Summary
Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie ist das wertvollste Werkzeug in der Entwicklungsbiologie. Ein wichtiges Thema in vergleichenden Studien ist die Varianz der Umgebung. Unser Protokoll beschreibt ein experimentelles Framework für die gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Proben und befasst sich daher proaktiv mit diesem Problem.
Abstract
Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie bietet effiziente Lösungen, um komplexe Prozesse auf mehreren biologisch relevanten Skalen zu untersuchen. Probenkammer-basierte Setups, die speziell entwickelt wurden, um die dreidimensionale Integrität der Probe zu erhalten und in der Regel Probenrotation aufweisen, sind die beste Wahl in der Entwicklungsbiologie. Zum Beispiel wurden sie verwendet, um die gesamte embryonale Morphogenese der Fruchtfliege Drosophila melanogaster und des Rotmehlkäfers Tribolium castaneumzu dokumentieren. Viele verfügbare Live-Bildgebungsprotokolle bieten jedoch nur experimentelle Frameworks für einzelne Embryonen. Gerade bei Vergleichsstudien sind solche Ansätze unbequem, da sequenzielle abgebildete Proben von der Umgebungsvarianz beeinflusst werden. Darüber hinaus begrenzt dies die Anzahl der Proben, die innerhalb einer bestimmten Zeit untersucht werden können. Wir bieten einen experimentellen Rahmen für die gleichzeitige Live-Bildgebung, der den Durchsatz in Probenkammer-basierten Setups erhöht und somit ähnliche Umgebungsbedingungen für alle Proben gewährleistet. Zunächst bieten wir eine Kalibrierrichtlinie für Lichtbogenfluoreszenzmikroskope an. Zweitens schlagen wir eine Montagemethode für mehrere Embryonen vor, die mit der Probenrotation kompatibel ist. Drittens bieten wir beispielhafte dreidimensionale Live-Imaging-Datensätze von Drosophila, für die wir drei transgene Linien mit fluoreszierend markierten Kernen sowie von Triboliumgegenüberstellen, für die wir die Leistung von drei transgenen Sublinien vergleichen, die dasselbe Transgen tragen, aber an verschiedenen genomischen Stellen. Unser Protokoll wurde speziell für vergleichende Studien entwickelt, da es proaktiv die Umgebungsvarianz anspricht, die immer in der sequenziellen Live-Bildgebung vorhanden ist. Dies ist besonders wichtig für quantitative Analysen und Die Charakterisierung von aberrationalen Phänotypen, die z.B. aus Knockout-Experimenten resultieren. Darüber hinaus erhöht es den Gesamtdurchsatz, was sehr praktisch ist, wenn der Zugang zu Lichtblattfluoreszenzmikroskopen begrenzt ist. Schließlich kann die vorgeschlagene Montagemethode für andere Insektenarten und weitere Modellorganismen, z.B. Zebrafische, ohne Optimierungsaufwand angepasst werden.
Introduction
Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine der wichtigsten bildgebenden Verfahren in den Biowissenschaften, insbesondere in der Zell- und Entwicklungsbiologie. Bei konfokalen Fluoreszenzmikroskopen1, die seit Mitte der 1990er Jahre auf dem Stand der dreidimensionalen Fluoreszenz-Bildgebung sind, wird dieselbe Linse für die Fluorophorerregung und Dieerkennung von Emissionslicht verwendet. Der Beleuchtungslaserstrahl regt alle Fluorophore entlang der Beleuchtungs-/Detektionsachse an und das jeweilige Out-of-Fokus-Signal wird vor der Erkennung durch ein Loch diskriminiert. Somit wird für jedes zweidimensionale Bild die gesamte Probe beleuchtet. Folglich wird für jedes dreidimensionale Bild, d.h. ein Stapel räumlich aufeinander folgender zweidimensionaler Bilder, die gesamte Probe mehrere Dutzend bis einige hundert mal2beleuchtet, was Photobleichungen und Phototoxizität3fördert.
Vor fast zwanzig Jahren entwickelte sich die Lichtbogentechnologie4 als vielversprechende Alternative zur dreidimensionalen Fluoreszenz-Bildgebung und wurde so zu einem wertvollen Werkzeug in der Entwicklungsbiologie5. Dabei werden Beleuchtung und Erkennung entkoppelt. Die Beleuchtungslinse wird verwendet, um eine Lichtplatte mit einer Tiefe von nur wenigen Mikrometern innerhalb der Brennebene der senkrecht angeordneten Detektionslinse zu erzeugen. Daher wird für jedes zweidimensionale Bild nur ein dünnes planares Volumen um die Brennebene beleuchtet. Folglich wird für jedes dreidimensionale Bild die gesamte Probe nur einmal beleuchtet, was die Photobleaching und Phototoxizität stark verringert6. Aus diesem Grund bieten Lichtbogenfluoreszenzmikroskope (LSFMs) effiziente Lösungen zur Untersuchung komplexer Prozesse auf mehreren biologisch relevanten Skalen und sind daher von besonderem Wert in der Entwicklungsbiologie, wo Proben bis zu mehreren Millimetern auf subzellulärer Ebene analysiert werden müssen.
In der Vergangenheit waren LSFMs stichprobenkammerbasiert7,8. In diesen Setups sind die Beleuchtungsachsen (x) und die Erkennungsachse (z) in der Regel senkrecht zur Gravitationsachse (y) angeordnet. Probenkammern bieten reichlich experimentelle Freiheit. Erstens bieten sie große bildgebende Pufferkapazitäten, was wiederum den Einsatz eines Perfusionssystems zur Kontrolle der Umwelt erleichtert, z. B. zur Aufrechterhaltung einer bestimmten Temperatur9 oder zur Anwendung biochemischer Stressoren. Darüber hinaus unterstützen sie kundenspezifische Montagemethoden10, die auf die jeweiligen experimentellen Bedürfnisse zugeschnitten sind, während die dreidimensionale, in einigen Fällen dynamische11-Integrität der Probe erhalten bleibt. Darüber hinaus sind Probenkammer-basierte Setups in der Regel mit einer Rotationsfunktion ausgestattet, die verwendet wird, um die Proben um die y-Achse zu drehen und sie so in zwei, vier oder sogar mehr Richtungen abzubilden. Da Embryonen von häufig verwendeten Modellorganismen im Kontext der Mikroskopie relativ große, aufeinander folgende Bildgebung entlang der ventral-dorsalen, lateralen und/oder vorderen-hinteren Körperachsen sind, bietet eine umfassendere Darstellung. Dies ermöglicht z.B. die langfristige Verfolgung von Zellen, die sich entlang komplexer dreidimensionaler Migrationspfadebewegen 12,13.
Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie wurde ausgiebig eingesetzt, um die embryonale Morphogenese von Drosophila melanogasterzu untersuchen, sowohl systematisch14,15 als auch mit einem spezifischen Fokus auf die biophysikalischen Aspekte der Entwicklung. Zum Beispiel wurde es verwendet, um hochauflösende morphogenetische Daten zu sammeln, um eine biomechanische Verbindung zwischen Endoderm-Invagination und Achsverlängerung während der Keimbanddehnung16 zu erkennen und den komplexen Zellfluss weiter mit Krafterzeugungsmustern während der Gastrulation17in Beziehung zu setzen. Es wurde auch mit anderen modernsten Techniken kombiniert, z.B. Optogenetik, um die Regulierung der Wnt-Signalisierung während der vorderen posterioren Musterung in der Epidermis18zu untersuchen.
