Summary
Lysarkbaseret fluorescensmikroskopi er det mest værdifulde værktøj inden for udviklingsbiologi. Et vigtigt spørgsmål i sammenlignende undersøgelser er variansen i omgivelserne. Vores protokol beskriver en eksperimentel ramme for samtidig live billeddannelse af flere prøver og behandler derfor dette problem proaktivt.
Abstract
Lysarkbaseret fluorescensmikroskopi tilbyder effektive løsninger til at studere komplekse processer på flere biologisk relevante skalaer. Prøvekammerbaserede opsætninger, der er specielt designet til at bevare prøvens tredimensionelle integritet og normalt har prøverotation, er det bedste valg inden for udviklingsbiologi. For eksempel er de blevet brugt til at dokumentere hele den embryonale morfogenese af frugtfluen Drosophila melanogaster og den røde melbille Tribolium castaneum. Mange tilgængelige protokoller for levende billeddannelse giver dog kun eksperimentelle rammer for enkelte embryoner. Især for sammenlignende undersøgelser er sådanne tilgange ubelejlige, da sekventielt afbildede prøver påvirkes af omgivende varians. Desuden begrænser dette antallet af prøver, der kan analyseres inden for en given tid. Vi tilbyder en eksperimentel ramme for samtidig live billeddannelse, der øger gennemstrømningen i prøvekammerbaserede opsætninger og dermed sikrer lignende omgivende forhold for alle prøver. For det første giver vi en kalibreringsretningslinje for lysark fluorescensmikroskoper. For det andet foreslår vi en monteringsmetode for flere embryoner, der er forenelig med prøverotation. For det tredje leverer vi eksemplariske tredimensionelle live imaging datasæt af Drosophila, som vi sidestiller tre transgene linjer med fluorescerende mærket kerner, såvel som af Tribolium, for hvilke vi sammenligner udførelsen af tre transgene underlinjer, der bærer den samme transgener, men på forskellige genomiske steder. Vores protokol er specielt designet til sammenlignende undersøgelser, da den proaktivt adresserer omgivende varians, som altid er til stede i sekventiel live billeddannelse. Dette er især vigtigt for kvantitative analyser og karakterisering af aberrationelle fænotyper, som f.eks. Desuden øger det den samlede gennemløb, hvilket er meget bekvemt, når adgangen til lysark fluorescens mikroskoper er begrænset. Endelig kan den foreslåede monteringsmetode tilpasses andre insektarter og yderligere modelorganismer, f.eks.
Introduction
Fluorescensmikroskopi er en af de mest essentielle billeddannelsesteknikker inden for biovidenskab, især i celle- og udviklingsbiologi. I confocal fluorescens mikroskoper1, som er state-of-the-art for tre-dimensionelle fluorescens billeddannelse siden midten af 1990'erne, den samme linse bruges til fluorophore excitation og emission lys afsløring. Belysningslaserstrålen ophidser alle fluorophorer langs belysnings-/detektionsaksen, og det respektive signal uden for fokus skelnes, inden det registreres af et pinhole. Derfor er hele prøven for hvert todimensionelt billede belyst. Derfor, for hver tre-dimensionelle billede, dvs en stak rumligt fortløbende to-dimensionelle billeder, hele prøven er belyst flere dusin til et par hundrede gange2, som fremmer photobleaching og fototoksicitet3.
For næsten tyve år siden fremstod lysarkbaseret teknologi4 som et lovende alternativ til tredimensionel fluorescensbilleddannelse og blev dermed et værdifuldt værktøj i udviklingsbiologi5. I denne tilgang afkobles belysning og detektion. Belysningslinsen bruges til at generere et lysark med en dybde på kun få mikrometer inden for brændplanet for den vinkelret arrangerede detektionslinse. Derfor er der for hvert todimensionelt billede kun et tyndt planarvolumen omkring brændplanet, der belyses. Derfor belyses hele prøven kun én gang for hvert tredimensionelt billede, hvilket stærkt reducerer fotobleaching og fototoksicitet6. Af denne grund tilbyder lysplade fluorescensmikroskoper (LSFMs) effektive løsninger til at studere komplekse processer på flere biologisk relevante skalaer og er derfor af særlig værdi i udviklingsbiologi, hvor prøver så store som flere millimeter skal analyseres på subcellulært niveau.
Historisk set har LSFMs været prøve kammer-baserede7,8. I disse opsætninger er belysnings- (x) og detektionsakserne (z) normalt arrangeret vinkelret på tyngdekraftsaksen (y). Prøvekamre giver rigelig eksperimentel frihed. For det første giver de en stor billedbufferkapacitet, hvilket igen letter brugen af et perfusionssystem til at kontrollere miljøet, f.eks. Desuden understøtter de tilpassede monteringsmetoder10, der er skræddersyet til de respektive eksperimentelle behov, samtidig med at de bevarer prøvens tredimensionelle, i nogle tilfælde dynamiske11, integritet. Derudover er prøvekammerbaserede opsætninger normalt udstyret med en rotationsfunktion, der bruges til at dreje prøverne omkring y-aksen og dermed afbilde dem langs to, fire eller endnu flere retninger. Da embryoner af almindeligt anvendte modelorganismer i forbindelse med mikroskopi er relativt store, giver successive billeder langs ventral-dorsale, laterale og/eller forreste bageste kropsakser en mere omfattende repræsentation. Dette giver f.eks. mulighed for langsigtet sporing af celler, der bevæger sig langs komplekse tredimensionale overflytningsstier12,13.
Lysarkbaseret fluorescensmikroskopi er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere Drosophila melanogastersembryonale morfose , både systematisk14,15 samt med et specifikt fokus på de biofysiske aspekter af udvikling. For eksempel blev det brugt til at indsamle morfogenetiske data i høj opløsning for at opdage en biomekanisk forbindelse mellem endoderm invagination og akseudvidelse under kimbåndsforlængelse16 og yderligere for at relatere det komplekse cellulære flow med kraftgenereringsmønstre under gastrulation17. Det er også blevet kombineret med andre state-of-the-art teknikker, f.eks optogenetics at undersøge reguleringen af Wnt signalering under forreste-posterior mønstre i epidermis18.
