Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61713
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF - MC), Goethe-Universität
* These authors contributed equally

Summary

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Abstract

Op lichtplaat gebaseerde fluorescentiemicroscopie biedt efficiënte oplossingen om complexe processen op meerdere biologisch relevante schalen te bestuderen. Op de monsterkamer gebaseerde opstellingen, die specifiek zijn ontworpen om de driedimensionale integriteit van het monster te behouden en meestal voorzien zijn van monsterrotatie, zijn de beste keuze in ontwikkelingsbiologie. Ze zijn bijvoorbeeld gebruikt om de volledige embryonale morfogenese van de fruitvlieg Drosophila melanogaster en de rode meelkever Tribolium castaneum te documenteren. Veel beschikbare live beeldvormingsprotocollen bieden echter alleen experimentele kaders voor enkele embryo's. Vooral voor vergelijkende studies zijn dergelijke benaderingen lastig, omdat opeenvolgend afgebeelde exemplaren worden beïnvloed door omgevingsafwijkingen. Verder beperkt dit het aantal exemplaren dat binnen een bepaalde tijd kan worden afgeteld. We bieden een experimenteel raamwerk voor gelijktijdige live beeldvorming dat de doorvoer in op de monsterkamer gebaseerde opstellingen verhoogt en zo zorgt voor vergelijkbare omgevingsomstandigheden voor alle monsters. Ten eerste bieden we een kalibratierichtlijn voor lichtplaatfluorescentiemicroscopen. Ten tweede stellen wij een montagemethode voor meerdere embryo's voor die compatibel is met monsterrotatie. Ten derde bieden we voorbeeldige driedimensionale live imaging datasets van Drosophila, waarvoor we drie transgene lijnen naast elkaar plaatsen met fluorescerend gelabelde kernen, evenals van Tribolium, waarvoor we de prestaties vergelijken van drie transgene sublijnen die hetzelfde transgeen dragen, maar op verschillende genomische locaties. Ons protocol is speciaal ontworpen voor vergelijkende studies omdat het proactief omgevingsafwijkingen aanpakt, die altijd aanwezig zijn in sequentiële live beeldvorming. Dit is vooral belangrijk voor kwantitatieve analyses en karakterisering van aberrationele fenotypes, die bijvoorbeeld het gevolg zijn van knock-out experimenten. Verder verhoogt het de algehele doorvoer, wat zeer handig is wanneer de toegang tot fluorescentiemicroscopen van lichtplaten beperkt is. Ten slotte kan de voorgestelde montagemethode worden aangepast voor andere insectensoorten en andere modelorganismen, bijvoorbeeld zebravissen, zonder optimalisatie-inspanning.

Introduction

Fluorescentiemicroscopie is een van de meest essentiële beeldvormingstechnieken in de biowetenschappen, vooral in de cel- en ontwikkelingsbiologie. In confocale fluorescentiemicroscopen1, die sinds het midden van de jaren negentig state-of-the-art zijn voor driedimensionale fluorescentiebeeldvorming, wordt dezelfde lens gebruikt voor fluorofoor excitatie en emissielichtdetectie. De verlichtingslaserstraal prikkelt alle fluoroforen langs de verlichtings-/detectieas en het betreffende storingssignaal wordt vóór detectie door een pinhole gediscrimineerd. Daarom wordt voor elk tweedimensionaal beeld het hele exemplaar verlicht. Bijgevolg wordt voor elk driedimensionaal beeld, d.w.z. een stapel ruimtelijk opeenvolgende tweedimensionale beelden, het hele exemplaar enkele tientallen tot enkele honderden kerenverlicht 2, wat fotobleaching en fototoxiciteitbevordert 3.

Bijna twintig jaar geleden kwam lichtplaattechnologie4 naar voren als een veelbelovend alternatief voor driedimensionale fluorescentiebeeldvorming en werd zo een waardevol hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie5. In deze benadering worden verlichting en detectie ontkoppeld. De verlichtingslens wordt gebruikt om een lichtplaat te genereren met een diepte van slechts enkele micrometers binnen het brandpuntsvlak van de loodrecht gerangschikte detectielens. Daarom wordt voor elk tweedimensionaal beeld slechts een dun vlak rond het brandpuntsvlak verlicht. Bijgevolg wordt voor elk driedimensionaal beeld het hele exemplaar slechts één keer verlicht, wat fotobleaching en fototoxiciteit sterk vermindert6. Om deze reden bieden lichtplaatfluorescentiemicroscopen (LSFMs) efficiënte oplossingen om complexe processen op meerdere biologisch relevante schalen te bestuderen en zijn daarom van bijzondere waarde in de ontwikkelingsbiologie, waar monsters zo groot als enkele millimeters op subcellulair niveau moeten worden geanalyseerd.

Historisch gezien zijn LSFM 's op de steekproefkamer gebaseerd7,8. In deze opstellingen staan de verlichtingsassen (x) en detectieassen (z) meestal loodrecht op de zwaartekrachtas (y). Monsterkamers bieden voldoende experimentele vrijheid. Ten eerste bieden ze grote beeldbuffercapaciteiten, wat op zijn beurt het gebruik van een perfusiesysteem vergemakkelijkt om de omgeving te beheersen, bijvoorbeeld om een specifieke temperatuur9 te handhaven of biochemische stressoren toe te passen. Verder ondersteunen ze aangepaste montagemethoden10 die zijn afgestemd op de respectieve experimentele behoeften met behoud van de driedimensionale, in sommige gevallen dynamische11, integriteit van het monster. Bovendien zijn op de monsterkamer gebaseerde opstellingen meestal uitgerust met een rotatiefunctie die wordt gebruikt om de monsters rond de y-as te draaien en ze zo langs twee, vier of zelfs meer richtingen te weergeven. Aangezien embryo's van veelgebruikte modelorganismen in de context van microscopie relatief grote, opeenvolgende beeldvorming langs de ventrale dorsale, laterale en/of voorste-posterieure lichaamsassen zijn, biedt een uitgebreidere weergave. Dit maakt bijvoorbeeld het mogelijk om cellen op lange termijn te volgen die zich langs complexe driedimensionale migratiepaden12,13bewegen .

Lichtbladgebaseerde fluorescentiemicroscopie is uitgebreid toegepast om de embryonale morfogenese van Drosophila melanogasterte bestuderen, zowel systematisch14,15 als met een specifieke focus op de biofysische aspecten van ontwikkeling. Het werd bijvoorbeeld gebruikt om morfogenetische gegevens met hoge resolutie te verzamelen om een biomechanisch verband te detecteren tussen endoderm-invaginatie en asuitbreiding tijdens kiembandverlenging16 en verder om de complexe cellulaire stroom te relateren met krachtgeneratiepatronen tijdens gastrulatie17. Het is ook gecombineerd met andere state-of-the-art technieken, bijvoorbeeld optogenetica om de regulatie van Wnt-signalering tijdens voor-posterieure patronen in de epidermis18te onderzoeken .