Das Studium nur einer Art gibt jedoch keine Erkenntnisse über die Entwicklung der Entwicklung. Um die Embryogenese im phylogenetischen Kontext zu verstehen, wurde intensiv an alternativen Insektenmodellorganismen geforscht. Eine der am umfassendsten untersuchten Arten ist der Rotmehlkäfer Tribolium castaneum, ein wirtschaftlich relevanter gelagerter Getreideschädling19, dessen embryonale Morphogenese ebenfalls bereits systematisch mit LSFM20abgebildet wurde. Die embryonale Morphogenese dieser beiden Arten unterscheidet sich in mehreren Aspekten bemerkenswert, z.B. der Segmentierungsmodus21, sowie die Bildung und degradierung von extraembryonalen Membranen22. Letzterer Aspekt wurde bereits mit LSFMs ausgiebig analysiert. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Serosa, ein extraembryonales Gewebe, das den Tribolium-Embryo vor verschiedenen Gefahren für den großteil seiner Embryogenese23,24schützt und schützt, auch als morphogenetischer "Treiber" für seinen eigenen Entzugsprozess während des rückenförmigen Verschlusses25fungiert. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass während der Gastrulation ein bestimmter Bereich des Blastoderms an der Vitelline-Membran verankert bleibt, um asymmetrische Gewebebewegungen zu erzeugen26 und dass die regionalisierte Gewebefluidisierung es den Zellen ermöglicht, die Serosa-Kante während des Serosa-Fensterverschlusses sequenziell zu verlassen27.
In allen oben genannten Drosophila-und Tribolium-assoziiertenStudien wurden kammerbasierte LSFMs verwendet. In den meisten wurde die Embryos in mehreren Richtungen mit hilfe der Probenrotationsfunktion aufgezeichnet. Obwohl nicht ausdrücklich angegeben, kann davon ausgegangen werden, dass sie einzeln und damit unabhängig voneinander in sequenziellen Live-Imaging-Assays aufgezeichnet wurden, ähnlich wie unsere früheren Arbeiten an Tribolium20,28. In bestimmten Szenarien ist ein solcher Ansatz akzeptabel, aber insbesondere bei quantitativen Vergleichsansätzen kann die Umgebungsvarianz die Ergebnisse verzerren. Zum Beispiel ist es seit langem bekannt, dass die Entwicklungsgeschwindigkeit von Insekten temperaturabhängigist 29, aber eine neuere Studie legt weiter nahe, dass in Drosophila,Temperatur kann auch die Konzentration von Morphogenen beeinflussen30. Sollten daher bestimmte Merkmale der Embryogenese, z. B. die dynamischen Proportionen, Teilungsraten und Migrationsgeschwindigkeiten der Zellen, genau quantifiziert werden, sind ausreichende Wiederholungen ohne Umgebungsvarianz erforderlich. Dies minimiert Standardabweichungen und Standardfehler, was wiederum die Gegenüberstellung mit anderen, auch nur geringfügig divergierenden Versuchsbedingungen erleichtert.
Beispielkammerbasierte LSFMs sind jedoch in erster Linie für Tests mit hohem Gehalt und nicht für Tests mit hohem Durchsatz konzipiert. Im Gegensatz zu konfokalen Mikroskopen, die typischerweise mit standardisierten Klemmmechanismen für Mikroskopien, Petrischalen und Brunnenplatten ausgestattet sind, verwenden fast alle probenkammerbasierten LSFMs zylinderbasierte Klemmmechanismen. Diese Mechanismen sind für kundenspezifische Probenhalter gedacht, die rotationskompatibel sowie nicht-invasive10sind, aber in der Regel nicht für mehr als eine Probe20,31,32ausgelegt sind. Ein Rahmen für die gleichzeitige Live-Bildgebung von zwei oder mehr Embryonen, bei dem die Vorteile von probenkammerbasierten Setups nicht beeinträchtigt werden, befasst sich mit dem Problem der Umgebungsvarianz und erhöht so den Wert von LSFMs für vergleichende Studien.
In unserem Protokoll stellen wir einen experimentellen Rahmen für die vergleichende Live-Bildgebung in probenkammerbasierten LSFMs (Abbildung 1A) vor, in dem die y-Achse als Option zum "Stapeln" von Embryonen verwendet wird. Erstens bieten wir eine fluoreszierende mikrosphärenbasierte Kalibrierrichtlinie für Probenkammer-basierte LSFMs an, was besonders für Instrumente wichtig ist, die keinen Kalibrierassistenten haben. Zweitens beschreiben wir ein Montageverfahren für mehrere Embryonen auf der Grundlage des Spinnwebenhalters28 (Abbildung 1B), das mit der Probenrotation kompatibel ist und somit die gleichzeitige Abbildung mehrerer Proben entlang mehrerer Richtungen ermöglicht (Abbildung 1C). Mehrere Embryonen werden auf einem dünnen Agarosefilm ausgerichtet und nach dem Einsetzen in die Probenkammer sukzessive durch das Lichtblatt bewegt, um dreidimensionale Bilder zu erhalten. Drittens bieten wir drei beispielhafte Live-Imaging-Datensätze für Drosophila sowie für Triboliuman. Für erstere stellen wir transgene Linien fluoreszierend gekennzeichneten Kernen gegenüber. Für letztere vergleichen wir die Leistung transgener Sublinien, die dasselbe Transgen tragen, aber an verschiedenen genomischen Stellen. Schließlich diskutieren wir die Bedeutung der Parallelisierung im Hinblick auf die vergleichende Live-Bildgebung und Umgebungsvarianz33, diskutieren die Durchsatzgrenze unseres experimentellen Rahmens und bewerten die Anpassung unseres Ansatzes an andere Modellorganismen.
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Protocol
1. Vorbereitende Arbeiten
- Wählen Sie für den LSFM eine Beleuchtungslinse/Erkennungslinse/Kamera-Kombination, die der wissenschaftlichen Frage gerecht wird, und richten Sie das Mikroskop ein. Die Größe des Sichtfeldes ist der Quotient der Kamerachipgröße und die Vergrößerung der Erkennungslinse. Die Beleuchtungslinse sollte so gewählt werden, dass das gesamte Sichtfeld durch ein grob planares Lichtblatt34abgedeckt wird. Drei empfohlene Kombinationen sind in Tabelle 1aufgeführt.
- Um Agarose-Aliquots zuzubereiten und Geschirr zu holen, 2 g schmelzende Agarose zu 200 ml autoklaviertem Leitungswasser hinzufügen und das Gemisch in einer Mikrowelle bei 600-800 W erhitzen, bis alle Agarosepartikel gelöst sind. Bereiten Sie mehrere 1 ml Agarose-Aliquots in 1,5 ml oder 2 ml Reaktionsrohren vor, dann füllen Sie mehrere 90-mm-Petrischalen 3-5 mm hoch mit Agarose. Erstarrte Aliquots und Geschirr bei 4 °C lagern.