Men at studere kun en art giver ikke indsigt i udviklingen af udviklingen. For at forstå embryogenese i den fylogenetiske kontekst er der udført intensiv forskning med alternative insektmodelorganismer. En af de mest omfattende undersøgte arter er den røde melbille Tribolium castaneum, et økonomisk relevant opbevaret korn skadedyr19, hvis embryonale morfogenese også allerede er blevet systematisk afbildet med LSFM20. Den embryonale morfogenese af disse to arter adskiller sig bemærkelsesværdigt i flere aspekter,f.eks. Sidstnævnte aspekt er allerede blevet grundigt analyseret ved hjælp af LSFMs. For eksempel har det vist sig, at serosa, et ekstra embryonalt væv, der omslutter og beskytter Tribolium-embryoet mod forskellige farer for det meste af dets embryogenese23,24, også fungerer som den morfogenetiske "driver" til sin egen tilbagetrækningsproces under dorsal lukning25. Endvidere er det blevet påvist, at en bestemt region af blastoderm under gastrulation forbliver forankret i vitellinemembranen for at skabe asymmetriske vævsbevægelser26 og efter denne observation, at regionaliseret vævsvæske gør det muligt for celler at sekventielt forlade serosakanten under serosavinduelukning27.
I alle ovennævnte Drosophila-og Tribolium-relateredeundersøgelser er der anvendt prøvekammerbaserede LSFMs. I de fleste blev embryonerne registreret i flere retninger ved hjælp af prøverotationsfunktionen. Selvom det ikke udtrykkeligt er angivet, kan det antages, at de er blevet registreret individuelt og dermed uafhængige af hinanden i sekventielle live billedanalyseanalyser, svarende til vores tidligere arbejde med Tribolium20,28. I visse scenarier er en sådan fremgangsmåde acceptabel, men især i kvantitative komparative tilgange kan variansen fordreje resultaterne. For eksempel har det længe været kendt, at insekternes udviklingshastighed er temperaturafhængig29, men en nyere undersøgelse tyder yderligere på, at temperaturen i Drosophilaogså kan påvirke koncentrationen af morfogener30. Hvis visse karakteristika ved embryogenese, f.eks. Dette minimerer standardafvigelser og standardfejl, hvilket igen letter sammenstilling med andre, selv bare marginalt divergerende eksperimentelle forhold.
Prøvekammerbaserede LSFM'er er dog primært designet til højt indhold i stedet for høje gennemløbsanalyser. I modsætning til konfokale mikroskoper, som typisk er udstyret med standardiserede klemmemekanismer til mikroskopidias, petriskåle og brøndplader, bruger næsten alle prøvekammerbaserede LSFM'er cylinderbaserede klemmemekanismer. Disse mekanismer er beregnet til specialfremstillede prøveholdere , der er rotationskompatible såvel som ikke-invasive10, men som normalt ikke er designet til mere end én prøve20,31,32. En ramme for samtidig levende billeddannelse af to eller flere embryoner, hvor fordelene ved prøvekammerbaserede opsætninger ikke kompromitteres, tager fat på spørgsmålet om omgivende varians og øger dermed værdien af LSFM'er til sammenlignende undersøgelser.
I vores protokol præsenterer vi en eksperimentel ramme for sammenlignende levende billeddannelse i prøvekammerbaserede LSFM'er (Figur 1A), hvor y-aksen bruges som en mulighed for at "stable" embryoner. For det første leverer vi en fluorescerende mikrosfærebaseret kalibreringsretningslinje for prøvekammerbaserede LSFM'er, hvilket er særligt vigtigt for instrumenter, der mangler en kalibreringsassistent. For det andet beskriver vi en monteringsmetode for flere embryoner baseret på spindelvævsholderen28 (Figur 1B),der er kompatibel med prøverotation og dermed giver mulighed for samtidig billeddannelse af flere prøver langs flere retninger (Figur 1C). Flere embryoner er justeret oven på en tynd agarosefilm og flyttede efter indsættelse i prøvekammeret successivt gennem lysarket for at erhverve tredimensionelle billeder. For det tredje leverer vi tre eksemplariske live billeddatasæt til Drosophila såvel som til Tribolium. For førstnævnte sidestiller vi transgene linjer med fluorescerende mærkede kerner. For sidstnævnte sammenligner vi ydeevnen af transgene underlinjer, der bærer den samme transgen, men på forskellige genomiske steder. Endelig diskuterer vi betydningen af parallelisering med hensyn til sammenlignende levende billeddannelse og omgivende varians33, diskuterer gennemløbsgrænsen for vores eksperimentelle ramme og evaluerer tilpasningen af vores tilgang til andre modelorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedende arbejde
- Vælg en belysning linse / detektion linse / kamera kombination for LSFM, der passer til det videnskabelige spørgsmål og oprette mikroskop. Størrelsen af synsfeltet er kvotienten af kamerachip størrelse og forstørrelse af detektionslinsen. Belysningslinsen skal vælges, så hele synsfeltet er dækket af et nogenlunde planar lysark34. Tre anbefalede kombinationer er anført i tabel 1.
- For at forberede agarose aliquots og hentning retter, tilsæt 2 g lav-smelte agarose til 200 mL autoklaveret vand fra hanen og varme blandingen i en mikrobølgeovn ved 600-800 W, indtil alle agarose partikler er opløst. Forbered flere 1 mL agarose aliquots i 1,5 mL eller 2 mL reaktionsrør, og fyld derefter flere 90 mm Ø Petri retter 3-5 mm høje med agarose. Størknede aliquots og retter opbevares ved 4 °C.
