Summary
प्रकाश पत्रक आधारित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विकासात्मक जीव विज्ञान में सबसे मूल्यवान उपकरण है। तुलनात्मक अध्ययनों में एक प्रमुख मुद्दा परिवेश विचरण है । हमारा प्रोटोकॉल कई नमूनों के एक साथ लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रयोगात्मक ढांचे का वर्णन करता है और इसलिए, इस मुद्दे को सक्रिय रूप से संबोधित करता है।
Abstract
लाइट शीट-आधारित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी कई जैविक रूप से प्रासंगिक पैमानों पर जटिल प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कुशल समाधान प्रदान करता है। नमूना कक्ष आधारित सेटअप, जो विशेष रूप से नमूने की त्रि-आयामी अखंडता को संरक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं और आमतौर पर नमूना रोटेशन की सुविधा देते हैं, विकासात्मक जीव विज्ञान में सबसे अच्छा विकल्प हैं। उदाहरण के लिए, उनका उपयोग फल फ्लाई ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर और लाल आटा बीटल ट्राइबोलियम कास्टेनियमके पूरे भ्रूणरूपेसिस को दस्तावेज करने के लिए किया गया है। हालांकि, कई उपलब्ध लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल एकल भ्रूण के लिए केवल प्रायोगिक ढांचे प्रदान करते हैं। विशेष रूप से तुलनात्मक अध्ययनों के लिए, ऐसे दृष्टिकोण असुविधाजनक हैं, क्योंकि क्रमिक रूप से चित्रित नमूने परिवेश विचरण से प्रभावित होते हैं। इसके अलावा, यह उन नमूनों की संख्या को सीमित करता है जिन्हें एक निर्धारित समय के भीतर परखा जा सकता है। हम एक साथ लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रयोगात्मक ढांचा प्रदान करते हैं जो नमूना कक्ष-आधारित सेटअप में थ्रूपुट को बढ़ाता है और इस प्रकार सभी नमूनों के लिए समान परिवेश की स्थिति सुनिश्चित करता है। सबसे पहले, हम प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के लिए एक अंशांकन दिशानिर्देश प्रदान करते हैं । दूसरे, हम कई भ्रूण है कि नमूना रोटेशन के साथ संगत है के लिए एक बढ़ते विधि का प्रस्ताव है । तीसरे, हम ड्रोसोफिलाके अनुकरणीय त्रि-आयामी लाइव इमेजिंग डेटासेट प्रदान करते हैं, जिसके लिए हम फ्लोरोसेंटली लेबल नाभिक के साथ-साथ ट्राइबोलियमके साथ तीन ट्रांसजेनिक लाइनों को मुक़ाबला करते हैं, जिसके लिए हम तीन ट्रांसजेनिक सबलाइन के प्रदर्शन की तुलना करते हैं जो एक ही ट्रांसजीन ले जाते हैं, लेकिन विभिन्न जीनोमिक स्थानों पर। हमारा प्रोटोकॉल विशेष रूप से तुलनात्मक अध्ययनों के लिए डिज़ाइन किया गया है क्योंकि यह सक्रिय रूप से परिवेश विचरण को संबोधित करता है, जो हमेशा अनुक्रमिक लाइव इमेजिंग में मौजूद होता है। यह मात्रात्मक विश्लेषण और विबरनल फेनोटाइप के लक्षण वर्णन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जिसका परिणाम नॉकआउट प्रयोगों से होता है। इसके अलावा, यह समग्र थ्रूपुट को बढ़ाता है, जो प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप तक पहुंच सीमित होने पर अत्यधिक सुविधाजनक है। अंत में, प्रस्तावित बढ़ते विधि को अन्य कीट प्रजातियों और आगे के मॉडल जीवों, उदाहरण के लिए, ज़ेब्राफ़िश के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, मूल रूप से कोई अनुकूलन प्रयास नहीं है।
Introduction
फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी जीवन विज्ञान में सबसे आवश्यक इमेजिंग तकनीकों में से एक है, विशेष रूप से सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान में। कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप 1 में, जो199 0 के दशक के मध्य से त्रि-आयामी फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए अत्याधुनिक हैं, एक ही लेंस का उपयोग फ्लोरोफोर एक्सटिटेशन और उत्सर्जन प्रकाश का पता लगाने के लिए किया जाता है। रोशनी लेजर बीम रोशनी के साथ सभी फ्लोरोफोरस उत्तेजित/पता लगाने धुरी और संबंधित बाहर का ध्यान केंद्रित संकेत एक पिनहोल द्वारा पता लगाने से पहले भेदभाव किया जाता है । इसलिए, प्रत्येक दो आयामी छवि के लिए, पूरा नमूना प्रकाशित किया जाता है। नतीजतन, प्रत्येक त्रि-आयामी छवि के लिए, यानी, स्थानिक रूप से लगातार दो-आयामी छवियों का ढेर, पूरे नमूने को कई दर्जन से कुछ सौ गुना2तक प्रकाशित किया जाता है, जो फोटोब्लैचिंग और फोटोटोक्सीसिटी3को बढ़ावा देता है।
लगभग बीस साल पहले, प्रकाश शीट आधारित प्रौद्योगिकी4 त्रि-आयामी फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए एक आशाजनक विकल्प के रूप में उभरी और इस प्रकार विकासात्मक जीव विज्ञान5में एक मूल्यवान उपकरण बन गई। इस दृष्टिकोण में, रोशनी और पता लगाने को अलग किया जाता है। रोशनी लेंस का उपयोग लंबवत रूप से व्यवस्थित डिटेक्शन लेंस के फोकल प्लेन के भीतर केवल कुछ माइक्रोमीटर की गहराई के साथ एक प्रकाश शीट उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। इसलिए, प्रत्येक द्वि-आयामी छवि के लिए, फोकल प्लेन के चारों ओर केवल एक पतली प्लैनर मात्रा प्रकाशित की जाती है। नतीजतन, प्रत्येक त्रि-आयामी छवि के लिए, पूरा नमूना केवल एक बार प्रकाशित होता है, जो फोटोब्लैचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी6को दृढ़ता से कम करता है। इस कारण से, प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (एलएसएफएम) कई जैविक रूप से प्रासंगिक पैमानों पर जटिल प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कुशल समाधान प्रदान करते हैं और इसलिए, विकासात्मक जीव विज्ञान में विशेष मूल्य के हैं, जहां नमूनों के रूप में कई मिलीमीटर के रूप में बड़े नमूनों को उपकोशिकीय स्तर पर विश्लेषण किया जाना है।
ऐतिहासिक रूप से, एलएसएफएम का नमूना कक्ष-आधारित7,8दिया गया है। इन सेटअप में, रोशनी (एक्स) और डिटेक्शन (जेड) कुल्हाड़ियों को आमतौर पर गुरुत्वाकर्षण धुरी (वाई) के लंबवत रूप से व्यवस्थित किया जाता है। नमूना कक्ष पर्याप्त प्रयोगात्मक स्वतंत्रता प्रदान करते हैं। सबसे पहले, वे बड़ी इमेजिंग बफर क्षमताएं प्रदान करते हैं, जो बदले में पर्यावरण को नियंत्रित करने के लिए एक परफ्यूजन प्रणाली के उपयोग को आसान बनाता है, उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट तापमान9 को बनाए रखने या जैव रासायनिक तनाव लागू करने के लिए। इसके अलावा, वे अनुकूलित बढ़ते तरीकों का समर्थन करते हैं10 जो तीन आयामी को संरक्षित करते हुए संबंधित प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुरूप हैं, कुछ उदाहरणों में गतिशील11,नमूने की अखंडता। इसके अतिरिक्त, नमूना कक्ष आधारित सेटअप आमतौर पर एक रोटेशन फ़ंक्शन से लैस होते हैं जिसका उपयोग वाई अक्ष के चारों ओर नमूनों को घूमना और इस प्रकार उन्हें दो, चार या अधिक दिशाओं के साथ छवि प्रदान करता है। चूंकि आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले मॉडल जीवों के भ्रूण, माइक्रोस्कोपी के संदर्भ में, अपेक्षाकृत बड़े, वेंट्रल-पृष्ठीय, पार्श्व, और/या पूर्वकाल-पीछे शरीर कुल्हाड़ियों के साथ लगातार इमेजिंग एक अधिक व्यापक प्रतिनिधित्व प्रदान करता है । यह उन कोशिकाओं की दीर्घकालिक ट्रैकिंग की अनुमति देता है जो जटिल त्रि-आयामी प्रवास पथ12,13के साथ चलते हैं।