- Für Drosophila: Um frische Aufzuchtfläschchen zuzubereiten, kochen Sie eine ausreichende Menge an maßgeschneiderten oder kommerziell erhältlichen Drosophila Medium, übertragen Sie 5-15 ml in breite Fläschchen und lagern Sie sie bei 4 °C. Um Eierlegende Gerichte zuzubereiten, fügen Sie 1 g niedrigschmelzende Agarose zu 50 ml autoklaviertem Leitungswasser hinzu und erhitzen Sie die Mischung in einer Mikrowelle bei 600-800 W, bis sich alle Agarosepartikel auflösen. Die Mischung auf 45 °C abkühlen lassen, dann 50 ml Fruchtsaft (vorzugsweise Apfel oder rote Traube) hinzufügen und gründlich vermischen. Gießen Sie die Mischung in 35 mm, Petrischalen und lagern Sie erstarrte Eierlegeschalen bei 4 °C.
- Für Tribolium: Um das Wachstumsmedium vorzubereiten, geben Sie Vollweizenmehl sowie inaktive trockene Hefe durch ein 710 m Maschenmaß sieb, dann ergänzen Sie das gesiebte Mehl mit 5% (w/w) gesiebte Hefe. Um eilegendes Medium zuzubereiten, geben Sie feines Weizenmehl sowie inaktive trockene Hefe durch ein 250 m Maschennetzsieb, dann ergänzen Sie das gesiebte Mehl mit 5% (w/w) gesiebter Hefe.
2. Kalibrierung von Probenkammer-basierten LSFMs mit fluoreszierenden Mikrosphären
HINWEIS: Der Zweck der Kalibrierung besteht darin, die Brennpunkte der Beleuchtungs- und Detektionslinsen auszurichten (Abbildung 2A), da dies die Voraussetzung für klare Bilder ist. LSFMs sollten regelmäßig kalibriert werden, mindestens einmal alle 3-4 Wochen.
- Eine Agarose aliquot in einem Trockenblocker/Mischer bei 80 °C wieder verflüssigen, dann die Agarose aliquot auf 35 °C abkühlen lassen.
- Übertragen Sie 50 l Agarose in ein 1,5 ml Reaktionsrohr und fügen Sie 0,5 l fluoreszierende Mikrosphärenlösung hinzu. Mischen Sie bei 1.400 Rpm für 1 min.
- Füllen Sie das Schlitzloch des Spinnwebenhalters mit 10 l Agarose/Fluoreszenz-Mikrosphärenlösungsmischung, dann so viel Agarose wie möglich ansaugen, bis nur noch ein dünner Agarosefilm übrig bleibt. Warten Sie 30-60 s auf Erstarrung.
- Füllen Sie die Probenkammer mit autoklaviertem Leitungswasser. Setzen Sie den Spinnwebenhalter langsam in die Probenkammer ein und bewegen Sie das Geschlitzloch mit den Mikroübersetzungsstufen vor der Erkennungslinse.
- Drehen Sie den Spinnwebenhalter mit der Rotationsstufe auf eine 45°-Position relativ zur Beleuchtungsachse (x) und Erkennungsachse (z). Der Spinnwebenhalter sollte im Transmissionslichtkanal nicht sichtbar sein.
- Schalten Sie auf den jeweiligen Fluoreszenzkanal um und passen Sie die Laserleistung sowie die Belichtungszeit so an, dass die fluoreszierenden Mikrosphären ein richtiges Signal liefern.
- Geben Sie ein Bildvolumen an, das den nun quer ausgerichteten Agarosefilm vollständig abdeckt. Definieren Sie den z-Abstand, indem Sie die maximal mögliche axiale Auflösung für die jeweilige Beleuchtungslinsen-/Erkennungslinsenkombination34berechnen. Alternativ kann die 4-fache seitliche Auflösung als grobe Annäherung verwendet werden.
- Zeichnen Sie einen dreidimensionalen Test-z-Stack der fluoreszierenden Mikrosphären auf und vergleichen Sie die maximalen x-, y- und z-Projektionen mit dem Kalibrierdiagramm (Abbildung 2). Wenn die Mikrosphären verschwommen, unscharf und/oder verzerrt erscheinen (Abbildung 2B,C), passen Sie die Positionen der Beleuchtungs- und/oder Erkennungslinse an.
3. Sammlung von Drosophila-Embryonen
- Übertragen Sie 100-200 Erwachsene der Drosophila-Linie ihrer Wahl 2-3 Tage vor dem bildgebenden Assay auf eine frische Aufzuchtfläschung, um eine Eiersammelkultur zu etablieren. Wenn noch nicht vorhanden, erwägen Sie, die alte Aufzucht-Fläschigkeit zu verwenden, um eine Nachkommenkultur zu starten. Um sicherzustellen, dass Erwachsene nicht mehr als zwei Wochen alt sind, ersetzen Sie die Embryo-Sammlungskultur rechtzeitig durch die Nachkommenkultur.
- Erwärmen Sie eine Eilegende auf Raumtemperatur und fügen Sie einen Tropfen Hefepaste auf den Agar.
- Übertragen Sie die Erwachsenen aus der Eiersammelkultur in eine leere schmale Durchstechflasche und legen Sie sie auf die Eierlegeschale. Inkubieren Sie die Ei-Sammlung Einrichtung bei Raumtemperatur für 15 min. Vermeiden Sie anästhesie (kalt, CO2) während dieses Schritts, wenn möglich.
- Bringen Sie die Erwachsenen in die Aufzuchtfläschung zurück. Die Eilegende in einer praktischen Temperatur-Zeit-Kombination bebrüten und dann 10-20 Embryonen mit einem kleinen Pinsel von der Eilegende auf ein 100 m Maschennetz-Zellsieb übertragen. Entsorgen Sie die Eierlegeschale.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.4 für jede Drosophila-Linie.
4. Sammlung von Tribolium-Embryonen
HINWEIS: Der Einfachheit halber wird ein Schema des Tribolium-Ei-Entnahmeverfahrens (Abbildung 3A) bereitgestellt, auf das sich auch die Zahlen innerhalb der Klammern in diesem Schritt beziehen.
- 200-300 Erwachsene (ca. 400-700 mg) der Tribolium-Linie nach Wahl in eine leere 1 L Glasflasche 2-10 Tage vor dem bildgebenden Assay übertragen, um eine Eiersammelkultur zu etablieren (Abbildung 3A_01). Füllen Sie die Flasche mit 50-100 g frischem Wachstumsmedium. Wenn noch nicht vorhanden, erwägen Sie, eine Nachkommenkultur mit verfügbaren Larven und Pupae zu starten. Um sicherzustellen, dass Erwachsene nicht älter als 3 Monate sind, ersetzen Sie die Eiersammelkultur rechtzeitig durch die Nachkommenkultur.
- Übergeben Sie die Eiersammelkultur durch ein Sieb der Maschengröße von 800 m (Abbildung 3A_02). Geben Sie das Wachstumsmedium, das nicht inszenierte Embryonen enthält, in die Ausgangsflasche zurück (Abbildung 3A_03) und übertragen Sie Erwachsene in eine leere 1 L Glasflasche(Abbildung 3A_04). Fügen Sie 10 g Ei-Legenmedium hinzu (Abbildung 3A_05) und inkubieren Sie die Ei-Sammlung bei Raumtemperatur für 1 h (Abbildung 3A_06,07).
