes locais genômicos. Nosso protocolo é especificamente projetado para estudos comparativos, pois aborda proativamente a variância ambiente, que está sempre presente em imagens vivas sequenciais. Isso é especialmente importante para análises quantitativas e caracterização de fenótipos aberrationais, que resultam, por exemplo, de experimentos eliminatórios. Além disso, aumenta o throughput global, que é altamente conveniente quando o acesso a microscópios de fluorescência de folha de luz é limitado. Finalmente, o método de montagem proposto pode ser adaptado para outras espécies de insetos e outros organismos modelo, por exemplo, zebrafish, sem basicamente nenhum esforço de otimização.
Introduction
A microscopia de fluorescência é uma das técnicas de imagem mais essenciais nas ciências da vida, especialmente na biologia celular e de desenvolvimento. Nos microscópios de fluorescência confocal1, que são de última geração para imagens de fluorescência tridimensional desde meados da década de 1990, a mesma lente é usada para excitação fluorófora e detecção de luz de emissões. O raio laser de iluminação excita todos os fluoroforos ao longo do eixo de iluminação/detecção e o respectivo sinal fora de foco é discriminado antes da detecção por um orifício. Assim, para cada imagem bidimensional, todo o espécime é iluminado. Consequentemente, para cada imagem tridimensional, ou seja, uma pilha de imagens tridimensionais espacialmente consecutivas, todo o espécime é iluminado várias dezenas a algumas centenasde vezes 2, o que promove fotobleaching e fototoxicidade3.
Há quase vinte anos, a tecnologia4 surgiu como uma alternativa promissora para a imagem de fluorescência tridimensional e, assim, tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia do desenvolvimento5. Nesta abordagem, a iluminação e a detecção são dissociadas. A lente de iluminação é usada para gerar uma folha de luz com uma profundidade de apenas alguns micrômetros dentro do plano focal da lente de detecção perpendicularmente organizada. Assim, para cada imagem bidimensional, apenas um fino volume planar ao redor do plano focal é iluminado. Consequentemente, para cada imagem tridimensional, todo o espécime é iluminado apenas uma vez, o que diminui fortemente o fotobleaching e a fototoxicidade6. Por essa razão, os microscópios de fluorescência de folhas de luz (LSFMs) oferecem soluções eficientes para estudar processos complexos em múltiplas escalas biologicamente relevantes e são, portanto, de valor particular na biologia do desenvolvimento, onde espécimes tão grandes quanto vários milímetros devem ser analisados no nível subcelular.
Historicamente, os LSFMs têm sido baseados em câmara de amostra7,8. Nestas configurações, os eixos de iluminação (x) e detecção (z) são geralmente organizados perpendicularmente ao eixo de gravidade (y). As câmaras de amostra oferecem ampla liberdade experimental. Em primeiro lugar, eles fornecem grandes capacidades de tampão de imagem, o que, por sua vez, facilita o uso de um sistema de perfusão para controlar o ambiente, por exemplo, para manter uma temperatura específica9 ou para aplicar estressores bioquímicos. Além disso, eles suportam métodos de montagem personalizados10 que são adaptados às respectivas necessidades experimentais, preservando o tridimensional, em alguns casos dinâmico11, integridade do espécime. Além disso, as configurações baseadas em câmaras de amostra são geralmente equipadas com uma função de rotação que é usada para girar os espécimes ao redor do eixo y e, assim, imagen-los ao longo de duas, quatro ou até mais direções. Uma vez que os embriões de organismos modelos comumente usados são, no contexto da microscopia, imagens relativamente grandes e sucessivas ao longo dos eixos ventral-dorsal, lateral e/ou anterior-posterior do corpo fornecem uma representação mais abrangente. Isso permite, por exemplo, o rastreamento a longo prazo de células que se movem ao longo de complexas rotas de migração tridimensional12,13.
A microscopia de fluorescência à base de folha de luz tem sido aplicada extensivamente para estudar a morfogênese embrionária de Drosophila melanogaster, ambos sistematicamente14,15, bem como com foco específico nos aspectos biofísicos do desenvolvimento. Por exemplo, foi usado para coletar dados morfogenéticos de alta resolução, a fim de detectar uma ligação biomecânica entre a invaginação do endoderme e a extensão do eixo durante o alongamento da banda germinal16 e ainda para relacionar o complexo fluxo celular com padrões de geração de força durante a gastrulação17. Também foi combinado com outras técnicas de última geração, por exemplo, optogenética para investigar a regulação da sinalização Wnt durante a padronização anterior-posterior na epiderme18.
No entanto, estudar apenas uma espécie não fornece insights sobre a evolução do desenvolvimento. Para entender a embriogênese dentro do contexto filogenético, pesquisas intensivas têm sido realizadas com organismos alternativos de modelos de insetos. Uma das espécies mais bem investigadas é o besouro de farinha vermelha Tribolium castaneum, uma praga de grãos armazenados economicamente relevante19,cuja morfogênese embrionária também já foi sistematicamente imageada com LSFM20. A morfogênese embrionária dessas duas espécies difere notavelmente em vários aspectos, por exemplo, no modo de segmentação21,bem como na formação e degradação das membranas extraembrionárias22. Este último aspecto já foi extensivamente analisado utilizando LSFMs. Por exemplo, foi demonstrado que o serosa, um tecido extraembrionário que envolve e protege o embrião do Tribípio de vários perigos para a maior parte de sua embriogênese23,24, também atua como o "driver" morfogenético para seu próprio processo de retirada durante o fechamento dorsal25. Além disso, foi demonstrado que durante a gastruação, uma determinada região do blastoderm permanece ancorada na membrana vitelline, a fim de criar movimentos assimétricos do tecido26 e, após essa observação, que a fluidização de tecido regionalizado permite que as células deixem sequencialmente a borda serosa durante o fechamento da janelaserosa 27.