Het bestuderen van slechts één soort geeft echter geen inzicht in de evolutie van de ontwikkeling. Om embryogenese binnen de fylogenetische context te begrijpen, is intensief onderzoek uitgevoerd met alternatieve insectenmodelorganismen. Een van de meest uitgebreid onderzochte soorten is de rode meelkever Tribolium castaneum, een economisch relevante opgeslagen graanplaag19, waarvan de embryonale morfogenese ook al systematisch is afgebeeld met LSFM20. De embryonale morfogenese van deze twee soorten verschilt opmerkelijk in verschillende aspecten, bijvoorbeeld de segmentatiemodus21, evenals de vorming en afbraak van extra-embryonale membranen22. Dit laatste aspect is al uitgebreid geanalyseerd met behulp van LSFMs. Zo is aangetoond dat de serosa, een extra-embryonaal weefsel dat het Tribolium-embryo omhult en beschermt tegen verschillende gevaren voor het grootste deel van zijn embryogenese23,24, ook fungeert als de morfogenetische "driver" voor zijn eigen terugtrekkingsproces tijdens dorsale sluiting25. Verder is aangetoond dat tijdens gastrulatie een bepaald gebied van het blastoderm verankerd blijft aan het vitellinemembraan om asymmetrische weefselbewegingen te creëren26 en, na deze observatie, dat geregionaliseerde weefselfluïdisatie cellen in staat stelt om de serosarand opeenvolgend te verlaten tijdens serosa-raamsluiting27.

In alle hierboven genoemde drosophila-en tribolium-geassocieerdestudies zijn LSFMs op basis van de steekproefkamer gebruikt. In de meeste gevallen werden de embryo's in meerdere richtingen geregistreerd met behulp van de monsterrotatiefunctie. Hoewel niet expliciet vermeld, kan worden aangenomen dat ze individueel en dus onafhankelijk van elkaar zijn geregistreerd in opeenvolgende live beeldvormingstesten, vergelijkbaar met ons eerdere werk over Tribolium20,28. In bepaalde scenario's is een dergelijke benadering aanvaardbaar, maar vooral in kwantitatieve vergelijkende benaderingen kan omgevingsafwijking de resultaten verstoren. Het is bijvoorbeeld al lang bekend dat de ontwikkelingssnelheid van insecten temperatuurafhankelijk is29, maar een recentere studie suggereert verder dat in Drosophilade temperatuur ook de concentratie van morfogenen30kan beïnvloeden . Als bepaalde kenmerken van embryogenese, bijvoorbeeld de dynamische verhoudingen, de delingspercentages en migratiesnelheden van cellen, nauwkeurig moeten worden gekwantificeerd, zijn voldoende herhalingen zonder omgevingsafwijking vereist. Dit minimaliseert standaardafwijkingen en standaardfouten, wat op zijn beurt het naast elkaar plaatsen vergemakkelijkt, zelfs slechts marginaal uiteenlopende experimentele omstandigheden.

LSFMs op basis van de steekproefkamer zijn echter voornamelijk ontworpen voor testtesten met een hoog gehalte in plaats van voor hoge doorvoer. In tegenstelling tot confocale microscopen, die meestal zijn uitgerust met gestandaardiseerde klemmechanismen voor microscopieglaasjes, Petrischalen en putplaten, gebruiken bijna alle op de monsterkamer gebaseerde LSFMs op cilinder gebaseerde klemmechanismen. Deze mechanismen zijn bedoeld voor op maat gemaakte monsterhouders die rotatiecompatibel en niet-invasiefzijn 10, maar meestal niet zijn ontworpen voor meer dan één monster20,31,32. Een kader voor gelijktijdige levende beeldvorming van twee of meer embryo's, waarbij de voordelen van op de steekproefkamer gebaseerde opstellingen niet in het gedrang komen, pakt het probleem van de omgevingsafwijking aan, waardoor de waarde van LSFM's voor vergelijkende studies toeneemt.

In ons protocol presenteren we een experimenteel kader voor vergelijkende live beeldvorming in op de steekproefkamer gebaseerde LSFMs (figuur 1A) waarin de y-as wordt gebruikt als een optie om embryo's te "stapelen". Ten eerste bieden we een fluorescerende microsfeergebaseerde kalibratierichtlijn voor op monsterkamers gebaseerde LSFMs, wat vooral belangrijk is voor instrumenten zonder kalibratieassistent. Ten tweede beschrijven we een montagemethode voor meerdere embryo's op basis van de spinnenwebhouder28 (figuur 1B) die compatibel is met monsterrotatie en dus gelijktijdige beeldvorming van meerdere monsters in meerdere richtingen mogelijk maakt (figuur 1C). Verschillende embryo's worden uitgelijnd op een dunne agarosefilm en, na inbrengen in de monsterkamer, achtereenvolgens door het lichtblad bewogen om driedimensionale beelden te verkrijgen. Ten derde bieden we drie voorbeeldige live imaging datasets voor Drosophila en voor Tribolium. Voor de eerste, we naast transgene lijnen met fluorescerend gelabelde kernen. Voor de laatste vergelijken we de prestaties van transgene sublijnen die hetzelfde transgeen dragen, maar op verschillende genomische locaties. Tot slot bespreken we het belang van parallellisatie met betrekking tot vergelijkende live beeldvorming en omgevingsafwijking33, bespreken we de doorvoerlimiet van ons experimentele kader en evalueren we de aanpassing van onze benadering van andere modelorganismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereidende werkzaamheden

  1. Kies een verlichtingslens/detectielens/cameracombinatie voor de LSFM die past bij de wetenschappelijke vraag en stel de microscoop in. De grootte van het gezichtsveld is het quotiënt van de grootte van de camerachip en de vergroting van de detectielens. De verlichtingslens moet zo worden gekozen dat het gehele gezichtsveld wordt bedekt door een ruwweg vlak lichtblad34. Tabel 1bevat drie aanbevolen combinaties .
  2. Om agarose aliquots en retrieval gerechten te bereiden, voeg 2 g laagsmeltende agarose toe aan 200 ml autoclaafd leidingwater en verwarm het mengsel in een magnetron op 600-800 W totdat alle agarosedeeltjes zijn opgelost. Bereid verschillende 1 ml agarose aliquots in reactiebuizen van 1,5 ml of 2 ml en vul vervolgens verschillende 90 mm Ø Petri-schalen van 3-5 mm hoog met agarose. Bewaar gestolde aliquots en gerechten bij 4 °C.
  3. Voor Drosophila: Om verse opfokflacons te bereiden, kookt u een voldoende hoeveelheid op maat gemaakt of in de handel verkrijgbaar Drosophila-medium, zet u 5-15 ml over in brede flacons en bewaart u deze bij 4 °C. Om eierleggerechten te bereiden, voegt u 1 g smeltarme agarose toe aan 50 ml autoclaaf kraanwater en verwarmt u het mengsel in een magnetron op 600-800 W totdat alle agarosedeeltjes zijn opgelost. Laat het mengsel afkoelen tot 45 °C, voeg vervolgens 50 ml vruchtensap (bij voorkeur appel of rode druif) toe en meng grondig. Giet het mengsel in 35 mm Ø Petrischalen en bewaar gestolde eierlegschalen bij 4 °C.
  4. Voor Tribolium: Om het groeimedium te bereiden, passeert u volkorenmeel en inactieve droge gist door een zeef van 710 μm maaswijdte en vult u het gezeefde meel aan met 5% (w / w) gezeefde gist. Om eierlegmedium te bereiden, passeert u fijn tarwemeel en inactieve droge gist door een zeef met een maaswijdte van 250 μm en vult u het gezeefde meel aan met 5% (w / w) gezeefde gist.

