Summary
光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。
Abstract
ライトシートベースの蛍光顕微鏡は、複数の生物学的に関連するスケールで複雑なプロセスを研究するための効率的なソリューションを提供します。試料の三次元の完全性を維持するためにとりわけ設計され、通常サンプルの回転を特色にするサンプル室ベースのセットアップは、発生生物学の最良の選択である。例えば、それらは、ショ ウジョウバエメラノガスター および赤い小麦粉カブトムシ トリボリウムカスタネウムの果実フライの胚形態形成全体を文書化するために使用されてきた。しかし、利用可能なライブイメージングプロトコルの多くは、単一胚の実験的枠組みのみを提供します。特に比較研究では、このようなアプローチは、順次画像化された標本が周囲分散の影響を受けるため、不便である。さらに、これにより、所定の時間内にアッセイできる検体の数が制限されます。我々は、同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを提供し、サンプル室ベースのセットアップのスループットを向上させ、すべての標本に対して同様の周囲条件を保証します。まず、光シート蛍光顕微鏡の校正ガイドラインを提供します。第2に、試料回転に適合する複数の胚の実装方法を提案する。第三に、ショ ウジョウバエの典型的な3次元ライブイメージングデータセットを提供し、蛍光標識核と3つのトランスジェニックラインと Triboliumを並置し、同じ遺伝子を運ぶ3つのトランスジェニックサブラインの性能を比較しますが、ゲノムの異なる場所で比較します。私たちのプロトコルは、連続ライブイメージングで常に存在する周囲分散に積極的に対処するため、比較研究のために特別に設計されています。これは、ノックアウト実験などから生じる非収量性の型の定量的分析と特徴付けに特に重要です。また、全体的なスループットが向上し、蛍光顕微鏡の光シートへのアクセスが制限される場合に非常に便利である。最後に、提案された取り付け方法は、他の昆虫種およびさらなるモデル生物、例えばゼブラフィッシュに対して、基本的に最適化努力を伴わない適応することができる。
Introduction
蛍光顕微鏡は、生命科学、特に細胞生物学および発生生物学において最も重要なイメージング技術の1つです。共焦点蛍光顕微鏡1では、1990年代半ば以降の3次元蛍光イメージングの最先端のものであり、同じレンズが蛍光色素励起および発光光検出に使用されている。照明レーザービームは、照明/検出軸に沿ってすべての蛍光を励起し、それぞれの焦点外信号はピンホールによって検出される前に識別されます。したがって、各2次元画像について、全体の標本が照らされます。その結果、各3次元画像、すなわち、空間的に連続した2次元画像の積層に対して、検体全体が数十〜数百倍2回照らされ、光漂白および光毒性を促進する3。
約20年前、光シートベースの技術4 は、3次元蛍光イメージングの有望な代替手段として登場し、発生生物学5において貴重なツールとなりました。このアプローチでは、照明と検出が分離されます。照明レンズは、垂直に配置された検出レンズの焦点面内に数マイクロメートルの深さの光シートを生成するために使用される。したがって、2 次元イメージごとに、焦点面の周りの薄い平面ボリュームのみが照らされます。その結果、各3次元画像について、検体全体が一度だけ照射され、光漂白と光毒性6が強く減少する。このため、光シート蛍光顕微鏡(LSFMs)は、複数の生物学的に関連するスケールで複雑なプロセスを研究するための効率的なソリューションを提供し、特に数ミリメートルの大きさの標本を細胞内レベルで分析する必要がある発生生物学において価値があります。
歴史的に、LSCMはサンプルチャンバーベース7、8であった。これらの設定では、照明(x)および検出(z)軸は、通常、重力軸(y)に垂直に配置されます。サンプルチャンバーは、十分な実験の自由を提供します。第一に、それらは、特定の温度9を維持したり、生化学的ストレッサーを適用するために、環境を制御するために灌流システムの使用を容易にする、大きなイメージングバッファ容量を提供します。また、それらは、三次元を維持しながらそれぞれの実験ニーズに合わせたカスタマイズされた取付方法10を支持し、場合によっては、試料の完全性を動的にする。さらに、サンプルチャンバベースのセットアップは、通常、y軸の周りに標本を回転させ、2つ、4つ以上の方向に沿ってそれらをイメージするために使用される回転関数が装備されています。一般的に使用されるモデル生物の胚は、顕微鏡の文脈では、腹側側側、横方向、および/または前後部体軸に沿って比較的大きく、連続したイメージングがより包括的な表現を提供するからである。これにより、例えば、複雑な3次元移行経路12、13に沿って移動する細胞の長期追跡が可能になります。
軽シート系蛍光顕微鏡は、ショウジョウバエメラノガスターの胚形態形成を研究するために広範囲に適用されており、いずれも体系的に14、15、ならびに開発の生物物理学的側面に特に焦点を当てています。例えば、胚芽伸長16中の内胚葉内挿と軸延長との間の生体力学的リンクを検出するために高解像度のモルモジェネティックデータを収集し、さらに、胃の間の力発生パターンと複雑な細胞流を関連付けるために使用した。また、他の最先端技術、例えば、表皮18における前後部パターニング中のWntシグナル伝達の調節を調査する光遺伝学も組み合わされている。