Em todos os estudos associados à Drosophila- e triboliumcitados acima, foram utilizados LSFMs baseados em câmaras de amostra. Na maioria, os embriões foram registrados ao longo de várias direções usando a função de rotação da amostra. Embora não declarado explicitamente, pode-se supor que eles foram registrados individualmente e, portanto, independentes uns dos outros em ensaios de imagem ao vivo sequencial, semelhante ao nosso trabalho anterior em Tribolium20,28. Em certos cenários, tal abordagem é aceitável, mas especialmente em abordagens quantitativas comparativas, a variância ambiente pode distorcer os resultados. Por exemplo, sabe-se há muito tempo que a velocidade de desenvolvimento dos insetos é dependente da temperatura29,mas um estudo mais recente sugere ainda que em Drosophila, a temperatura também pode afetar a concentração de morfogênicos30. Consequentemente, se certas características da embriogênese, por exemplo, as proporções dinâmicas, as taxas de divisão e as velocidades de migração das células, devem ser precisamente quantificadas, são necessárias repetições suficientes sem variância ambiente. Isso minimiza desvios padrão e erros padrão, o que, por sua vez, facilita a justaposição com outras condições experimentais, mesmo que marginalmente divergentes.
No entanto, os LSFMs baseados em câmara de amostra são projetados principalmente para alto conteúdo em vez de ensaios de alto rendimento. Ao contrário dos microscópios confocal, que são tipicamente equipados com mecanismos padronizados de grampo para lâminas de microscopia, placas de Petri e placas de poço, quase todos os LSFMs baseados em câmara de amostra usam mecanismos de grampo baseados em cilindros. Estes mecanismos destinam-se a suportes de amostra personalizados compatíveis com a rotação, bem como não invasivos10,mas geralmente não projetados para mais de uma amostra20,31,32. Uma estrutura para imagens ao vivo simultâneas de dois ou mais embriões, em que as vantagens das configurações baseadas em câmaras de amostra não são comprometidas, aborda a questão da variância ambiente, aumentando assim o valor dos LSFMs para estudos comparativos.
Em nosso protocolo, apresentamos uma estrutura experimental para imagens ao vivo comparativas em LSFMs baseados em câmara de amostra (Figura 1A) em que o eixo y é usado como opção para "empilhar" embriões. Em primeiro lugar, fornecemos uma diretriz de calibração baseada em microesfera fluorescente para LSFMs baseados em câmara de amostra, o que é especialmente importante para instrumentos que não possuem um assistente de calibração. Em segundo lugar, descrevemos um método de montagem para múltiplos embriões baseado no suporte da teia de aranha28 (Figura 1B) que é compatível com a rotação da amostra e, portanto, permite imagens simultâneas de múltiplas amostras ao longo de múltiplas direções(Figura 1C). Vários embriões são alinhados em cima de um filme fino de ágarose e, após a inserção na câmara de amostra, moveram-se sucessivamente através da folha de luz para adquirir imagens tridimensionais. Em terceiro lugar, fornecemos três conjuntos de dados de imagem ao vivo exemplares para Drosophila, bem como para Tribolium. Para o primeiro, justapomos linhas transgênicas com núcleos fluorescentes rotulados. Para este último, comparamos o desempenho de sublines transgênicas que carregam o mesmo transgênico, mas em diferentes locais genômicos. Por fim, discutimos a importância da paraleloização no que diz respeito à imagem ao vivo comparativa e à variância ambiente33,debatemos o limite de rendimento de nosso quadro experimental e avaliamos a adaptação de nossa abordagem a outros organismos modelo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Trabalho preparatório
- Escolha uma combinação de lente/lente de detecção/câmera de iluminação para o LSFM que se adapte à questão científica e configure o microscópio. O tamanho do campo de visão é o quociente do tamanho do chip da câmera e a ampliação da lente de detecção. A lente de iluminação deve ser escolhida para que todo o campo de visão seja coberto por uma folha de luz aproximadamente planar34. Três combinações recomendadas estão listadas na Tabela 1.
- Para preparar alíquotas e pratos de recuperação, adicione 2 g de baixa derretimento à água da torneira autoclavada de 200 mL e aqueça a mistura em um forno de micro-ondas a 600-800 W até que todas as partículas de ágarose sejam dissolvidas. Prepare várias alíquotas de 1 mL em tubos de reação de 1,5 mL ou 2 mL, depois encha várias placas Ø Petri de 90 mm de 3-5 mm de altura com agarose. Armazene alíquotas e pratos solidificados a 4 °C.
- Para Drosophila: Para preparar frascos de criação frescos, cozinhe uma quantidade adequada de meio Drosophila personalizado ou comercialmente disponível, transfira 5-15 mL em frascos largos e armazene-os a 4 °C. Para preparar pratos de colocação de ovos, adicione 1 g de agarose de baixo derretimento a 50 mL de água da torneira autoclavada e aqueça a mistura em um forno de micro-ondas a 600-800 W até que todas as partículas de agarose sejam dissolvidas. Deixe a mistura esfriar até 45 °C, depois adicione 50 mL de suco de fruta (de preferência maçã ou uva vermelha) e misture bem. Despeje a mistura em pratos Ø Petri de 35 mm e armazene pratos solidificados de colocação de ovos a 4 °C.
- Para o Tribolium: Para preparar o meio de crescimento, passe a farinha de trigo integral, bem como a levedura seca inativa através de uma peneira de tamanho de malha de 710 μm, em seguida, suplementar a farinha peneirada com 5% (w/w) levedura peneirada. Para preparar o meio de colocação de ovos, passe farinha de trigo fina, bem como levedura seca inativa através de uma peneira de tamanho de malha de 250 μm e, em seguida, suplementar a farinha peneirada com levedura peneirada de 5% (w/w).