ड्रोसोफिला मेलनोगास्टरके भ्रूणरूपोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए प्रकाश शीट आधारित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को बड़े पैमाने पर लागू किया गया है, दोनों व्यवस्थित रूप से14,15 के साथ-साथ विकास के जैव भौतिक पहलुओं पर एक विशिष्ट ध्यान केंद्रित करते हैं। उदाहरण के लिए, इसका उपयोग उच्च-रिज़ॉल्यूशन मॉर्फोजेनेटिक डेटा इकट्ठा करने के लिए किया गया था ताकि जर्मबैंड विस्तार16 के दौरान एंडोडर्म इनवेजिनेशन और एक्सिस एक्सटेंशन के बीच बायोमैकेनिकल लिंक का पता लगाया जा सके और आगे गैस्ट्रुलेशन17के दौरान बल उत्पादन पैटर्न के साथ जटिल सेलुलर प्रवाह को संबंधित किया जा सके। इसे एपिडर्मिस18में पूर्वकाल-पीछे पैटर्निंग के दौरान डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग के नियमन की जांच करने के लिए अन्य अत्याधुनिक तकनीकों, उदाहरण के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ भी जोड़ा गया है।
हालांकि, केवल एक प्रजाति का अध्ययन विकास के विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करता है। भ्रूणजनेसिस को फिलोजेनेटिक संदर्भ के भीतर समझने के लिए वैकल्पिक कीट मॉडल जीवों के साथ गहन शोध किया गया है । सबसे व्यापक रूप से जांच की गई प्रजातियों में से एक लाल आटा बीटल ट्राइबोलियम कास्टेनियमहै , जो आर्थिक रूप से प्रासंगिक संग्रहित अनाज कीट19है , जिसका भ्रूणीय मॉर्फोजेनेसिस भी पहले से ही एलएसएफएम20के साथ व्यवस्थित रूप से चित्रित किया गया है। इन दोनों प्रजातियों के भ्रूणरूपाय कई पहलुओं में उल्लेखनीय रूप से भिन्न हैं, उदाहरण के लिए, विभाजन मोड21,साथ ही अतिरिक्त भ्रूणीय झिल्ली22का गठन और क्षरण। बाद के पहलू पहले से ही बड़े पैमाने पर LSFMs का उपयोग कर विश्लेषण किया गया है । उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि सेरोसा, एक अतिरिक्त भ्रूण ऊतक जो ट्राइबोलियम भ्रूण को अपने भ्रूण के बेहतर हिस्से के लिए विभिन्न खतरों से ढंकता है और उसकी रक्षा करताहै, 25,पृष्ठीय बंद होने केदौरानअपनी वापसी प्रक्रिया के लिए मॉर्फोजेटिक "ड्राइवर" के रूप में भी कार्य करता है। इसके अलावा, यह प्रदर्शित किया गया है कि गैस्ट्रुलेशन के दौरान, ब्लास्टोडर्म का एक विशेष क्षेत्र असममित ऊतक आंदोलनों को बनाने के लिए विटेललाइन झिल्ली में लंगर डालेरहता है और इस अवलोकन के बाद, कि क्षेत्रीयकृत ऊतक तरलीकरण कोशिकाओं को क्रमिक रूप से सेरोसा खिड़की बंद करने के दौरान सेरोसा किनारे छोड़ने की अनुमति देता है27।
सभी ड्रोसोफिलामें - और ट्राइबोलियमसे जुड़े अध्ययनों में ऊपर उद्धृत किया गया है, नमूना कक्ष-आधारित एलएसएफएम का उपयोग किया गया है। अधिकांश में, भ्रूण नमूना रोटेशन समारोह का उपयोग कर कई दिशाओं के साथ दर्ज किए गए थे । हालांकि स्पष्ट रूप से नहीं कहा गया है, यह माना जा सकता है कि उन्हें व्यक्तिगत रूप से दर्ज किया गया है और इस प्रकार अनुक्रमिक लाइव इमेजिंग परख में एक दूसरे से स्वतंत्र है, जो ट्राइबोलियम20,28पर हमारे पिछले काम के समान है। कुछ परिदृश्यों में, इस तरह के एक दृष्टिकोण स्वीकार्य है, लेकिन विशेष रूप से मात्रात्मक तुलनात्मक दृष्टिकोण में, परिवेश विचरण परिणामों को विकृत कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, यह लंबे समय से ज्ञात है कि कीड़ों की विकासात्मक गति तापमान पर निर्भर29है, लेकिन हाल के एक और अध्ययन से पता चलता है कि ड्रोसोफिलामें तापमान30मॉर्फोजन की एकाग्रता को भी प्रभावित कर सकता है। नतीजतन, यदि भ्रूणजेनेसिस की कुछ विशेषताओं, उदाहरण के लिए, गतिशील अनुपात, विभाजन दर और कोशिकाओं के प्रवास वेग, ठीक मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए, परिवेश विचरण के बिना पर्याप्त पुनरावृत्ति की आवश्यकता है । यह मानक विचलन और मानक त्रुटियों को कम करता है, जो बदले में अन्य के साथ मुक़ाबला की सुविधा देता है, यहां तक कि सिर्फ मामूली भिन्न प्रायोगिक स्थितियों को भी।
हालांकि, नमूना कक्ष आधारित LSFMs मुख्य रूप से उच्च थ्रूपुट परख के बजाय उच्च सामग्री के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के विपरीत, जो आमतौर पर माइक्रोस्कोपी स्लाइड, पेट्री व्यंजन और अच्छी प्लेटों के लिए मानकीकृत क्लैंप तंत्र से लैस होते हैं, लगभग सभी नमूना कक्ष-आधारित एलएसएफएम सिलेंडर आधारित क्लैंप तंत्र का उपयोग करते हैं। ये तंत्र कस्टम-निर्मित नमूना धारकों के लिए हैं जो रोटेशन-संगत के साथ-साथ गैर-आक्रामक10हैं, लेकिन आमतौरपर एक से अधिक नमूना20,31,32के लिए डिज़ाइन नहीं किए गए हैं। दो या अधिक भ्रूणों की एक साथ लाइव इमेजिंग के लिए एक ढांचा, जिसमें नमूना कक्ष-आधारित सेटअप के फायदों से समझौता नहीं किया जाता है, परिवेश विचरण के मुद्दे को संबोधित करता है जिससे तुलनात्मक अध्ययन के लिए एलएसएफएम का मूल्य बढ़ जाता है।
हमारे प्रोटोकॉल में, हम नमूना कक्ष आधारित LSFMs(चित्रा 1A)में तुलनात्मक लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रयोगात्मक ढांचा पेश करते हैं जिसमें वाई अक्ष का उपयोग भ्रूण को "स्टैक" करने के विकल्प के रूप में किया जाता है। सबसे पहले, हम नमूना कक्ष आधारित LSFMs के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर आधारित अंशांकन दिशानिर्देश प्रदान करते हैं, जो उन उपकरणों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जिनमें अंशांकन सहायक की कमी है। दूसरे, हम जाबवे धारक28 (चित्रा 1B)के आधार पर कई भ्रूणों के लिए एक बढ़ते विधि का वर्णन करते हैं जो नमूना रोटेशन के साथ संगत है और इस प्रकार कई दिशाओं(चित्रा 1C)के साथ कई नमूनों की एक साथ इमेजिंग की अनुमति देता है। कई भ्रूण एक पतली agarose फिल्म के शीर्ष पर गठबंधन कर रहे है और, नमूना कक्ष में प्रविष्टि के बाद, प्रकाश शीट के माध्यम से लगातार चले गए तीन आयामी छवियों को प्राप्त करने के लिए । तीसरा, हम ड्रोसोफिला के साथ-साथ ट्राइबोलियमके लिए तीन अनुकरणीय लाइव इमेजिंग डेटासेट प्रदान करते हैं। पूर्व के लिए, हम फ्लोरोसेंटली लेबल नाभिक के साथ ट्रांसजेनिक लाइनों मुक़ाबला । उत्तरार्द्ध के लिए, हम ट्रांसजेनिक सबलाइन के प्रदर्शन की तुलना करते हैं जो एक ही ट्रांसजीन ले जाते हैं, लेकिन विभिन्न जीनोमिक स्थानों पर। अंत में, हम तुलनात्मक लाइव इमेजिंग और परिवेश विचरण33के संबंध में समानांतर के महत्व पर चर्चा करते हैं, हमारे प्रयोगात्मक ढांचे की थ्रूपुट सीमा पर बहस करते हैं और अन्य मॉडल जीवों के प्रति हमारे दृष्टिकोण के अनुकूलन का मूल्यांकन करते हैं।