- Til Drosophila: For at tilberede friske opdrætsglas skal der koges en tilstrækkelig mængde specialfremstillet eller kommercielt tilgængeligt Drosophila-medium, overføres 5-15 mL til brede hætteglas og opbevares ved 4 °C. For at forberede æglægningsretter tilsættes 1 g lavsmeltnings agarose til 50 mL autoklaveret postevand og opvarmes blandingen i en mikrobølgeovn ved 600-800 W, indtil alle agarosepartikler er opløst. Lad blandingen køle af til 45 °C, tilsæt derefter 50 mL frugtsaft (helst æble eller rød drue) og bland grundigt. Blandingen hældes i 35 mm Ø Petri-retter, og der opbevares størkne æglægningsretter ved 4 °C.
- Til tribolium: For at forberede vækstmediet skal du passere hele hvedemel samt inaktiv tørgær gennem en 710 μm maskestørrelsesigte og derefter supplere det sigtemel med 5% (w / w) sigtet gær. For at forberede æglægningsmediet skal du passere fint hvedemel samt inaktiv tørgær gennem en 250 μm maskestørrelsesigte og derefter supplere det sigtemel med 5% (w / w) sigtet gær.
2. Kalibrering af prøvekammerbaserede LSFM'er ved hjælp af fluorescerende mikrosfærer
BEMÆRK: Formålet med kalibreringen er at justere brændpunkterne for belysnings- og detektionslinserne (Figur 2A), da dette er forudsætningen for klare billeder. LSFMs skal kalibreres regelmæssigt, mindst en gang hver 3-4 uger.
- Flydende en agarose aliquot i en tør blokvarmer/mixer ved 80 °C, og lad derefter agarose aliquot køle af til 35 °C.
- 50 μL agarose overføres til et 1,5 ml reaktionsrør, og der tilsættes 0,5 μL fluorescerende mikrosfæreopløsning. Bland ved 1.400 omdrejninger i minuttet i 1 minut.
- Spindelvævsholderens slidsede hul fyldes med 10 μL agarose/fluorescerende mikrosfæreopløsningsblanding, hvorefter der aspireres så meget agarose som muligt, indtil der kun er en tynd agarosefilm tilbage. Vent 30-60 s for størkning.
- Fyld prøvekammeret med autoklaveret postevand. Sæt spindelvævsholderen langsomt ind i prøvekammeret, og flyt det slidsede hul med mikrotranslationsstadierne foran detektionslinsen.
- Spindelvævsholderen roteres med rotationsstadiet til en position på 45° i forhold til belysnings- (x) og detektionsakserne (z). Spindelvævsholderen må ikke være synlig i transmissionslyskanalen.
- Skift til den respektive fluorescenskanal, og juster lasereffekten samt eksponeringstiden, så fluorescerende mikrosfærer giver et korrekt signal.
- Angiv et synsvolumen, der dækker den nu tværgående orienterede agarosefilm fuldstændigt. Definer z-afstanden ved at beregne den maksimalt mulige aksiale opløsning for den respektive kombination af belysningslinse/detektionslinse34. Alternativt kan 4 gange sideopløsningen bruges som en grov tilnærmelse.
- Optag en tredimensionel test z-stak af fluorescerende mikrosfærer, og sammenlign de maksimale fremskrivninger x, y og z med kalibreringsdiagrammet (Figur 2). Hvis mikrosfærerne fremstår slørede, fuzzy og/eller forvrængede (Figur 2B,C), justeres belysnings- og/eller detektionslinsens positioner.
3. Indsamling af Drosophila embryoner
- Overfør 100-200 voksne af Drosophila linje valg til en frisk opdræt hætteglas 2-3 dage før billeddannelse analyse for at etablere et æg indsamling kultur. Hvis det endnu ikke eksisterer, overveje at bruge den gamle opdræt hætteglas til at starte en afkom kultur. For at sikre, at voksne ikke er mere end to uger gamle, skal embryokollektionskulturen erstattes i tide med afkomkulturen.
- Varm en æglægningsskål til stuetemperatur og tilsæt en dråbe gærpasta oven på agaren.
- Overfør de voksne fra ægopsamlingskulturen til et tomt smalt hætteglas og læg det oven på æglægningsskålen. Inkuber ægopsamlingsopsætningen ved stuetemperatur i 15 minutter. Undgå anæstesi (kold, CO2) i dette trin, hvis det er muligt.
- Sæt de voksne tilbage i opdrætsglasset. Inkuber æglægningsskålen ved en bekvem temperatur/tidskombination, og overfør derefter 10-20 embryoner med en lille pensel fra æglægningsskålen til en 100 μm cellefødde med maskestørrelse. Kassér æglægningsskålen.
- Gentag trin 3.1 til 3.4 for hver Drosophila-linje.
4. Indsamling af triboliumembryoner
BEMÆRK: For nemheds skyld er der fastsat en ordning for indsamling af triboliumæg (figur 3A), som også tallene i parentesen i dette trin henviser til.
- Overførsel 200-300 voksne (ca. 400-700 mg) af Tribolium linje valg til en tom 1 L glasflaske 2-10 dage før billeddiagnostik analyse for at etablere et æg indsamling kultur(Figur 3A_01). Fyld flasken med 50-100 g frisk vækstmedium. Hvis det endnu ikke eksisterer, overveje at starte en afkom kultur ved hjælp af tilgængelige larver og pupper. For at sikre, at voksne ikke er mere end 3 måneder gamle, skal ægopsamlingskulturen erstattes i tide med afkomkulturen.
- Ægopsamlingskulturen overføres gennem en sigte med en maskestørrelse på 800 μm(figur 3A_02). Tilbagefør vækstmediet, som indeholder ikke-iscenesatte embryoner, til den oprindelige flaske (figur 3A_03) og overfør voksne til en tom 1 L-glasflaske (figur 3A_04). Der tilsættes 10 g æglægningsmedium (figur 3A_05) og ægopsamlingen inkuberes ved stuetemperatur i 1 time (figur 3A_06,07).