2. Calibração de LSFMs baseados em câmara de amostra usando microesferas fluorescentes
NOTA: O objetivo da calibração é alinhar os pontos focais das lentes de iluminação e detecção(Figura 2A),pois esta é a premissa para imagens claras. Os LSFMs devem ser calibrados regularmente, pelo menos uma vez a cada 3-4 semanas.
- Liquefate uma alíquota agarose em um aquecedor/misturador de bloco seco a 80 °C, em seguida, permita que a alíquota agarose esfrie até 35 °C.
- Transfira 50 μL de agarose para um tubo de reação de 1,5 mL e adicione 0,5 μL de solução de microesfera fluorescente. Misture a 1.400 rpm por 1 min.
- Encha o orifício ranhuado do suporte da teia de aranha com 10 μL de mistura de solução de agarose/microesfera fluorescente, em seguida, aspire o máximo de agarose possível até que apenas um filme de ágarose fina permaneça. Espere 30-60 s para solidificação.
- Encha a câmara de amostra com água da torneira autoclavada. Insira o suporte da teia de aranha lentamente na câmara de amostra e mova o orifício ranhuado com os estágios de microtranslização na frente da lente de detecção.
- Gire o suporte da teia de aranha com o estágio de rotação para uma posição de 45° em relação aos eixos de iluminação (x) e detecção (z). O suporte da teia de aranha não deve ser visível no canal de luz de transmissão.
- Mude para o respectivo canal de fluorescência e ajuste a potência do laser, bem como o tempo de exposição para que as microesferas fluorescentes forneçam sinal adequado.
- Especifique um volume de visualização que cubra completamente o filme agarose orientado transversalmente. Defina o espaçamento z calculando a resolução axial máxima possível para a respectiva combinação de lente de iluminação/lente de detecção34. Alternativamente, 4 vezes a resolução lateral pode ser usada como uma aproximação áspera.
- Regissão um teste tridimensional z pilha das microesferas fluorescentes e compare as projeções máximas x, y e z com o gráfico de calibração(Figura 2). Se as microesferas aparecerem embaçadas, difusas e/ou distorcidas(Figura 2B,C),ajuste as posições da lente de iluminação e/ou detecção.
3. Coleção de embriões de Drosophila
- Transfira 100-200 adultos da linha Drosophila de escolha para um frasco de criação fresco 2-3 dias antes do ensaio de imagem para estabelecer uma cultura de coleta de ovos. Se ainda não existe, considere usar o velho frasco de criação para iniciar uma cultura descendente. Para garantir que os adultos não têm mais de duas semanas, substitua a cultura de coleta de embriões a tempo pela cultura progênia.
- Aqueça um prato de colocação de ovos à temperatura ambiente e adicione uma gota de pasta de levedura em cima do ágar.
- Transfira os adultos da cultura de coleta de ovos para um frasco estreito vazio e coloque-o em cima do prato de colocação de ovos. Incubar a configuração de coleta de ovos em temperatura ambiente por 15 minutos. Evite anestesia (fria, CO2) durante esta etapa, se possível.
- Devolva os adultos ao frasco de criação. Incubar o prato de colocação de ovos em uma combinação conveniente de temperatura/tempo, em seguida, transfira 10-20 embriões com um pequeno pincel do prato de colocação de ovos para um coador de células de tamanho de malha de 100 μm. Descarte o prato de colocação de ovos.
- Repita as etapas 3.1 a 3.4 para cada linha Drosophila.
4. Coleção de embriões de Tribálio
NOTA: Por conveniência, é fornecido um esquema do procedimento de coleta de ovos de Tribálio (Figura 3A)ao qual também se referem os números dentro dos suportes nesta etapa.
- Transfira 200-300 adultos (cerca de 400-700 mg) da linha Tribolium de escolha para uma garrafa de vidro 1 L vazia 2-10 dias antes do ensaio de imagem para estabelecer uma cultura de coleta de ovos(Figura 3A_01). Encha a garrafa com 50-100 g de meio de crescimento fresco. Se ainda não existir, considere iniciar uma cultura progênita usando larvas e pupas disponíveis. Para garantir que os adultos não têm mais de 3 meses, substitua a cultura da coleta de ovos a tempo pela cultura progênia.
- Passe a cultura de coleta de ovos através de uma peneira de tamanho de malha de 800 μm(Figura 3A_02). Devolva o meio de crescimento, que contém embriões não encenados, à garrafa inicial(Figura 3A_03) e transfira os adultos para uma garrafa de vidro 1 L vazia(Figura 3A_04). Adicione 10 g de meio de colocação de ovos(Figura 3A_05) e incubar a configuração da coleta de ovos à temperatura ambiente por 1h(Figura 3A_06,07).
- Passe a configuração da coleta de ovos através da peneira de tamanho de malha de 800 μm(Figura 3A_08). Devolva os adultos à sua garrafa inicial(Figura 3A_09). Dependendo do processo de desenvolvimento que deve ser imageado, incubar o meio de colocação de ovos, que agora contém cerca de 30-100 embriões, a uma combinação conveniente de temperatura/tempo(Figura 3A_10).
- Passe o meio de colocação de ovos através da peneira de tamanho de malha de 300 μm(Figura 3A_11) e transfira os embriões(Figura 3A_12) para um coador de células de tamanho de malha de 100 μm. Descarte a mídia peneirada de colocação de ovos(Figura 3A_13).
- Repita as etapas 4.1 a 4.4 para cada linha Tribolium.