しかし、1つの種だけを研究することは、発達の進化に関する洞察を提供するものではありません。系統的な文脈における胚発生を理解するために、代替昆虫モデル生物を用いて集中的な研究が行われている。最も包括的に調査された種の1つは、経済的に関連する貯蔵穀物害虫19である赤い小麦粉カブトムシトボリウムカスタネウムであり、その胚形態形成もすでにLSFM20で体系的に画像化されている。これら2種の胚形態形成は、いくつかの局面において著しく異なり、例えば、セグメンテーションモード21、ならびに胚外膜22の形成および分解が挙げられる。後者の側面は、LSFMを使用してすでに広範囲に分析されています。例えば、胚発生の良い部分に対する様々な危険からトリボリウム胚を包み込み、保護する胚外組織であるセロサは、背側閉鎖25の間に独自の撤退プロセスのための形態遺伝学的「ドライバー」としても作用することが示されている。また、気中中、ブラストドアルムの特定の領域が、非対称組織運動26を作成するためにビテリン膜に固定されたままであり、この観察に続いて、細胞がセロサ窓閉閉中に細胞を順次残すことを可能にすることが実証されている。
上記に引用したすべてのショウジョウバエとトリボリウム関連研究では、サンプルチャンバーベースのLSFMが使用されている。ほとんどの場合、胚はサンプル回転関数を使用して複数の方向に沿って記録された。明示的には述べられていないが、Tribolium20,28に関する我々の以前の研究と同様に、逐次ライブイメージングアッセイにおいて個別に独立して記録されていると仮定することができる。特定のシナリオでは、このようなアプローチは許容されますが、特に定量的比較アプローチでは、周囲分散が結果を歪める可能性があります。例えば、昆虫の発生速度は温度依存性29であると長い間知られているが、さらに最近の研究では、ショウジョウバエでは、温度がモルフォゲン30の濃度にも影響を与える可能性があることを示唆している。その結果、胚発生の特定の特性、例えば、細胞の動的な割合、分割速度および移動速度を、正確に定量化する必要がある場合、周囲分散を伴わない十分な反復が必要となる。これにより標準偏差と標準偏差誤差が最小限に抑え、わずかに発散した実験条件であっても他の条件との並置が容易になります。
しかし、サンプルチャンバーベースのLSFMは、主に高スループットアッセイではなく、高い含有量のために設計されています。顕微鏡スライド、ペトリ皿、ウェルプレート用の標準化クランプ機構が一般的に装備されている共焦点顕微鏡とは異なり、ほぼすべてのサンプルチャンバーベースのLSFMはシリンダーベースのクランプ機構を使用します。これらのメカニズムは、回転互換性があるカスタムメイドのサンプルホルダーと非侵襲的な10を対象としていますが、通常は20、31、32以上の標本用に設計されていません。サンプルチャンバーベースのセットアップの利点が損なわれない2つ以上の胚の同時ライブイメージングのフレームワークは、周囲分散の問題に対処し、それによって比較研究のためのLSFMsの価値を高める。
我々のプロトコルでは、y軸が胚を「積み重ねる」オプションとして使用されるサンプルチャンバーベースのLSFM(図1A)における比較ライブイメージングの実験的枠組みを提示する。まず、サンプルチャンバーベースのLSFMsに蛍光マイクロスフィアベースのキャリブレーションガイドラインを提供します。第二に、試料の回転に対応し、複数の方向に沿って複数の標本を同時に撮像できるクモの巣ホルダー28(図1B)に基づく複数の胚の取り付け方法を説明する(図1C)。いくつかの胚は、薄いアガロースフィルムの上に整列し、サンプルチャンバーに挿入した後、三次元画像を取得するためにライトシートを連続的に移動した。第三に、ショウジョウバエとトリボリウムのための3つの模範的なライブイメージングデータセットを提供します。前者については、トランスジェニックラインを蛍光標識核と並置する。後者の場合、同じ遺伝子導入を運ぶトランスジェニックサブラインのパフォーマンスを比較しますが、ゲノムの異なる場所で行います。最後に、比較ライブイメージングと周囲分散33に関する並列化の重要性について議論し、実験フレームワークのスループット限界を議論し、他のモデル生物へのアプローチの適応を評価する。
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Protocol
1. 準備作業
- 科学的な質問に合ったLSFM用の照明レンズ/検出レンズ/カメラの組み合わせを選択し、顕微鏡を設定します。視野の大きさは、カメラチップサイズの商と検出レンズの倍率です。照明レンズは、視野全体が平面ライトシート34で覆われるように選択されるべきである。3 つの推奨される組み合わせを 表 1に示します。
- アガロースアリコートと検索皿を調製するには、200mLオートクレーブ水道水に2gの低溶融アガロースを加え、すべてのアガロース粒子が溶解するまで600〜800 Wの電子レンジで混合物を加熱します。1.5 mL または 2 mL 反応チューブに 1 mL アガロースアリコートを用意し、高さ 3~5 mm の高い 90 mm の Ø ペトリ料理をアガロースで満たします。固めたアリコートと料理を4°Cで保管してください。
- ショウジョウバエの場合:新鮮な飼育バイアルを準備するには、十分な量のカスタムメイドまたは市販のショウジョウバエ培地を調理し、5〜15mLを広いバイアルに移し、4°Cで保管してください。 産卵皿を準備するには、低融解アガロース1gを50mLのオートクレーブ水道水に加え、すべてのアガロース粒子が溶解するまで600-800 Wの電子レンジで混合物を加熱します。混合物を45°Cまで冷やし、50 mLフルーツジュース(好ましくはリンゴまたは赤ブドウ)を加え、十分に混ぜます。35 mm Ø ペトリ皿に混合物を注ぎ、4 °Cで固化した産卵皿を保管します。