- Pas ægopsamlingsopsætningen gennem 800 μm maskestørrelsessigten (figur 3A_08). Tilbagevendte voksne til deres oprindelige flaske(figur 3A_09). Afhængigt af den udviklingsproces, der skal afbildes, inkuberes æglægningsmediet, som nu indeholder ca. 30-100 embryoner, ved en bekvem temperatur / tidskombination (Figur 3A_10).
- Æglægningsmediet overføres gennem 300 μm maskestørrelsessigten (figur 3A_11) og embryonerne ( figur3A_12)overføres til en cellestister med en maskestørrelse på 100 μm. Kassere det sigteæglæggende medie (figur 3A_13).
- Gentag trin 4.1 til 4.4 for hver Tribolium-linje.
5. Natriumhypochloritbaseret dechorionation
BEMÆRK: Både Drosophila og Tribolium embryoner er dækket af en chorion, en beskyttende og stærkt lys-spredning protein lag, der ikke er afgørende for en ordentlig udvikling, så længe embryoner holdes fugtige efter fjernelse. Dechorionationsprotokollen for embryoner af begge arter er identisk.
- Forbered en 6-brønds plade ved at fylde A1-, A2-, A3- og B3-brøndene med 8 ml autoklaveret postevand og B1- og B2-brøndene med 7 ml autoklaveret postevand og 1 ml natriumhyperchloritopløsning (NaOCl)(Figur 3B). Overhold dechorionationsprocessen under et stereomikroskop, ideelt i transmissionslys.
ADVARSEL: Natriumhypochlorit er ætsende. - Den embryoholdige cellesien (trin 3.4 og/eller 4.4) indsættes i den A1-brønd, og embryonerne vaskes ca. 30-60 s under skånsom omrøring.
- Flyt cellesien til B1-brønden og ryst pladerne kraftigt i 30 s, overfør den derefter til A2-brønden og vask embryonerne i 1 minutter under blid omrøring.
- Flyt cellesien til B2-brønden, ryst pladen kraftigt, indtil de fleste embryoner er helt dechorionerede (Figur 3C), overfør den derefter til A3-brønden og vask embryonerne i 1 minutter under blid omrøring.
- Opbevar cellesien i B3-brønden, før monteringsproceduren fortsættes.
- Gentag trin 5.1 til 5.5 for hver linje.
6. Montering af flere embryoner ved hjælp af spindelvævsholderen
- Flydende en agarose aliquot i en tør blokvarmer/mixer ved 80 °C, og lad derefter agarose aliquot køle af til 35 °C.
- Rør 10 μL agarose oven på spindelvævsholderens slidsede hul. Med pipettespidsen spredes agarose over det slidsede hul og aspirerer derefter så meget agarose som muligt, indtil der kun er en tynd agarosefilm tilbage. Vent 30-60 s for størkning.
- For hver linje skal du omhyggeligt vælge et eller flere embryoner med en lille pensel og placere dem på agarosefilmen.
- Arranger embryonerne langs den lange akse i det slidsede hul, og juster derefter også deres forreste bageste akse med den lange akse i det slidsede hul (Figur 3D).
- Embryonerne stabiliseres omhyggeligt ved at pipetter 1-2 μL agarose ind i mellemrummet mellem embryonerne og agarosefilmen. Vent 30-60 s for størkning.
- Sæt spindelvævsholderen med de monterede embryoner langsomt ind i det billedbufferfyldte prøvekammer.
7. Sammenlignende levende billeddannelse i prøvekammerbaserede LSFM'er
- Flyt et af embryonerne med mikrotranslationsstadierne foran detektionslinsen. Sørg for, at spindelvævsholderen er i en position på 45° i forhold til belysningsakserne (x) og detektionsakserne (jf. figur 1C).
- I transmissionslyskanalen skal du flytte embryoet ind i midten af synsfeltet. Spindelvævsholderen må ikke være synlig.
- Flyt embryoet med mikrotranslationsstadierne i z, indtil embryoets mellemplan overlapper med brændplanet, dvs. indtil konturen vises skarp. Uden at skifte til lysstofrøret skal du angive synsvolumenet ved at flytte 250 μm væk fra mellemplanen i begge retninger.
- Hvis billeddannelse i flere retninger er påkrævet, kan du eventuelt rotere embryoet korrekt og gentage trin 7.2 og 7.3. Spindelvævsholderen understøtter op til fire retninger i trin på 90°.
- Gentag trin 7.1 til 7.3 (eller 7.4) for alle andre embryoner monteret på spindelvævsholderen (Figur 3E). Sørg for, at det øverste embryon ikke forlader billeddiafferen, når det nederste embryo er foran detektionslinsen.
- Definer fluorescenskanalen (lasereffekt, eksponeringstid, registreringsfilter) og tidsforskydningsparametre (interval, samlet varighed), og start billedprocessen. For vejledende værdier henvises til metadatatabellen for eksempeldatasættene (supplerende tabel 1). For assays, der varer flere dage, overveje at dække prøvekammeret åbning i det mindste delvist for at reducere fordampning.
8. Genfinding og yderligere dyrkning af afbildede embryoner
- Når billedanalysen er afsluttet, skal du forsigtigt fjerne spindelvævsholderen fra prøvekammeret.
- Tag embryonerne ud af agarosefilmen med en lille pensel, og overfør dem til et korrekt mærket mikroskopdias. Placer rutsjebanen i en hentningsskål, og inkuber under de respektive standardopdrætsforhold.
- Med hensyn til de eksperimentelle modaliteter, skøn, når embryogenese er afsluttet. Når udklækningstidspunktet nærmer sig, skal du kontrollere hentningsretterne ofte og overføre udklækkede Drosophila larver til individuelle opdrætsglas og Tribolium larver til individuelle brønde af en 24-brønds plade. Fyld brøndene op til halvdelen med vækstmedium. Inkuber under de respektive standardopdrætsbetingelser.