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Protocol
1. तैयारी का काम
- एलएसएफएम के लिए एक रोशनी लेंस/डिटेक्शन लेंस/कैमरा कॉम्बिनेशन चुनें जो वैज्ञानिक प्रश्न के अनुकूल हो और माइक्रोस्कोप स्थापित करे । देखने के क्षेत्र का आकार कैमरा चिप आकार और पता लगाने लेंस के आवर्धन का भागफल है। रोशनी लेंस को चुना जाना चाहिए ताकि देखने का पूरा क्षेत्र लगभग प्लैनर लाइट शीट34से ढका रहे . तीन अनुशंसित संयोजन तालिका 1में सूचीबद्ध हैं।
- एगरल्ड एलिकोट्स और पुनः प्राप्त व्यंजन तैयार करने के लिए, 200 एमएल ऑटोक्लेव्ड नल के पानी में 2 ग्राम कम पिघला हुआ जोड़ें और मिश्रण को 600-800 डब्ल्यू पर माइक्रोवेव ओवन में गर्म करें जब तक कि सभी एगर उठे कण भंग न हो जाएं। 1.5 एमएल या 2 एमएल रिएक्शन ट्यूब में कई 1 एमएल एगरेग्मेंट तैयार करें, फिर एगर उठे के साथ कई 90-मिमी क्र पेट्री व्यंजन 3-5 मिमी उच्च भरें। 4 डिग्री सेल्सियस पर जम एलिकोट्स और व्यंजन स्टोर करें।
- ड्रोसोफिलाके लिए: ताजा पालन शीशियों को तैयार करने के लिए, पर्याप्त मात्रा में कस्टम-मेड या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ड्रोसोफिला माध्यम पकाएं, 5-15 एमएल को चौड़ी शीशियों में स्थानांतरित करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अंडा बिछाने वाले व्यंजन तैयार करने के लिए, 1 ग्राम कम पिघलने वाले एग्राम को ऑटोक्लेव्ड नल के पानी के 50 एमएल में जोड़ें और मिश्रण को 600-800 डब्ल्यू पर माइक्रोवेव ओवन में गर्म करें जब तक कि सभी एगर उठे कण भंग न हो जाएं। मिश्रण को 45 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें, फिर 50 एमएल फलों का रस (अधिमानतः सेब या लाल अंगूर) जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं। मिश्रण को 35 मिमी Ø पेट्री व्यंजनों में डालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर ठोस अंडा बिछाने वाले व्यंजनों को स्टोर करें।
- ट्राइबोलियमके लिए: विकास माध्यम तैयार करने के लिए, पूरे गेहूं के आटे के साथ-साथ निष्क्रिय शुष्क खमीर को 710 माइक्रोम जाल आकार छलनी के माध्यम से पास करें, फिर 5% (w/w) छलनी खमीर के साथ छलनी आटे को पूरक करें। अंडा बिछाने का माध्यम तैयार करने के लिए, ठीक गेहूं के आटे के साथ-साथ निष्क्रिय सूखे खमीर को 250 माइक्रोम जाल आकार छलनी के माध्यम से पास करें, फिर 5% (w/w) छलनी खमीर के साथ छलनी आटे को पूरक करें।
2. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर का उपयोग करके नमूना कक्ष आधारित एलएसएफएमएस का अंशांकन
नोट: अंशांकन का उद्देश्य रोशनी और डिटेक्शन लेंस(चित्रा 2 ए)के केंद्र बिंदुओं को संरेखित करना है, क्योंकि यह स्पष्ट छवियों के लिए आधार है। एलएसएफएम को नियमित रूप से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए, कम से कम एक बार हर 3-4 सप्ताह में।
- 80 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखी ब्लॉक हीटर/मिक्सर में एक एग्राज्वार्ल्ड एलिकोट को फिर से द्रवित करें, फिर एगर उठे एलिकोट को 35 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
- 1.5 एमएल रिएक्शन ट्यूब में एगर के 50 माइक्रोल को स्थानांतरित करें और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर समाधान के 0.5 माइक्रोल जोड़ें। 1 मिनट के लिए 1,400 आरपीएम पर मिलाएं।
- कोबवेब धारक के स्लॉटेड छेद को 10 माइक्रोल के साथ भरें एगर उठे/फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर समाधान मिश्रण, फिर जितना संभव हो उतना ऊंचा करें जब तक कि केवल एक पतली एगर उठे फिल्म बनी न हो। ठोसकरण के लिए 30-60 एस रुको।
- ऑटोक्लेव नल के पानी से नमूना कक्ष भरें। कोबवे धारक को धीरे-धीरे नमूना कक्ष में डालें और स्लॉट किए गए छेद को माइक्रोट्रांसलेशन चरणों के साथ डिटेक्शन लेंस के सामने स्थानांतरित करें।
- रोशनी (एक्स) और डिटेक्शन (जेड) कुल्हाड़ियों के सापेक्ष रोटेशन चरण के साथ मकड़जाल धारक को 45 डिग्री की स्थिति में घुमाएं। ट्रांसमिशन लाइट चैनल में मकड़जाल धारक को दिखाई नहीं देना चाहिए।
- संबंधित फ्लोरेसेंस चैनल पर स्विच करें और लेजर पावर के साथ-साथ एक्सपोजर समय को समायोजित करें ताकि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर उचित संकेत प्रदान कर सकें।
- देखने की एक मात्रा निर्दिष्ट करें जो अब ट्रांसवर्स ओरिएंटेड एगरेग्यास फिल्म को पूरी तरह से कवर करती है। संबंधित रोशनी लेंस/डिटेक्शन लेंस संयोजन34के लिए अधिकतम संभव अक्षीय संकल्प की गणना करके जेड रिक्ति को परिभाषित करें । वैकल्पिक रूप से, पार्श्व संकल्प का 4 गुना किसी न किसी सन्निकटन के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
- फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर के त्रि-आयामी परीक्षण जेड स्टैक को रिकॉर्ड करें और एक्स, वाई और जेड अधिकतम अनुमानों की तुलना अंशांकन चार्ट(चित्रा 2)से करें। यदि माइक्रोस्फीयर धुंधली, फजी, और/या विकृत(चित्रा 2बी, सी)दिखाई देते हैं, तो रोशनी और/या डिटेक्शन लेंस की स्थिति को समायोजित करें ।
3. ड्रोसोफिला भ्रूण का संग्रह
- एक अंडा संग्रह संस्कृति स्थापित करने के लिए इमेजिंग परख से 2-3 दिन पहले एक ताजा पालन शीशी के लिए पसंद की ड्रोसोफिला लाइन के 100-200 वयस्कों को स्थानांतरित करें। यदि अभी तक अस्तित्व में नहीं है, तो एक संतान संस्कृति शुरू करने के लिए पुरानी पालन शीशी का उपयोग करने पर विचार करें। यह सुनिश्चित करने के लिए वयस्कों से अधिक दो सप्ताह पुराने हैं, संतान संस्कृति के साथ समय में भ्रूण संग्रह संस्कृति की जगह ।
- कमरे के तापमान के लिए एक अंडा बिछाने पकवान गर्म और आगर के शीर्ष पर खमीर पेस्ट की एक बूंद जोड़ें ।
- अंडे संग्रह संस्कृति से वयस्कों को एक खाली संकीर्ण शीशी में स्थानांतरित करें और इसे अंडे बिछाने वाले पकवान के शीर्ष पर रखें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंडा संग्रह सेटअप इनक्यूबेट। यदि संभव हो तो इस चरण के दौरान संज्ञाहरण (ठंडा, सीओ2)से बचें।
- वयस्कों को पालने वाली शीशी पर लौटाें। एक सुविधाजनक तापमान/समय संयोजन पर अंडे बिछाने पकवान इनक्यूबेट, तो अंडे बिछाने पकवान से एक छोटे तूलिका के साथ 10-20 भ्रूण हस्तांतरण एक १०० μm जाल आकार सेल छलनी । अंडा बिछाने वाली डिश को छोड़ दें।