- Triboliumの場合:成長培地を調製するには、全粒粉と不活性乾燥酵母を710μmのメッシュサイズふるいに通し、ふるいにかけられた小麦粉を5%(w/w)ふるい酵母で補います。産卵培地を準備するには、250 μmメッシュサイズふるいを通して細かい小麦粉と不活性乾燥酵母を渡し、ふるいにかけた小麦粉を5%(w/w)ふるいにかけた酵母で補います。
2. 蛍光微小球を用いたサンプルチャンバーベースLSFMの較正
注:キャリブレーションの目的は、照明レンズと検出レンズの焦点を合わせることです(図2A)。これは、鮮明な画像の前提です。LSFMは、少なくとも3〜4週間に1回は定期的に校正する必要があります。
- 80°Cの乾燥ブロックヒーター/ミキサーでアガロースアリコートを再液化し、アガロースアリコートを35°Cまで冷却します。
- 50 μLのアガロースを1.5 mL反応チューブに移し、0.5 μLの蛍光微小球溶液を加えます。1,400 rpmで1分間混ぜます。
- クモの巣ホルダーのスロット穴にアガロース/蛍光微小球溶液混合物を10μL充填し、薄いアガロースフィルムが残るまでできるだけ多くのアガロースを吸引します。固化のために30-60 sを待ちます。
- サンプルチャンバーにオートクレーブ水道水を充填します。サンプルチャンバーにゆっくりとクモの巣ホルダーを挿入し、検出レンズの前にマイクロトランスレーションステージでスロット穴を移動します。
- 回転ステージでクモの巣ホルダーを、イルミネーション(x)軸と検出軸(z軸)に対して45°の位置に回転させます。クモの巣ホルダーは、伝送灯チャネルで見えない必要があります。
- それぞれの蛍光チャネルに切り替え、蛍光微小球が適切な信号を提供するように、レーザーパワーと露光時間を調整します。
- 今横方向のアガロースフィルムを完全に覆うビューのボリュームを指定します。それぞれの照明レンズ/検出レンズの組み合わせ34に対して可能な最大の軸解像度を計算して、z間隔を定義する。あるいは、横解像度の4倍を大まかな近似として使用することができる。
- 蛍光微小球の3次元テストzスタックを記録し、x、y、zの最大投影をキャリブレーションチャートと比較する(図2)。微小球がぼやけた、ぼやけている、または歪んでいる(図2B,C)場合は、照明レンズや検出レンズの位置を調整します。
3. ショ ウジョウバエ の回収
- 選択した ショウジョウバエ ラインの成人100~200人を、イメージングアッセイの2〜3日前に新鮮な飼育バイアルに移し、採卵培養を確立する。まだ存在しない場合は、古い飼育バイアルを使用して子孫の文化を始めることを検討してください。成人が生後2週間以下であることを保証するために、胚採取培養物を子孫培養物に間に合うように置き換える。
- 室温に産卵皿を温め、寒天の上に酵母ペーストを一滴加えます。
- 卵のコレクション文化から空の狭いバイアルに大人を転送し、産卵皿の上に置きます。卵の収集設定を室温で15分間インキュベートします。可能であれば、このステップ中に麻酔(冷たい、CO2)を避けてください。
- 大人を飼育バイアルに戻します。便利な温度/時間の組み合わせで産卵皿をインキュベートし、産卵皿から100 μmメッシュサイズのセルストレーナーに小さな絵筆で10〜20個の胚を移します。産卵皿を捨てる。
- ショ ウジョウバエ の各線について、手順3.1~3.4を繰り返します。
4. トリボリウム 胚のコレクション
注: 便宜上 、Tribolium の卵の収集手順のスキームが提供されています (図 3A) この手順のブラケット内の数字も参照します。
- 選択したトリボリウムラインの成人200~300名(約400~700mg)を、イメージングアッセイの2~10日前に空の1-Lガラスボトルに移し、コレクション培養を確立する(図3 A_01)。ボトルに50〜100gの新鮮な成長培地を充填してください。まだ存在しない場合は、利用可能な幼虫と子犬を使用して子孫培養を開始することを検討してください。成人が生後3ヶ月以下であることを保証するために、卵の採取培養を子孫の培養物に間に合うように置き換えます。
- 800 μm メッシュサイズのふるいを通して、卵の採取培養を渡します(図3A_02)。非段型胚を含む成長培地を初期ボトル(図3 A_03)に戻し、大人を空の1つのLガラス瓶に移す(図3 A_04)。産卵培地(図3 A_05)を10g加え、卵の採取設定を室温で1時間インキュベートする(図3 A_06,07)。
- 800 μm メッシュサイズのふるいを通して、卵の収集設定を渡します(図3A_08)。大人を最初のボトルに戻す(図3 A_09)。画像化すべき発達過程に応じて、現在約30〜100個の胚を含む産卵培地を便利な温度/時間の組み合わせでインキュベートする(図3A_10)。
- 産卵培地を300μmメッシュサイズの篩(図3A_11)に通し、胚(図3A_12)を100μmメッシュサイズのセルストレーナーに移します。ふるいにかけた産卵媒体を捨てる(図3A_13)。
- 各トリボリウム線について、手順 4.1 ~ 4.4 を繰り返します。
5. 次亜塩素酸ナトリウム系デコール化
注:ショ ウジョウバエ と トリボリウム の胚は、除去後に胚が湿っている限り、適切な発達に不可欠ではない保護的で重い光散乱タンパク質層であるコリオンで覆われています。両方の種の胚のデコールリオネーションプロトコルは同一である。