- Når de observerede personer er voksne, skal du give dem en passende parringspartner og kontrollere for afkom efter flere dage.
9. Billeddatabehandling og metadatadokumentation
BEMÆRK: Til billeddatabehandling anbefales imagej-afledningen fiji35 (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI kræver ikke installation, og 32- samt 64-bit versioner er tilgængelige. Et af de hyppigst anvendte formater til LSFM-data er TIFF (TAGGED Image File Format), som gør det muligt at lagre billedstakke i form af en TIFF-objektbeholder.
- Beregn z-maksimumfremskrivningerne for alle z-stakke(Billede | Stakke | Z Project, vælg Maks. De maksimale fremskrivninger er dataforenklingsmetoder, der reducerer antallet af rumlige dimensioner fra tre til to. Der findes et FIJI-script til batchafvikling (Supplerende fil 1).
- Sammenkæde de respektive z maksimale fremskrivninger for at oprette tidsstakke (t stakke). Gem disse i én TIFF-objektbeholder. Gør dette for alle registrerede embryoner samt de respektive retninger og fluorescenskanaler, hvis det er relevant.
- Roter z- og t-stakken rundt om z-aksen for at justere embryonernes forreste bageste akse med x- eller y-billedaksen (Billede | Transformer | Roter). Beskær z-stakkene langs alle tre billedakser og t-stakken i x- og y-billedakserne, så der kun er minimal bufferplads (20-40 pixel langs x- og y-akserne, 5-10 billeder langs z-aksen) omkring embryoet forbliver(Billede | Juster | Lærredsstørrelse for x- og y-akserne, billed- | Stakke | Værktøj | Skive keeper for z-aksen).
- Gør dette individuelt for alle registrerede embryoner samt de respektive retninger, hvis det er relevant. Fluorescenskanaler bør, hvis det er relevant, behandles med identiske rotations- og beskæringsparametre.
- Dokumenter metadataene så detaljeret som muligt. Som retningslinje kan metadatatabellen for eksempeldatasættene, som findes i afsnittet Repræsentative resultater, bruges (Supplerende tabel 1).
10. Datavisualisering
BEMÆRK: Denne datavisualiseringsretningslinje fokuserer primært på oprettelsen af z maksimale projektionsbilledmatrixer, der viser flere registrerede embryoner langs flere retninger og / eller over tid. Følgende trin beskriver den datavisualiseringsprocedure, der blev anvendt på eksempeldatasæt til oprettelse af de viste tal og videoer, der er knyttet til afsnittet Repræsentative resultater.
- Kombiner t stakke med flere retninger(Billede | Stakke | Værktøj | Kombiner) og/eller flet flere lysstofkanaler(| Farve | Flettekanaler) for at visualisere den biologiske struktur og/eller processen af interesse.
- Justere intensiteten af t-stakke(Billede | Juster | Lysstyrke/kontrast) efter behov ved hjælp af funktionen "Set". Den viste minimumværdi skal indstilles lidt over baggrundssignalet, den maksimale viste værdi skal resultere i en bekvem kontrast. Dokumenter begge værdier, da de kan bruges til en ensartet justering af de respektive z-stakke. Aftryksjusteringer ved hjælp af funktionen "Anvend". Afhængigt af de eksperimentelle metoder skal du overveje at behandle alle registrerede embryoner med identiske værdier.
- Gem intensitetsjusterede t-stakke som separate filer, og oversæt ikke de ikke-justerede t-stakke. Kompiler passende understakke fra de justerede t-stakke med dedikerede billedvalgsfunktioner (f.eks. billede | Stakke | Værktøj | Slice Keeper) og bruge montageværktøjet (Billede | Stakke | Lav Montage) for at oprette billedgitter, der kan bruges til figurdesign.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores protokol beskriver en eksperimentel ramme for sammenlignende fluorescens levende billeddannelse i prøvekammer baseret LSFMs. F.eks. kan rammen anvendes til at sidestille i) embryoner af to eller flere arter, ii) embryoner af linjer, hvor et eller flere gener er slået ud, plus kontrol af vildtype, iii) flere embryoner af samme transgene linje, iv) embryoner fra forskellige transgene linjer eller v) embryoner fra underlinjer, der bærer samme transgene , men på forskellige genomiske steder. I dette afsnit giver vi eksempler på de sidste to scenarier.
I vores første eksemplariske ansøgning viser vi fluorescenssignaldynamikken i tre embryoner, der stammer fra forskellige transgene Drosophila-linjer (tabel 2)over en periode på ca. 1 dag (Figur 4, Supplerende film 1). For disse linjer forventede vi temmelig ens fluorescensmønstre, da de alle udtrykker nuklear lokaliseret EGFP/GFP under kontrol af forskellige formentlig allestedsnærværende og konstituerende aktive initiativtagere. Men vores komparative live billeddannelse resultater viser, at der er stærke spatiotemporal forskelle i udtrykket mønstre, der er bestemt ikke sekundære virkninger på grund af omgivende varians.
I vores andet applikationseksempel sammenligner vi udførelsen af tre embryoner, der stammer fra AGOC{Zen1'#O(LA)-mEmerald} #1, #2 og #3 (Zen1'LA-mE #1, #2 og #3, henholdsvis) transgene Tribolium-underlinjer 36. Alle disse bærer den samme piggyBac-baserede transgene, der fører til udtryk for mEmerald-forbundet37 Lifeact38 under kontrol af zerknüllt 139 promotor, en transskribering faktor involveret i serosa specifikation. Vores komparative live billeddannelse resultater, som illustrerer serosa vindue lukning proces under gastrulation, tyder på, at subline #2 giver en bemærkelsesværdig stærkere samlede signal end de to andre underlinjer (Figur 5, Supplerende Movie 2). Dette indikerer, at også i Tribolium, den genomiske kontekst kan have en stærk indflydelse på udtrykket niveau af transgener, der bærer et udtryk kassette.