- प्रत्येक ड्रोसोफिला लाइन के लिए 3.1 से 3.4 चरणों को दोहराएं।
4. ट्राइबोलियम भ्रूण का संग्रह
नोट: सुविधा के लिए, ट्राइबोलियम अंडा संग्रह प्रक्रिया की एक योजना प्रदान की जाती है(चित्रा 3A)जो भी इस कदम में कोष्ठक के भीतर की संख्या का उल्लेख है ।
- एक अंडा संग्रह संस्कृति (चित्रा 3 A_01) स्थापित करने के लिए इमेजिंग परख से 2-10 दिन पहले एक खाली 1 एल ग्लास बोतल 2-10 दिनों के लिए पसंद की ट्राइबोलियम लाइन के200-300वयस्कों (लगभग 400-700मिलीग्राम)को स्थानांतरित करें। ताजा विकास माध्यम के 50-100 ग्राम के साथ बोतल भरें। यदि अभी तक मौजूद नहीं है, तो उपलब्ध लार्वा और पिल्ले का उपयोग करके एक संतान संस्कृति शुरू करने पर विचार करें। यह सुनिश्चित करने के लिए वयस्क 3 महीने से अधिक पुराने नहीं हैं, संतान संस्कृति के साथ समय में अंडा संग्रह संस्कृति की जगह ।
- एक 800 μm जाल आकार छलनी(चित्रा 3A_02)के माध्यम से अंडा संग्रह संस्कृति पास विकास माध्यम है, जो गैर मंचन भ्रूण शामिल है वापस, प्रारंभिक बोतल(चित्रा 3A_03)और एक खाली 1 एल कांच की बोतल(चित्रा 3A_04) केलिए वयस्कों के हस्तांतरण । अंडा बिछाने के माध्यम के 10 ग्राम जोड़ें(चित्र 3A_05)और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंडा संग्रह सेटअप इनक्यूबेट(चित्रा 3A_06,07)।
- 800 माइक्रोन जाल आकार छलनी(चित्रा 3A_08)के माध्यम से अंडा संग्रह सेटअप पास करें। अपनी प्रारंभिक बोतल(चित्रा 3A_09)के लिए वयस्कों वापसी विकास की प्रक्रिया है कि छवि होनी चाहिए पर निर्भर करता है, अंडा बिछाने माध्यम है, जो अब के बारे में 30-100 भ्रूण शामिल है, एक सुविधाजनक तापमान/समय संयोजन(चित्रा 3A_10)पर इनक्यूबेट ।
- 300 माइक्रोन जाल आकार छलनी(चित्रा 3A_11)के माध्यम से अंडा बिछाने के माध्यम से पास करें और भ्रूण(चित्रा 3A_12)को 100 माइक्रोन जाल आकार सेल छलनी में स्थानांतरित करें। छलनी अंडे बिछाने मीडिया(चित्रा 3A_13)त्यागें ।
- प्रत्येक ट्राइबोलियम लाइन के लिए चरण 4.1 से 4.4 तक दोहराएं।
5. सोडियम हाइपोक्लोराइट आधारित डिकेरेशन
नोट: ड्रोसोफिला और ट्राइबोलियम भ्रूण दोनों को एक कोरियोन, एक सुरक्षात्मक और भारी प्रकाश बिखरने वाली प्रोटीन परत द्वारा कवर किया जाता है जो उचित विकास के लिए आवश्यक नहीं है जब तक भ्रूण को हटाने के बाद नम रखा जाता है। दोनों प्रजातियों के भ्रूण के लिए डिकेरेशन प्रोटोकॉल एक समान है।
- ऑटोक्लेव नल के पानी के 8 एमएल और बी 1 और बी 2 कुओं के साथ ए 1, A2, A3 और B3 कुओं को भरकर 6-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें और 7 एमएल ऑटोक्लेव नल के पानी के साथ और सोडियम हाइपोक्लोराइट (नाओसीएल) समाधान(चित्रा 3 बी)का 1 एमएल। ट्रांसमिशन लाइट में आदर्श रूप से एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत डिकेरियोशन प्रक्रिया का निरीक्षण करें।
सावधानी: सोडियम हाइपोक्लोराइट संक्षारक है। - A1 में भ्रूण युक्त कोशिका छलनी (चरण 3.4 और/या 4.4) अच्छी तरह से डालें और कोमल आंदोलन के तहत 30-60 एस के बारे में भ्रूण धोएं।
- बी 1 को सेल छलनी अच्छी तरह से ले जाएं और प्लेटों को 30 एस के लिए सख्ती से हिलाएं, फिर इसे A2 अच्छी तरह से स्थानांतरित करें और कोमल आंदोलन के तहत 1 मिनट के लिए भ्रूण को धोएं।
- बी 2 को सेल छन्नी को अच्छी तरह से ले जाएं और प्लेट को तेजी से हिलाएं जब तक कि अधिकांश भ्रूण पूरी तरह से डिकोरियोनेटेड(चित्रा 3 सी)न हों, फिर इसे A3 अच्छी तरह से स्थानांतरित करें और कोमल आंदोलन के तहत 1 मिनट के लिए भ्रूण को धोएं।
- बढ़ते प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ने से पहले अच्छी तरह से B3 में सेल छलनी स्टोर करें।
- प्रत्येक पंक्ति के लिए चरण 5.1 से 5.5 तक दोहराएं।
6. मकड़जाल धारक का उपयोग कर कई भ्रूण के बढ़ते
- 80 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखी ब्लॉक हीटर/मिक्सर में एक एग्राज्वार्ल्ड एलिकोट को फिर से द्रवित करें, फिर एगर उठे एलिकोट को 35 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
- कोबवे धारक के स्लॉटेड छेद के शीर्ष पर एगर के पिपेट 10 माइक्रोन। पिपेट टिप के साथ, स्लॉटेड छेद पर एगर उठे, फिर जितना संभव हो उतना ऊंचा हो गया जब तक कि केवल एक पतली एगरेग्मेंट फिल्म बनी न हो। ठोसकरण के लिए 30-60 एस रुको।
- प्रत्येक पंक्ति के लिए, ध्यान से एक छोटे से तूलिका के साथ एक या एक से अधिक भ्रूण लेने और उन्हें agarose फिल्म पर जगह है।
- स्लॉट छेद की लंबी धुरी के साथ भ्रूण की व्यवस्था करें, फिर स्लॉटेड छेद(चित्रा 3 डी)की लंबी धुरी के साथ अपने पूर्वकाल-पीछे की धुरी को भी संरेखित करें।
- भ्रूण और एगर उठे फिल्म के बीच के अंतर में 1-2 μL को पिपिंग करके भ्रूण को ध्यान से स्थिर करें। ठोसकरण के लिए 30-60 एस रुको।
- छवि बफर से भरे नमूना कक्ष में धीरे-धीरे घुड़सवार भ्रूण के साथ जाब धारक डालें।
7. नमूना चैंबर आधारित LSFMs में तुलनात्मक लाइव इमेजिंग
- पता लगाने लेंस के सामने माइक्रोट्रांसलेशन चरणों के साथ भ्रूण में से एक ले जाएँ। सुनिश्चित करें कि मकड़जाल धारक रोशनी (एक्स) और डिटेक्शन (जेड) कुल्हाड़ियों (cf. चित्रा 1C)के सापेक्ष 45 डिग्री की स्थिति में है।
- ट्रांसमिशन लाइट चैनल में, भ्रूण को देखने के क्षेत्र के केंद्र में ले जाएं। मकड़जाल धारक को दिखाई नहीं देना चाहिए।
- भ्रूण के मध्यग्रह तक फोकल विमान के साथ ओवरलैप होने तक जेड में माइक्रोट्रांसलेशन चरणों के साथ भ्रूण को स्थानांतरित करें, यानी जब तक रूपरेखा तेज दिखाई न दे। फ्लोरेसेंस चैनल पर स्विच किए बिना, मिडप्लेन से 250 माइक्रोन को दोनों दिशाओं में ले जाकर देखने की मात्रा निर्दिष्ट करें।
- वैकल्पिक रूप से, यदि कई दिशाओं के साथ इमेजिंग की आवश्यकता है, तो भ्रूण को उचित रूप से घुमाएं और चरण 7.2 और 7.3 दोहराएं। मकड़जाल धारक 90 डिग्री के चरणों में चार झुकाव तक का समर्थन करता है।
- जाब धारक (चित्रा 3E) पर चढ़कर अन्य सभी भ्रूणों के लिए 7.1 से7.3 (या 7.4)तक के चरणों को दोहराएं। सुनिश्चित करें कि सबसे ऊपर भ्रूण इमेजिंग बफर नहीं छोड़ता है जब सबसे नीचे भ्रूण का पता लगाने के लेंस के सामने है।
- फ्लोरेसेंस चैनल (लेजर पावर, एक्सपोजर टाइम, डिटेक्शन फिल्टर) और टाइम लैप्स (इंटरवल, टोटल प्रोसीज) पैरामीटर्स को परिभाषित करें और इमेजिंग प्रोसेस शुरू करें। सांकेतिक मूल्यों के लिए, उदाहरण डेटासेट(अनुपूरक तालिका 1)की मेटाडेटा तालिका से परामर्श करें। परख के लिए है कि पिछले कई दिनों, नमूना कक्ष खोलने को कवर करने पर विचार कम से आंशिक रूप से वाष्पीकरण को कम करने के लिए ।
8. इमेज्ड भ्रूण की पुनः प्राप्ति और आगे की खेती