- A1、A2、A3、B3ウェルを8mLのオートクレーブ水道水とB1およびB2ウェルに7mLのオートクレーブ水道水と1mLの次亜塩素酸ナトリウム(NaOCl)溶液で充填して6ウェルプレートを準備する(図3B)。透過光の中で理想的には、ステレオ顕微鏡でデコールリオネーションプロセスを観察してください。
注意:次亜塩素酸ナトリウムは腐食性です。 - 胚含有細胞ストレーナー(ステップ3.4および/または4.4)をA1ウェルに挿入し、穏やかな攪拌の下で約30〜60sの胚を洗います。
- 細胞ストレーナーをB1ウェルに移動し、プレートを30sのために激しく振り、それをA2ウェルに移し、穏やかな攪拌の下で胚を1分間洗います。
- 細胞ストレーナーをB2によく移動し、ほとんどの胚が完全にデコリオネートされるまでプレートを激しく振り(図3C)、それをA3ウェルに移し、穏やかな攪拌の下で1分間胚を洗います。
- 取り付け手順を進める前に、セルストレーナーをB3によく保管してください。
- 各行に対して手順 5.1 ~ 5.5 を繰り返します。
6. クモの巣ホルダーを用いた複数の胚の取り付け
- 80°Cの乾燥ブロックヒーター/ミキサーでアガロースアリコートを再液化し、アガロースアリコートを35°Cまで冷却します。
- クモの巣ホルダーのスロット穴の上にアガロースのピペット10 μL。ピペットの先端で、細いアガロースフィルムだけが残るまで、アガロースを細孔の上に広げ、できるだけ多くのアガロースを吸引する。固化のために30-60 sを待ちます。
- 各ラインに対して、小さな絵筆で1つ以上の胚を慎重に選び、アガロースフィルムに置きます。
- 細孔の長い軸に沿って胚を配置し、その後、前部後方軸をスロット穴の長い軸に合わせます(図3D)。
- 1-2μLのアガロースを胚とアガロース膜の間の隙間に入れ、慎重に胚を安定化させる。固化のために30-60 sを待ちます。
- 取り付けられた胚を持つクモの巣ホルダーを、画像バッファで満たされたサンプルチャンバーにゆっくりと挿入します。
7. サンプルチャンバーベースLSFMにおける比較ライブイメージング
- 検出レンズの前にマイクロトランスレーションステージを持つ胚の1つを移動します。クモの巣ホルダーが、照明(x)および検出(z)軸に対して45°の位置にあることを確認します(図 1Cを参照)。
- 透過光チャンネルで、胚を視野の中央に移動します。クモの巣ホルダーは表示されません。
- 胚のミッドプレーンが焦点面と重なるまで、すなわち輪郭が鋭くなるまで、zのマイクロトランスレーション段階で胚を移動します。蛍光チャネルに切り替えないで、ミッドプレーンから250μm離れて両方向に移動して、ビューの体積を指定します。
- 必要に応じて、複数の方向に沿ってイメージングが必要な場合は、胚を適切に回転させ、ステップ7.2および7.3を繰り返します。クモの巣のホールダーは90°のステップの4つまでのオリエンテーションを支える。
- クモの巣ホルダーに取り付けられた他のすべての胚について、ステップ7.1~7.3(7.4)を繰り返します(図3E)。最下の胚が検出レンズの前にあるときに、最上の胚がイメージングバッファを離れないようにしてください。
- 蛍光チャネル(レーザーパワー、露光時間、検出フィルタ)およびタイムラプス(間隔、全持続時間)パラメータを定義し、イメージングプロセスを開始します。指標値については、サンプル データセットのメタデータ テーブル (補足表 1) を参照してください。数日間続くアッセイについては、蒸発を減らすためにサンプルチャンバーの開口部を少なくとも部分的に覆うことを検討してください。
8. 画像化胚の検索とさらなる培養
- イメージングアッセイが終了したら、サンプルチャンバからクモの巣ホルダーを慎重に取り外します。
- 小さな絵筆でアガロースフィルムから胚を取り外し、適切にラベル付けされた顕微鏡スライドに移します。スライドを取り出し皿に入れ、それぞれの標準的な飼育条件下でインキュベートします。
- 実験モダリティについて、胚発生がいつ完了したかを推定する。孵化タイムポイントが近づくにつれて、頻繁に検索皿をチェックし、孵化した ショウジョウバエ 幼虫を個々の飼育バイアルと トリボリウム 幼虫に24ウェルプレートの個々の井戸に移します。成長培地で半分までの井戸を埋めます。それぞれの標準的な飼育条件の下でインキュベートする。
- 観察された個人が成人になったら、適切な交配パートナーを提供し、数日後に子孫をチェックします。
9. 画像データ処理とメタデータのドキュメント
注意: 画像データ処理の場合、ImageJ 派生フィジー35 (imagej.net/Fiji/Downloads) をお勧めします。FIJI はインストールを必要とせず、32 ビットバージョンと 64 ビットバージョンも利用できます。LSFM データで最も頻繁に使用される形式の 1 つは、TIFF コンテナーの形式でイメージ スタックを保存できるタグ付きイメージ ファイル形式 (TIFF) です。
- すべての z スタックの z 最大投影を計算します (イメージ|スタック |Z プロジェクト を選択し、[ 最大強度]を選択します。最大投影法は、空間ディメンションの数を 3 から 2 に減らすデータ単純化アプローチです。バッチ処理用のフィジースクリプトが提供されています (補助ファイル 1)。
- それぞれの z 最大投影を連結して時間スタック(t スタック)を作成します。これらを 1 つの TIFF コンテナーに保存します。すべての記録された胚に加えて、該当する場合は、それぞれの方向および蛍光チャネルにこれを行います。