En vellykket hentning af alle seks embryoner, der er vist i dette afsnit, var mulig som beskrevet i trin 8 i vores protokol. Alle udviklede sig til fuldt funktionelle og frugtbare voksne(supplerende tabel 1, "Hentning" række), hvilket indikerer, at den overordnede procedure, fra dechorionation over montering til optagelse, var ikke-invasiv. Dette kvalitetskontrolniveau er afgørende, når der forventes udvikling af vilde typer, f.eks.
Alle datasæt, der blev brugt til at oprette de repræsentative resultater, leveres som ressourcer, der hjælper især LSFM-nybegyndere med at evaluere kvaliteten af deres eget arbejde. De links til overførsel baseret på digitalt objekt-id'er findes i metadatatabellen (rækken Supplementary Table 1, "Data Access").
Figur 1: Eksperimentel ramme og oversigt over monteringsmetoder. (A) Rutediagram over de ti protokoltrin med korte påmindelser og et skøn over den krævede tid. Opgaver, der er markeret med stjerner, behøver ikke at blive udført under hver analyse, men afhængigt af omstændighederne. Grønne bokse angiver trin, der er forbundet med Drosophila og / eller Tribolium, blå bokse angiver trin, der er forbundet med mikroskopi. (B)Tegning af spindelvævsholderen. Det præsenterede design er velegnet til cylinderbaserede klemmemekanismer, som almindeligvis anvendes i prøvekammerbaserede LSFMs. Specifikationerne er i millimeter. Holderen kan skaleres, så længe detektionslinsens arbejdsafstand overholdes. (C) Registreringssekvens for levende billeddannelse af flere embryoner i flere retninger. I første omgang registreres z-stakke af det øverste embryo langs op til fire retninger, dvs. 0°, 90°, 180° og 270°. Derefter flyttes embryoet nedenfor foran detektionslinsen, og optagelses-/rotationssekvensen begynder forfra. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fluorescerende mikrosfærebaseret kalibreringsdiagram for LSFMs. Diagrammet illustrerer, hvordan fluorescerende mikrosfærer forekommer i de maksimale fremskrivninger x, y og z, hvis LSFM er korrekt kalibreret (A), eller hvis der er en belysning (B) eller detektionsforskydning (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Indsamling, dechorionation, montering og billeddannelse af flere embryoner. (A)Oversigt over indsamling af triboliumembryoner. Illustrationerne er nævnt i hele trin 4 i henhold til tallene øverst til venstre. (B) Forberedelses- og overførselsordning for den 6-brønds plade, der blev anvendt under trin 5. B1- og B2-brøndene indeholdt fortyndet natriumhypochlorit (NaOCl), hvilket fremkalder dechorionation. (C) Den 100 μm celle si, som blev brugt til at overføre embryoner fra en brønd til en anden, inden for B2 godt. Den øverste detalje billedet viser et nærbillede af flere Tribolium embryoner på toppen af cellen si mesh, den nederste detalje billedet viser en transmission lys stereo mikroskop billede af flere Tribolium embryoner med delvist løsrevet chorion. D) Spindelvævsholder med tre monterede Triboliumembryoner. Embryonerne, såvel som deres forreste bageste akser, blev justeret langs den lange akse af det slidsede hul. (E) Spindelvævsholderens bevægelse i LSFM's prøvekammer under registreringen af tre embryoner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Sammenlignende fluorescens levende billeddannelse af et embryon hver fra #01691, #29724 og #24163 transgene Drosophila linjer. Embryoner vises langs to (af fire registrerede) retninger over en periode på 20:00 h (fra en samlet billeddannelsesperiode på 23:40 h). Der blev ikke udført nogen dynamisk intensitetskorrektion over tid. Metadata for Drosophila-datasættene findes i supplerende tabel 1. ZA, Z maksimal projektion med billedjustering. Skalalinje, 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Sammenlignende fluorescens levende billeddannelse af et embryon hver fra Zen1'LA-mE #1, #2 og #3 transgene Tribolium-underlinjer. (A) Embryoner vises i fire retninger under gasning lige før serosa-vindueslukning. (B) Embryoner vises ventrally over en periode på 01:30 h (fra en samlet billeddannelse periode på 118:00 h). Billedjustering blev udført med identiske minimum- og maksimumsværdier, og der blev ikke udført nogen dynamisk intensitetskorrektion over tid. Metadata for Tribolium-datasættene findes i supplerende tabel 1. Datasæt blev synkroniseret med det stadie, der vises i (A). ZA, Z maksimal projektion med billedjustering. Skalalinje, 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| kombination | Begrundelse | Belysning linse | Registrering linse | kamera | henvisning |
| #1 | hele embryoet på celleniveau, stor pixelafstand (lille datamængde) | 2,5× forstørrelse numerisk blænde 0,06 (luft) | 10× forstørrelse numerisk blænde 0,3 (vand-dypning) | CCD med 1,4 megapixel (1392×1040, 6,45 μm pitch) | denne undersøgelse, Drosophila41, Tribolium20,41 |
| #2 | hele embryon på cellulært/subcellulært niveau, lille pixelafstand (stort datavolumen) | 2,5× forstørrelse numerisk blænde 0,06 (luft) | 20× forstørrelse numerisk blænde 0,5 (vand-dypning) | sCMOS med 5,5 megapixel (2560×2160, 6,5 μm pitch) | Tribolium9 |
| #3 | specifikke regioner af embryoet på subcellulært niveau eller specialiserede applikationer, f.eks. | 5.0× forstørrelse numerisk blænde 0,16 (luft) | 40× forstørrelse numerisk blænde 0,75 (vand-dypning) | CCD med 1,4 megapixel (1392×1040, 6,45 μm pitch) | Tribolium44 |
Tabel 1: Anbefalet belysningslinse/detektionslinse/kamerakombinationer til livebilleddannelse af Drosophila- og Tribolium-embryoner ved hjælp af LSFM. Alle kombinationer er blevet anvendt med succes i tidligere undersøgelser (se Referencerækken). Bemærk, at de fleste prøvekammerbaserede LSFMs bruger vanddypningslinser til detektion, som primært er designet til billedbuffere med et brydningsindeks på 1,33 (f.eks. autoklaveret postevand eller andre vandige medier). Billedbuffere med andre brydningsindekser kan bruges40, men dette ændrer visse egenskaber ved det optiske system, f.eks.