- जब इमेजिंग परख समाप्त हो गई है, तो ध्यान से नमूना कक्ष से मकड़जाल धारक को हटा दें।
- एक छोटे से तूलिका के साथ agarose फिल्म से भ्रूण अलग और उन्हें एक उचित लेबल माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए स्थानांतरित। स्लाइड को एक पुनः प्राप्त पकवान में रखें और संबंधित मानक पालन शर्तों के तहत इनक्यूबेट करें।
- प्रायोगिक तौर-तरीकों के बारे में, भ्रूणजीन पूरा होने पर अनुमान लगाएं। हैचिंग टाइम पॉइंट दृष्टिकोण के रूप में, पुनः प्राप्त व्यंजनों की अक्सर जांच करें और 24-अच्छी प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में व्यक्तिगत पालन शीशियों और ट्राइबोलियम लार्वा को ड्रोसोफिला लार्वा स्थानांतरित करें। कुओं को आधे तक ग्रोथ मीडियम से भरें। संबंधित मानक पालन शर्तों के तहत इनक्यूबेट।
- एक बार देखे गए व्यक्ति वयस्क होते हैं, उन्हें एक उपयुक्त संभोग साथी प्रदान करते हैं और कई दिनों के बाद संतान की जांच करें।
9. इमेज डेटा प्रोसेसिंग और मेटाडेटा डॉक्यूमेंटेशन
नोट: इमेज डेटा प्रोसेसिंग के लिए, इमेजजे व्युत्पन्न फिजी35 की सिफारिश की जाती है (imagej.net/Fiji/Downloads)। फिजी को स्थापना की आवश्यकता नहीं है और 32- साथ ही 64-बिट संस्करण उपलब्ध हैं। एलएसएफएम डेटा के लिए सबसे अधिक बार उपयोग किए जाने वाले प्रारूपों में से एक टैग किया गया इमेज फाइल प्रारूप (झगड़ा) है, जो झगड़ा कंटेनर के रूप में छवि के ढेर के भंडारण की अनुमति देता है।
- सभी जेड स्टैक के लिए जेड अधिकतम अनुमानों की गणना करें(इमेज | ढेर | जेड प्रोजेक्ट, अधिकतम तीव्रताचुनें) । अधिकतम अनुमान डेटा सरलीकरण दृष्टिकोण हैं जो स्थानिक आयामों की संख्या को तीन से घटाकर दो करते हैं। बैच प्रोसेसिंग के लिए फिजी स्क्रिप्ट प्रदान की जाती है(अनुपूरक फ़ाइल 1)।
- समय ढेर (टी ढेर) बनाने के लिए संबंधित जेड अधिकतम अनुमानों को संक्षिप्त करें। इन्हें एक झगड़ा कंटेनर में सहेजें। यदि लागू हो तो सभी रिकॉर्ड किए गए भ्रूण के साथ-साथ संबंधित दिशाओं और फ्लोरेसेंस चैनलों के लिए ऐसा करें।
- एक्स या वाई इमेज एक्सिस (इमेज |) के साथ भ्रूण के पूर्वकाल-पीछे की धुरी को संरेखित करने के लिए जेड एक्सिस के चारों ओर जेड और टी स्टैक घुमाएं | को बदलें घुमाएं)। सभी तीन छवि कुल्हाड़ियों और एक्स और वाई छवि कुल्हाड़ियों में टी ढेर के साथ जेड ढेर फसल इतना है कि केवल ंयूनतम बफर अंतरिक्ष (एक्स और वाई कुल्हाड़ियों के साथ 20-40 पिक्सल, जेड धुरी के साथ 5-10 छवियां) भ्रूण रहता है(छवि | | समायोजित करें एक्स और वाई अक्षों के लिए कैनवास आकार, छवि | ढेर | उपकरण | जेड धुरी के लिए स्लाइस कीपर) ।
- यदि लागू हो तो सभी दर्ज भ्रूण के साथ-साथ संबंधित दिशाओं के लिए व्यक्तिगत रूप से ऐसा करें। फ्लोरेसेंस चैनल, यदि लागू हो, समान रोटेशन और फसल मापदंडों के साथ संसाधित किया जाना चाहिए।
- मेटाडेटा को यथासंभव विस्तृत दस्तावेज करें। एक दिशानिर्देश के रूप में, उदाहरण डेटासेट की मेटाडेटा तालिका, जो प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में चित्रित की जाती है, का उपयोग किया जा सकताहै (अनुपूरक तालिका 1)।
10. डेटा विज़ुअलाइज़ेशन
नोट: यह डेटा विज़ुअलाइज़ेशन दिशानिर्देश मुख्य रूप से जेड अधिकतम प्रक्षेपण छवि मैट्रिस के निर्माण पर केंद्रित है जो कई दिशाओं और/या समय के साथ कई रिकॉर्ड किए गए भ्रूण दिखाते हैं । निम्नलिखित चरण डेटा विज़ुअलाइज़ेशन प्रक्रिया का वर्णन करते हैं जिसे प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में दिखाए गए आंकड़ों और वीडियो के निर्माण के लिए उदाहरण डेटासेट पर लागू किया गया था।
- कई दिशाओं के टी ढेर गठबंधन(छवि | ढेर | उपकरण | गठबंधन)और/या कई फ्लोरेसेंस चैनलों का विलय(छवि | रंग | चैनलोंको मर्ज करें) जैविक संरचना और/या ब्याज की प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए ।
- टी ढेर की तीव्रता को समायोजित करें(छवि | | समायोजित करें ब्राइटनेस/कंट्रास्ट)जैसा कि"सेट"फ़ंक्शन का उपयोग करके आवश्यक है। न्यूनतम प्रदर्शित मूल्य पृष्ठभूमि संकेत से थोड़ा ऊपर सेट किया जाना चाहिए, अधिकतम प्रदर्शित मूल्य एक सुविधाजनक विपरीत में परिणाम होना चाहिए । दोनों मूल्यों को दस्तावेज़ करें, क्योंकि उनका उपयोग संबंधित जेड स्टैक के लगातार समायोजन के लिए किया जा सकता है। "लागू करें"समारोह का उपयोग कर छाप समायोजन। प्रयोगात्मक तौर-तरीकों के आधार पर, समान मूल्यों के साथ सभी दर्ज भ्रूणों को संसाधित करने पर विचार करें।
- अलग फ़ाइलों के रूप में तीव्रता समायोजित टी ढेर सहेजें, गैर समायोजित टी ढेर ओवरराइड नहीं है। समर्पित छवि चयन कार्यों के साथ समायोजित टी स्टैक से उपयुक्त उप ढेर संकलित करें (उदाहरण के लिए, छवि | ढेर | उपकरण | स्लाइस कीपर)और असेंबल उपकरण का उपयोग करें(छवि | ढेर | असेंबल करें)इमेज ग्रिड बनाने के लिए जिसका उपयोग फिगर डिजाइन के लिए किया जा सकता है।
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Representative Results
हमारा प्रोटोकॉल नमूना कक्ष आधारित एलएसएफएमएस में तुलनात्मक फ्लोरेसेंस लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रयोगात्मक ढांचे का वर्णन करता है। उदाहरण के लिए, इस ढांचे का उपयोग दो या अधिक प्रजातियों के भ्रूणों (i) के भ्रूण, (ii) लाइनों के भ्रूणों के लिए किया जा सकता है जिसमें एक या अधिक जीन ों को खटखटाया जाता है प्लस जंगली प्रकार के नियंत्रण, (iii) एक ही ट्रांसजेनिक लाइन के कई भ्रूण, (iv) भ्रूण विभिन्न ट्रांसजेनिक लाइनों से, या (v) भ्रूण जो एक ही ट्रांसजीन ले जाते हैं , लेकिन विभिन्न जीनोमिक स्थानों पर। इस खंड में, हम पिछले दो परिदृश्यों के लिए उदाहरण प्रदान करते हैं।
हमारे पहले अनुकरणीय अनुप्रयोग में, हम तीन भ्रूणों की फ्लोरेसेंस सिग्नल गतिशीलता दिखाते हैं जो लगभग 1 दिन(चित्रा 4, अनुपूरक फिल्म 1)की अवधि में विभिन्न ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लाइनों(तालिका 2)से प्राप्त होते हैं। इन पंक्तियों के लिए, हमें इसी तरह के फ्लोरेसेंस पैटर्न की उम्मीद थी क्योंकि वे सभी विभिन्न संभवतः सर्वव्यापी और संविलियन सक्रिय प्रमोटरों के नियंत्रण में परमाणु-स्थानीयकृत EGFP/GFP व्यक्त करते हैं । हालांकि, हमारे तुलनात्मक लाइव इमेजिंग परिणाम बताते हैं कि अभिव्यक्ति पैटर्न में मजबूत स्थानिक अंतर हैं जो निश्चित रूप से परिवेश विचरण के कारण द्वितीयक प्रभाव नहीं हैं।