- z 軸を中心に z と t のスタックを回転させて、胚の前後軸を x または y イメージ軸に合わせます (イメージ |変換|回転)。3 つのイメージ軸すべてに沿って z スタックを切り取り、x および y イメージ軸の t スタックをトリミングして、胚の周りの最小のバッファ空間(x 軸と y 軸に沿って 20 ~ 40 ピクセル、z 軸に沿った 5 ~10 の画像)だけが残るようにします(Image ||を調整するx 軸と y 軸のキャンバス サイズ、 イメージ |スタック | ツール| z 軸のスライスキーパー)。
- 必要に応じて、記録されたすべての胚とそれぞれの方向にこれを個別に行います。蛍光チャネルは、該当する場合、同一の回転およびトリミングパラメータで処理する必要があります。
- メタデータをできるだけ詳細に文書化します。ガイドラインとして、「代表的な結果」セクションに記載されているサンプルデータセットのメタデータテーブルを使用できます (補足表 1)。
10. データの視覚化
注: このデータ可視化ガイドラインは、主に、複数の方向または時間の経過に沿っていくつかの記録された胚を示すz最大投影画像行列の作成に焦点を当てています。次の手順では、表示された図と「代表的な結果」セクションにリンクされたビデオを作成するためにサンプル データセットに適用されたデータ視覚化手順について説明します。
- 複数の方向のスタックを組み合わせる (画像|スタック |ツール|) を結合または複数の蛍光チャネル (画像|) を結合するカラー|チャネルをマージする ) を使用して、目的の生物学的構造および/またはプロセスを視覚化します。
- t スタックの強度を調整します (画像||を調整する必要に応じて、"Set"関数を使用して明るさ/コントラストを指定します。表示される最小値はバックグラウンド信号より少し上に設定する必要があり、最大表示値はコントラストが便利になります。それぞれの z スタックの一貫した調整に使用できるため、両方の値を文書化します。適用機能を使用して調整をインプリントします。実験のモダリティに応じて、記録されたすべての胚を同じ値で処理することを検討してください。
- 強度調整後の t スタックを別々のファイルとして保存し、調整されていない t スタックを上書きしないでください。専用の画像選択関数(例えば、画像|を使用して調整されたtスタックから適切なサブスタックをコンパイル スタック |ツール|スライスキーパー)を使用し、モンタージュツール(画像|スタック |「モンタージュを作成」をクリックして、フィギュアデザインに使用できるイメージグリッドを作成します。
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Representative Results
我々のプロトコルは、サンプルチャンバーベースのLSCMにおける比較蛍光ライブイメージングのための実験的枠組みについて説明する。例えば、フレームワークは、2種以上の(i)胚、(ii)1つ以上の遺伝子がノックアウトされるラインの胚と野生型コントロール、(iii)同じトランスジェニックラインの複数の胚、(iv)異なるトランスジェニックラインからの複数の胚、または(v)同じトランスジーンを運ぶサブラインからの胚を並置するために使用することができるが、異なるゲノムの場所で。このセクションでは、最後の 2 つのシナリオの例を示します。
我々の最初の例示的な適用では、我々は、異なるトランスジェニックショウジョウバエラインに由来する3つの胚の蛍光シグナルダイナミクスを示す(表2)約1日間にわたって(図4、補足ムービー1)。これらのラインについては、おそらくユビキタスで構成的に活性なプロモーターの制御下で核に局在するEGFP/GFPを発現するため、かなり似た蛍光パターンが予想されていました。しかし、我々の比較ライブイメージング結果は、周囲分散による二次的な影響ではない表現パターンに強い時空間的な違いがあることを示しています。
2番目のアプリケーション例では、AGOC{Zen1'#O(LA)-mEmerald} #1、#2、#3(Zen1'LA-mE #1、#2、#3)に由来する3つの胚のパフォーマンスを比較します。 これらのすべては、セルナーゼの仕様に関与する転写因子であるツェルクニュルト139プロモーターの制御下でmEmeraldにリンクされた37 Lifeact38の発現につながる同じピギーバクトベースのトランスジーンを運ぶ。ガストルレーション中のセロサウィンドウ閉鎖プロセスを示す我々の比較ライブイメージング結果は、サブライン#2が他の2つのサブラインよりも著しく強い全体的な信号を提供することを示唆している(図5、補足ムービー2)。これは、トリボリウムにおいても、ゲノムコンテキストが発現カセットを運ぶトランスジーンの発現レベルに強い影響を与える可能性があることを示している。
このセクションに示されている6つの胚の全ての正常な検索は、プロトコルのステップ8で説明されているように可能であった。それらのすべては、完全に機能的で肥沃な成人(補足表1、"検索"行)に発展し、全体的な手順は、土台から記録に対するデコールリオネーションから、非侵襲的であることを示す。このレベルの品質管理は、野生型の発達が予想されるたびに不可欠であり、例えば、1つ以上の遺伝子がノックダウンまたはノックアウトされる胚と同時に画像化される対照胚に関しては不可欠である。
代表的な結果を作成するために使用されたすべてのデータセットは、特に LSFM 初心者が自分の作業の品質を評価するのに役立つリソースとして提供されます。デジタル オブジェクト識別子ベースのダウンロード リンクは、メタデータ テーブル (補足表 1、"データ アクセス" 行) にあります。