| linje | genotype | Fluorophore-udtryk |
| #01691 | y[1] w[67c23]; P{w[+mC]=Ubi-GFP.nls}ID-2; P{Ubi-GFP.nls}ID-3 | NLS-GFP under kontrol af polyubiquitin-initiativtageren |
| #29724 | w[*]; P{w[+mC]=Tub84B-EGFP.NLS}3 | NLS-GFP under kontrol af alfa-tubulin 84B initiativtager |
| #24163 | w[*]; P{w[+mC]=His2Av-EGFP.C}2/SM6a | EGFP-mærket histone 2A variant i alle celler |
Tabel 2: De tre transgene Drosophila-linjer, der blev anvendt i det første anvendelseseksempel. Kolonnen "line" henviser til Bloomington Drosophila Stock Center (bdsc.indiana.edu) aktienummer.
Supplerende Video 1: Sammenlignende fluorescens levende billeddannelse af et embryo hver fra #01691, #29724 og #24163 transgene Drosophila linjer. Hver transgen linje udtrykker den nukleare lokaliserede EGFP/GFP under kontrol af en formentlig allestedsnærværende og konstituerende aktiv initiativtager. ZA, Z maksimal projektion med billedjustering. Der blev ikke udført nogen dynamisk intensitetskorrektion over tid. ZA, Z maksimal projektion med billedjustering. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende Video 2: Sammenlignende fluorescens levende billeddannelse af et foster hver fra Zen1'LA-mE #1, #2 og #3 transgene Tribolium sublines. Hver transgen underlinje udtrykker mEmerald-mærket Lifeact under kontrol af zerknüllt 1 promotor, en transskription faktor involveret i serosa specifikation. Bemærk venligst, at Zen1'LA-mE #1 embryoet drejer ca. 90° i serosaen lige efter serosa-vinduets lukning. Datasæt blev synkroniseret med det stadie, der er vist i figur 4A. Billedjustering blev udført med identiske minimum- og maksimumsværdier, og der blev ikke udført nogen dynamisk intensitetskorrektion over tid. Embryoner vises ventrally og sideværts over en periode på 48:00 h. ZA, Z maksimal projektion med billedjustering. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende fil 1: FIJI batchbehandling script til automatiseret beregning af z maksimale fremskrivninger fra alle z stakke i én mappe. Scriptet kan åbnes i FIJI via træk og slip. I starten ("Kør") er det kun inputmappen, der skal angives. Outputundermappen ("Z Maximum Projections") oprettes automatisk. Klik her for at hente denne fil.
Supplerende tabel 1: Metadata og parameter for de langsigtede datasæt til live-billedbehandling DS0001-6. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et af LSFMs eksklusive anvendelsesområder er udviklingsbiologi. I denne disciplin er det vigtigt at se på levende prøver, ellers kan morfogenetiske processer ikke beskrives på en dynamisk måde. En eksperimentel ramme for den samtidige levende billeddannelse i prøvekammerbaserede LSFM'er, som beskrevet her, er praktisk af to hovedårsager.
Omgivende varians, som er uundgåelig i sekventiel live billeddannelse, kan behandles proaktivt. I insektfoster-associeret levende billeddannelse ser vi f.eks. følgende modtageligheder. Ægopsamlingskulturerne kan have forskellige aldre på tidspunktet for embryonindsamlingen. I Drosophilahar det vist sig, at dette påvirker afkomets kvaliteter45. Selvom det er en mulighed at arbejde med korrekt desynkroniserede kulturer, er samtidig billeddannelse med synkroniserede kulturer betydeligt mere praktisk. Både Drosophila- og Tribolium-baserede repræsentative resultater stammer fra synkroniserede ægopsamlingskulturer, og vi kan trygt udelukke, at de forskellige fluorescensegenskaber er en utilsigtet effekt af forældrenes senescens.
Dechorionation er et afgørende skridt, da langvarig udsættelse for natriumhypochlorit reducerer embryoets levedygtighed. Ubelejligt falder natriumhypochlorittens ioniske styrke over tid. Målinger af den ioniske styrke er mulige46, men besværlige og besværlige. Ved samtidig livebilleddannelse kan der anvendes en masterblanding til alle linjer og/eller forhold under forberedelsen af dechorionationsrelaterede 6-brøndsplader.
Selv i laboratorier med effektiv aircondition er små, men uregelmæssige temperaturudsving uundgåelige og påvirker også temperaturstyrede9 prøvekammerbaserede LSFMs. Teoretisk set kan temperaturen i prøvekammeret logføres, men en nøjagtig gentagelse er ikke mulig. I samtidig levende billeddannelse forekommer disse udsving også, men de påvirker alle embryoner på samme måde.
Fra et praktisk synspunkt øger en protokol til samtidig billeddannelse af flere embryoner gennemløbet. I live imaging bestemmer varigheden af den udviklingsmæssige proces af interesse, hvor mange assays der kan udføres inden for en given periode, hvilket er en vigtig overvejelse, når adgangen til LSFMs er begrænset. Prime eksempler for langsigtet optagelse er levende billedbehandling assays, hvor celler spores. Sådanne eksperimenter spænder normalt over lange udviklingsperioder. Mens den embryonale udvikling af Drosophila tager kun omkring en dag ved stuetemperatur47, Tribolium tager omkring syv dage48. Derfor er parallelisering for denne art afgørende for at forblive inden for en rimelig tidsramme, især med hensyn til assays, hvor mange forhold sammenlignes.