- Übergeben Sie die Ei-Sammlung-Setup durch die 800 m Maschenweite Sieb(Abbildung 3A_08). Kehren Sie Erwachsene zu ihrer ursprünglichen Flasche zurück (Abbildung 3A_09). Je nach dem zu bebildernden Entwicklungsprozess das Eiablagemedium, das jetzt etwa 30-100 Embryonen enthält, bei einer praktischen Temperatur-Zeit-Kombination inkubieren (Abbildung 3A_10).
- Übergeben Sie das Eilegendesmittel durch das Sieb der Maschenöffnung von 300 m (Abbildung 3A_11) und übertragen Sie die Embryonen (Abbildung 3A_12) auf ein 100 m Maschennetz-Zellsieb. Entsorgen Sie die gesiebten Eiablagemedien (Abbildung 3A_13).
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.4 für jede Tribolium-Linie.
5. Natriumhypochlorit-basierte Dechorionation
HINWEIS: Sowohl Drosophila- als auch Tribolium-Embryonen werden von einer Chorion bedeckt, einer schützenden und stark lichtdurchstreuenden Proteinschicht, die für die richtige Entwicklung nicht wesentlich ist, solange die Embryonen nach der Entfernung feucht gehalten werden. Das Dechorionationsprotokoll für die Embryonen beider Arten ist identisch.
- Bereiten Sie eine 6-Well-Platte vor, indem Sie die Brunnen A1, A2, A3 und B3 mit 8 ml autoklaviertem Leitungswasser und die B1- und B2-Brunnen mit 7 ml autoklaviertem Leitungswasser und 1 ml Natriumhypochlorit (NaOCl) Lösung füllen (Abbildung 3B). Beobachten Sie den Dechorionationsprozess unter einem Stereomikroskop, idealerweise bei Überlicht.
VORSICHT: Natriumhypochlorit ist ätzend. - Setzen Sie das embryohaltige Zellsieb (Schritt 3.4 und/oder 4.4) in den A1-Brunnen ein und waschen Sie die Embryonen etwa 30-60 s unter sanfter Erregung.
- Das Zellsieb gut auf den B1 bewegen und die Platten 30 s kräftig schütteln, dann auf den A2-Brunnen übertragen und die Embryonen 1 min unter sanfter Erregung waschen.
- Das Zellsieb gut auf den B2-Brunnen bewegen und die Platte kräftig schütteln, bis die meisten Embryonen vollständig dechorioniert sind (Abbildung 3C), dann auf den A3-Brunnen übertragen und die Embryonen 1 min unter sanfter Erregung waschen.
- Bewahren Sie das Zellsieb im B3 gut auf, bevor Sie mit dem Montageverfahren fortfahren.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.1 bis 5.5 für jede Zeile.
6. Montage mehrerer Embryonen mit dem Spinnwebenhalter
- Eine Agarose aliquot in einem Trockenblocker/Mischer bei 80 °C wieder verflüssigen, dann die Agarose aliquot auf 35 °C abkühlen lassen.
- Pipetten Sie 10 l Agarose auf dem Schlitzloch des Spinnwebenhalters. Mit der Pipettenspitze die Agarose über das Schlitzloch verteilen, dann so viel Agarose wie möglich aspirieren, bis nur noch eine dünne Agarosefolie übrig bleibt. Warten Sie 30-60 s auf Erstarrung.
- Für jede Linie einen oder mehrere Embryonen sorgfältig mit einem kleinen Pinsel auswählen und auf den Agarosefilm legen.
- Ordnen Sie die Embryonen entlang der langen Achse des Schlitzlochs an, und richten Sie dann auch ihre vordere hintere Achse an der langen Achse des Schlitzlochs aus (Abbildung 3D).
- Stabilisieren Sie die Embryonen sorgfältig, indem Sie 1-2 l Agarose in den Spalt zwischen den Embryonen und dem Agarosefilm pfeifen. Warten Sie 30-60 s auf Erstarrung.
- Legen Sie den Spinnwebenhalter mit den montierten Embryonen langsam in die mit Bildpuffergefüllte Probenkammer ein.
7. Vergleichende Live-Bildgebung in Probenkammer-basierten LSFMs
- Bewegen Sie einen der Embryonen mit den Mikroübersetzungsstufen vor die Detektionslinse. Stellen Sie sicher, dass sich der Spinnwebenhalter in einer 45°-Position relativ zu den Beleuchtungsachsen (x) und der Erkennungsachse (z) befindet (vgl. Abbildung 1C).
- Bewegen Sie den Embryo im Transmissionslichtkanal in die Mitte des Sichtfeldes. Der Spinnwebenhalter sollte nicht sichtbar sein.
- Bewegen Sie den Embryo mit den Mikrotranslationsstufen in z, bis sich die Mittelebene des Embryos mit der Brennebene überlappt, d.h. bis der Umriss scharf erscheint. Ohne auf den Fluoreszenzkanal umzuschalten, geben Sie das Bildvolumen an, indem Sie 250 m von der Mittelebene in beide Richtungen bewegen.
- Optional, wenn eine Bildgebung in mehreren Richtungen erforderlich ist, drehen Sie den Embryo entsprechend und wiederholen Sie die Schritte 7.2 und 7.3. Der Spinnwebenhalter unterstützt bis zu vier Ausrichtungen in Schritten von 90°.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.3 (oder 7.4) für alle anderen Embryonen, die auf dem Spinnwebenhalter montiert sind (Abbildung 3E). Stellen Sie sicher, dass der oberste Embryo den bildgebenden Puffer nicht verlässt, wenn sich der unterste Embryo vor der Detektionslinse befindet.
- Definieren Sie die Fluoreszenzkanalparameter (Laserleistung, Belichtungszeit, Detektionsfilter) und Zeitrafferparameter (Intervall, Gesamtdauer) und starten Sie den Bildgebungsprozess. Indikative Werte finden Sie in der Metadatentabelle der Beispieldatensätze (Ergänzende Tabelle 1). Bei Assays, die mehrere Tage dauern, sollten Sie die Probenkammeröffnung zumindest teilweise abdecken, um die Verdunstung zu reduzieren.
8. Rückgewinnung und weitere Kultivierung von abgebildeten Embryonen
- Wenn der bildgebende Test beendet ist, entfernen Sie vorsichtig den Spinnwebenhalter aus der Probenkammer.
- Lösen Sie die Embryonen mit einem kleinen Pinsel aus dem Agarosefilm und übertragen Sie sie auf ein entsprechend beschriftetes Mikroskopschlitten. Legen Sie die Rutsche in eine Retrievalschale und brüten Sie unter den jeweiligen Standard-Aufzuchtbedingungen.