図1:実験フレームワークと取り付け方法の概要(A) 短いリマインダーと必要な時間の推定を伴う10のプロトコルステップのフローチャート。アスタリスクが付いているタスクは、すべてのアッセイ中に実行する必要はありませんが、状況に応じて行われます。緑色のボックスは 、ショウジョウバエ および/または トリボリウムに関連するステップを示し、青いボックスは顕微鏡に関連するステップを示す。(B) クモの巣ホルダーの詳細図。提示された設計はサンプル部屋ベースLSCMで一般的に使用されるシリンダーベースのクランプ機構のために適している。ホルダーは、検出レンズの作動距離が尊重される限り、スケールすることができます。(C)複数の方向に沿った複数の胚のライブイメージングのための記録配列。最初に、最上胚のzスタックは、最大4つの向き、すなわち0°、90°、180°および270°に沿って記録されます。その後、以下の胚が検出レンズの前に移動し、記録/回転シーケンスが新たに開始されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:LSFMs用蛍光微小球ベースのキャリブレーション・チャートこの図は、LSFMが正しく較正されている場合、または照明(B)または検出オフセット(C)がある場合に、x、y、zの最大投影法で蛍光微小球がどのように現れるかを示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:複数胚の収集、デコールリオネーション、装着およびイメージング。(A) トリボリウム 胚コレクションの概要。図は、左上の数字に従ってステップ4全体で引用されています。(B)ステップ5で使用した6ウェルプレートの調製および移送方式。B1およびB2ウェルには、デコールリオネーションを誘発する希薄化された次亜塩素酸ナトリウム(NaOCl)が含まれていた。(C)B2ウェル内で胚を1つの井戸から別のウェルに移すために使用された100 μm細胞ストレーナー。上層詳細画像は、細胞ストレーナーメッシュの上に複数の Tribolium 胚のクローズアップを示し、下細部画像は部分的に切り離された絨毛を有するいくつかの Tribolium 胚の透過光ステレオ顕微鏡画像を示す。(D)3つのマウント されたトボリウム 胚を有するクモの巣のホルダー。胚は、その前部後軸と同様に、スロット穴の長い軸に沿って整列した。(E)3つの胚の記録中のLSFMのサンプルチャンバー内のクモの巣のホールダーの動き。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:#01691、#29724 #24163およびトランスジェニックショ ウジョウバエ 線からそれぞれ1つの胚の比較蛍光生画像化。胚は、20:00時間(全イメージング期間23:40時間から)の2つの(記録された4つの)方向に沿って示される。時間の経過に応じて動的強度の補正は行われませんでした。 ショウジョウバエ データセットのメタデータは 補足表 1を参照してください。ZA、Z最大投影、画像調整。スケールバー、100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:Zen1'LA-mE#1、#2および#3トランスジェニックトリボリウムサブラインからの1つの胚の比較蛍光ライブイメージング。(A)胚は、セルロサの窓の閉鎖の直前に、胃の間に4方向に沿って示されています。(B) 胚は、01:30の期間にわたって腹孔を示す(全画像化期間118:00時間から)。画像調整は、表示される最小値と最大値を同一にして行ったが、時間経過に伴う動的強度補正は行われなかった。Triboliumデータセットのメタデータについては、補足表 1を参照してください。データセットは、Aに示すステージに同期されました。ZA、Z最大投影、画像調整。スケールバー、100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| コンビネーション | 根拠 | 照明レンズ | 検出レンズ | カメラ | 参考 |
| #1 | 細胞レベルの胚全体、大きなピクセル間隔(小さなデータ量) | 2.5×倍率 0.06 (空気) | 10×倍率アパーチャ0.3(水浸漬) | 1.4メガピクセルのCCD(1392×1040、6.45 μmピッチ) | 本研究,ショウジョウバエ41, トリボリウム20,41 |
| #2 | 細胞/細胞内レベルの胚全体、小さなピクセル間隔(大容量データ) | 2.5×倍率 0.06 (空気) | 20×倍率開口0.5(水浸漬) | 5.5メガピクセルのsCMOS(2560×2160、6.5 μmピッチ) | トリボリウム9 |
| #3 | 細胞下レベルまたは特殊なアプリケーション上の胚の特定の領域(例えば解剖された生殖細胞の生画像化42,43) | 5.0×倍率 0.16 (空気) | 40×倍率アパーチャ 0.75 (水浸漬) | 1.4メガピクセルのCCD(1392×1040、6.45 μmピッチ) | トリボリウム44 |
表1:LSFMを用いた ショウジョウバエ および トリボリウム 胚のライブイメージングに推奨される照明レンズ/検出レンズ/カメラの組み合わせ すべての組み合わせは、これまでの研究で正常に採用されています (参照行を参照)。ほとんどのサンプルチャンバーベースのLSFMは、主に1.33の屈折率(オートクレーブ水道水やその他の水性媒体)のイメージングバッファ用に設計された検出用の水浸漬レンズを使用しています。他の屈折率を持つイメージングバッファは40を使用できますが、これは光学系の特定の特性、例えば作動距離を変更します。