5. Descorionação à base de hipoclorito de sódio
NOTA: Tanto os embriões de Drosophila quanto o Tribolium são cobertos por um acorde, uma camada protetiva e fortemente leve que não é essencial para o desenvolvimento adequado, desde que os embriões sejam mantidos úmidos após a remoção. O protocolo de descorção para os embriões de ambas as espécies é idêntico.
- Prepare uma placa de 6 poços preenchendo os poços A1, A2, A3 e B3 com 8 mL de água da torneira autoclavada e os poços B1 e B2 com 7 mL de água da torneira autoclavada e 1 mL de solução de hipoclorito de sódio (NaOCl)(Figura 3B). Observe o processo de descorção sob um microscópio estéreo, idealmente em luz de transmissão.
ATENÇÃO: A hipoclorito de sódio é corrosiva. - Insira o coador celular contendo embriões (Passo 3.4 e/ou 4.4) no poço A1 e lave os embriões cerca de 30-60 s sob suave agitação.
- Mova o coador de células para o B1 bem e agite as placas vigorosamente por 30 s, depois transfira-a para o poço A2 e lave os embriões por 1 min sob suave agitação.
- Mova o coador de células para o B2 bem e agite a placa vigorosamente até que a maioria dos embriões estejam completamente descorioados(Figura 3C), depoistransfira-o para o poço A3 e lave os embriões por 1 minuto sob agitação suave.
- Armazene bem o coador de células na B3 antes de prosseguir com o procedimento de montagem.
- Repita as etapas 5.1 a 5.5 para cada linha.
6. Montagem de embriões múltiplos usando o suporte da teia de aranha
- Liquefate uma alíquota agarose em um aquecedor/misturador de bloco seco a 80 °C, em seguida, permita que a alíquota agarose esfrie até 35 °C.
- Pipet 10 μL de agarose em cima do orifício ranhuado do suporte da teia de aranha. Com a ponta da pipeta, espalhe a agarose sobre o orifício ranhudo, depois aspire o máximo possível de agarose até que apenas um filme de agarose fina permaneça. Espere 30-60 s para solidificação.
- Para cada linha, escolha cuidadosamente um ou mais embriões com um pequeno pincel e coloque-os no filme agarose.
- Disponha os embriões ao longo do longo eixo do orifício ranhutado, em seguida, também alinhe seu eixo anterior-posterior com o eixo longo do orifício ranhuted(Figura 3D).
- Estabilize os embriões cuidadosamente, pipetando 1-2 μL de agarose na lacuna entre os embriões e o filme agarose. Espere 30-60 s para solidificação.
- Insira o suporte da teia de aranha com os embriões montados lentamente na câmara de amostra cheia de tampão de imagem.
7. Imagem ao vivo comparativa em LSFMs baseados em câmara de amostra
- Mova um dos embriões com os estágios de microtranslação na frente da lente de detecção. Certifique-se de que o suporte da teia de aranha esteja em uma posição de 45° em relação aos eixos de iluminação (x) e detecção (z) (cf. Figura 1C).
- No canal de luz de transmissão, mova o embrião para o centro do campo de visão. O suporte da teia de aranha não deve ser visível.
- Mova o embrião com os estágios de microtranslização em z até que o plano médio do embrião se sobreponha ao plano focal, ou seja, até que o contorno pareça afiado. Sem mudar para o canal de fluorescência, especifique o volume de visualização movendo-se 250 μm de distância do plano médio em ambas as direções.
- Opcionalmente, se for necessária a imagem ao longo de várias direções, gire o embrião adequadamente e repita as etapas 7.2 e 7.3. O suporte da teia de aranha suporta até quatro orientações em etapas de 90°.
- Repita as etapas 7.1 a 7.3 (ou 7.4) para todos os outros embriões montados no suporte da teia de aranha(Figura 3E). Certifique-se de que o embrião superior não deixe o tampão de imagem quando o embrião inferior estiver na frente da lente de detecção.
- Defina os parâmetros do canal de fluorescência (potência do laser, tempo de exposição, filtro de detecção) e lapso de tempo (intervalo, duração total) e inicie o processo de imagem. Para valores indicativos, consulte a tabela de metadados dos conjuntos de dados de exemplo (Tabela Complementar 1). Para ensaios que duram vários dias, considere cobrir a abertura da câmara de amostra pelo menos parcialmente para reduzir a evaporação.
8. Recuperação e maior cultivo de embriões imaged
- Quando o ensaio de imagem terminar, remova cuidadosamente o suporte da teia de aranha da câmara de amostra.
- Retire os embriões do filme agarose com um pequeno pincel e transfira-os para um slide de microscópio apropriadamente rotulado. Coloque o slide em uma antena de recuperação e incubar sob as respectivas condições de criação padrão.
- Em relação às modalidades experimentais, estima-se quando a embriogênese for concluída. À medida que o ponto de tempo de eclosão se aproxima, verifique os pratos de recuperação com frequência e transfira larvas de Drosophila eclodidas para frascos de criação individuais e larvas de Tribólio para poços individuais de uma placa de 24 poços. Encha os poços até a metade com meio de crescimento. Incubar sob as respectivas condições de criação padrão.
- Uma vez que os indivíduos observados são adultos, forneça-lhes um parceiro de acasalamento adequado e verifique se há progêneo após vários dias.
9. Processamento de dados de imagem e documentação de metadados
NOTA: Para o processamento de dados de imagem, recomenda-se o derivado ImageJ FIJI35 (imagej.net/Fiji/Downloads). O FIJI não requer instalação e versões de 32 e 64 bits estão disponíveis. Um dos formatos mais usados para dados LSFM é o formato de arquivo de imagem marcado (TIFF), que permite o armazenamento de pilhas de imagens na forma de um recipiente TIFF.