2. Kalibratie van op monsterkamer gebaseerde LSFM's met fluorescerende microsferen

OPMERKING: Het doel van de kalibratie is om de brandpunten van de verlichtings- en detectielenzen uit te lijnen (figuur 2A), omdat dit het uitgangspunt is voor heldere beelden. LSFMs moeten regelmatig worden gekalibreerd, ten minste eenmaal per 3-4 weken.

  1. Maak een agarose aliquot opnieuw vloeibaar in een droge blokverwarming/mixer bij 80 °C en laat de agarose aliquot afkoelen tot 35 °C.
  2. Breng 50 μL agarose over naar een reactiebuis van 1,5 ml en voeg 0,5 μL fluorescerende microsfeeroplossing toe. Meng bij 1.400 tpm gedurende 1 min.
  3. Vul het sleufgat van de spinnenwebhouder met 10 μL agarose/fluorescerend microsfeeroplossingsmengsel en aspireer vervolgens zoveel mogelijk agarose totdat er slechts een dunne agarosefilm overblijft. Wacht 30-60 s op stolling.
  4. Vul de monsterkamer met autoclaaf kraanwater. Plaats de spinnenwebhouder langzaam in de monsterkamer en beweeg het sleufgat met de microvertalingsfasen voor de detectielens.
  5. Draai de spinnenwebhouder met de draaitrap in een stand van 45° ten opzichte van de verlichtings- en detectieassen (z). De spinnenwebhouder mag niet zichtbaar zijn in het zendlichtkanaal.
  6. Schakel over naar het betreffende fluorescentiekanaal en pas het laservermogen en de belichtingstijd aan, zodat de fluorescerende microbolletjes het juiste signaal geven.
  7. Geef een volume van de weergave op dat de nu transversaal georiënteerde agarose-film volledig bedekt. Definieer de z-afstand door de maximaal mogelijke axiale resolutie voor de betreffende combinatie van verlichtingslens/detectielens te berekenen34. Als alternatief kan 4 keer de laterale resolutie worden gebruikt als een ruwe benadering.
  8. Neem een driedimensionale test z-stack van de fluorescerende microbolletjes op en vergelijk de maximale projecties x, y en z met de kalibratiegrafiek (figuur 2). Als de microsferen wazig, wazig en/of vervormd lijken(figuur 2B,C),past u de posities van de verlichtings- en/of detectielens aan.

3. Verzameling van Drosophila embryo's

  1. Breng 100-200 volwassenen van de Drosophila-lijn naar keuze 2-3 dagen voor de beeldvormingstest over naar een verse opfokfcon om een eicelverzamelingscultuur vast te stellen. Als deze nog niet bestaat, overweeg dan om de oude opfokfflacon te gebruiken om een nakomelingencultuur te starten. Om ervoor te zorgen dat volwassenen niet ouder zijn dan twee weken, vervangt u de embryoverzamelingscultuur op tijd door de nakomelingencultuur.
  2. Verwarm een eierlegschaal op kamertemperatuur en voeg een druppel gistpasta toe bovenop de agar.
  3. Breng de volwassenen van de eierverzamelingscultuur over in een lege smalle flacon en leg deze bovenop de eierlegschaal. Incubeer de eierverzameling op kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Vermijd anesthesie (koud, CO2)tijdens deze stap indien mogelijk.
  4. Breng de volwassenen terug naar de opfokfcon. Incubeer de eierlegschaal op een handige combinatie van temperatuur en tijd en breng vervolgens 10-20 embryo's met een kleine kwast van de eierlegschaal naar een celzeef van 100 μm maaswijdte over. Gooi de eierlegschaal weg.
  5. Herhaal stap 3.1 tot en met 3.4 voor elke Drosophila-lijn.

4. Verzameling triboliumembryo's

OPMERKING: Voor het gemak is een schema van de Tribolium-eierverzamelingsprocedure ( figuur3A) beschikbaar waarnaar ook de nummers tussen de haakjes in deze stap verwijzen.

  1. Breng 200-300 volwassenen (ongeveer 400-700 mg) van de Tribolium-lijn naar keuze 2-10 dagen voor de beeldvormingstest over in een lege glazen fles van 1 L om een eicelverzamelingscultuur vast te stellen (figuur 3A_01). Vul de fles met 50-100 g vers groeimedium. Als deze nog niet bestaat, overweeg dan om een nakomelingencultuur te starten met beschikbare larven en poppen. Om ervoor te zorgen dat volwassenen niet ouder zijn dan 3 maanden, vervangt u de eierverzamelingscultuur op tijd door de nakomelingencultuur.
  2. Doorloop de eicelopvangcultuur door een maaswijdtezeef van 800 μm(figuur 3A_02). Breng het groeimedium, dat niet-geënsceneerde embryo's bevat, terug naar de oorspronkelijke fles (figuur 3A_03) en breng volwassenen over in een lege glazen fles van 1 L (figuur 3A_04). Voeg 10 g eierlegmedium(figuur 3A_05) toe en incubeer de opstelling van de eierverzameling gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (figuur 3A_06,07).
  3. Doorloop de eieropvangopstelling door de maaswijdtezeef van 800 μm(figuur 3A_08). Breng volwassenen terug naar hun eerste fles (figuur 3A_09). Afhankelijk van het ontwikkelingsproces dat moet worden afgebeeld, incubeer het eilegmedium, dat nu ongeveer 30-100 embryo's bevat, bij een handige combinatie van temperatuur en tijd (figuur 3A_10).
  4. Passeer het eilegmedium door de zeef met een maaswijdte van 300μm (figuur 3A_11)en breng de embryo's (figuur 3A_12) over in een celzeef met een maaswijdte van 100 μm. Gooi de gezeefde eierlegmedia weg (figuur 3A_13).
  5. Herhaal stap 4.1 tot 4.4 voor elke Triboliumlijn.