- In Bezug auf die experimentellen Modalitäten, schätzen, wann embryogenese abgeschlossen ist. Wenn sich der Brutzeitpunkt nähert, überprüfen Sie häufig die Retrieval-Gerichte und übertragen Sie geschlüpfte Drosophila-Larven auf einzelne Aufzuchtfläschchen und Triboliumlarven auf einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte. Füllen Sie die Brunnen bis zur Hälfte mit Wachstumsmedium. Unter den jeweiligen Standardhaltungsbedingungen inkubieren.
- Sobald die beobachteten Personen Erwachsene sind, stellen Sie ihnen einen geeigneten Paarungspartner zur Verfügung und überprüfen Sie nach mehreren Tagen auf Nachkommenschaft.
9. Bilddatenverarbeitung und Metadatendokumentation
HINWEIS: Für die Bilddatenverarbeitung wird das ImageJ-Derivat FIJI35 empfohlen (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI erfordert keine Installation und 32- sowie 64-Bit-Versionen sind verfügbar. Eines der am häufigsten verwendeten Formate für LSFM-Daten ist das markierte Bilddateiformat (TIFF), das die Speicherung von Bildstapeln in Form eines TIFF-Containers ermöglicht.
- Berechnen Sie die z maximalen Projektionen für alle z-Stacks(Bild | Stacks | Z-Projekt, wählen Sie Max Intensity). Maximale Projektionen sind Datenvereinfachungsansätze, die die Anzahl der räumlichen Dimensionen von drei auf zwei reduzieren. Ein FIJI-Skript für die Stapelverarbeitung wird bereitgestellt (Zusatzdatei 1).
- Verketten Sie die jeweiligen z maximalen Projektionen, um Zeitstapel (t-Stacks) zu erstellen. Speichern Sie diese in einem TIFF-Container. Tun Sie dies für alle aufgezeichneten Embryonen sowie die jeweiligen Richtungen und Fluoreszenzkanäle, falls zutreffend.
- Drehen Sie den z- und t-Stapel um die z-Achse, um die vordere hintere Achse der Embryonen an der x- oder y-Bildachse auszurichten(Bild | Transform-| Drehen). Schneiden Sie die z-Stacks entlang aller drei Bildachsen und des t-Stacks in den x- und y-Bildachsen zu, so dass nur minimaler Pufferraum (20-40 Pixel entlang der x- und y-Achse, 5-10 Bilder entlang der z-Achse) um den Embryo herum bleibt(Bild | Anpassen | Canvas-Größe für die x- und y-Achsen, Bild | Stacks | Werkzeuge | Slice Keeper für die z-Achse).
- Tun Sie dies einzeln für alle aufgezeichneten Embryonen sowie die jeweiligen Richtungen, falls zutreffend. Gegebenenfalls sollten Fluoreszenzkanäle mit identischen Rotations- und Zuschneideparametern verarbeitet werden.
- Dokumentieren Sie die Metadaten so detailliert wie möglich. Als Richtlinie kann die Metadatentabelle der Beispiel-Datasets verwendet werden, die im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse aufgeführt sind (ergänzende Tabelle 1).
10. Datenvisualisierung
HINWEIS: Diese Datenvisualisierungsrichtlinie konzentriert sich in erster Linie auf die Erstellung von z maximalen Projektionsbildmatrizen, die mehrere aufgezeichnete Embryonen entlang mehrerer Richtungen und/oder im Laufe der Zeit zeigen. Die folgenden Schritte beschreiben die Datenvisualisierungsprozedur, die auf die Beispiel-Datasets für die Erstellung der angezeigten Abbildungen und Videos angewendet wurde, die im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse verknüpft sind.
- Kombinieren Sie t-Stacks aus mehreren Richtungen(Bild | Stacks | Werkzeuge | Kombinieren) und/oder mehrere Fluoreszenzkanäle zusammenführen (Bild | Farbe | Merge Channels), um die biologische Struktur und/oder den Prozess von Interesse zu visualisieren.
- Anpassen der Intensitäten der t-Stacks(Bild | Anpassen | Helligkeit/Kontrast) nach Bedarf mit der Funktion "Set" verwenden. Der angezeigte Mindestwert sollte leicht über dem Hintergrundsignal eingestellt werden, der maximal angezeigte Wert sollte zu einem bequemen Kontrast führen. Dokumentieren Sie beide Werte, da sie für eine konsistente Anpassung der jeweiligen z-Stacks verwendet werden können. Impressumsanpassungen mit der Funktion "Anwenden". Je nach den experimentellen Modalitäten sollten Sie alle aufgezeichneten Embryonen mit identischen Werten verarbeiten.
- Speichern Sie intensitätsangepasste t-Stacks als separate Dateien, überschreiben Sie die nicht angepassten t-Stacks nicht. Geeignete Sub-Stacks aus den angepassten t-Stacks mit dedizierten Bildauswahlfunktionen (z.B. Image | Stacks | Werkzeuge | Slice Keeper) und verwenden Sie das Montagewerkzeug(Bild | Stacks | Erstellen Sie Montage), um Bildraster zu erstellen, die für den Abbildungsentwurf verwendet werden können.
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Representative Results
Unser Protokoll beschreibt einen experimentellen Rahmen für die vergleichende Fluoreszenz-Live-Bildgebung in Probenkammer-basierten LSFMs. Beispielsweise kann das Rahmenwerk verwendet werden, um (i) Embryonen von zwei oder mehr Arten, (ii) Embryonen von Linien, in denen ein oder mehrere Gene ausgeschlagen werden, plus Wildtypkontrollen, (iii) mehrere Embryonen derselben transgenen Linie, (iv) Embryonen aus verschiedenen transgenen Linien oder (v) Embryonen aus Unterlinien, die die gleiche Transgene tragen, gegenüberzustellen. , aber an verschiedenen genomischen Standorten. In diesem Abschnitt finden Sie Beispiele für die letzten beiden Szenarien.
In unserer ersten beispielhaften Anwendung zeigen wir die Fluoreszenzsignaldynamik von drei Embryonen, die aus verschiedenen transgenen Drosophila-Linien (Tabelle 2) über einen Zeitraum von etwa 1 Tag stammen (Abbildung 4, Ergänzender Film 1). Für diese Linien erwarteten wir eher ähnliche Fluoreszenzmuster, da sie alle kerngesteuerte EGFP/GFP unter Kontrolle verschiedener vermutlich allgegenwärtiger und konstitutiv aktiver Projektträger ausdrücken. Unsere vergleichenden Ergebnisse der Live-Bildgebung zeigen jedoch, dass es starke raumzeitliche Unterschiede in den Expressionsmustern gibt, die aufgrund der Umgebungsvarianz sicherlich keine sekundären Effekte sind.
In unserem zweiten Anwendungsbeispiel vergleichen wir die Leistung von drei Embryonen, die sich aus den transgenen Tribolium-Sublinien 36von AGOC-Zen1'#O(LA)-mEmerald #1, #2 und #3 (Zen1'LA-mE #1, #2 bzw. #3) ergeben. Alle diese tragen das gleiche piggyBac-basierte Transgen, das zur Expression von mEmerald-verknüpften37 Lifeact38 unter Kontrolle des zerknüllt 139 Promoters führt, einem Transkriptionsfaktor, der an der Serosa-Spezifikation beteiligt ist. Unsere vergleichenden Live-Bildgebungsergebnisse, die den Serosa-Fensterverschlussprozess während der Gastrulation veranschaulichen, deuten darauf hin, dass die Subline-#2 ein bemerkenswert stärkeres Gesamtsignal als die beiden anderen Unterlinien liefert (Abbildung 5, Ergänzender Film 2). Dies deutet darauf hin, dass auch in Triboliumder genomische Kontext einen starken Einfluss auf die Expressionsebene von Transgenen haben kann, die eine Expressionskassette tragen.