- Calcule as projeções máximas de z para todas as pilhas z(Imagem | Pilhas | Projeto Z, escolha Intensidade Máxima). Projeções máximas são abordagens de simplificação de dados que reduzem o número de dimensões espaciais de três para dois. Um script FIJI para processamento em lote é fornecido(Arquivo Suplementar 1).
- Concatenar as respectivas projeções máximas de z para criar pilhas de tempo (pilhas de t). Guarde isso em um recipiente TIFF. Faça isso para todos os embriões registrados, bem como para as respectivas direções e canais de fluorescência, se aplicável.
- Gire a pilha z e t ao redor do eixo z para alinhar o eixo anterior-posterior dos embriões com o eixo de imagem x ou y(Imagem | Transforme | Gire). Crop as pilhas z ao longo de todos os três eixos de imagem e a pilha t nos eixos de imagem x e y de modo que apenas o espaço mínimo de buffer (20-40 pixels ao longo dos eixos x e y, 5-10 imagens ao longo do eixo z) em torno dos restos de embrião(Imagem | Ajuste | Tamanho da tela para os eixos x e y, imagem | Pilhas | Ferramentas | Corta Guardião para o eixo z).
- Faça isso individualmente para todos os embriões registrados, bem como para as respectivas direções, se aplicável. Os canais de fluorescência, se aplicável, devem ser processados com parâmetros de rotação e corte idênticos.
- Documente os metadados o mais detalhado possível. Como diretriz, a tabela de metadados dos conjuntos de dados de exemplo, que são apresentados na seção Resultados Representativos, pode ser utilizada (Tabela Suplementar 1).
10. Visualização de dados
NOTA: Esta diretriz de visualização de dados se concentra principalmente na criação de matrizes de imagem de projeção máxima z que mostram vários embriões gravados ao longo de várias direções e/ou ao longo do tempo. As etapas a seguir descrevem o procedimento de visualização de dados aplicado aos conjuntos de dados de exemplo para a criação dos números mostrados e vídeos vinculados na seção Resultados Representativos.
- Combine pilhas de várias direções(| de imagem Pilhas | Ferramentas | Combine) e/ou mescle vários canais de fluorescência(imagem | | de cor Mesclar Canais) para visualizar a estrutura biológica e/ou processo de interesse.
- Ajuste as intensidades das pilhas t(Imagem | Ajuste | Brilho/Contraste) conforme necessário usando a função "Set". O valor mínimo exibido deve ser definido ligeiramente acima do sinal de fundo, o valor máximo exibido deve resultar em um contraste conveniente. Documente ambos os valores, pois podem ser usados para um ajuste consistente das respectivas pilhas z. Ajuste de impressão usando a função "Aplicar". Dependendo das modalidades experimentais, considere processar todos os embriões registrados com valores idênticos.
- Salve pilhas de t ajustadas com intensidade como arquivos separados, não substitua as pilhas de t não ajustadas. Compilar sub pilhas adequadas das pilhas de t ajustadas com funções de seleção de imagem dedicadas (por exemplo, imagem | Pilhas | Ferramentas | Slice Keeper) e use a ferramenta de montagem(Imagem | Pilhas | Faça montage) para criar grades de imagem que podem ser usadas para o design de figuras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo de fluorescência comparativa em LSFMs baseados em câmara de amostra. Por exemplo, a estrutura pode ser usada para justapor (i) embriões (i) de duas ou mais espécies, (ii) embriões de linhas em que um ou mais genes são eliminados mais controles do tipo selvagem, (iii) embriões múltiplos da mesma linha transgênica, (iv) embriões de diferentes linhas transgênicas, ou (v) embriões de sublines que carregam o mesmo transgene , mas em diferentes locais genômicos. Nesta seção, fornecemos exemplos para os dois últimos cenários.
Em nossa primeira aplicação exemplar, mostramos a dinâmica do sinal de fluorescência de três embriões que derivam de diferentes linhas transgênicas de Drosophila (Tabela 2) durante um período de cerca de 1 dia(Figura 4, Filme Suplementar 1). Para essas linhas, esperávamos padrões de fluorescência bastante semelhantes, uma vez que todos eles expressam EGFP/GFP localizados nucleares sob controle de diferentes promotores presumivelmente onipresentes e constitutivamente ativos. No entanto, nossos resultados comparativos de imagem ao vivo mostram que há fortes diferenças espesso nos padrões de expressão que certamente não são efeitos secundários devido à variância ambiente.
Em nosso segundo exemplo de aplicação, comparamos o desempenho de três embriões que derivam das #1 sublines #O(LA)-mEmerald} #O, #2 e #3 (Zen1'LA-mE #1, #2 e #3, respectivamente) sublines transgênicas tribolium 36. Todos eles carregam o mesmo transgene baseado em piggyBac que leva à expressão do mEmerald-linkedLifeact 38 sob controle do promotor zerknüllt 139, um fator de transcrição envolvido na especificação serosa. Nossos resultados comparativos de imagem ao vivo, que ilustram o processo de fechamento da janela serosa durante a gastruação, sugerem que a sublina #2 fornece um sinal geral notavelmente mais forte do que as outras duas sublines(Figura 5, Filme Suplementar 2). Isso indica que também em Tribálium, o contexto genômico pode ter uma forte influência no nível de expressão de transgenes que carregam um de expressão.
A recuperação bem sucedida de todos os seis embriões que são mostrados nesta seção foi possível, como descrito na etapa 8 do nosso protocolo. Todos eles desenvolveram-se em adultos totalmente funcionais e férteis(Tabela Suplementar 1, linha "Recuperação", indicando que o procedimento geral, desde a descorção sobre a montagem até o registro, não foi invasivo. Esse nível de controle de qualidade é essencial sempre que se espera um desenvolvimento do tipo selvagem, por exemplo, em relação aos embriões de controle que são imagens simultaneamente com embriões nos quais um ou mais genes são derrubados ou nocauteados.