5. Dechorionatie op basis van natriumhypochloriet

OPMERKING: Zowel Drosophila- als Tribolium-embryo's zijn bedekt met een koraal, een beschermende en zwaar lichtverstrooiende eiwitlaag die niet essentieel is voor een goede ontwikkeling, zolang de embryo's na verwijdering vochtig worden gehouden. Het dechorionatieprotocol voor de embryo's van beide soorten is identiek.

  1. Bereid een 6-putplaat voor door de A1-, A2-, A3- en B3-putten te vullen met 8 ml autoclaafd leidingwater en de B1- en B2-putten met 7 ml autoclaaf kraanwater en 1 ml natriumhypochlorietoplossing (NaOCl) (figuur 3B). Observeer het dechorionatieproces onder een stereomicroscoop, idealiter bij zendlicht.
    LET OP: Natriumhypochloriet is corrosief.
  2. Steek de embryobevattende celzeef (stap 3.4 en/of 4.4) in de A1 put en was de embryo's ongeveer 30-60 s onder zachte agitatie.
  3. Verplaats de celzeef goed naar de B1 en schud de platen krachtig gedurende 30 s, breng deze vervolgens over naar de A2-put en was de embryo's gedurende 1 minuut onder zachte agitatie.
  4. Verplaats de celzeef goed naar de B2 en schud de plaat krachtig totdat de meeste embryo's volledig zijn ontchorioneerd(figuur 3C),breng deze vervolgens over naar de A3-put en was de embryo's gedurende 1 minuut onder zachte agitatie.
  5. Bewaar de celzeef ruim in de B3 voordat u doorgaat met de montageprocedure.
  6. Herhaal stap 5.1 tot 5.5 voor elke regel.

6. Montage van meerdere embryo's met behulp van de spinnenwebhouder

  1. Maak een agarose aliquot opnieuw vloeibaar in een droge blokverwarming/mixer bij 80 °C en laat de agarose aliquot afkoelen tot 35 °C.
  2. Pipet 10 μL agarose bovenop het sleufgat van de spinnenwebhouder. Met de pipetpunt spreidt u de agarose over het sleufgat en aspireert u vervolgens zoveel mogelijk agarose totdat er slechts een dunne agarosefilm overblijft. Wacht 30-60 s op stolling.
  3. Kies voor elke lijn zorgvuldig een of meer embryo's met een kleine kwast en plaats ze op de agarosefilm.
  4. Schik de embryo's langs de lange as van het sleufgat en lijn vervolgens ook hun voorste-achterste as uit met de lange as van het sleufgat (figuur 3D).
  5. Stabiliseer de embryo's zorgvuldig door 1-2 μL agarose in de opening tussen de embryo's en de agarosefilm te gieten. Wacht 30-60 s op stolling.
  6. Plaats de spinnenwebhouder met de gemonteerde embryo's langzaam in de met beeldbuffer gevulde monsterkamer.

7. Vergelijkende live beeldvorming in op de steekproefkamer gebaseerde LSFMs

  1. Beweeg een van de embryo's met de microvertalingsfasen voor de detectielens. Zorg ervoor dat de spinnenwebhouder zich in een stand van 45° bevindt ten opzichte van de verlichtings-(x) en detectieassen (z) (zie figuur 1C).
  2. Verplaats het embryo in het lichtkanaal naar het midden van het gezichtsveld. De spinnenwebhouder mag niet zichtbaar zijn.
  3. Verplaats het embryo met de microtranslation-stadia in z totdat het middenvlak van het embryo overlapt met het brandpuntsvlak, d.w.z. totdat de omtrek scherp lijkt. Zonder over te schakelen naar het fluorescentiekanaal, specificeert u het volume van het zicht door 250 μm van het middenvlak in beide richtingen te bewegen.
  4. Optioneel, als beeldvorming in meerdere richtingen vereist is, roteer het embryo op de juiste manier en herhaal stap 7.2 en 7.3. De spinnenwebhouder ondersteunt maximaal vier oriëntaties in stappen van 90°.
  5. Herhaal de stappen 7.1 tot en met 7.3 (of 7.4) voor alle andere embryo's die op de spinnenwebhouder zijn gemonteerd (figuur 3E). Zorg ervoor dat het bovenste embryo de beeldvormingsbuffer niet verlaat wanneer het onderste embryo zich voor de detectielens bevindt.
  6. Definieer de parameters fluorescentiekanaal (laservermogen, belichtingstijd, detectiefilter) en timelapse (interval, totale duur) en start het beeldvormingsproces. Raadpleeg voor indicatieve waarden de metagegevenstabel van de voorbeeldgegevenssets (Aanvullende tabel 1). Voor testtesten die enkele dagen duren, moet u overwegen de opening van de monsterkamer ten minste gedeeltelijk te bedekken om verdamping te verminderen.

8. Ophalen en verder kweken van afgebeelde embryo's

  1. Wanneer de beeldvormingstest is beëindigd, verwijdert u de spinnenwebhouder voorzichtig uit de monsterkamer.
  2. Maak de embryo's los van de agarosefilm met een kleine kwast en breng ze over op een microscoopschuif met het juiste label. Plaats de schuif in een ophaalschaal en incubeer onder de respectievelijke standaard opfokomstandigheden.
  3. Wat de experimentele modaliteiten betreft, moet worden geschat wanneer embryogenese is voltooid. Als het broedtijdpunt nadert, controleert u de ophaalschotels regelmatig en draagt u uitgebroede Drosophila-larven over naar individuele opfokf flacons en Tribolium-larven naar individuele putten van een 24-putplaat. Vul de putten tot de helft met groeimedium. Incubeer onder de respectieve standaard opfokomstandigheden.
  4. Zodra de waargenomen individuen volwassen zijn, geef ze dan een geschikte paringspartner en controleer na enkele dagen op nageslacht.

9. Beeldverwerking en metadatadocumentatie

OPMERKING: Voor de verwerking van beeldgegevens wordt de ImageJ-derivaat FIJI35 aanbevolen (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI vereist geen installatie en er zijn 32- en 64-bits versies beschikbaar. Een van de meest gebruikte formaten voor LSFM-gegevens is het TIFF (TIFF) (TIFF) met getagde afbeeldingsbestandsindeling, waarmee afbeeldingsstapels in de vorm van een TIFF-container kunnen worden opgeslagen.