हमारे दूसरे आवेदन उदाहरण में, हम तीन भ्रूण है कि AGOC से प्राप्त के प्रदर्शन की तुलना {Zen1'#O (ला)-mEmerald} #1, #2 और #3 (Zen1'LA-mE #1, #2 और #3, क्रमशः) ट्रांसजेनिक ट्राइबोलियम sublines३६। इन सभी में एक ही पिग्गीबैक-आधारित ट्रांसजीन होता है जो एमईमेरल्ड-लिंक्ड37 लाइफएक्ट38 की अभिव्यक्ति की ओर जाता है जो ज़ेर्कनल्ट 139 प्रमोटर के नियंत्रण में है, जो सेरोसा विनिर्देश में शामिल एक ट्रांसक्रिप्शन कारक है। हमारे तुलनात्मक लाइव इमेजिंग परिणाम, जो गैस्ट्रुलेशन के दौरान सेरोसा विंडो बंद करने की प्रक्रिया को दर्शाते हैं, सुझाव देते हैं कि सबलाइन #2 अन्य दो सबलाइन(चित्रा 5, अनुपूरक फिल्म 2)की तुलना में एक उल्लेखनीय रूप से मजबूत समग्र संकेत प्रदान करता है। यह इंगित करता है कि ट्राइबोलियममें भी जीनोमिक संदर्भ का ट्रांसजीन के अभिव्यक्ति स्तर पर एक मजबूत प्रभाव हो सकता है जो अभिव्यक्ति कैसेट ले जाता है।
इस खंड में दिखाए गए सभी छह भ्रूणों की सफल पुनर्प्राप्ति संभव थी जैसा कि हमारे प्रोटोकॉल के चरण 8 में वर्णित है। उन सभी को पूरी तरह से कार्यात्मक और उपजाऊ वयस्कों(अनुपूरक तालिका 1,"पुनर्प्राप्ति" पंक्ति) में विकसित किया गया, यह दर्शाता है कि समग्र प्रक्रिया, बढ़ते से रिकॉर्डिंग तक, गैर-आक्रामक थी। गुणवत्ता नियंत्रण के इस स्तर पर आवश्यक है जब भी जंगली प्रकार के विकास की उंमीद है, उदाहरण के लिए, नियंत्रण भ्रूण है कि भ्रूण जिसमें एक या एक से अधिक जीन नीचे खटखटाया या बाहर खटखटाया जाता है के साथ एक साथ छवि रहे है के बारे में ।
प्रतिनिधि परिणाम बनाने के लिए उपयोग किए गए सभी डेटासेट संसाधनों के रूप में प्रदान किए जाते हैं जो विशेष रूप से एलएसएफएम नौसिखियों को अपने काम की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने में मदद करेंगे। डिजिटल ऑब्जेक्ट पहचानकर्ता आधारित डाउनलोड लिंक मेटाडेटा टेबल(पूरक तालिका 1,"डेटा एक्सेस"पंक्ति) में पाया जा सकता है।
चित्रा 1: प्रायोगिक ढांचे और बढ़ते विधि अवलोकन। (A)दस प्रोटोकॉल चरणों का फ्लोचार्ट जिसमें शॉर्ट रिमाइंडर और अपेक्षित समय का अनुमान लगाया गया है । तारक के साथ चिह्नित कार्यों को हर परख के दौरान नहीं किया जाना चाहिए, लेकिन परिस्थितियों के आधार पर । हरे बक्से ड्रोसोफिला और/या ट्राइबोलियमसे जुड़े चरणों का संकेत देते हैं, नीले बक्से माइक्रोस्कोपी से जुड़े चरणों को इंगित करते हैं । (ख)जाबवे धारक की डिटेल ड्राइंग । प्रस्तुत डिजाइन सिलेंडर आधारित क्लैंप तंत्र के लिए उपयुक्त है, जो आमतौर पर नमूना कक्ष आधारित LSFMs में उपयोग किया जाता है । विनिर्देश मिलीमीटर में हैं । धारक को तब तक बढ़ाया जा सकता है जब तक कि डिटेक्शन लेंस की कार्य दूरी का सम्मान किया जाता है। (ग)कई दिशाओं के साथ कई भ्रूणों की लाइव इमेजिंग के लिए रिकॉर्डिंग अनुक्रम । सबसे पहले, ऊपरी भ्रूण के जेड ढेर चार झुकाव, यानी 0 डिग्री, 90 डिग्री, 180 डिग्री और 270 डिग्री तक के साथ दर्ज किए जाते हैं। बाद में, नीचे दिए गए भ्रूण को डिटेक्शन लेंस के सामने ले जाया जाता है और रिकॉर्डिंग/रोटेशन अनुक्रम नए सिरे से शुरू होता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: एलएसएफएमएस के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर-आधारित अंशांकन चार्ट। चार्ट दिखाता है कि यदि एलएसएफएम को सही ढंग से कैलिब्रेट(ए)किया जाता है, या यदि कोई रोशनी(बी)या डिटेक्शन ऑफसेट(सी)है तो एक्स, वाई और जेड अधिकतम अनुमानों में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर कैसे दिखाई देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: संग्रह, dechorionation, बढ़ते और कई भ्रूण की इमेजिंग । (A) ट्राइबोलियम भ्रूण संग्रह अवलोकन। ऊपरी बाईं ओर की संख्या के अनुसार चरण 4 में चित्र उद्धृत किए जाते हैं। (ख)स्टेप 5 के दौरान इस्तेमाल होने वाली 6-वेल प्लेट के लिए तैयारी और ट्रांसफर स्कीम । बी 1 और बी 2 कुओं में पतला सोडियम हाइपोक्लोराइट (नाओसीएल) था, जो डिकेरियोनेशन को प्रेरित करता है। (ग)१०० माइक्रोन सेल छलनी, जिसका उपयोग भ्रूण को एक अच्छी तरह से दूसरे में स्थानांतरित करने के लिए किया जाता था, B2 कुएं के भीतर । ऊपरी विस्तार छवि सेल छलनी जाल के शीर्ष पर कई ट्राइबोलियम भ्रूण के एक करीबी से पता चलता है, कम विस्तार छवि आंशिक रूप से अलग chorion के साथ कई ट्राइबोलियम भ्रूण के एक संचरण प्रकाश स्टीरियो माइक्रोस्कोप छवि से पता चलता है । (घ)तीन घुड़सवार ट्राइबोलियम भ्रूण के साथ मकड़जाल धारक । भ्रूण, साथ ही उनके पूर्वकाल-पीछे कुल्हाड़ियों, स्लॉट छेद की लंबी धुरी के साथ गठबंधन किया गया था। (ई)तीन भ्रूणों की रिकार्डिंग के दौरान एलएसएफएम के नमूना कक्ष के भीतर मकड़जाल धारक का मूवमेंट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4: तुलनात्मक फ्लोरेसेंस #01691, #29724 और #24163 ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लाइनों से एक-एक भ्रूण की लाइव इमेजिंग। भ्रूण 20:00 घंटे की अवधि में दो (चार दर्ज की) दिशाओं के साथ दिखाया गया है (23:40 घंटे की कुल इमेजिंग अवधि से) । समय के साथ कोई गतिशील तीव्रता सुधार नहीं किया गया था। ड्रोसोफिला डेटासेट के लिए मेटाडेटा पूरक तालिका 1में पाया जा सकता है। ZA, छवि समायोजन के साथ जेड अधिकतम प्रक्षेपण। स्केल बार, 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: तुलनात्मक फ्लोरेसेंस जेन1'ला-एमई #1, #2 और #3 ट्रांसजेनिक ट्राइबोलियम सबलाइन से एक-एक भ्रूण की लाइव इमेजिंग। (क)भ्रूण को सेरोसा खिड़की बंद होने से ठीक पहले गैस्ट्रुलेशन के दौरान चार दिशाओं के साथ दिखाया गया है । (ख)भ्रूण 01:30 घंटे की अवधि में ventrally दिखाया गया है (118:00 घंटे की कुल इमेजिंग अवधि से) । छवि समायोजन समान न्यूनतम और अधिकतम प्रदर्शित मूल्यों के साथ किया गया था, समय के साथ कोई गतिशील तीव्रता सुधार नहीं किया गया था। ट्राइबोलियम डेटासेट के लिए मेटाडेटा अनुपूरक तालिका 1में पाया जा सकता है। डेटासेट(ए)में दिखाए गए मंच पर सिंक्रोनाइज्ड थे। ZA, छवि समायोजन के साथ जेड अधिकतम प्रक्षेपण। स्केल बार, 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| योग | मूलाधार | रोशनी लेंस | डिटेक्शन लेंस | कैमरा | हवाला |
| #1 | सेलुलर स्तर पर पूरे भ्रूण, बड़े पिक्सेल रिक्ति (छोटे डेटा मात्रा) | 2.5× आवर्धन संख्यात्मक एपर्चर 0.06 (वायु) | 10× आवर्धन संख्यात्मक अपर्चर 0.3 (पानी की सूई) | सीसीडी 1.4 मेगापिक्सल (1392×1040, 6.45 माइक्रोन पिच) | यह अध्ययन, ड्रोसोफिला41,ट्राइबोलियम20,41 |
| #2 | सेलुलर/उपकोशिकीय स्तर पर पूरे भ्रूण, छोटे पिक्सेल अंतर (बड़े डेटा मात्रा) | 2.5× आवर्धन संख्यात्मक एपर्चर 0.06 (वायु) | 20× आवर्धन संख्यात्मक अपर्चर 0.5 (पानी की सूई) | 5.5 मेगापिक्सल (2560×2160, 6.5 माइक्रोन पिच के साथ टीसीएमओ) | ट्राइबोलियम9 |
| #3 | उपकोशिकीय स्तर या विशेष अनुप्रयोगों पर भ्रूण के विशिष्ट क्षेत्र जैसे विच्छेदित जर्मबैंड की लाइव इमेजिंग42,43 | 5.0× आवर्धन संख्यात्मक एपर्चर 0.16 (हवा) | 40× आवर्धन संख्यात्मक अपर्चर 0.75 (पानी की सूई) | सीसीडी 1.4 मेगापिक्सल (1392×1040, 6.45 माइक्रोन पिच) | ट्राइबोलियम44 |
तालिका 1: एलएसएफएम का उपयोग करके ड्रोसोफिला और ट्राइबोलियम भ्रूण की लाइव इमेजिंग के लिए अनुशंसित रोशनी लेंस/डिटेक्शन लेंस/कैमरा संयोजन। सभी संयोजनों को पिछले अध्ययनों में सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है (संदर्भ पंक्ति देखें)। कृपया ध्यान दें कि अधिकांश नमूना कक्ष-आधारित एलएसएफएम पता लगाने के लिए पानी की सूई लेंस का उपयोग करते हैं, जो मुख्य रूप से 1.33 (जैसे ऑटोक्लेव नल के पानी या अन्य जलीय मीडिया) के अपवर्तक सूचकांक के साथ इमेजिंग बफ़र्स के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। अन्य अपवर्तक सूचकांकों के साथ इमेजिंग बफ़र्स का उपयोग40किया जा सकता है, लेकिन यह ऑप्टिकल सिस्टम के कुछ गुणों को बदलता है, जैसे कामकाजी दूरी।
| क़तारें लगाना | जीनोटाइप | फ्लोरोफोर अभिव्यक्ति |
| #01691 | y [1] w [67c23]; पी {w [+mC]=Ubi-GFP.nls}ID-2; पी {यूबीआई-जीएफपी.एनएलएस}आईडी-3 | पॉलीबॉफ्टाइन प्रमोटर के नियंत्रण में एनएलएस-जीएफपी |
| #29724 | w [*]; पी {w [+mC]=Tub84B-EGFP.NLS}3 | अल्फा-ट्यूबलिन 84B प्रमोटर के नियंत्रण में एनएलएस-जीएफपी |
| #24163 | w [*]; पी {w [+mC]=His2Av-EGFP.C}2/SM6a | सभी कोशिकाओं में EGFP-लेबल हिस्टोन 2A संस्करण |
तालिका 2: पहले आवेदन उदाहरण में उपयोग की जाने वाली तीन ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लाइनें। "लाइन" कॉलम ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर (bdsc.indiana.edu) स्टॉक नंबर को संदर्भित करता है।
अनुपूरक वीडियो 1: #01691, #29724 और #24163 ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लाइनों से एक-एक भ्रूण की तुलनात्मक फ्लोरेसेंस लाइव इमेजिंग। प्रत्येक ट्रांसजेनिक लाइन संभवतः सर्वव्यापी और संविलियन रूप से सक्रिय प्रमोटर के नियंत्रण में परमाणु-स्थानीयकृत ईजीएफपी/जीएफपी को व्यक्त करती है । ZA, छवि समायोजन के साथ जेड अधिकतम प्रक्षेपण। समय के साथ कोई गतिशील तीव्रता सुधार नहीं किया गया था। ZA, छवि समायोजन के साथ जेड अधिकतम प्रक्षेपण। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक वीडियो 2: जेन1'ला-एमई #1, #2 और #3 ट्रांसजेनिक ट्राइबोलियम सबलाइन से एक-एक भ्रूण की तुलनात्मक फ्लोरेसेंस लाइव इमेजिंग। प्रत्येक ट्रांसजेनिक सबलाइन ज़ेरकनल्ट 1 प्रमोटर के नियंत्रण में mEmerald-लेबल लाइफएक्ट को व्यक्त करता है, जो सेरोसा विनिर्देश में शामिल एक ट्रांसक्रिप्शन कारक है। कृपया ध्यान दें कि Zen1'la-mE #1 भ्रूण सेरोसा खिड़की बंद होने के ठीक बाद सेरोसा के भीतर लगभग 90 ° बदल जाता है। डेटासेट को चित्रा 4 एमें दिखाए गए मंच पर सिंक्रोनाइज्ड किया गया था । छवि समायोजन समान न्यूनतम और अधिकतम प्रदर्शित मूल्यों के साथ किया गया था, समय के साथ कोई गतिशील तीव्रता सुधार नहीं किया गया था। भ्रूण वेंट्रैल और पार्श्व 48:00 एच ZA, छवि समायोजन के साथ जेड अधिकतम प्रक्षेपण की अवधि में दिखाया गया है । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक फ़ाइल 1: फिजी बैच प्रोसेसिंग स्क्रिप्ट एक फ़ोल्डर के भीतर सभी जेड स्टैक से जेड अधिकतम अनुमानों की स्वचालित गणना के लिए। स्क्रिप्ट फिजी में ड्रैग-एंड-ड्रॉप के माध्यम से खोली जा सकती है। शुरुआत में ("रन") केवल इनपुट फ़ोल्डर निर्दिष्ट किया जाना चाहिए। आउटपुट सबफोल्डर ("जेड अधिकतम अनुमान") स्वचालित रूप से बनाया जाता है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
अनुपूरक तालिका 1: लंबी अवधि के लाइव इमेजिंग डेटासेट डीएस0001-6 के लिए मेटाडेटा और पैरामीटर। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
एलएसएफएम के विशेष अनुप्रयोग क्षेत्रों में से एक विकासात्मक जीव विज्ञान है। इस विधा में जीवित नमूनों को देखना महत्वपूर्ण है, अन्यथा मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रियाओं को गतिशील तरीके से वर्णित नहीं किया जा सकता है। नमूना कक्ष आधारित LSFMs में एक साथ लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रयोगात्मक रूपरेखा, जैसा कि यहां वर्णित है, दो प्रमुख कारणों के लिए सुविधाजनक है ।
परिवेश विचरण, जो अनुक्रमिक लाइव इमेजिंग में अपरिहार्य है, समर्थक सक्रिय रूप से संबोधित किया जा सकता है । कीट भ्रूण से जुड़े लाइव इमेजिंग में, हम देखते हैं जैसे, निम्नलिखित संवेदनशीलता। अंडा संग्रह संस्कृतियों भ्रूण संग्रह के समय अलग उम्र हो सकती है। ड्रोसोफिलामें यह दर्शाया गया है कि इससे संतान के गुण प्रभावितहोतेहैं . हालांकि उचित रूप से desynchronized संस्कृतियों के साथ काम करना एक विकल्प है, सिंक्रोनाइज्ड संस्कृतियों के साथ एक साथ इमेजिंग काफी अधिक सुविधाजनक है। ड्रोसोफिला- और ट्राइबोलियमआधारित प्रतिनिधि परिणाम दोनों सिंक्रोनाइज्ड अंडा संग्रह संस्कृतियों से प्राप्त होते हैं, और हम आत्मविश्वास से बाहर कर सकते हैं कि विभिन्न फ्लोरेसेंस विशेषताएं माता-पिता की सेनेसेंस का अनपेक्षित प्रभाव हैं।
डेफोरियनेशन एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि सोडियम हाइपोक्लोराइट के लंबे समय तक संपर्क में रहने से भ्रूण की व्यवहार्यता कम हो जाती है। असुविधाजनक रूप से, सोडियम हाइपोक्लोराइट की आयनिक ताकत समय के साथ कम हो जाती है। आयनिक शक्ति के माप संभव हैं46,लेकिन श्रमसाध्य और बोझिल। एक साथ लाइव इमेजिंग में, एक मास्टर मिश्रण dechorionation से जुड़े 6-अच्छी तरह से प्लेटों की तैयारी के दौरान सभी लाइनों और/या शर्तों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
यहां तक कि कुशल हवा की स्थिति वाली प्रयोगशालाओं में, छोटे लेकिन अनियमित तापमान में उतार-चढ़ाव अपरिहार्य हैं और तापमान नियंत्रित9 नमूना कक्ष-आधारित एलएसएफएम को भी प्रभावित करते हैं । सैद्धांतिक रूप से, नमूना कक्ष में तापमान लॉग इन किया जा सकता है, लेकिन एक सटीक पुनरावृत्ति संभव नहीं है । एक साथ लाइव इमेजिंग में, ये उतार-चढ़ाव भी होते हैं, लेकिन वे इसी तरह सभी भ्रूणों को प्रभावित करते हैं।
व्यावहारिक दृष्टिकोण से, कई भ्रूणों की एक साथ इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल थ्रूपुट को बढ़ाता है। लाइव इमेजिंग में, ब्याज की विकास प्रक्रिया की अवधि यह निर्धारित करती है कि किसी निश्चित अवधि के भीतर कितने परखें आयोजित की जा सकती हैं, जो एलएसएफएमएस तक पहुंच सीमित होने पर एक महत्वपूर्ण विचार है। दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग के लिए प्रमुख उदाहरण लाइव इमेजिंग परख हैं जिसमें कोशिकाओं को ट्रैक किया जाता है। इस तरह के प्रयोग आमतौर पर लंबे विकास की अवधि में होते हैं। जबकि ड्रोसोफिला के भ्रूणीय विकास में केवल एक दिन का तापमान47 होताहै , ट्राइबोलियम में लगभग सात दिन लगते हैं48. इसलिए, इस प्रजाति के लिए, समानांतरीकरण एक उचित समय सीमा के भीतर रहने के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से परख के बारे में जहां कई शर्तों की तुलना की जाती है।
थ्रूपुट, यानी, भ्रूण की संख्या जो एक साथ चित्रित की जाती है, मुख्य रूप से दो कारकों द्वारा सीमित है: पहले नमूना कक्ष के भीतर वाई एक्सिस के साथ उपलब्ध स्थान है। जब सबसे निचले भ्रूण के बारे में छवि होने के लिए है, ऊपरवाला भ्रूण इमेजिंग बफर नहीं छोड़ा जाना चाहिए था । इसके अलावा, मकड़जाल धारक और संबद्ध समर्थन प्रणाली इतनी लंबी नहीं होनी चाहिए कि यह जेड स्टैक रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के दौरान लड़खड़ा जाए और/या घबराहट काफ़ी हो । दूसरा अभीष्ट लौकिक संकल्प है । प्रति भ्रूण रिकॉर्डिंग समय प्रति दो आयामी छवि (आमतौर पर 10-200 एमएस) प्रति जेड स्टैक (आमतौर पर कई सौ), चैनलों की संख्या (एक और तीन के बीच सामान्य), दिशाओं की संख्या (आमतौर पर एक और आठ के बीच) और अनुवाद और रोटेशन आंदोलनों के लिए एक सेटअप-निर्भर कारक (१.२ और १.५ के बीच अनुमानित) के साथ जोखिम समय गुणा करके अनुमानित किया जा सकता है । इच्छित लौकिक संकल्प का अनुपात और प्रति भ्रूण रिकॉर्डिंग समय भ्रूण की अधिकतम संख्या को इंगित करता है जिसे एक साथ इमेज किया जा सकता है। संक्षेप में, हमारा प्रोटोकॉल अनुक्रमिक लाइव इमेजिंग से मध्यम थ्रूपुट तक आगे बढ़ने के लिए उपयुक्त है, लेकिन आम तौर पर उच्च थ्रूपुट के रूप में माना जाता है। उत्तरार्द्ध के लिए, माइक्रोस्कोपस्लाइड49,50, 51या अच्छी तरह से प्लेटों52 के लिए उपयुक्तएलएसएफएम पर विचार किया जा सकता है, लेकिन इन कार्यान्वयनों में आमतौर पर अन्य सीमाएं होती हैं।
प्रायोगिक प्रश्न के आधार पर और इसलिए इमेजिंग मापदंडों के साथ संयोजन के रूप में रोशनी लेंस/डिटेक्शन लेंस/कैमरा संयोजन, साथ ही छवि LSFM डेटासेट उनके कच्चे राज्य में विशाल भंडारण स्थान की आवश्यकता हो सकती है । इस मुद्दे को प्रदान किए गए ड्रोसोफिला उदाहरण डेटासेट(अनुपूरक तालिका 1), यानीडीएस0001-3 पर विचार करके सबसे अच्छा सचित्र किया जा सकता है। प्रत्येक दो आयामी कच्चे छवि के बारे में २.८ Megabytes की एक डेटा की मात्रा थी, प्रत्येक कच्चे जेड ढेर १२० विमानों के शामिल है, और सभी तीन भ्रूण चार दिशाओं के साथ दर्ज किए गए १४३ बार की कुल । परिणामस्वरूप, कच्चे डेटासेट ने लगभग आधा टेराबाइट पर कब्जा कर लिया। इमेज डेटा प्रोसेसिंग के माध्यम से, यानी, ज़िप-आधारित संपीड़न के साथ सभी स्थानिक आयामों (चरण 9) के साथ फसल, डेटा की मात्रा 53.3 गीगाबाइट तक कम हो गई थी, जो प्रारंभिक राशि का लगभग 10% है। टेराबाइट शासन में डेटासेट को संसाधित करने के लिए, बिगडेटाव्यूयर53 प्लगइन, जो फिजी में पूर्व-स्थापित है(प्लगइन्स | बिगडाटाव्यूअर),की सिफारिश की जाती है।
प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उल्लिखित पांच परिदृश्यों के अलावा, हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग आरएनएआई नॉकडाउन प्रभावों के प्रभाव की विशेषता के लिए भी किया जा सकता है, जो ट्राइबोलियम54में एक लोकप्रिय दृष्टिकोण है। हालांकि, यह यौगिकों (जैसे, कीटनाशकों या अन्य जैव रासायनिक तनावों) के विश्लेषण के लिए सीमित उपयोग का है यदि इन्हें इमेजिंग बफर के माध्यम से लागू किया जाना चाहिए - जो सबसे सीधा दृष्टिकोण है - क्योंकि नियंत्रण भ्रूण की एक साथ इमेजिंग संभव नहीं है।
हमने अपने कस्टम-निर्मित माइक्रोस्कोप8,55में से एक का उपयोग करके अपने प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया, लेकिन यह किसी भी नमूना कक्ष-आधारित सेटअप पर लागू होता है, उदाहरण के लिए, ओपनएसपीआईएम56 या अधिकांश वाणिज्यिक एलएसएफएम। यह प्रोटोकॉल एलएसएफएम से जुड़ी संसाधन स्थापना पहल का पूरक है जिसका उद्देश्य नौसिखियों को सक्रिय रूप से प्रकाश पत्रक आधारित प्रौद्योगिकी को अपनी शोध योजनाओं में एकीकृत करने के लिए प्रोत्साहित करना है। अधिकांश विश्वविद्यालय और संस्थान आजकल अच्छी तरह से सुसज्जित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी सुविधाएं57संचालित करते हैं। ये आमतौर पर एक या एक से अधिक चैंबर आधारित LSFMs के लिए उपयोग प्रदान करते हैं, लेकिन कर्मचारियों को हाथ में हर वैज्ञानिक सवाल के लिए उचित प्रयोगात्मक समाधान की उंमीद नहीं की जा सकती है ।
हमारे परिणाम बताते हैं कि हमारा प्रायोगिक ढांचा ड्रोसोफिला और ट्राइबोलियमके लिए उपयुक्त है । हमें विश्वास है कि हमारे तुलना केंद्रित प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य कीट प्रजातियों के भ्रूणजीन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक एलएसएफएम आधारित दृष्टिकोण को जंगली प्रकार की तुलना करने के लिए लागू किया गया है और स्कूटी फ्लाई मेगासेलिया अब्दिता58में नॉकडाउन विकास, और अनुवर्ती अध्ययन भी हमारे बढ़ते तरीके से लाभान्वित होंगे। इसके अलावा, दो-देखा क्रिकेट ग्रिलस bimaculatus विशेष रूप से फ्लोरेसेंस लाइव इमेजिंग५९ के लिए डिजाइन की ट्रांसजेनिक लाइनें उपलब्ध हैं, लेकिन केवल वर्तमान में उपलब्ध तुलना केंद्रित प्रोटोकॉल६० पारंपरिक उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए करना है और इसलिए तीन आयामी छवि अधिग्रहण या रोटेशन नमूना पता नहीं है । इसके अतिरिक्त, यह पहले से ही दिखाया गया है कि जाब धारक जेब्राफिश के लिए एक सुविधाजनक विकल्प है, जिसके भ्रूण भ्रूण61के दौरान उनके आकार को काफी बदलते हैं। हमारे प्रोटोकॉल का एक अनुकूलन, जिसके लिए मूल रूप से कोई अनुकूलन प्रयास की आवश्यकता नहीं है, इस मॉडल जीव के लिए उपरोक्त वर्णित लाभ भी प्रदान करेगा।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम अर्नेस्ट एच के स्टेल्जर को अपने संसाधनों के साथ-साथ पांडुलिपि के बारे में उनकी मूल्यवान टिप्पणियों का उपयोग करने के अवसर के लिए धन्यवाद देते हैं, ट्राइबोलियम लाइव इमेजिंग के साथ समर्थन के लिए अनीता एंडरल, तकनीकी सहायता के लिए स्वेन प्लाथ के साथ-साथ इलन डेविस, निकोल ग्रिडर और गेरोल्ड शुबिगर ब्लूमिंगटन स्टॉक सेंटर के माध्यम से अपने ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लाइनों को साझा करने के लिए।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100 µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
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