Todos os conjuntos de dados utilizados para criar os resultados representativos são fornecidos como recursos que ajudarão especialmente os novatos da LSFM a avaliar a qualidade de seu próprio trabalho. Os links de download baseados em identificadores de objetos digitais podem ser encontrados na tabela metadados(Tabela Suplementar 1, "Acesso de Dados").
Figura 1: Estrutura experimental e visão geral do método de montagem. (A) Fluxograma das dez etapas do protocolo com lembretes curtos e uma estimativa do tempo necessário. Tarefas marcadas com asteriscos não devem ser executadas durante todos os ensaios, mas dependendo das circunstâncias. As caixas verdes indicam passos associados à Drosophila e/ou Tribolium,as caixas azuis indicam passos associados à microscopia. (B) Desenho detalhado do suporte da teia de aranha. O design apresentado é adequado para mecanismos de grampo baseados em cilindros, que são comumente usados em LSFMs baseados em câmara de amostra. O suporte pode ser dimensionado desde que a distância de trabalho da lente de detecção seja respeitada. (C) Sequência de gravação para imagens ao vivo de múltiplos embriões ao longo de várias direções. A princípio, pilhas z do embrião superior são registradas ao longo de até quatro orientações, ou seja, 0°, 90°, 180° e 270°. Posteriormente, o embrião abaixo é movido na frente da lente de detecção e a sequência de gravação/rotação começa novamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Gráfico de calibração baseado em microesfera fluorescente para LSFMs. O gráfico ilustra como as microesferas fluorescentes aparecem nas projeções máximas x, y e z se o LSFM estiver corretamente calibrado(A),ou se houver uma iluminação(B) ou compensação de detecção(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Coleta, descorção, montagem e imagem de múltiplos embriões. (A) Visão geral da coleção de embriões do tribuário. As ilustrações são citadas ao longo da Etapa 4 de acordo com os números no canto superior esquerdo. (B) Esquema de preparação e transferência para a placa de 6 poços utilizada durante a Etapa 5. Os poços B1 e B2 continham hipoclorito de sódio diluído (NaOCl), que induz a descorção. (C) O coador de células de 100 μm, que foi usado para transferir os embriões de um poço para outro, dentro do poço B2. A imagem de detalhe superior mostra um close-up de vários embriões tribolium no topo da malha do coador celular, a imagem de detalhe inferior mostra uma imagem de microscópio estéreo de transmissão de vários embriões de Tribálio com acordes parcialmente separados. (D) Suporte de teia de aranha com três embriões tribuários montados. Os embriões, bem como seus eixos anterior-posteriores, foram alinhados ao longo do longo eixo do orifício ranhutado. (E) Movimento do suporte da teia de aranha dentro da câmara amostral do LSFM durante a gravação de três embriões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem ao vivo de fluorescência comparativa de um embrião cada um das linhas de #01691, #29724 e #24163 de Drosophila transgênica. Os embriões são mostrados ao longo de duas (de quatro direções registradas) ao longo de um período de 20:00 h (de um período total de imagem de 23:40 h). Não foi realizada correção dinâmica de intensidade ao longo do tempo. Os metadados para os conjuntos de dados Drosophila podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1. ZA, Z projeção máxima com ajuste de imagem. Barra de escala, 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens ao vivo de fluorescência comparativa de um embrião cada um das sublines Zen1'LA-mE #1, #2 e #3 sublines transgênicos do Tribálio. (A) Os embriões são mostrados ao longo de quatro direções durante a gastruação, pouco antes do fechamento da janela serosa. (B) Os embriões são mostrados ventricamente durante um período de 01:30 h (a partir de um período total de imagem de 118:00 h). O ajuste da imagem foi realizado com valores mínimos e máximos apresentados idênticos, não foi realizada correção dinâmica de intensidade ao longo do tempo. Os metadados para os conjuntos de dados tribolium podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1. Os conjuntos de dados foram sincronizados com o estágio mostrado em (A). ZA, Z projeção máxima com ajuste de imagem. Barra de escala, 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| combinação | Lógica | Lente de iluminação | Lente de detecção | câmera | referência |
| #1 | embrião inteiro no nível celular, grande espaçamento de pixels (pequeno volume de dados) | 2,5× abertura numérica de ampliação 0,06 (ar) | 10× abertura numérica de ampliação 0.3 (mergulho de água) | CCD com 1,4 megapixels (1392×1040, 6,45 μm de arremesso) | este estudo, Drosophila41, Tribolium20,41 |
| #2 | embrião inteiro no nível celular/subcelular, espaçamento de pequenos pixels (grande volume de dados) | 2,5× abertura numérica de ampliação 0,06 (ar) | 20× abertura numérica de ampliação 0,5 (mergulho de água) | sCMOS com 5,5 megapixels (2560×2160, 6,5 μm de arremesso) | Tribolium9 |
| #3 | regiões específicas do embrião no nível subcelular ou aplicações especializadas, por exemplo, imagens vivas de bandaminas dissecadas42,43 | 5.0× abertura numérica de ampliação 0.16 (ar) | 40× abertura numérica de ampliação 0,75 (mergulho de água) | CCD com 1,4 megapixels (1392×1040, 6,45 μm de arremesso) | Tribípio44 |
Tabela 1: Combinações recomendadas de lente/lente de detecção/câmera para imagens ao vivo de embriões Drosophila e Tribolium usando LSFM. Todas as combinações foram empregadas com sucesso em estudos anteriores (ver linha de referência). Observe que a maioria dos LSFMs baseados em câmaras de amostra usam lentes de mergulho de água para detecção, que são projetadas principalmente para buffers de imagem com um índice refrativo de 1,33 (como água da torneira autoclavada ou outra mídia aquosa). Tampões de imagem com outros índices de refração podem ser usados40,mas isso altera certas propriedades do sistema óptico, por exemplo, a distância de trabalho.