  1. Bereken de z-maximale projecties voor alle z-stacks (Image | Stapels | Z Project, kies Max Intensity). Maximale projecties zijn benaderingen voor gegevensvereenvoudiging die het aantal ruimtelijke dimensies terugbrengen van drie naar twee. Er wordt een FIJI-script voor batchverwerking verstrekt (Aanvullend bestand 1).
  2. Concatenate de respectieve z maximum projecties om tijd stapels (t stapels) te maken. Bewaar deze in één TIFF-container. Doe dit voor alle geregistreerde embryo's, evenals de respectieve richtingen en fluorescentiekanalen, indien van toepassing.
  3. Draai de z- en t-stapel rond de z-as om de voorste-achterste as van de embryo's uit te lijnen met de x- of y-beeldas(Afbeelding | Transformeer | Roteren). Snijd de z-stapels bij langs alle drie de afbeeldingsassen en de t-stack in de x- en y-afbeeldingsassen, zodat er slechts minimale bufferruimte (20-40 pixels langs de x- en y-assen, 5-10 afbeeldingen langs de z-as) rond het embryo overblijft(Afbeelding | | aanpassen Canvasgrootte voor de x- en y-assen, Afbeelding | Stapels | Gereedschap | Slice Keeper voor de z-as).
    1. Doe dit individueel voor alle geregistreerde embryo's en de respectieve aanwijzingen, indien van toepassing. Fluorescentiekanalen moeten, indien van toepassing, worden verwerkt met identieke rotatie- en bijsnijdparameters.
  4. Documenteer de metadata zo gedetailleerd mogelijk. Als richtsnoer kan de metagegevenstabel van de voorbeeldgegevenssets, die worden weergegeven in de sectie Representatieve resultaten, worden gebruikt (Aanvullende tabel 1).

10. Datavisualisatie

OPMERKING: Deze richtlijn voor gegevensvisualisatie richt zich voornamelijk op het maken van z maximale projectiebeeldmatrices die meerdere geregistreerde embryo's in meerdere richtingen en/of in de loop van de tijd laten zien. In de volgende stappen wordt de gegevensvisualisatieprocedure beschreven die is toegepast op de voorbeeldgegevenssets voor het maken van de weergegeven cijfers en video's die zijn gekoppeld in de sectie Representatieve resultaten.

  1. Combineer t-stacks van meerdere richtingen (Afbeelding | Stapels | Gereedschap | Meerderefluorescentiekanalen combineren en/of samenvoegen(Afbeelding | Kleur | Merge Channels) om de biologische structuur en/of het proces van belang te visualiseren.
  2. De intensiteiten van de t-stapels aanpassen (Afbeelding | | aanpassen Helderheid/contrast) indien nodig met behulp van de functie "Set". De minimaal weergegeven waarde moet iets boven het achtergrondsignaal worden ingesteld, de maximaal weergegeven waarde moet resulteren in een handig contrast. Documenteer beide waarden, omdat ze kunnen worden gebruikt voor een consistente aanpassing van de respectieve z-stacks. Afdrukaanpassingen met behulp van de functie "Toepassen". Afhankelijk van de experimentele modaliteiten, overweeg het verwerken van alle geregistreerde embryo's met identieke waarden.
  3. Sla intensiteitsgecorrigeerde t-stacks op als afzonderlijke bestanden, overschrijf de niet-aangepaste t-stacks niet. Geschikte substacks samenstellen uit de aangepaste t-stacks met speciale beeldselectiefuncties (bijv. Image | Stapels | Gereedschap | Slice Keeper) en gebruik het montagegereedschap (Image | Stapels | Maak Montage)om beeldrasters te creëren die voor cijferontwerp kunnen worden gebruikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor vergelijkende fluorescentie live beeldvorming in op de monsterkamer gebaseerde LSFMs. Het raamwerk kan bijvoorbeeld worden gebruikt om (i) embryo's van twee of meer soorten naast elkaar te zetten, (ii) embryo's van lijnen waarin een of meer genen worden uitgeschakeld plus wild-type controles, (iii) meerdere embryo's van dezelfde transgene lijn, (iv) embryo's uit verschillende transgene lijnen, of (v) embryo's van sublijnen die dezelfde transgene dragen , maar op verschillende genomische locaties. In deze sectie geven we voorbeelden voor de laatste twee scenario's.

In onze eerste voorbeeldige toepassing tonen we de fluorescentiesignaaldynamiek van drie embryo's die afkomstig zijn van verschillende transgene Drosophila-lijnen (Tabel 2) over een periode van ongeveer 1 dag (Figuur 4, Aanvullende film 1). Voor deze lijnen verwachtten we vrij vergelijkbare fluorescentiepatronen, aangezien ze allemaal een nucleair gelokaliseerd EGFP/GFP uitdrukken onder controle van verschillende vermoedelijk alomtegenwoordige en constitutief actieve promotors. Onze vergelijkende live beeldvormingsresultaten laten echter zien dat er sterke spatiotemporale verschillen zijn in de expressiepatronen die zeker geen secundaire effecten zijn als gevolg van omgevingsafwijkingen.

In ons tweede toepassingsvoorbeeld vergelijken we de prestaties van drie embryo's die voortkomen uit de AGOC{Zen1'#O(LA)-mEmerald} #1, #2 en #3 (respectievelijk Zen1'LA-mE #1, #2 en #3) transgene Tribolium sublijnen36. Al deze dragen dezelfde piggyBac-gebaseerde transgene die leidt tot expressie van mEmerald-gekoppelde37 Lifeact38 onder controle van de zerknüllt 139 promotor, een transcriptiefactor betrokken bij serosa specificatie. Onze vergelijkende live beeldvormingsresultaten, die het serosa-venstersluitingsproces tijdens gastrulatie illustreren, suggereren dat sublijn #2 een opmerkelijk sterker algemeen signaal geeft dan de andere twee sublijnen (Figuur 5, Aanvullende film 2). Dit geeft aan dat ook in Triboliumde genomische context een sterke invloed kan hebben op het expressieniveau van transgenen die een expressiecassette dragen.

Het succesvol ophalen van alle zes embryo's die in deze sectie worden getoond, was mogelijk zoals beschreven in stap 8 van ons protocol. Ze ontwikkelden zich allemaal tot volledig functionele en vruchtbare volwassenen (aanvullende tabel 1, rij "Ophalen"), wat aangeeft dat de algehele procedure, van dechorionatie over montage tot opname, niet-invasief was. Dit niveau van kwaliteitscontrole is essentieel wanneer een wilde ontwikkeling wordt verwacht, bijvoorbeeld met betrekking tot controleembryo's die gelijktijdig met embryo's worden afgebeeld waarin een of meer genen worden neergehaald of knock-out worden geslagen.

Alle datasets die zijn gebruikt om de representatieve resultaten te maken, worden geleverd als bronnen die vooral LSFM-beginners zullen helpen om de kwaliteit van hun eigen werk te evalueren. De downloadlinks op basis van digitale objectidentificatie zijn te vinden in de tabel metagegevens(aanvullende tabel 1, rij "Gegevenstoegang").