Eine erfolgreiche Rückholung aller sechs Embryonen, die in diesem Abschnitt gezeigt werden, war möglich, wie in Schritt 8 unseres Protokolls beschrieben. Alle entwickelten sich zu voll funktionsfähigen und fruchtbaren Erwachsenen(Ergänzende Tabelle 1, "Retrieval"-Zeile), was darauf hindeutet, dass das Gesamtverfahren, von der Dechorionation über die Montage bis zur Aufnahme, nicht-invasiv war. Diese Qualitätskontrolle ist immer dann unerlässlich, wenn eine Entwicklung des Wildtyps erwartet wird, z. B. bei Kontrollembryonen, die gleichzeitig mit Embryonen abgebildet werden, bei denen ein oder mehrere Gene niedergeschlagen oder ausgeschlagen werden.
Alle Datasets, die zum Erstellen der repräsentativen Ergebnisse verwendet wurden, werden als Ressourcen bereitgestellt, die insbesondere LSFM-Neulingen helfen, die Qualität ihrer eigenen Arbeit zu bewerten. Die digitalen Objekt-ID-basierten Download-Links finden Sie in der Metadatentabelle (Supplementary Table 1, "Data Access" row).
Abbildung 1: Überblick über versuchsweises Gerüst und Montagemethoden. (A) Flussdiagramm der zehn Protokollschritte mit kurzen Erinnerungen und einer Schätzung der benötigten Zeit. Aufgaben, die mit Sternchen gekennzeichnet sind, müssen nicht bei jedem Test ausgeführt werden, sondern je nach den Umständen. Grüne Kästchen zeigen Schritte im Zusammenhang mit Drosophila und/oder Triboliuman, blaue Kästchen zeigen Schritte im Zusammenhang mit der Mikroskopie an. (B) Detailzeichnung des Spinnwebenhalters. Das vorgestellte Design eignet sich für zylinderbasierte Klemmmechanismen, die häufig in Probenkammer-basierten LSFMs verwendet werden. Der Halter kann skaliert werden, solange der Arbeitsabstand der Erkennungslinse eingehalten wird. (C) Aufzeichnungssequenz für die Live-Bildgebung mehrerer Embryonen in mehrere Richtungen. Zunächst werden z-Stacks des obersten Embryos entlang von bis zu vier Ausrichtungen aufgezeichnet, d.h. 0°, 90°, 180° und 270°. Anschließend wird der darunter stehende Embryo vor die Detektionslinse bewegt und die Aufnahme-/Rotationssequenz beginnt von neuem. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Fluoreszierendes mikrosphärenbasiertes Kalibrierdiagramm für LSFMs. Das Diagramm zeigt, wie fluoreszierende Mikrosphären in den maximalen x-, y- und z-Projektionen erscheinen, wenn der LSFM korrekt kalibriert ist (A), oder wenn ein Beleuchtungs- (B) oder Detektionsversatz (C) vorliegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Sammlung, Dechorionation, Montage und Bildgebung mehrerer Embryonen. (A) Tribolium-Embryo-Sammlungsübersicht. Die Abbildungen werden in Schritt 4 entsprechend den Zahlen in der oberen linken Seite zitiert. (B) Vorbereitungs- und Transferschema für die 6-Well-Platte, die in Schritt 5 verwendet wird. Die B1- und B2-Brunnen enthielten verdünntes Natriumhypochlorit (NaOCl), das Dechorionation induziert. (C) Das 100-m-Zellsieb, mit dem die Embryonen innerhalb des B2-Brunnens von einem Brunnen auf einen anderen übertragen wurden. Das obere Detailbild zeigt eine Nahaufnahme mehrerer Tribolium-Embryonen auf dem Zellsiebnetz, das untere Detailbild zeigt ein Transmissionslicht-Stereomikroskopbild mehrerer Tribolium-Embryonen mit teilweise abgetrennter Chorion. (D) Spinnwebenhalter mit drei montierten Tribolium-Embryonen. Die Embryonen sowie ihre vorderen hinteren Achsen wurden entlang der langen Achse des Schlitzlochs ausgerichtet. (E) Bewegung des Spinnwebenhalters innerhalb der Probenkammer des LSFM während der Aufzeichnung von drei Embryonen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Vergleichende Fluoreszenz-Live-Bildgebung von je einem Embryo aus den #01691, #29724 und #24163 transgenen Drosophila-Linien. Embryonen werden in zwei (von vier aufgezeichneten) Richtungen über einen Zeitraum von 20:00 h (ab einer gesamtbildnenden Periode von 23:40 h) gezeigt. Es wurde keine dynamische Intensitätskorrektur im Laufe der Zeit durchgeführt. Metadaten für die Drosophila-Datensätze finden Sie in Der Ergänzenden Tabelle 1. ZA, Z maximale Projektion mit Bildanpassung. Maßstabsleiste, 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Vergleichende Fluoreszenz-Live-Bildgebung von je einem Embryo aus den Zen1'LA-mE-#1, #2 und #3 transgenen Tribolium-Sublinien. (A) Embryonen werden während der Gastrulation in vier Richtungen angezeigt, kurz vor dem Schließen des Serosa-Fensters. (B) Embryonen werden über einen Zeitraum von 01:30 h (ab einer Gesamtbildperiode von 118:00 h) ventral dargestellt. Die Bildanpassung wurde mit identischen minimalen und maximal angezeigten Werten durchgeführt, es wurde keine dynamische Intensitätskorrektur im Laufe der Zeit durchgeführt. Metadaten für die Tribolium-Datensätze finden Sie in Der Ergänzenden Tabelle 1. Datasets wurden mit der in (A )dargestellten Phase synchronisiert. ZA, Z maximale Projektion mit Bildanpassung. Maßstabsleiste, 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Kombination | Gründe | Beleuchtungslinse | Erkennungslinse | Kamera | Verweis |
| #1 | gesamter Embryo auf Zellebene, großer Pixelabstand (kleines Datenvolumen) | 2,5×- und Vergrößerungsöffnung 0,06 (Luft) | 10×- vergrößerungs-Numerische Blende 0,3 (Wassertauch) | CCD mit 1,4 Megapixel (1392×1040, 6,45 m Tonhöhe) | diese Studie, Drosophila41, Tribolium20,41 |
| #2 | Gesamtembryon auf zellulärer/subzellulärer Ebene, kleiner Pixelabstand (großes Datenvolumen) | 2,5×- und Vergrößerungsöffnung 0,06 (Luft) | 20×- und Vergrößerungs-Zahlenöffnung 0,5 (Wassertauch) | sCMOS mit 5,5 Megapixeln (2560×2160, 6,5 m Tonhöhe) | Tribolium9 |
| #3 | spezifische Regionen des Embryos auf subzellulärer Ebene oder spezielle Anwendungen, z.B. Live-Bildgebung von sezierten Keimbändern42,43 | 5,0×- numerische Blende 0,16 (Luft) | 40×- numerische Blende 0,75 (Wassertauch) | CCD mit 1,4 Megapixel (1392×1040, 6,45 m Tonhöhe) | Tribolium44 |
Tabelle 1: Empfohlene Beleuchtungslinsen-/Erkennungslinsen-/Kamerakombinationen zur Live-Bildgebung von Drosophila- und Tribolium-Embryonen mit LSFM. Alle Kombinationen wurden in früheren Studien erfolgreich eingesetzt (siehe Referenzzeile). Bitte beachten Sie, dass die meisten probenkammerbasierten LSFMs wassertauchende Linsen zur Detektion verwenden, die in erster Linie für Bildgebungspuffer mit einem Brechungsindex von 1,33 (z. B. autoklaviertes Leitungswasser oder andere wässrige Medien) entwickelt wurden. Bildgebungspuffer mit anderen Brechungsindizes können40verwendet werden, aber dies ändert bestimmte Eigenschaften des optischen Systems, z.B. den Arbeitsabstand.
| Linie | Genotyp | Fluorophorexpression |
| #01691 | y[1] w[67c23]; P-w[+mC]=Ubi-GFP.nls-ID-2; P-Ubi-GFP.nls-ID-3 | NLS-GFP unter Kontrolle des Polyubiquitin-Promotors |
| #29724 | w[*]; P-w[+mC]=Tub84B-EGFP.NLS 3 | NLS-GFP unter Kontrolle des Alpha-Tubulin 84B-Promotors |
| #24163 | w[*]; P-w[+mC]=His2Av-EGFP.C-2/SM6a | EGFP-markierte Histon 2A-Variante in allen Zellen |
Tabelle 2: Die drei transgenen Drosophila-Linien, die im ersten Anwendungsbeispiel verwendet werden. Die Spalte "line" bezieht sich auf die Aktiennummer des Bloomington Drosophila Stock Center (bdsc.indiana.edu).
Ergänzendes Video 1: Vergleichende Fluoreszenz-Live-Bildgebung von je einem Embryo aus den #01691, #29724 und #24163 transgenen Drosophila-Linien. Jede transgene Linie drückt das kernlokalisierte EGFP/GFP unter der Kontrolle eines vermutlich allgegenwärtigen und konstitutiv aktiven Promotors aus. ZA, Z maximale Projektion mit Bildanpassung. Es wurde keine dynamische Intensitätskorrektur im Laufe der Zeit durchgeführt. ZA, Z maximale Projektion mit Bildanpassung. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video 2: Vergleichende Fluoreszenz-Live-Bildgebung von je einem Embryo aus den Zen1'LA-mE-#1, #2 und #3 transgenen Tribolium-Sublinien. Jede transgene Sublinie drückt mEmerald-markierte Lifeact unter Kontrolle des zerknüllt 1-Promotors aus, einem Transkriptionsfaktor, der an der Serosa-Spezifikation beteiligt ist. Bitte beachten Sie, dass sich der Zen1'LA-mE-#1 Embryo direkt nach dem Schließen des Serosa-Fensters um ca. 90° innerhalb des Serosa-Fensterverschlusses dreht. Die Datasets wurden mit der in Abbildung 4Adargestellten Stufe synchronisiert. Die Bildanpassung wurde mit identischen minimalen und maximal angezeigten Werten durchgeführt, es wurde keine dynamische Intensitätskorrektur im Laufe der Zeit durchgeführt. Embryonen werden ventral und seitlich über einen Zeitraum von 48:00 h gezeigt. ZA, Z maximale Projektion mit Bildanpassung. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzende Datei 1: FIJI Batch-Verarbeitungsskript für die automatisierte Berechnung von z maximalen Projektionen aus allen z-Stacks in einem Ordner. Das Skript kann in FIJI per Drag-and-Drop geöffnet werden. Beim Start ("Ausführen") muss nur der Eingabeordner angegeben werden. Der Ausgabeunterordner ("Z Maximum Projections") wird automatisch erstellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Metadaten und Parameter für die Langfristigen Live-Imaging-Datasets DS0001-6. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Eines der exklusiven Anwendungsbereiche von LSFMs ist die Entwicklungsbiologie. In dieser Disziplin ist es wichtig, lebende Exemplare zu betrachten, da sonst morphogenetische Prozesse nicht dynamisch beschrieben werden können. Ein experimenteller Rahmen für die gleichzeitige Live-Bildgebung in Probenkammer-basierten LSFMs, wie hier beschrieben, ist aus zwei Hauptgründen praktisch.
Umgebungsvarianz, die in der sequentiellen Live-Bildgebung unvermeidbar ist, kann proaktiv angegangen werden. In der mit Insekten embryonenassoziierten Live-Bildgebung sehen wir z.B. die folgenden Anfälligkeiten. Die Eiersammelkulturen können zum Zeitpunkt der Embryonenentnahme unterschiedliche Altersstufen haben. In Drosophilahat sich gezeigt, dass dies die Qualitäten der Nachkommen45beeinflusst. Obwohl die Arbeit mit entsprechend desynchronisierten Kulturen eine Option ist, ist die gleichzeitige Bildgebung mit synchronisierten Kulturen wesentlich bequemer. Sowohl die Drosophila- als auch die Tribolium-basiertenrepräsentativen Ergebnisse stammen aus synchronisierten Ei-Sammlungskulturen, und wir können getrost ausschließen, dass die verschiedenen Fluoreszenzeigenschaften eine unbeabsichtigte Wirkung der elterlichen Seneszenz sind.
Dechorionation ist ein entscheidender Schritt, da eine längere Exposition gegenüber Natriumhypochlorit die Lebensfähigkeit des Embryos verringert. Unbequemerweise nimmt die Ionenstärke von Natriumhypochlorit im Laufe der Zeit ab. Messungen der Ionenstärke sind möglich46, aber mühsam und umständlich. Bei der gleichzeitigen Live-Bildgebung kann bei der Herstellung der dechorionationsassoziierten 6-Well-Platten für alle Linien und/oder Bedingungen ein Master-Mix verwendet werden.
Auch in Laboren mit effizienter Klimaanlage sind kleine, aber unregelmäßige Temperaturschwankungen unvermeidlich und beeinflussen auch temperaturgeregelte9 Probenkammer-basierte LSFMs. Theoretisch kann die Temperatur in der Probenkammer protokolliert werden, eine exakte Wiederholung ist jedoch nicht möglich. Bei der gleichzeitigen Live-Bildgebung treten diese Schwankungen ebenfalls auf, aber sie betreffen alle Embryonen gleichermaßen.
Aus praktischer Sicht erhöht ein Protokoll zur gleichzeitigen Abbildung mehrerer Embryonen den Durchsatz. Bei live imaging bestimmt die Dauer des Entwicklungsprozesses von Interesse, wie viele Assays innerhalb eines bestimmten Zeitraums durchgeführt werden können, was eine wichtige Überlegung ist, wenn der Zugang zu LSFMs begrenzt ist. Hauptbeispiele für Langzeitaufnahmen sind Live-Imaging-Assays, bei denen Zellen nachverfolgt werden. Solche Experimente reichen in der Regel über lange Entwicklungsperioden. Während die embryonale Entwicklung von Drosophila nur etwa einen Tag bei Raumtemperatur47dauert, dauert Tribolium etwa sieben Tage48. Daher ist für diese Art die Parallelisierung unerlässlich, um innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens zu bleiben, insbesondere in Bezug auf Assays, bei denen viele Bedingungen verglichen werden.
Der Durchsatz, d.h. die Anzahl der Embryonen, die gleichzeitig abgebildet werden, wird in erster Linie durch zwei Faktoren begrenzt: Erstens ist der Raum entlang der y-Achse innerhalb der Probenkammer verfügbar. Wenn der unterste Embryo kurz vor der Abbildung steht, sollte der oberste Embryo den bildgebenden Puffer nicht verlassen haben. Darüber hinaus sollten der Spinnwebenhalter und das zugehörige Stützsystem nicht so langwierig sein, dass er während des Z-Stack-Aufnahmevorgangs merklich wackelt und/oder nervt. Zweitens ist die beabsichtigte zeitliche Auflösung. Die Aufnahmezeit pro Embryo kann angenähert werden, indem die Belichtungszeit pro zweidimensionalem Bild (in der Regel 10-200 ms) mit der Anzahl der Ebenen pro z-Stack (in der Regel mehrere hundert), der Anzahl der Kanäle (üblich zwischen eins und drei), der Anzahl der Richtungen (in der Regel zwischen eins und acht) und einem einrichtungsabhängigen Faktor für die Übersetzungs- und Rotationsbewegungen (geschätzt zwischen 1,2 und 1,5) multipliziert wird. Das Verhältnis zwischen der beabsichtigten zeitlichen Auflösung und der Aufnahmezeit pro Embryo gibt die maximale Anzahl von Embryonen an, die gleichzeitig abgebildet werden können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Protokoll geeignet ist, um von der sequenziellen Live-Bildgebung auf den mittleren Durchsatz vorzudringen, aber nicht für das, was allgemein als hoher Durchsatz angesehen wird. Für letztere können LSFMs, die für Mikroskopschlitten49,50,51 oder Wellplatten52 geeignet sind, in Betracht gezogen werden, aber diese Implementierungen haben in der Regel andere Einschränkungen.
Je nach experimenteller Frage und damit der Lichtlinse/Erkennungslinse/Kamerakombination in Verbindung mit den Bildparametern können gleichzeitig abgebildete LSFM-Datensätze in ihrem Rohzustand großen Speicherplatz benötigen. Dieses Problem lässt sich am besten unter Berücksichtigung der bereitgestellten Drosophila-Beispieldatensätze (Ergänzende Tabelle 1), d. h. DS0001-3, veranschaulichen. Jedes zweidimensionale Rohbild hatte ein Datenvolumen von etwa 2,8 Megabyte, jeder Raw-Z-Stack bestand aus 120 Ebenen, und alle drei Embryonen wurden in vier Richtungen insgesamt 143 Mal aufgezeichnet. In der Folge besetzten die Rohdatensätze etwa ein halbes Terabyte. Durch bildbezogene Datenverarbeitung, d.h. das Zuschneiden aller räumlichen Dimensionen (Schritt 9) in Verbindung mit ZIP-basierter Komprimierung, wurde das Datenvolumen auf 53,3 Gigabyte reduziert, was etwa 10% der ursprünglichen Menge entspricht. Um Datensätze im Terabyte-Regime zu verarbeiten, das BigDataViewer53-Plugin, das in FIJI vorinstalliert ist(Plugins | BigDataViewer) wird empfohlen.
Zusätzlich zu den fünf Szenarien, die im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse beschrieben werden, kann unser Protokoll auch verwendet werden, um die Wirkung von RNAi Knockdown-Effekten zu charakterisieren, was ein beliebter Ansatz in Tribolium54ist. Für die Analyse von Verbindungen (z. B. Insektizide oder andere biochemische Stressoren) ist es jedoch nur bedingt sinnvoll, wenn diese über den bildgebenden Puffer – der einfachste Ansatz – angewendet werden sollten, da eine gleichzeitige Abbildung eines Kontrollembryons nicht möglich ist.
Wir haben unser Protokoll mit einem unserer kundenspezifischen Mikroskope8,55demonstriert, aber es ist für alle Probenkammer-basierten Setups anwendbar, z. B. OpenSPIM56 oder die meisten kommerziellen LSFMs. Dieses Protokoll ergänzt die LSFM-assoziierte Ressourceneinrichtungsinitiative, die Anfänger dazu ermutigen soll, Lichtblechtechnologie aktiv in ihre Forschungspläne zu integrieren. Die meisten Universitäten und Institute betreiben heute gut ausgestattete Fluoreszenzmikroskopie-Einrichtungen57. Diese bieten in der Regel Zugang zu einem oder mehreren kammerbasierten LSFMs, aber von den Mitarbeitern kann nicht erwartet werden, dass sie für jede wissenschaftliche Frage die richtigen experimentellen Lösungen zur Hand haben.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass unser experimentelles Framework für Drosophila und Triboliumgeeignet ist. Wir sind zuversichtlich, dass unser auf Vergleichen fokussiertes Protokoll verwendet werden kann, um die Embryogenese anderer Insektenarten zu untersuchen. Zum Beispiel wurde ein LSFM-basierter Ansatz angewendet, um die Entwicklung von Wildtyp und Knockdown in der Scuttle fly Megaselia abdita58zu vergleichen, und Folgestudien würden ebenfalls von unserer Montagemethode profitieren. Darüber hinaus stehen transgene Linien des zweifleckigen Cricket Gryllus bimaculatus speziell für fluoreszenzlive Imaging59 zur Verfügung, aber das einzige derzeit verfügbare vergleichsorientierte Protokoll60 ist für herkömmliche invertierte Mikroskope bestimmt und befasst sich daher nicht mit dreidimensionaler Bildaufnahme oder Probenrotation. Darüber hinaus hat sich bereits gezeigt, dass der Spinnwebenhalter eine bequeme Wahl für Zebrafische ist, deren Embryonen ihre Form während der Embryogenese61erheblich verändern. Eine Anpassung unseres Protokolls, die grundsätzlich keinen Optimierungsaufwand erfordert, würde auch für diesen Modellorganismus die oben beschriebenen Vorteile bieten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Ernst H. K. Stelzer für die Gelegenheit, seine Ressourcen zu nutzen, sowie seine wertvollen Kommentare zum Manuskript, Anita Anderl für die Unterstützung mit dem Tribolium Live Imaging, Sven Plath für die technische Unterstützung sowie Ilan Davis, Nicole Grieder und Gerold Schubiger für die gemeinsame Nutzung ihrer transgenen Drosophila-Linien über das Bloomington Stock Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100 µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
References
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
- Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
- Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
- Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
- El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
- Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
- Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
- Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
- Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
- Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
- Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
- Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
- Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
- Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
- Mcdonald, J. H. Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , Sparky House Publication. (2013).
- Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
- Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
- Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
- Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
- He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
- Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
- Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , Springer. (1997).
- Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
- McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
- Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
- Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
- Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
- Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).