Gennemløbet, dvs. antallet af embryoner, der afbildes samtidigt, er primært begrænset af to faktorer: For det første er den plads, der er tilgængelig langs y-aksen i prøvekammeret. Når det nederste foster er ved at blive afbildet, bør det øverste embryo ikke have forladt billeddiagnostikbufferen. Desuden bør spindelvævsholderen og det tilhørende støttesystem ikke være så langvarige, at det vakler og /eller ryster mærkbart under z-stakoptagelsesprocessen. For det andet er den tilsigtede tidsmæssige beslutning. Registreringstiden pr. embryon kan tilnærmes ved at gange eksponeringstiden pr. todimensionelt billede (normalt 10-200 ms) med antallet af planer pr. z-stak (normalt flere hundrede), antallet af kanaler (normalt mellem en og tre), antallet af retninger (normalt mellem en og otte) og en opsætningsafhængig faktor for oversættelses- og rotationsbevægelserne (anslået mellem 1,2 og 1,5). Forholdet mellem den tilsigtede tidsmæssige opløsning og registreringstiden pr. embryon angiver det maksimale antal embryoner, der kan afbildes samtidigt. Sammenfattende er vores protokol passende at gå fra sekventiel live billeddannelse til medium gennemløb, men ikke egnet til det, der generelt betragtes som høj gennemløb. For sidstnævnte kan LSFMs egnet til mikroskop dias49,50,51 eller godt plader52 overvejes, men disse implementeringer har normalt andre begrænsninger.
Afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål og dermed belysningslinsen / detektionslinsen / kamerakombinationen i forbindelse med billedparametrene kan samtidig afbildede LSFM-datasæt kræve stor lagerplads i deres rå tilstand. Dette problem kan bedst illustreres ved at overveje de medfølgende Drosophila-eksempeldatasæt (Supplerende tabel 1), dvs. Hver to-dimensionelle rå billede havde en datamængde på omkring 2,8 Megabyte, hver rå z stak bestod af 120 fly, og alle tre embryoner blev registreret langs fire retninger i alt 143 gange. Som følge heraf besatte de rå datasæt omkring en halv Terabyte. Gennem billeddatabehandling, dvs. beskæring langs alle rumlige dimensioner (trin 9) i forbindelse med ZIP-baseret komprimering, blev datamængden reduceret til 53,3 Gigabyte, hvilket er ca. 10% af den oprindelige mængde. Til behandling af datasæt i Terabyte-regimet, BigDataViewer 53-plug-in'en, som er forudinstalleret i FIJI (Plugins | BigDataViewer), anbefales.
Ud over de fem scenarier, der er skitseret i afsnittet Repræsentative resultater, kan vores protokol også bruges til at karakterisere effekten af RNAi knockdown-effekter, som er en populær tilgang i Tribolium54. Det er dog kun til begrænset brug til analyse af forbindelser (f.eks. insekticider eller andre biokemiske stressorer), hvis disse skal anvendes gennem billedbufferen – som er den mest enkle tilgang – da samtidig billeddannelse af et kontrolembryo ikke er mulig.
Vi demonstrerede vores protokol ved hjælp af et af vores specialbyggede mikroskoper8,55, men den gælder for enhver prøvekammerbaseret opsætning, f.eks. OpenSPIM56 eller de fleste kommercielle LSFMs. Denne protokol supplerer LSFM-associeret ressource etablering initiativ, der har til formål at tilskynde nybegyndere til aktivt at integrere lys ark-baseret teknologi i deres forskningsplaner. De fleste universiteter og institutter driver i dag veludstyrede fluorescensmikroskopifaciliteter57. Disse giver normalt adgang til en eller flere kammerbaserede LSFM'er, men personalet kan ikke forventes at have de rette eksperimentelle løsninger for hvert videnskabeligt spørgsmål ved hånden.
Vores resultater viser, at vores eksperimentelle rammer er velegnede til Drosophila og Tribolium. Vi er overbeviste om, at vores sammenligningsfokuserede protokol kan bruges til at studere embryogenese af andre insektarter. For eksempel er der anvendt en LSFM-baseret tilgang til at sammenligne wild-type og knockdown udvikling i scuttle fly Megaselia abdita58, og opfølgende undersøgelser vil også drage fordel af vores monteringsmetode. Derudover er transgene linjer af den to-plettede cricket Gryllus bimaculatus specielt designet til fluorescens live imaging59 tilgængelige, men den eneste aktuelt tilgængelige sammenligningsfokuserede protokol60 er beregnet til konventionelle omvendte mikroskoper og adresserer derfor ikke tredimensionel billederhvervelse eller prøverotation. Derudover har det allerede vist sig, at spindelvævsholderen er et bekvemt valg for zebrafisk, hvis embryoner ændrer deres form betydeligt under embryogenese61. En tilpasning af vores protokol, som kræver stort set ingen optimeringsindsats, ville give de ovenfor beskrevne fordele også for denne modelorganisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Ernst H. K. Stelzer for muligheden for at bruge hans ressourcer samt hans værdifulde kommentarer vedrørende manuskriptet, Anita Anderl for støtte med Tribolium live imaging, Sven Plath for teknisk support samt Ilan Davis, Nicole Grieder og Gerold Schubiger for at dele deres transgene Drosophila linjer via Bloomington Stock Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100 µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
References
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
- Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
- Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
- Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
- El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
- Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
- Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
- Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
- Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
- Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
- Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
- Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
- Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
- Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
- Mcdonald, J. H. Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , Sparky House Publication. (2013).
- Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
- Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
- Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
- Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
- He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
- Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
- Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , Springer. (1997).
- Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
- McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
- Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
- Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
- Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
- Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).