Figure 1
Figuur 1: Overzicht experimenteel raamwerk en montagemethode. (A) Stroomdiagram van de tien protocolstappen met korte herinneringen en een schatting van de vereiste tijd. Taken gemarkeerd met sterretjes hoeven niet tijdens elke test te worden uitgevoerd, maar afhankelijk van de omstandigheden. Groene vakken geven stappen aan die verband houden met Drosophila en/of Tribolium, blauwe vakken geven stappen aan die verband houden met microscopie. (B) Detailtekening van de spinnenwebhouder. Het gepresenteerde ontwerp is geschikt voor cilindergebaseerde klemmechanismen, die vaak worden gebruikt in LSFMs op basis van monsterkamers. Specificaties zijn in millimeters. De houder kan worden geschaald zolang de werkafstand van de detectielens wordt gerespecteerd. (C) Opnamesequentie voor levende beeldvorming van meerdere embryo's langs meerdere richtingen. In eerste instantie worden z-stapels van het bovenste embryo geregistreerd langs maximaal vier oriëntaties, d.w.z. 0°, 90°, 180° en 270°. Vervolgens wordt het embryo hieronder voor de detectielens bewogen en begint de opname-/rotatiesequentie opnieuw. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Fluorescerende microsfeergebaseerde kalibratiegrafiek voor LSFMs. De grafiek illustreert hoe fluorescerende microsferen in de maximale projecties x, y en z worden weergegeven als de LSFM correct is gekalibreerd (A), of als er een verlichtings - (B) of detectieverschuiving (C) is. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Verzamelen, dechorioneren, monteren en in beeld brengen van meerdere embryo's. (A) Tribolium embryo collectie overzicht. De illustraties worden in stap 4 geciteerd op basis van de getallen linksboven. (B) Voorbereidings- en overdrachtsregeling voor de 6-putplaat die tijdens stap 5 wordt gebruikt. De B1- en B2-putten bevatten verdund natriumhypochloriet (NaOCl), dat dechorionatie induceert. (C) De 100 μm celzeef, die werd gebruikt om de embryo's van de ene put naar de andere over te brengen, in de B2-put. Het bovenste detailbeeld toont een close-up van verschillende Tribolium-embryo's bovenop het celzeefgaas, het onderste detailbeeld toont een transmissielicht stereomicroscoopbeeld van verschillende Tribolium-embryo's met gedeeltelijk losgemaakt koraal. (D) Spinnenwebhouder met drie gemonteerde Tribolium embryo's. De embryo's, evenals hun voorste-posterieure assen, werden uitgelijnd langs de lange as van het sleufgat. (E) Beweging van de spinnenwebhouder in de monsterkamer van de LSFM tijdens de registratie van drie embryo's. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Vergelijkende fluorescentie levende beeldvorming van elk één embryo uit de #01691, #29724 en #24163 transgene Drosophila-lijnen.  Embryo's worden getoond langs twee (van de vier geregistreerde) richtingen over een periode van 20:00 uur (vanaf een totale beeldvormingsperiode van 23:40 uur). Er is in de loop van de tijd geen dynamische intensiteitscorrectie uitgevoerd. Metagegevens voor de Drosophila-gegevenssets zijn te vinden in aanvullende tabel 1. ZA, Z maximale projectie met beeldaanpassing. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Vergelijkende fluorescentie levende beeldvorming van elk één embryo uit de Zen1'LA-mE #1, #2 en #3 transgene Tribolium sublijnen. (A) Embryo's worden in vier richtingen getoond tijdens de gastrulatie, net voor de sluiting van het serosa-venster. (B) Embryo's worden ventrally getoond over een periode van 01:30 uur (vanaf een totale beeldvormingsperiode van 118:00 uur). Beeldaanpassing werd uitgevoerd met identieke minimum- en maximumwaarden, er werd geen dynamische intensiteitscorrectie in de loop van de tijd uitgevoerd. Metagegevens voor de Tribolium-gegevenssets zijn te vinden in aanvullende tabel 1. Gegevenssets zijn gesynchroniseerd met de fase die wordt weergegeven in (A). ZA, Z maximale projectie met beeldaanpassing. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

combinatie reden Verlichting lens Detectielens fototoestel referentie
#1 volledig embryo op cellulair niveau, grote pixelafstand (klein gegevensvolume) 2.5× vergroting numeriek diafragma 0.06 (lucht) 10× vergroting numeriek diafragma 0,3 (waterdip) CCD met 1,4 megapixel (1392×1040, 6,45 μm pitch) deze studie, Drosophila41, Tribolium20,41
#2 volledig embryo op cellulair/subcellulair niveau, kleine pixelafstand (groot gegevensvolume) 2.5× vergroting numeriek diafragma 0.06 (lucht) 20× vergroting numeriek diafragma 0,5 (waterdip) sCMOS met 5,5 megapixel (2560×2160, 6,5 μm pitch) Tribolium
#3 specifieke embryogebieden op subcellulair niveau of gespecialiseerde toepassingen, bijvoorbeeld levende beeldvorming van ontlede kiembanden42,43 5.0× vergroting numeriek diafragma 0.16 (lucht) 40× vergroting numeriek diafragma 0,75 (waterdip) CCD met 1,4 megapixel (1392×1040, 6,45 μm pitch) Tribolium

Tabel 1: Aanbevolen verlichtingslens/detectielens/cameracombinaties voor live beeldvorming van Drosophila- en Tribolium-embryo's met LSFM. Alle combinaties zijn met succes gebruikt in eerdere studies (zie rij Referentie). Houd er rekening mee dat de meeste LSFM's op basis van de monsterkamer waterdiplenzen gebruiken voor detectie, die voornamelijk zijn ontworpen voor beeldbuffers met een brekingsindex van 1,33 (zoals autoclaaf kraanwater of andere waterige media). Beeldbuffers met andere brekingsindexen kunnen worden gebruikt40, maar dit verandert bepaalde eigenschappen van het optische systeem, bijvoorbeeld de werkafstand.

lijn genotype Fluorofoorexpressie
#01691 y[1] w[67c23]; P{w[+mC]=Ubi-GFP.nls}ID-2; P{Ubi-GFP.nls}ID-3 NLS-GFP onder controle van de polyubiquitin promotor
#29724 w[*]; P{w[+mC]=Tub84B-EGFP.NLS}3 NLS-GFP onder controle van de alfa-tubuline 84B promotor
#24163 w[*]; P{w[+mC]=His2Av-EGFP.C}2/SM6a EGFP-gelabelde histon 2A-variant in alle cellen

Tabel 2: De drie transgene Drosophila-lijnen die in het eerste toepassingsvoorbeeld worden gebruikt. De kolom "regel" verwijst naar het voorraadnummer van het Bloomington Drosophila Stock Center (bdsc.indiana.edu).