| 線 | 遺伝子型 | 蛍光素発現 |
| #01691 | y[1] w[67c23];P{w[+mC]=ウビ-GFP.nls}ID-2;P{ウビ-GFP.nls}ID-3 | ポリウビキチンプロモーターの制御下のNLS-GFP |
| #29724 | w[*];P{w[+mC]=タブ84B-EGFP.NLS}3 | アルファ-チューブリン84Bプロモーターの制御下でNLS-GFP |
| #24163 | w[*];P{w[+mC]=His2Av-EGFP.C}2/SM6a | すべての細胞におけるEGFPラベルヒストン2A変異体 |
表2:第1の応用例で用いられる3本のトランスジェニック ショウジョウバエ 線。 「ライン」列はブルーミントンショ ウジョウバエ ストックセンター(bdsc.indiana.edu)の在庫番号を指します。
補足ビデオ1:#01691、#29724および#24163トランスジェニックショ ウバエ ラインからそれぞれ1つの胚の比較蛍光ライブイメージング。 各トランスジェニックラインは、おそらくユビキタスで構成的に活性なプロモーターの制御下で核局在性EGFP/GFPを発現する。ZA、Z最大投影、画像調整。時間の経過に応じて動的強度の補正は行われませんでした。ZA、Z最大投影、画像調整。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
補足ビデオ2:Zen1'LA-mE#1、#2および#3トランスジェニック トリボリウム サブラインからそれぞれ1つの胚の比較蛍光ライブイメージング。 トランスジェニックサブラインはそれぞれ、セロサ仕様に関与する転写因子である ツェルクニュルト1 プロモーターの制御下でmEmerald標識のライフアクトを発現する。Zen1'LA-mE#1胚は、セローザの窓の閉鎖直後に、セローザ内で約90°回転します。データセットは、 図 4Aに示すステージに同期化されました。画像調整は、表示される最小値と最大値を同一にして行ったが、時間経過に伴う動的強度補正は行われなかった。胚は、画像調整を伴う48:00 h.ZA、Z最大投影の期間にわたって腹腹および横に示される。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
補足ファイル 1: 1 つのフォルダー内のすべての z スタックから z 最大射影の自動計算のためのフィジーバッチ処理スクリプト。 スクリプトは、ドラッグアンドドロップでフィジーで開くことができます。開始位置 (「実行」) では、入力フォルダーのみを指定する必要があります。出力サブフォルダー(「Z 最大投影」)が自動的に作成されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表 1: 長期ライブイメージングデータセット DS0001-6 のメタデータとパラメータこちらの表をダウンロードしてください。
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Discussion
LSFの排他的な応用分野の1つは、発生生物学です。この分野では、生きた標本を見ることは重要であり、そうでなければ形態形成プロセスは動的に記述することはできません。ここで説明するサンプルチャンバベースのLSFMにおける同時ライブイメージングの実験的フレームワークは、2つの大きな理由から便利である。
連続ライブイメージングでは避けられない周囲分散は、積極的に対処することができます。昆虫胚関連の生画像では、例えば、次の感受性が見られます。卵の採取培養物は、胚採取時に異なる年齢を有し得る。 ショウジョウバエでは、これが子孫45の性質に影響を与えることを示している。適切に非同期化されたカルチャを使用することもできますが、同期カルチャとの同時イメージングの方が便利です。 ショウジョウバエと トリボリウムベースの代表的な結果は、両方とも同期した卵の採取培養に由来し、異なる蛍光特性が親の老化の意図しない効果であることを確信して排除することができます。
デコールリオネーションは、次亜塩素酸ナトリウムへの長期暴露が胚の生存率を低下させる重要なステップである。不都合なことに、次亜塩素酸ナトリウムのイオン強度は時間の経過とともに低下する。イオン強度の測定は46が可能であるが、面倒で面倒である。同時ライブイメージングでは、マスターミックスは、デコールリオネーション関連の6ウェルプレートの調製中にすべてのラインおよび/または条件に使用することができます。
効率的な空気状態の実験室でも、小さいながらも不規則な温度変動は避けられず、温度制御9 サンプルチャンバーベースのLSFMsにも影響を与えます。同時ライブイメージングでは、これらの変動も発生しますが、同様にすべての胚に影響を与えます。
実用的な観点から、複数の胚の同時イメージングのためのプロトコルは、スループットを増加させます。ライブイメージングでは、目的の発達プロセスの期間は、LSFMsへのアクセスが制限されている場合に重要な考慮事項である、特定の期間内に実施できるアッセイの数を決定します。長期記録の主な例は、細胞が追跡されるライブイメージングアッセイである。このような実験は、通常、長い開発期間にわたって及ぶ。 ショウジョウバエ の胚発生は室温47で約1日しかかかりませんが、 トリボリウム は約7日間48日かかります。したがって、この種では、並列化は、特に多くの条件が比較されるアッセイに関して、合理的な時間枠内にとどまるために不可欠である。
スループット、すなわち同時に画像化される胚の数は、主に2つの要因によって制限される:まず、サンプルチャンバ内のy軸に沿って利用可能な空間である。最下胚が画像化されようとしているとき、最上の胚はイメージングバッファを離れるべきではなかった。さらに、クモの巣ホルダーと関連するサポートシステムは、zスタック記録プロセス中に著しく揺れ動いたり、ジッタを発生させるほど長くなるべきではありません。2 つ目は、意図した時間的解像度です。胚当たりの記録時間は、2次元画像あたりの露光時間(通常は10~200ミリ秒)とzスタックあたりの平面数(通常は数百)、チャンネル数(通常は1~3)、方向の数(通常は1~8)、および移動と移動回転のセットアップ依存因子(推定1.2~1.5の間)を掛けることによって近似することができます。胚当たりの意図された時間分解能と記録時間の比率は、同時に画像化できる胚の最大数を示します。要約すると、当社のプロトコルは、シーケンシャルライブイメージングから中程度のスループットに進化するのに適していますが、一般的に高スループットと見なされるものには適していません。後者の場合、顕微鏡スライド49、50、51またはウェルプレート52に適したLSFMが考慮され得るが、これらの実施には通常他の制限がある。
実験の質問に応じて、イメージングパラメータと組み合わせて照明レンズ/検出レンズ/カメラの組み合わせ、同時に画像化されたLSFMデータセットは、その生の状態で膨大な記憶スペースを必要とするかもしれません。この問題は、提供された ショウジョウバエサンプルデータセット(補足表1)、すなわちDS0001-3を考慮することによって最もよく説明できます。各2次元の生画像は約2.8メガバイトのデータ量を有し、各生のzスタックは120面で構成され、3つの胚はすべて合計143回4方向に沿って記録された。その結果、生のデータセットはテラバイトの約半分を占めていました。画像データ処理、すなわち、すべての空間寸法に沿ってトリミング(ステップ9)をZIPベースの圧縮と組み合わせることで、データ量は初期量の約10%である53.3ギガバイトに減少した。テラバイト政権でデータセットを処理するには、フィジーにプリインストールされているBigDataViewer53 プラグイン(プラグイン|ビッグデータビューアを使用することをお勧めします。
代表結果セクションで概説されている5つのシナリオに加えて、当社のプロトコルは 、Tribolium54で一般的なアプローチであるRNAiノックダウン効果の効果を特徴付けるためにも使用できます。しかし、コントロール胚の同時イメージングは不可能であるため、イメージングバッファを介して適用する必要がある場合は、化合物(例えば殺虫剤または他の生化学的ストレッサー)の分析に限られた使用しかできません。
私達は私達の特製の顕微鏡8、55の私達の議定書をデモにしたが、それはあらゆるサンプルチャンバーベースのセットアップ、例えば、OpenSPIM56またはほとんどの商業LSCMに適用可能である。このプロトコルは、初心者が軽シートベースの技術を研究計画に積極的に統合することを奨励することを目的としたLSFM関連の資源確立イニシアチブを補完します。現在、ほとんどの大学や機関は、設備の整った蛍光顕微鏡施設57を運営しています。これらは通常、1つ以上のチャンバーベースのLSCMへのアクセスを提供しますが、スタッフは手元にあるすべての科学的な質問に対して適切な実験的解決策を持つことは期待できません。
我々の実験フレームワークはショウジョウバエおよびトリボリウムに適していることを我々の結果は示した。我々は、我々の比較に焦点を当てたプロトコルが他の昆虫種の胚発生を研究するために使用することができると確信している。例えば、LSFMベースのアプローチは、スカットルフライメガセリアアブディータ58で野生型とノックダウンの開発を比較するために適用されており、フォローアップ研究も当社の取り付け方法の恩恵を受けるでしょう。さらに、蛍光ライブイメージング59用に特別に設計された2点のクリケットGryllus bimaculatusのトランスジェニックラインが利用可能であるが、現在利用可能な比較焦点プロトコル60は従来の反転顕微鏡を対象としているため、3次元画像取得やサンプル回転には対応していない。さらに、クモの巣ホルダーは、胚発生61の間に胚がかなり形状を変化させるゼブラフィッシュにとって便利な選択であることを既に示している。基本的に最適化の努力を必要としないプロトコルの適応は、このモデル生物に対しても上記の利点を提供するであろう。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
エルンスト・H・K・ステルツァーは、彼のリソースだけでなく、原稿に関する彼の貴重なコメントを使用する機会に感謝します, トリボリウム ライブイメージングのためのサポートのためのアニタ・アンデルル, 技術サポートのためのスヴェン・プラスだけでなく、イラン・デイビス, ニコール・グリーダーとジェロルド・シュービガーは、ブルーミントンストックセンターを介して彼らの遺伝子導入 ショウジョフィラ ラインを共有しました.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100 µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800 µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
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