| linha | genótipo | Expressão fluorófora |
| #01691 | y[1] w[67c23]; P{w[+mC]=Ubi-GFP.nls}ID-2; P{Ubi-GFP.nls}ID-3 | NLS-GFP sob controle do promotor de poliutilidade |
| #29724 | w[*]; P{w[+mC]=Tub84B-EGFP.NLS}3 | NLS-GFP sob controle do promotor alfa-tubulin 84B |
| #24163 | w[*]; P{w[+mC]=His2Av-EGFP.C}2/SM6a | Variante histona rotulada por EGFP em todas as células |
Tabela 2: As três linhas transgênicas de Drosophila utilizadas no primeiro exemplo de aplicação. A coluna "linha" refere-se ao número de ações do Bloomington Drosophila Stock Center (bdsc.indiana.edu).
Vídeo suplementar 1: Imagem ao vivo de fluorescência comparativa de um embrião cada um das linhas de #01691, #29724 e #24163 transgênicas de Drosophila. Cada linha transgênica expressa o EGFP/GFP localizado nuclear sob o controle de um promotor presumivelmente onipresente e constitutivamente ativo. ZA, Z projeção máxima com ajuste de imagem. Não foi realizada correção dinâmica de intensidade ao longo do tempo. ZA, Z projeção máxima com ajuste de imagem. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo suplementar 2: Imagem ao vivo de fluorescência comparativa de um embrião cada um das sublines Zen1'LA-mE #1, #2 e #3 sublines transgênicos do Tribálium. Cada subline transgênica expressa o Lifeact rotulado por mEmerald sob controle do promotor zerknüllt 1, um fator de transcrição envolvido na especificação serosa. Por favor, note que o embrião zen1'LA-mE #1 gira aproximadamente 90° dentro do serosa logo após o fechamento da janela serosa. Os conjuntos de dados foram sincronizados com o estágio mostrado na Figura 4A. O ajuste da imagem foi realizado com valores mínimos e máximos apresentados idênticos, não foi realizada correção dinâmica de intensidade ao longo do tempo. Os embriões são mostrados de forma ventricamente e lateral durante um período de 48:00 h. ZA, projeção máxima Z com ajuste de imagem. Clique aqui para baixar este vídeo.
Arquivo complementar 1: Script de processamento de lote FIJI para o cálculo automatizado de projeções máximas z de todas as pilhas z dentro de uma pasta. O script pode ser aberto em FIJI via arrastar e soltar. No início ("Executar") apenas a pasta de entrada deve ser especificada. A subpasta de saída ("Z Maximum Projections") é criada automaticamente. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela suplementar 1: Metadados e parâmetros para os conjuntos de dados de imagem ao vivo de longo prazo DS0001-6. Clique aqui para baixar esta tabela.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uma das áreas de aplicação exclusivas dos LSFMs é a biologia do desenvolvimento. Nesta disciplina, é importante olhar para espécimes vivos, caso contrário, processos morfogenéticos não podem ser descritos de forma dinâmica. Uma estrutura experimental para a imagem ao vivo simultânea em LSFMs baseados em câmara de amostras, como descrito aqui, é conveniente por duas razões principais.
A variância ambiente, que é inevitável em imagens vivas sequenciais, pode ser tratada proativamente. Em imagens vivas associadas a embriões de insetos, vemos, por exemplo, as seguintes suscetibilidades. As culturas de coleta de ovos podem ter idades diferentes no momento da coleta de embriões. Em Drosophila,foi demonstrado que isso afeta as qualidades da prole45. Embora trabalhar com culturas adequadamente dessincronizadas seja uma opção, a imagem simultânea com culturas sincronizadas é consideravelmente mais conveniente. Tanto os resultados representativos baseados em Drosophila- quanto os de Triboliumderivam de culturas sincronizadas de coleta de óvulos, e podemos excluir com confiança que as diferentes características da fluorescência são um efeito não intencional da senescência parental.
A descorionação é um passo crucial, pois a exposição prolongada ao hipoclorito de sódio diminui a viabilidade do embrião. Inconvenientemente, a força iônica do hipoclorito de sódio diminui com o tempo. Medições da força iônica são possíveis46,mas trabalhosas e complicadas. Em imagens ao vivo simultâneas, uma mistura mestra pode ser usada para todas as linhas e/ou condições durante a preparação das placas de 6 poços associadas à descorção.
Mesmo em laboratórios com ar condicionado eficiente, pequenas mas irregulares flutuações de temperatura são inevitáveis e também afetam LSFMs baseados em câmara de9 amostras controladas pela temperatura. Em imagens ao vivo simultâneas, essas flutuações também ocorrem, mas afetam todos os embriões da mesma forma.
Do ponto de vista prático, um protocolo para imagens simultâneas de múltiplos embriões aumenta o rendimento. Em imagens ao vivo, a duração do processo de desenvolvimento de interesse determina quantos ensaios podem ser conduzidos dentro de um determinado período, o que é uma consideração importante quando o acesso aos LSFMs é limitado. Os principais exemplos para gravação a longo prazo são ensaios de imagem ao vivo nos quais as células são rastreadas. Tais experimentos geralmente variam por longos períodos de desenvolvimento. Enquanto o desenvolvimento embrionário de Drosophila leva apenas cerca de um dia à temperatura ambiente47, Tribolium leva cerca de sete dias48. Assim, para esta espécie, a paraleloização é essencial para permanecer dentro de um prazo razoável, especialmente em relação aos ensaios onde muitas condições são comparadas.
O throughput, ou seja, o número de embriões que são retratados simultaneamente, é limitado principalmente por dois fatores: Primeiro é o espaço disponível ao longo do eixo y dentro da câmara amostral. Quando o embrião mais baixo está prestes a ser imageado, o embrião superior não deveria ter deixado o tampão de imagem. Além disso, o suporte da teia de aranha e o sistema de suporte associado não devem ser tão longos que oscilam e/ou tremem visivelmente durante o processo de gravação da pilha z. Em segundo lugar está a resolução temporal pretendida. O tempo de gravação por embrião pode ser aproximado multiplicando o tempo de exposição por imagem bidimensional (geralmente de 10-200 ms) com o número de planos por pilha de z (geralmente várias centenas), o número de canais (usual entre um e três), o número de direções (geralmente entre um e oito) e um fator dependente de configuração para os movimentos de tradução e rotação (estimado entre 1,2 e 1,5). A razão da resolução temporal pretendida e o tempo de registro por embrião indicam o número máximo de embriões que podem ser imagens simultaneamente. Em resumo, nosso protocolo é apropriado para avançar de imagens ao vivo sequenciais para rendimento médio, mas não adequado para o que é geralmente considerado como alta produtividade. Para este último, LSFMs adequados para slides de microscópio49,50,51 ou placas de poço52 podem ser considerados, mas essas implementações geralmente têm outras limitações.
Dependendo da questão experimental e, portanto, da combinação de lente/lente de detecção/câmera de iluminação em conjunto com os parâmetros de imagem, conjuntos de dados LSFM simultaneamente visualizados podem exigir vasto espaço de armazenamento em seu estado bruto. Esta questão pode ser melhor ilustrada considerando os conjuntos de dados de exemplo de Drosophila fornecidos (Tabela Suplementar 1), ou seja, DS0001-3. Cada imagem bruta bidimensional tinha um volume de dados de cerca de 2,8 Megabytes, cada pilha z bruta consistia de 120 planos, e todos os três embriões foram registrados ao longo de quatro direções um total de 143 vezes. Em consequência, os conjuntos de dados brutos ocuparam cerca de meio Terabyte. Através do processamento de dados de imagem, ou seja, o corte ao longo de todas as dimensões espaciais (Passo 9) em conjunto com a compressão baseada em ZIP, o volume de dados foi reduzido para 53,3 Gigabyte, o que representa cerca de 10% da quantidade inicial. Para processar conjuntos de dados no regime terabyte, o plugin BigDataViewer53, que é pré-instalado em FIJI (Plugins | BigDataViewer), é recomendado.
Além dos cinco cenários descritos na seção Resultados Representativos, nosso protocolo também pode ser usado para caracterizar o efeito dos efeitos de knockdown da RNAi, que é uma abordagem popular no Tribolium54. No entanto, é apenas de uso limitado para a análise de compostos (por exemplo, inseticidas ou outros estressores bioquímicos) se estes devem ser aplicados através do tampão de imagem – que é a abordagem mais simples – já que a imagem simultânea de um embrião de controle não é possível.
Demonstramos nosso protocolo usando um de nossos microscópios personalizados8,55, mas é aplicável a qualquer configuração baseada em câmara de amostra, por exemplo, OpenSPIM56 ou a maioria dos LSFMs comerciais. Este protocolo complementa a iniciativa de estabelecimento de recursos associada à LSFM que visa incentivar os novatos a integrar ativamente a tecnologia baseada em folha de luz em seus planos de pesquisa. A maioria das universidades e institutos hoje em dia opera instalações de microscopia de fluorescência bem equipadas57. Estes geralmente fornecem acesso a um ou mais LSFMs baseados em câmara, mas não se pode esperar que a equipe tenha as soluções experimentais adequadas para cada questão científica em questão.
Nossos resultados mostram que nossa estrutura experimental é adequada para Drosophila e Tribolium. Estamos confiantes de que nosso protocolo focado em comparação pode ser usado para estudar a embriogênese de outras espécies de insetos. Por exemplo, uma abordagem baseada em LSFM foi aplicada para comparar o desenvolvimento do tipo selvagem e knockdown na mosca scuttle Megaselia abdita58, e estudos de acompanhamento também se beneficiariam do nosso método de montagem. Além disso, linhas transgênicas do bimaculatus de críquete de dois pontos Gryllus especificamente projetado para fluorescência ao vivo de imagem59 estão disponíveis, mas o único protocolo focado em comparação60 atualmente é destinado a microscópios invertidos convencionais e, portanto, não aborda aquisição de imagem tridimensional ou rotação de amostras. Além disso, já foi demonstrado que o suporte da teia de aranha é uma escolha conveniente para o zebrafish, cujos embriões mudam consideravelmente sua forma durante a embriogênese61. Uma adaptação do nosso protocolo, que não requer basicamente nenhum esforço de otimização, forneceria as vantagens acima descritas também para este organismo modelo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Ernst H. K. Stelzer pela oportunidade de usar seus recursos, bem como seus valiosos comentários sobre o manuscrito, Anita Anderl pelo apoio com a imagem ao vivo do Tribolium, Sven Plath pelo apoio técnico, bem como Ilan Davis, Nicole Grieder e Gerold Schubiger por compartilharem suas linhas transgênicas de Drosophila através do Bloomington Stock Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100 µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
References
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
- Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
- Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
- Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
- El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
- Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
- Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
- Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
- Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
- Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
- Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
- Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
- Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
- Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
- Mcdonald, J. H. Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , Sparky House Publication. (2013).
- Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
- Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
- Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
- Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
- He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
- Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
- Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , Springer. (1997).
- Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
- McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
- Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
- Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
- Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
- Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).