Aanvullende video 1: Vergelijkende fluorescentie levende beeldvorming van één embryo elk van de #01691, #29724 en #24163 transgene Drosophila-lijnen. Elke transgene lijn drukt nucleair gelokaliseerd EGFP/GFP uit onder controle van een vermoedelijk alomtegenwoordige en constitutief actieve promotor. ZA, Z maximale projectie met beeldaanpassing. Er is in de loop van de tijd geen dynamische intensiteitscorrectie uitgevoerd. ZA, Z maximale projectie met beeldaanpassing. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video 2: Vergelijkende fluorescentie levende beeldvorming van elk één embryo van de Zen1'LA-mE #1, #2 en #3 transgene Tribolium sublijnen. Elke transgene sublijn drukt mEmerald-gelabelde Lifeact uit onder controle van de zerknüllt 1 promotor, een transcriptiefactor die betrokken is bij serosa-specificatie. Houd er rekening mee dat het Zen1'LA-mE #1 embryo ongeveer 90° draait in de serosa direct na het sluiten van het serosa-venster. Gegevenssets zijn gesynchroniseerd met de fase in figuur 4A. Beeldaanpassing werd uitgevoerd met identieke minimum- en maximumwaarden, er werd geen dynamische intensiteitscorrectie in de loop van de tijd uitgevoerd. Embryo's worden ventrally en lateraal getoond over een periode van 48:00 uur ZA, Z maximale projectie met beeldaanpassing. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend bestand 1: FIJI batchverwerkingsscript voor de geautomatiseerde berekening van z-maximale projecties van alle z-stacks in één map. Het script kan in FIJI worden geopend via drag-and-drop. Aan het begin ("Uitvoeren") moet alleen de invoermap worden opgegeven. De uitvoersubmap ("Z Maximum Projections") wordt automatisch gemaakt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Metagegevens en parameter voor de gegevenssets DS0001-6 voor livebeeldvorming op lange termijn. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een van de exclusieve toepassingsgebieden van LSFMs is ontwikkelingsbiologie. In deze discipline is het van belang om naar levende exemplaren te kijken, anders kunnen morfogenetische processen niet op een dynamische manier worden beschreven. Een experimenteel kader voor de gelijktijdige live beeldvorming in op de steekproefkamer gebaseerde LSFM's, zoals hier beschreven, is om twee belangrijke redenen handig.

Omgevingsafwijkingen, die onvermijdelijk zijn bij sequentiële live beeldvorming, kunnen proactief worden aangepakt. In met insectenembryo geassocieerde levende beeldvorming zien we bijvoorbeeld de volgende gevoeligheiden. De culturen voor het verzamelen van eieren kunnen verschillende leeftijden hebben op het moment van embryoverzameling. In Drosophilais aangetoond dat dit de kwaliteiten van het nageslachtbeïnvloedt 45. Hoewel het werken met correct gedesynchroniseerde culturen een optie is, is gelijktijdige beeldvorming met gesynchroniseerde culturen aanzienlijk handiger. Zowel de op Drosophila- als Triboliumgebaseerde representatieve resultaten zijn afkomstig van gesynchroniseerde eierverzamelingsculturen, en we kunnen vol vertrouwen uitsluiten dat de verschillende fluorescentiekenmerken een onbedoeld effect zijn van ouderlijke senescentie.

Dechorionatie is een cruciale stap omdat langdurige blootstelling aan natriumhypochloriet de levensvatbaarheid van embryo's vermindert. Onhandig neemt de ionische sterkte van natriumhypochloriet in de loop van de tijd af. Metingen van de ionische sterkte zijn mogelijk46, maar moeizaam en omslachtig. Bij gelijktijdige live beeldvorming kan een mastermix worden gebruikt voor alle lijnen en/of omstandigheden tijdens de bereiding van de met dechorionatie geassocieerde 6-putplaten.

Zelfs in laboratoria met een efficiënte airconditioning zijn kleine maar onregelmatige temperatuurschommelingen onvermijdelijk en hebben ze ook invloed op temperatuurgestuurde9 op de monsterkamer gebaseerde LSFMs. Theoretisch kan de temperatuur in de monsterkamer worden geregistreerd, maar een exacte herhaling is niet mogelijk. Bij gelijktijdige live beeldvorming komen deze fluctuaties ook voor, maar ze beïnvloeden ook alle embryo's.

Vanuit praktisch oogpunt verhoogt een protocol voor gelijktijdige beeldvorming van meerdere embryo's de doorvoer. Bij live beeldvorming bepaalt de duur van het ontwikkelingsproces van belang hoeveel assays binnen een bepaalde periode kunnen worden uitgevoerd, wat een belangrijke overweging is wanneer de toegang tot LSFM's beperkt is. Belangrijke voorbeelden voor langdurige opname zijn live beeldtesten waarbij cellen worden bijgehouden. Dergelijke experimenten variëren meestal over lange ontwikkelingsperioden. Terwijl de embryonale ontwikkeling van Drosophila slechts ongeveer één dag duurt bijkamertemperatuur 47, duurt Tribolium ongeveer zeven dagen48. Daarom is parallellisatie voor deze soort essentieel om binnen een redelijk tijdsbestek te blijven, vooral met betrekking tot assays waarbij veel omstandigheden worden vergeleken.

De doorvoer, d.w.z. het aantal embryo's dat tegelijkertijd wordt afgebeeld, wordt voornamelijk beperkt door twee factoren: ten eerste is de beschikbare ruimte langs de y-as in de monsterkamer. Wanneer het onderste embryo op het punt staat te worden afgebeeld, mag het bovenste embryo de beeldvormingsbuffer niet hebben verlaten. Verder mogen de spinnenwebhouder en het bijbehorende ondersteuningssysteem niet zo lang zijn dat deze tijdens het opnameproces van de z-stack merkbaar wiebelt en/of kriebelt. Ten tweede is de beoogde tijdelijke resolutie. De opnametijd per embryo kan worden benaderd door de belichtingstijd per tweedimensionaal beeld (meestal 10-200 ms) te vermenigvuldigen met het aantal vlakken per z-stack (meestal enkele honderden), het aantal kanalen (gebruikelijk tussen één en drie), het aantal richtingen (meestal tussen één en acht) en een setup-afhankelijke factor voor de vertaal- en rotatiebewegingen (geschat tussen 1,2 en 1,5). De verhouding tussen de beoogde temporele resolutie en de opnametijd per embryo geeft het maximale aantal embryo's aan dat tegelijkertijd kan worden afgebeeld. Kortom, ons protocol is geschikt om van sequentiële live imaging naar gemiddelde doorvoer te gaan, maar niet geschikt voor wat over het algemeen als hoge doorvoer wordt beschouwd. Voor de laatste kunnen LSFMs worden overwogen die geschikt zijn voor microscoopdia's49,50,51 of putplaten52, maar deze implementaties hebben meestal andere beperkingen.

