样品室光片荧光显微镜中多个昆虫胚胎的同步实时成像

Summary

光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。比较研究中的一个主要问题是环境差异。我们的协议描述了多个标本同时进行实时成像的实验框架，因此，主动解决这个问题。

Abstract

基于光片的荧光显微镜为研究多个生物相关尺度上的复杂过程提供了有效的解决方案。样品室设置是发育生物学的最佳选择，这些设置是专门为保持标本的三维完整性而设计的，通常具有样品旋转功能。例如，它们被用来记录果蝇 德罗索菲拉褪黑麦加斯特 和红面粉甲虫 三宝座的整个胚胎形态。然而，许多可用的活成像协议只为单个胚胎提供实验框架。特别是对于比较研究，这种方法不方便，因为顺序成像标本受环境方差的影响。此外，这限制了在给定时间内可以检测的标本数量。我们为同步实时成像提供一个实验框架，以增加基于样品室的设置的吞吐量，从而确保所有标本的类似环境条件。首先，我们为光片荧光显微镜提供校准指南。其次，我们提出了一种与样本旋转相容的多个胚胎的安装方法。第三，我们提供示范性的三维D 罗索菲拉活成像数据集，为此，我们将三条转基因线与荧光标记的核以及 三聚氰胺并列，为此我们比较了携带相同转基因但在不同基因组位置的三条转基因子系的性能。我们的协议是专门为比较研究设计的，因为它主动解决环境方差，这总是存在于连续实时成像中。这对于定量分析和异常表型的定性尤其重要，例如，从淘汰实验中产生的表型。此外，它增加了总吞吐量，当光片荧光显微镜的获取有限时，这非常方便。最后，建议的安装方法可以适应其他昆虫物种和进一步的模型生物，如斑马鱼，基本上没有优化的努力。

Introduction

荧光显微镜是生命科学中最重要的成像技术之一，特别是在细胞和发育生物学方面。在共焦荧光显微镜¹中，这是自20世纪90年代中期以来最先进的三维荧光成像技术，同一镜头用于荧光激发和发射光检测。照明激光束激发照明/检测轴沿线的所有荧光素，在通过针孔检测之前，对各自的对焦信号进行区分。因此，对于每个二维图像，整个标本都会被照亮。因此，对于每个三维图像，即一叠空间连续的二维图像，整个标本被照亮几十到几百倍^2，这促进光漂白和光毒性^3。

近二十年前，光片技术⁴ 成为三维荧光成像的有前途的替代品，成为发展生物学⁵的宝贵工具。在这种方法中，照明和检测是脱钩的。照明透镜用于在垂直排列的检测透镜的焦平面内生成深度只有几微米的光片。因此，对于每个二维图像，只有焦平面周围的细平面体积被照亮。因此，对于每个三维图像，整个标本只被照亮一次，这强烈地降低了光漂白和光毒性^6。因此，光片荧光显微镜（LSFMs）为研究多个生物相关尺度的复杂过程提供了有效的解决方案，因此，在发育生物学中具有特殊价值，在亚细胞水平上必须分析高达几毫米的标本。

从历史上看，LSFM一直以样品室为基础....

Protocol

1. 筹备工作

1. 为适合科学问题的 LSFM 选择照明镜头/检测镜头/相机组合，并设置显微镜。视场的大小是相机芯片大小的商量和检测镜头的放大倍数。照明透镜应选择，以便整个视野被大致平面光片³⁴覆盖。 表1中列出了三个推荐组合。
2. 要准备阿加罗斯别名和检索菜肴，请将 2 克低熔性蔗糖加入 200 mL 高压自来水中，并在 600-800 W 的微波炉中加热混合物，直到所有高糖颗粒溶解。在 1.5 mL 或 2 mL 反应管中准备几个 1 mL 的阿加罗斯阿加罗斯别名，然后用 agarose 填充几个 90 毫米的培养皿 3-5 毫米高。在 4 °C 时存储凝固的阿里报价和菜肴。
3. 对于 Drosophila: 要准备新鲜的饲养小瓶，请烹饪足够数量的定制或市售 的 Drosophila 介质，将 5-15 mL 传输到宽小瓶中，并将它们储存在 4 °C。 要准备产蛋菜肴，请将 1 克低熔性蔗糖加入 50 mL 的高压自来水中，并在 600-800 W 的微波炉中加热混合物，直到所有高糖颗粒溶解。让混合物冷却到45°C，然后加入50mL果汁（最好是苹果或红葡萄），并彻底混合。将混合物倒入 35 mm + Petri 菜肴中，并在 4 °C 时储存凝固的产蛋菜肴。
4. 对于 三叶草:要准备生长介质，通过710μm网状大小筛子传递全麦面粉....

Results

我们的协议描述了基于样品室 LSFMs 的比较荧光实时成像的实验框架。例如，该框架可用于并列两个或两个以上物种的胚胎，（ii） 一个或多个基因被击倒的线状胚胎加上野生型对照组:（iii） 同一转基因系的多个胚胎:（iv） 来自不同转基因系的胚胎，或（v） 携带相同转基因基因的子线胚胎，但在不同的基因组位置。在本节中，我们为最后两个方案提供示例。

在我们的第一个示范应用中，我们展示了三个胚胎的荧光信号动力学，这些胚胎来自不同的转基因嗜血管（表2），持续约1天（图4，辅助电影1）。对于这些线，我们预计荧光模式相当相似，因为所有这些模式都表达了核局部EGFP/GFP在不同可能无处不在和构成活跃的促进者的控制下。然而，我们的比较活成像结果表明，表达模式存在很强的空间差异，由于环境方差，这些差异肯定不是次要影响。

在我们的第二个应用示例中，我们比较了来自 AGOC[Zen1'#O（LA）-mE.......

Discussion

LSFM 的独家应用领域之一是发育生物学。在这个学科中，观察活的标本很重要，否则无法动态地描述形态遗传过程。此处描述的基于样品室 LSFM 的同步实时成像实验框架很方便，原因有二。

环境方差是连续实时成像中不可避免的，可以主动解决。在与昆虫胚胎相关的活成像中，我们看到以下易感性。在胚胎采集时，卵子收集培养可能有不同的年龄。在 德罗索菲拉，已经证明，这影响后代⁴⁵的素质。虽然使用适当的去同步文化是一种选择，但与同步文化同步成像要方便得多。基于 嗜血杆菌和 三叶草的代表性结果都源于同步的卵子收集培养，我们可以自信地排除不同的荧光特征是父母衰老的意外效应。

减孕是关键一步，因为长期接触次氯酸钠会降低胚胎存活率。不方便的是，次氯酸钠的离子强度会随着时间的流变而降低。测量离子强度是可能的^46，但费力和繁琐。在同步现场成像中，在准备与减压相关的 6 井板时，可用于所有线路和/或条件的主组合。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 孔板	Orange Scientific	4430500
24 孔板	Orange Scientific	4430300	仅用于涉及 Tribolium
35 mm 和 Oslash 的实时成像;培养皿	Fisher Scientific	153066	仅用于涉及 Drosophila 的实时成像。
90 毫米 & 斜线;培养皿	Fisher Scientific	L9004575
100 µm 目大小的细胞过滤器	BD Biosciences	352360
250 µm 网孔尺寸筛	VWR International	200.025.222-038	仅用于涉及 Tribolium
300 和微的实时成像;m 网孔尺寸筛	VWR International	200.025.222-040	仅用于涉及 Tribolium
710 和微的实时成像;m 网孔尺寸筛	VWR International	200.025.222-050	仅用于涉及 Tribolium
800 和微的实时成像;m 目尺寸筛	VWR International	200.025.222-051	仅用于涉及 Tribolium
405 细小麦粉	Demeter e.V.	SP061006	仅用于涉及 Tribolium
市售果蝇培养基	Genesee Scientific	66-115	仅用于涉及 果蝇 / 定制的 果蝇 培养基也可以使用
荧光微球，1.0 µm Ø	Thermo Fisher Scientific	T7282
非活性干酵母	Genesee Scientific	62-108
低熔点琼脂糖	Carl Roth	6351.2
窄小瓶	Genesee Scientific	32-109	仅用于涉及 果蝇
小油漆刷	VWR International	149-2121
次氯酸钠 （NaOCl），~12% 活性 Cl	Carl Roth	9062.3	注意：次氯酸钠是腐蚀性
的全麦面粉	Demeter e.V.	SP061036	仅用于涉及 Tribolium / 英国的实时成像：全麦面粉
宽瓶	Genesee Scientific	32-110	仅用于涉及 Drosophila