Afhankelijk van de experimentele vraag en dus de combinatie van verlichtingslens/detectielens/camera in combinatie met de beeldparameters, kunnen gelijktijdig afgebeelde LSFM-datasets enorme opslagruimte in hun ruwe staat vereisen. Dit probleem kan het best worden geïllustreerd door rekening te houden met de verstrekte Drosophila-voorbeeldgegevenssets (aanvullende tabel 1), d.w.z. DS0001-3. Elk tweedimensionaal ruw beeld had een gegevensvolume van ongeveer 2,8 Megabytes, elke ruwe z-stack bestond uit 120 vlakken en alle drie de embryo's werden in totaal 143 keer langs vier richtingen geregistreerd. Bijgevolg bezetten de ruwe datasets ongeveer een halve Terabyte. Door middel van beeldgegevensverwerking, d.w.z. het bijsnijden langs alle ruimtelijke dimensies (stap 9) in combinatie met ZIP-gebaseerde compressie, werd het gegevensvolume teruggebracht tot 53,3 Gigabyte, wat ongeveer 10% van de initiële hoeveelheid is. Om datasets in het Terabyte-regime te verwerken, is de BigDataViewer 53-plug-in, die vooraf is geïnstalleerd in FIJI(Plug-ins | BigDataViewer), wordt aanbevolen.

Naast de vijf scenario's die worden beschreven in de sectie Representatieve resultaten, kan ons protocol ook worden gebruikt om het effect van RNAi knockdown-effecten te karakteriseren, wat een populaire aanpak is in Tribolium54. Het is echter slechts van beperkt nut voor de analyse van verbindingen (bijv. insecticiden of andere biochemische stressoren) als deze via de beeldvormingsbuffer moeten worden toegepast - wat de meest eenvoudige aanpak is - omdat gelijktijdige beeldvorming van een controleembryo niet mogelijk is.

We hebben ons protocol gedemonstreerd met behulp van een van onze op maat gemaakte microscopen8,55,maar het is van toepassing op elke op de monsterkamer gebaseerde opstelling, bijvoorbeeld OpenSPIM56 of de meeste commerciële LSFMs. Dit protocol vormt een aanvulling op het LSFM-geassocieerde initiatief voor het opzetten van hulpbronnen dat tot doel heeft beginners aan te moedigen om op lichtplaten gebaseerde technologie actief te integreren in hun onderzoeksplannen. De meeste universiteiten en instituten hebben tegenwoordig goed uitgeruste fluorescentiemicroscopiefaciliteiten57. Deze bieden meestal toegang tot een of meer kamergebaseerde LSFM's, maar van het personeel kan niet worden verwacht dat het de juiste experimentele oplossingen heeft voor elke wetenschappelijke vraag.

Onze resultaten tonen aan dat ons experimentele raamwerk geschikt is voor Drosophila en Tribolium. We zijn ervan overtuigd dat ons vergelijkingsgerichte protocol kan worden gebruikt om de embryogenese van andere insectensoorten te bestuderen. Zo is er een LSFM-gebaseerde aanpak toegepast om wild-type en knockdown ontwikkeling in de scuttle fly Megaselia abdita58te vergelijken, en vervolgstudies zouden ook baat hebben bij onze montagemethode. Bovendien zijn transgene lijnen van de tweevlekige cricket Gryllus bimaculatus die speciaal is ontworpen voor fluorescentie live beeldvorming59 beschikbaar, maar het enige momenteel beschikbare vergelijkingsgerichte protocol60 is bedoeld voor conventionele omgekeerde microscopen en heeft daarom geen betrekking op driedimensionale beeldverwerving of monsterrotatie. Bovendien is al aangetoond dat de spinnenwebhouder een handige keuze is voor zebravissen, waarvan de embryo's hun vorm aanzienlijk veranderen tijdens embryogenese61. Een aanpassing van ons protocol, die in principe geen optimalisatie-inspanning vereist, zou de hierboven beschreven voordelen ook voor dit modelorganisme bieden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

We danken Ernst H.K. Stelzer voor de mogelijkheid om zijn middelen te gebruiken, evenals zijn waardevolle opmerkingen over het manuscript, Anita Anderl voor ondersteuning met de Tribolium live imaging, Sven Plath voor technische ondersteuning, evenals Ilan Davis, Nicole Grieder en Gerold Schubiger voor het delen van hun transgene Drosophila-lijnen via het Bloomington Stock Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plate Orange Scientific 4430500  
24-well plate Orange Scientific 4430300 Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dish Fisher Scientific 153066 Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dish Fisher Scientific L9004575
100 µm mesh size cell strainer BD Biosciences 352360
250 µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-038 Only for live imaging involving Tribolium
300 µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-040 Only for live imaging involving Tribolium
710 µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-050 Only for live imaging involving Tribolium
800 µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-051 Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flour Demeter e.V. SP061006 Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila medium Genesee Scientific 66-115 Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø Thermo Fisher Scientific T7282
inactive dry yeast Genesee Scientific 62-108
low-melt agarose Carl Roth 6351.2
narrow vials Genesee Scientific 32-109 Only for live imaging involving Drosophila
small paint brush VWR International 149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl Carl Roth 9062.3 Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flour Demeter e.V. SP061036 Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vials Genesee Scientific 32-110 Only for live imaging involving Drosophila

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
  2. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
  3. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
  4. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
  5. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
  6. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
  7. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  8. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  9. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
  10. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
  11. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
  12. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
  13. Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
  14. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  15. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
  16. Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
  17. Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
  18. Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
  19. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  20. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
  21. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
  22. Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
  23. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
  24. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
  25. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
  26. Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
  27. Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
  28. Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
  29. Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
  30. Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
  31. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
  32. Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
  33. Mcdonald, J. H. Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , Sparky House Publication. (2013).
  34. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
  35. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  36. Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
  37. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
  38. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
  39. vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
  40. Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
  41. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
  42. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  43. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
  44. He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
  45. Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
  46. Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
  47. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , Springer. (1997).
  48. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
  49. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
  50. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
  51. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
  52. Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
  53. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  54. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  55. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
  56. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
  57. Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
  58. Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
  59. Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
  60. Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
  61. Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).

Tags

Biologie Nummer 163 vergelijkende live beeldvorming gelijktijdige live beeldvorming driedimensionale lichtmicroscopie op lichtblad gebaseerde fluorescentiemicroscopie LSFM spinnenwebhouder insectenontwikkeling embryonale morfogenese embryogenese Drosophila melanogaster, Tribolium castaneum,omgevingsafwijking
Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ratke, J., Krämer, F., Strobl,… More

Ratke, J., Krämer, F., Strobl, F. Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes. J. Vis. Exp. (163), e61713, doi:10.3791/61713 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter