Summary
يفصل هذا البروتوكول خطوات تكوين الحشرات المستهدف CRISPR/Cas9 في ذباب الرمل: جمع الأجنة، والحقن، وتربية الحشرات، وتحديد الهوية، فضلا عن اختيار الطفرات ذات الاهتمام.
Abstract
الذباب الرملي هو النواقل الطبيعية لأنواع الليشمانيا ، الطفيليات البروتوزوانية التي تنتج طيفا واسعا من الأعراض التي تتراوح بين الآفات الجلدية إلى علم الأمراض الحشوي. فك طبيعة التفاعلات ناقلات / الطفيلي هو ذات أهمية أساسية لفهم أفضل لانتقال الليشمانيا إلى مضيفيهم. ومن بين البارامترات التي تتحكم في كفاءة ناقلات ذبابة الرمل (أي قدرتها على حمل مسببات الأمراض ونقلها)، تبين أن البارامترات المتأصلة في هذه الحشرات تلعب دورا رئيسيا. الاستجابة المناعية للحشرات ، على سبيل المثال ، تؤثر على كفاءة ناقلات ذبابة الرمل إلى الليشمانيا. وكانت دراسة هذه المعلمات محدودة بسبب عدم وجود أساليب لتعديل التعبير الجيني مكيفة للاستخدام في هذه الكائنات غير النموذجية. التنظيم الجيني من قبل الجيش الملكي النيبالي التدخل الصغيرة (siRNA) ممكن، ولكن بالإضافة إلى كونها صعبة من الناحية الفنية، وإسكات يؤدي إلى فقدان جزئي فقط للوظيفة، والتي لا يمكن أن تنتقل من جيل إلى جيل. تم مؤخرا تكييف mutagenesis المستهدفة من قبل التكنولوجيا CRISPR / Cas9 لذبابة الرمال Phlebotomus papatasi. تؤدي هذه التقنية إلى توليد طفرات قابلة للإنتهاك في مكان تم اختياره خصيصا ، مما يسمح بدراسة الجينات ذات الاهتمام. يعتمد نظام CRISPR/Cas9 على تحريض فواصل الحمض النووي المزدوجة المستهدفة ، التي تم إصلاحها لاحقا إما عن طريق الانضمام إلى النهاية غير المثلية (NHEJ) أو عن طريق إصلاح مدفوع بالهومولوجيا (HDR). يتكون NHEJ من إغلاق بسيط للكسر ويؤدي في كثير من الأحيان إلى أحداث الإدراج / الحذف الصغيرة. في المقابل ، يستخدم HDR وجود جزيء الحمض النووي المانح الذي يشارك علم الأوهام مع الحمض النووي المستهدف كنموذج للإصلاح. هنا ، نقدم طريقة التجميل الدقيق لجنين ذبابة الرمل للطفرات المستهدفة من قبل CRISPR / Cas9 باستخدام NHEJ ، وهي تقنية تعديل الجينوم الوحيدة المكيفة مع ناقلات ذبابة الرمل حتى الآن.
Introduction
تشكل الأمراض المنقولة بالنواقل تهديدا رئيسيا للصحة العامة في تطور مستمر. مئات الأنواع الناقلة المنتشرة عبر أسر فيلوجينية متميزة جدا (مثل البعوض والقراد والبراغيث) هي المسؤولة عن انتقال عدد كبير من مسببات الأمراض الميكروبية، مما يؤدي إلى أكثر من 700،000 حالة وفاة بشرية سنويا، وفقا لمنظمة الصحة العالمية. ومن بين الحشرات الناقلة، يشكل ذباب الرمل البلوبوتومين (Diptera, Psychodidae) مجموعة واسعة، حيث يظهر 80 نوعا من ناقلات الأمراض المثبتة سمات وصفية وقدرات متجهية متميزة موجودة في مناطق جغرافية مختلفة. وهي ناقلات لطفيليات البروتوزوان من جنس الليشمانيا، مما تسبب في حوالي 1.3 مليون حالة جديدة من الليشمانيات وبين 20،000 و 30،000 حالة وفاة سنويا. نتائج الليشمانيات السريرية متنوعة ، مع أعراض تتراوح بين الآفات الجلدية ذاتية الحد إلى النشر الحشوي الذي هو قاتل في غياب العلاج.
ذباب الرمل هي الحشرات الأرضية البحتة. تستمر دورة حياتها، الطويلة نسبيا مقارنة ب Diptera الأخرى، لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر، اعتمادا على معايير مختلفة مثل درجة الحرارة والرطوبة والتغذية. وهو يتألف من مرحلة جنينية واحدة (من 6 إلى 11 يوما)، وأربع مراحل يرقية (تدوم ما مجموعه 23 إلى 25 يوما) ومرحلة جروة واحدة (من 9 إلى 10 أيام) يليها التحول ثم البلوغ. الذباب الرملي يتطلب بيئة رطبة ودافئة للتربية. يتغذى كل من الذكور والإناث على السكريات ، التي يتم الحصول عليها في البرية من رحيق الزهور. الإناث فقط هي مغذيات الدم، لأنها تتطلب البروتينات التي تم الحصول عليها من وجبة الدم لإنتاج البيض1.
ومن مجالات التركيز الهامة للبحوث تحديد طبيعة التفاعلات بين ناقلات الأمراض/الطفيليات التي تؤدي إلى تطور العدوى المنقولة. وكما هو الحال مع الحشرات الناقلة الأخرى، ثبت أن البارامترات المتأصلة في ذباب الرمل تؤثر على كفاءتها في ناقلات الأمراض، والتي تعرف بأنها قدرتها على حمل مسببات الأمراض ونقلها إلى مضيفيهم. على سبيل المثال ، يمكن للتعبير عن galectins بواسطة الرمال Phlebotomus papatasi يطير الخلايا midgut ، بوصفها مستقبلات التعرف على مكونات سطح الطفيلي ، تؤثر مباشرة على كفاءتها ناقلات للليشمانيا الرئيسية2،3. مسار الاستجابة المناعية للحشرات ، نقص المناعة (IMD) ، هو أيضا حاسم لكفاءة ناقلات ذبابة الرمال Phlebotomus papatasi للليشمانيا الرئيسية 4. كما تم الإبلاغ عن دور حاسم لمسارات الاستجابة المناعية للحشرات الناقلة في السيطرة على انتقالها لمسببات الأمراض المعدية في بعوض Aedes aegypti 5و6و7، في ذبابة تسيتسي Glossina morsitans8، وفي بعوض Anopheles gambiae 9،10.
وقد تم الحد من دراسات ذبابة الرمل /التفاعلات الليشمانيا بسبب عدم وجود طرق تعديل التعبير الجيني تكييفها للاستخدام في هذه الحشرات. فقط تنظيم الجينات من قبل الجيش الملكي النيبالي التدخل الصغيرة (siRNA) قد أجريت11،12،13،14 حتى وقت قريب. ولا تؤدي هذه التقنية، التي تحد منها الوفيات المرتبطة بالحرمان الدقيق للإناث البالغات، إلا إلى فقدان جزئي للوظيفة، لا يمكن أن ينتقل من جيل إلى جيل.
أحدثت تقنية CRISPR/Cas9 ثورة في البحوث الجينومية الوظيفية في الكائنات غير النموذجية مثل ذباب الرمل. تم تعديل نظام المناعة التكيفي في prokaryotes للدفاع ضد البكتيريا15،16، تم تكييف نظام CRISPR Cas9 بسرعة كأداة لتحرير الجينوم للكائنات الحية eukaryotic متفوقة ، بما في ذلك الحشرات. ويستند مبدأ CRISPR/Cas9 المستهدفة الجينوم التحرير على التكامل من الحمض النووي الريبي دليل واحد (sgRNA) إلى مكان الجينوم محددة. ترتبط نواة Cas9 بالسرنا وتخلق كسر الحمض النووي المزدوج (dsDNA) في الحمض النووي الجينومي حيث يرتبط sgRNA بتسلسلها التكميلي. يتم توجيه مجمع Cas9-sgRNA إلى التسلسل المستهدف من خلال 17 إلى 20 قاعدة تكميلية في sgRNA إلى الموضع المختار ، ويمكن بعد ذلك إصلاح كسر dsDNA بواسطة مسارين مستقلين: نهاية انضمام nonhomologous (NHEJ) أو إصلاح موجهة بالهومولوجيا (HDR)17. إصلاح NHEJ ينطوي على إغلاق بسيط للكسر ولكن كثيرا ما يؤدي إلى أحداث الإدراج / الحذف الصغيرة. إصلاح الحمض النووي من خلال تقرير التنمية البشرية يستخدم جزيء الحمض النووي المانحة تقاسم homology مع الحمض النووي الهدف كنموذج للإصلاح. تمتلك الحشرات كلا الجهازين.
يمكن أن تولد تقنية CRISPR/Cas9 طفرات في مكان مختار ، من خلال مسار إصلاح NHEJ ؛ أو لاستراتيجيات تحرير الجينوم الأكثر تعقيدا، مثل طرق أو مراسلي التعبير، من خلال مسار HDR مع قالب المانح المناسب. في ذباب الرمل ، تم إنشاء الأليل المتحولة الخالية من عامل الاستجابة المناعي Relish من خلال CRISPR بوساطة NHEJ في Phlebotomus papatasi4. كما تم حقن أجنة ذبابة الرمل في دراسة أخرى مع مزيج CRISPR/Cas9 الذي يستهدف ترميز الجينات الأصفر. ومع ذلك ، لم يتم إنتاج أي بالغين يحملون الطفرة18. ونصف هنا طريقة مفصلة لتولد ذبابة الرمل المستهدفة من قبل CRISPR/Cas9 بوساطة NHEJ ، مع التركيز بشكل خاص على التجميل الدقيق للجنين ، وهي خطوة حاسمة في البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استخدام الفئران كمصدر للدم لتغذية ذبابة الرمل وفقا للتوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبر للمعاهد الوطنية للصحة (NIH). تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامه من NIAID ، المعاهد القومية للصحة (رقم البروتوكول LPD 68E). اللافقاريات غير مشمولة بالمبادئ التوجيهية للصحة القومية للصحة.
1. إعداد إبرة (الشكل 1)
- سحب الإبر و شطبة كما هو موضح في موتي و هاريل19. لفترة وجيزة، وسحب الإبر على سحب الزجاج micropipette على مرحلة مزدوجة، وذلك باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية borosilicate.
- شحذ الإبر عن طريق شطب الرطب على مجسم micropipette، وذلك باستخدام حجر غرامة اضافية.
2. جمع الأجنة وmicromanipulation (الشكل 2)
- قبل خمسة أيام من يوم الحقن ، تطير الإناث ذبابة الرمل تغذية الدم كما يتم إجراؤها بشكل روتيني لصيانة المستعمرة. للحصول على تفاصيل حول إجراءات تربية مستعمرات ذبابة الرمل والمواد المطلوبة ، يرجى الرجوع إلى Lawyer et al.1 الحفاظ على الحشرات في الحاضنات بنسبة رطوبة 70٪ و 26 درجة مئوية ، أثناء تطورها بالكامل.
- يوم واحد بعد تغذية الدم، والتقاط الإناث التي تغذيها الدم من قبل مجموعات من 100-150 في الأواني الجص مع ميناء جانبي. الحفاظ على الإناث عن طريق إطعامهم بمحلول السكر (30٪ السكروز - ما يكفي من الحجم لامتصاص كرة القطن الصغيرة) وهو أمر معتاد لصيانة المستعمرة.
- في اليوم 2-3 بعد تغذية الدم، لا ترطيب الأواني الجص. إن إبقاء الإناث على ركيزة جافة سيمنع وضع البيض المبكر ، لأن الإناث يفضلن وضع البيض على بيئة رطبة.
- في اليوم الخامس بعد تغذية الدم، قم بجمع الأجنة، والميكروباينيبيشن، والتحنيم الدقيق. أدخل ورقة فلتر رطبة إلى غرفة وضع البيض. الأجنة الطازجة لم يكن لديك المشيمة المتقدمة تماما وتظهر بيضاء. استخدم ورق الفلتر الأسود أثناء العملية لتسهيل تصور الأجنة البيضاء.
- نقل مجموعة صغيرة من الإناث من وعاء الجص إلى غرفة وضع البيض من خلال المنافذ الجانبية باستخدام الفم الطامح. وجود ركيزة رطبة (ورقة التصفية) يحفز الإناث على oviposit.
- بعد 30-60 دقيقة، استرجع ورق الفلتر بعناية مع الأجنة الموضوعة حديثا من الغرفة. احتفظ بورق الفلتر والأجنة في طبق بيتري لمدة تصل إلى 3 ساعات. خلال هذا الوقت ، قم بتقييم مستوى رطوبة ورقة التصفية بانتظام لضمان بقائها رطبة. خلال هذا الوقت، كرر الخطوات 2.4 إلى 2.6 مع مجموعات جديدة من الإناث وجمع أكبر عدد ممكن من الأجنة.
- إعداد الشرائح المجهر للحقن: جمع البيض يدويا واحدا تلو الآخر مع فرشاة طلاء غرامة جدا ونقلها بعناية على قطعة أخرى من ورق تصفية سوداء رطبة وضعت على شريحة المجهر يعلوها غطاء زجاجي.
- إضافة الماء إلى ورقة التصفية، وهو ما يكفي للحفاظ على الأجنة رطبة ولكن لا يسبب لهم أن تطفو بعيدا عن غطاء أو يجري امتص تحت غطاء. اصطف الأجنة ضد غطاء. يعمل غطاء الغطاء كظهر يمنع البيض من التدحرج أثناء الحقن.
3. حقن الأجنة (الشكل 3)
- بدء الحقن 2.5 إلى 3 ساعات بعد بدء جمع البيض. إجراء الحقن في درجة حرارة الغرفة والرطوبة في المختبر المحيط.
- تأكد من أن الأجنة المنحازة لديها ما يكفي من الماء حتى تبقى رطبة.
ملاحظة: من الأهمية بمكان أن تبقى الأجنة رطبة أثناء الحقن. إذا لم تكن رطبة أثناء عملية الحقن، والحقن تصبح صعبة لأن الإبرة لديها مشكلة ثقب الجنين. الكمية الصحيحة من الماء هي النقطة التي تحتوي فيها الأجنة على الغضروف المفصلي من الماء حولها ، ولكن غطاء الغطاء لا يطفو فوق الماء مما يؤدي إلى دفع الأجنة تحت الغطاء. من المهم مراقبة كمية المياه حول الأجنة أثناء الحقن. إضافة الماء حسب الضرورة للحفاظ على الأجنة رطبة. - أضف الماء بعناية عن طريق ترطيب فرشاة بالماء ونقل الماء إلى الطرف الخلفي من ورق الفلتر. إضافة الماء بهذه الطريقة يسمح بإضافة الماء بطريقة بطيئة وخاضعة للرقابة بحيث يتم إضافة ما يكفي للحفاظ على الأجنة رطبة. يمكن أن يتسبب الكثير من الماء في تعويم الأجنة خارج المحاذاة ، مما يجعل من الصعب حقن الأجنة.
- مرة أخرى تحميل حقن مزيج في إبرة microinjection. إضافة ما يقرب من 0.5 إلى 1 ميكرولتر من مزيج الحقن في الإبرة باستخدام حشو إبرة البوروسيليكات مرسومة باليد، هلام تحميل نصائح ماصة يمكن أيضا أن تستخدم. يتكون مزيج الحقن من واحد أو عدة دليل الحمض النووي الريبي (80 نانوغرام / ميكرولتر لكل منهما) مصممة لاستهداف مكان معين مختلط مع بروتين Cas9 المؤتلف التجاري (300 نانوغرام / ميكرولتر).
- بدءا من ضغط الحقن في 30 psi، اضغط على الزناد حقن لطرد الهواء من طرف الإبرة. وهذا سيجبر مزيج الحقن إلى طرف الإبرة مما يسمح لمزيج الحقن بالتدفق. عند هذه النقطة, زيادة الضغط ببطء عقد / ثابت حتى تبدأ مادة الحقن في التدفق, ثم التراجع عن الضغط عقد / ثابت بحيث يكون أقل قليلا من نقطة من مزيج الحقن المتدفقة من الإبرة. يجب أن يوفر الإعداد المسور ما يكفي من مواد الحقن بحيث يمكن رؤية كمية صغيرة من المواد لدخول الجنين.
ملاحظة: تم اختبار حقن أجنة ذبابة الرمل تحت زيت الهالوكربون على غرار البروتوكولات الأخرى المستخدمة في Drosophila والبعوض في البداية ، ولكن نسبة البقاء على قيد الحياة لهذه الحقن كانت منخفضة للغاية. تم تحسين البقاء على قيد الحياة عن طريق التحول إلى الحقن على ورق فلتر رطب كما هو موضح أعلاه. - أدخل الإبرة في جانب الجنين. استخدام غطاء خلف الجنين كظهر التي سوف تساعد الإبرة لثقب الجنين. تقديم كمية صغيرة من مزيج الحقن في الجنين قبل إزالة الإبرة بلطف.
- بعد إزالة الإبرة مباشرة، اضغط على المحقن لإزالة أي مواد مملوءة من طرف الإبرة. وهذا سوف يساعد على منع الإبرة من انسداد.
- انتقل إلى الجنين التالي. بين كل حقنة، تأكد من أن ورق الفلتر رطب وأن الإبرة ليست مسدودة.
- بمجرد حقن جميع الأجنة، عد عدد الأجنة المحقونة للحفاظ على حصيلة جارية.
- قم بإزالة غطاء الغطاء بإضافة الماء إلى ورق التصفية بحيث يطفو غطاء الغطاء. عند هذه النقطة ، استخدم مسبارا (عصا قضيب الخشب مع دبوس الحشرات الملصق على الطرف) لعقد ورقة التصفية في مكانها أثناء استخدام إصبع لسحب الغطاء بعيدا عن الأجنة المحقونة.
- لطخة المياه الزائدة بعيدا عن ورقة التصفية مرة واحدة تمت إزالة غطاء.
4. تربية ما بعد الحقن (G0) (الشكل 4)
- نقل ورقة التصفية مع الأجنة على رأس عدة طبقات من ورق تصفية رطبة وضعت في طبق بيتري للحفاظ على الرطوبة. احتفظ بالأجنة هنا خلال الوقت اللازم لحقن الأجنة الأخرى. يمكن الاحتفاظ بالأجنة لمدة أقصاها 3 ساعات مثل هذه. بعد الحقن سوف تتحول ببطء البني.
- بمجرد حقن جميع الأجنة ، قم بنقلها يدويا إلى الأواني الجصية الصغيرة الرطبة سابقا. لا تضع الكثير من الأجنة في كل وعاء والحفاظ على المسافة بينهما، لتجنب التلوث الفطري المحتمل بين الأفراد. قم بتغطية الأواني بشاشة وتخزينها كما هو الحال عادة لبيض مستعمرة ذبابة الرمل ، التي يتم الحفاظ عليها في الحاضنات بنسبة رطوبة 70٪ و 26 درجة مئوية ، أثناء تطورها بالكامل.
- في اليوم الأول بعد الحقن، قم بإزالة جميع الأجنة التالفة والميتة باستخدام فرشاة الطلاء. أضف 100 ميكرولتر من حمض البروبيونيك بنسبة 0.5٪ ، قطرة قطرة ، على الأواني الجصية التي تحتوي على الأجنة المحقونة للحد من التلوث الفطري. إطلاق السيتوبلازم من الأجنة التالفة أثناء عملية الحقن هو مواتية بشكل خاص لنمو الفطريات.
- تحقق من الأواني الجصية كل يوم وإزالة أي أجنة سيئة أو ميتة. إذا الفطريات موجودة، وإزالة جميع الأجنة المصابة وإضافة بضع قطرات من حمض البروبيونيك 0.5٪.
- تفقس اليرقات بين اليوم 8 و 12 بعد الحقن. مرتين في اليوم ، قم بنقل اليرقات الناشئة حديثا إلى أوعية جصية جديدة ، في مجموعات من 5-10 كحد أقصى. إضافة كمية صغيرة من الطعام والتحقق من الطعام 2-3 مرات في الأسبوع.
- مراقبة كمية أغذية اليرقات بعناية ، حيث يزيد الكثير بشكل كبير من خطر التلوث الفطري. يرقات ذبابة الرمل البقاء على قيد الحياة بشكل أفضل في مجموعات ولكن يمكن أن تكون أكل لحوم البشر إذا لم يكن هناك ما يكفي من الغذاء.
- عندما اليرقات pupate، فصلها عن طريق الجنس للحفاظ على الإناث العذارى. إذا كان هناك الكثير من الناجين، تجاهل الذكور والحفاظ على الإناث فقط.
ملاحظة: يمكن لكل من الذكور والإناث حمل ونقل الطفرات. ومع ذلك ، حيث يجب الاحتفاظ بالإناث عذارى قبل عبورهن ، فمن الأسهل استخدام الإناث المحقونات G0 فقط لتجنب الاضطرار إلى فصل حشرات wt حسب الجنس. يمكن الاحتفاظ بالذكور G0 كاحتياطي إذا كان عدد الناجين البالغين منخفضا وسيتم في هذه الحالة تزاوجه مع الإناث البكر المصنفات.
5. اختيار وفحص الأليل متحولة (الشكل 5)
- كتلة عبر G0 الإناث مع الذكور wt في قفص. الدم إطعامهم تماما، كما سيتم القيام به لصيانة مستعمرة العادية.
- يوم واحد بعد تغذية الدم، ونقل كل أنثى G0 مع الذكور 2-3 طن في أنابيب الجص الفردية باستخدام الطامح الفم. إطعام الذباب مع السكر على كرة قطنية صغيرة تتغير كل يوم واستخدام حقنة من الماء لضمان رطوبة الجص مناسبة لوضع البيض.
- بعد أن وضعت الإناث G0 البيض (المقابلة لG1)،وجمع أجسادهم في الفردية، أنابيب Eppendorf المشروح ل genotyping في وقت لاحق. الحفاظ على الأجنة كما تفعل عادة لمستعمرات wt.
- استخراج الحمض النووي من الإناث G0 عن طريق الطريقة المفضلة.
- فحص الحمض النووي لوجود الطفرات ، على سبيل المثال عن طريق تصميم فحص PCR باستخدام التمهيديات المحيطة بمنطقة تخفيضات CRISPR المتوقعة.
- احتفظ فقط بالأجنة G1 التي وضعتها إناث G0 والتي تظهر أدلة على التحول. عندما تتطور هذه الأجنة G1 إلى جروة، وفصلها عن طريق الجنس والحفاظ على الإناث فقط. عبور G1 الإناث من نفس G0 الإناث إلى wt الذكور، والدم إطعامهم، ثم نقل في مجموعات صغيرة من 2-3 الإناث و 4-5 الذكور في حاويات صغيرة الحجم.
ملاحظة: جميع الأفراد G1 لديهم فرصة لحمل طفرة فريدة من نوعها، لذلك إذا كان عدد الأفراد الباقين على قيد الحياة ليست عالية جدا ثم فمن الأفضل لعبور G1 الإناث بشكل فردي مع الذكور wt. حالة العديد من الإناث تحمل طفرة مختلفة موجودة في نفس الأنبوب أمر نادر الحدوث ولكن يمكن أن يحدث. إذا لوحظت مثل هذه الحالة بعد الإبادة الجماعية ، فيجب تزاوج الإناث من الفئة G2 بشكل فردي للذكور. هذا المخطط التزاوج يتجنب إمكانية حدوث طفرات متعددة في ذرية. - بعد وضع البيض، وجمع الهيئات الإناث G1 وفحصها للكشف عن الطفرات. احتفظ فقط بالأنابيب حيث أظهرت أنثى واحدة على الأقل أدلة على حدوث طفرة.
- للأجيال اللاحقة جعل زوج واحد في الصلبان. بعد وضع البيض، فحص الآباء والأمهات لوجود طفرة. كرر في كل جيل حتى كلا الوالدين هي homozygous لنفس الطفرة. وبمجرد التعرف عليهم، سيكونون مؤسسي مخزون متحول متجانس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إنشاء بروتوكول CRISPR/Cas9 microinjection الموصوف هنا لتوليد طفرات ذبابة الرمل في منشور سابق4. وقد أدى هذا النهج إلى توليد طفرات عالية الكفاءة، حيث نجا 11 فردا من أصل 540 شخصا من هذا الإجراء، منهم 9 متحولين. عند تصميم أدلة لطفرة CRISPR/Cas9 ، فإن الخطوة الأولى الحرجة هي تسلسل المنطقة المحيطة بالمنطقة التي سيتم استهدافها. يجب أن يكون نموذج التسلسل من السلالة التي سيتم استخدامها كمصدر للأجنة للحقن. ومن الخطر الاعتماد فقط على تسلسل الجينوم المنشور لتصميم الأدلة. ليس من غير المألوف أن يكون هناك اختلافات بين الجينوم المنشور وتسلسل التصميم قبل الدليل. وفي بعض الحالات، لا تكون الأدلة المصممة من تسلسل الجينوم المنشور موجودة عندما يتم تسلسل المنطقة المحيطة بالجين المستهدف (هاريل، المراقبة الشخصية). بالإضافة إلى ذلك، قد يتضمن التسلسل تعدد الأشكال النيوكليوتيدية المفردة (SNPs) التي يمكن أن تكون خاطئة كتعديلات CRISPR حقيقية أثناء الكتابة الجينية. ولذلك، تأكيد التسلسل للمنطقة المستهدفة أمر بالغ الأهمية لنجاح بقية البروتوكول.
يعتمد التعديل الوراثي الناجح للحشرات عن طريق التشخيص الدقيق بشكل رئيسي على جانبين حاسمين: تسليم المواد (البروتين أو البلازميد أو الحمض النووي الريبي) في الوقت المناسب في التطور بأقل ضرر ممكن للأجنة؛ وتربية الحشرات القوية والصحية التي من شأنها البقاء على قيد الحياة الإجراء وإنتاج ذرية. تبدأ المرحلة الأولية من هذا الإجراء، الموصوفة في الشكل 2،بتغذية الدم للإناث من مستعمرة WT وتنتقل إلى جمع الأجنة والتحنيم الدقيق بعد خمسة أيام. وتتألف المرحلة الثانية من تربية الأجنة المحقونة حتى سن البلوغ، وصنع الصلبان المناسبة، وتحديد وعزل الطفرات ذات الأهمية.
يتم جمع الأجنة للحقن لمدة 30 - 60 دقيقة بحيث يمكن تحديد العمر النسبي في ساعات ما بعد oviposition. ثم يسمح للأجنة لتطوير لمدة 3 ساعة قبل بدء الحقن. هذه النافذة الزمنية لتطوير الحشرات تسمح للأجنة بالبقاء على قيد الحياة في الحقن. بعد فترة الشيخوخة هذه، يتم جمع الأجنة على شريحة حقن معدة ويتم لف الأجنة في مكانها مقابل حافة غطاء باستخدام فرشاة ناعمة. يظهر التكوين النهائي في الشكل 3A. من المهم أن تبلل ورقة التصفية بما فيه الكفاية بحيث يتشكل الغضروف المفصلي على حافة الغطاء حيث تجلس الأجنة. سيتم دفع الكثير من الماء والأجنة بعيدا عن حافة الغطاء. القليل جدا سيتسبب في سحب الأجنة تحت غطاء الغطاء. الأجنة تحتاج إلى أن تبقى رطبة، وإلا تصبح أغشية الجنين صعبة الحقن. تعمل حافة الغطاء كمحطة خلفية ، مما يسمح بالإبرة باختراق الأجنة عند الضغط عليها ضد الحافة. هو مزيج من إبرة حادة والظهر الذي يسمح للإبرة لاختراق بسلاسة.
وكما هو الحال مع معظم بروتوكولات الحقن المجهري الناجحة، من المهم وجود إبرة حقن دقيقة جيدة مناسبة للأجنة التي يتم حقنها. يتم تعريف الإبر الجيدة والحادة على أنها إبر تخترق الجنين بسهولة دون السماح للمواد بالهروب بعد الحقن. الاختراق الجيد واضح عندما تنزلق الإبرة إلى الجنين ، مما يسبب مسافة بادئة ضئيلة أو معدومة لغشاء الجنين أثناء الاختراق ولا تسرب مادي من الجنين بعد سحب الإبرة. يتم إنتاج إبر حادة جيدة باستخدام إعدادات إبرة سحب التي تنتج إبرة التي تأتي إلى نقطة غرامة(الشكل 1A). الإبرة سحبت لا ينبغي أن يكون تفتق التي هي طويلة جدا. خلاف ذلك ، يصبح تجويف الإبرة ضيقا جدا بالنسبة لجزء كبير من التفتق(الشكل 1B)، ويصبح من الصعب الحصول على ضغط الحقن عاليا بما يكفي لإجبار المادة من خلال الإبرة. في هذا البروتوكول، تم استخدام الإبر مشطوف. وصف عملية سحب و شطب الإبر في موتي و هاريل19. في حالة الأجنة ذبابة الرمل التي تتطور على مدى فترة طويلة من الزمن، فمن الأهمية بمكان أن يكون الإبر الحادة التي تقلل من الأضرار التي لحقت الجنين، وبالتالي منع المواد من التسرب في موقع الحقن. عندما يتسرب جنين من جنين ما بعد الحقن ، فإن هذه المادة هي وسيلة غنية لنمو العفن والفطريات. في الأجنة التي تتطور على مدى فترة أقصر من الزمن يمكن للجنين أن يتطور ويفقس قبل أن يصبح القالب مشكلة. يجب إزالة أي أجنة تتسرب منها الأجنة بشكل واضح بعد الحقن.
أثناء الحقن ، من المهم إضافة الماء حسب الحاجة عن طريق ترطيب فرشاة طلاء ناعمة ولمسها على ورقة التصفية ، وتكرارها حسب الضرورة حتى يكون الغضروف المفصلي للماء فقط في قاعدة الأجنة. يجب ملاحظة الانتباه إلى الرطوبة النسبية في يوم الحقن. في أيام الرطوبة المنخفضة، سوف تحتاج إلى إضافة المزيد من المياه. بمجرد الانتهاء من الحقن ، يتم إضافة القليل من الماء الإضافي إلى ورقة التصفية بحيث يطفو الغطاء قليلا ، مما يسهل إزالته. بمجرد إزالة غطاء الغطاء، يمكن لطخ ورق الفلتر مع الأجنة المحقونة، بحيث تكون ورقة التصفية رطبة بالكاد. ويمكن بعد ذلك نقل الأجنة إلى وعاء من الجص الرطب للفقس باستخدام فرشاة طلاء ناعمة. في هذه المرحلة ، الأجنة هشة للغاية لذلك يجب إجراء العملية بعناية فائقة. من المهم أيضا منع الأجنة من لمس بعضها البعض لتكون قادرة على إزالة الأجنة المتعفنة والحد من انتشار التلوث الفطري.
بعد الحقن، يتم الاحتفاظ بالأجنة المحقونة G0 على الأواني الجصية وفقا لإجراءات التربية العادية. وإلى أن يفقس الجنين، ينبغي فحص أواني الأجنة المحقونة مرة واحدة في اليوم لإزالة الأجنة غير الصحية. ويعرض الشكل 4 ألف الجدول الزمني المتوقع للتربية الفردية من G0 من يوم وضع البيض وحقنها إلى مرحلة البلوغ. ويبين الشكل 4ب أمثلة على أجنة مجموعة0 السليمة التي ينبغي الاحتفاظ بها؛ أو التالفة، الملوثة بالفطريات، المجففة، أو مشوهة وينبغي التخلص منها. من المفترض أن الأفراد الذين حقنوا G0 هم فسيفساء للألييل المتحولة. وينبغي تصميم طريقة لتحديد الأليلات المتحولة المحتملة، مثل فحص PCR للمنطقة المحيطة بموقع القطع المتوقع(المواقع). الشكل 4C يقدم مثالا على PCR-المقايسة تظهر فسيفساء G0 الفردية, عرض منتج PCR إضافية إلى المنتج wt المتوقع, تمثل أليل متحولة.
وبمجرد ظهور البالغين، يتم عبور الإناث G0 النامية من الأجنة بالحقن G0 مع الذكور wt، ويسمح لوضع البيض، ويتم النمط الجيني في وقت لاحق. يتم الاحتفاظ فقط الأنابيب التي تحتوي على ذبابة G0 التي تظهر أدلة على طفرة من طريقة اختيار genotyping. يتم عبور الذباب من الأجيال القادمة (G1 الإناث) إما مع الذكور wt أو بشكل فردي بين الأشقاء (من G2). ويسمح لهذه الصلبان لوضع البيض ومن ثم النمط الجيني من قبل الطريقة المفضلة. وتتكرر الخطوة الأخيرة حتى يتم الحصول على الذكور والإناث متحولة homozygous، وإنشاء خط متحولة homozygous. يتم إعطاء تمثيل تخطيطي للخلافة المناسبة من الصلبان لإنشاء خط متحولة في الشكل 5A. الشكل 5B يظهر مثالا على PCR genotyping السماح للتعرف على الصليب شقيق متحولة homozygous.
الشكل 1: إبر الحقن المجهري. A. إبرة جيدة. B. إبرة مع تفتق المدقع ليست جيدة للحقن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظرة عامة على جمع الأجنة والتموج الدقيق (تم تكييف هذا الرقم من4). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إعداد الميكرويكشن. أ. التمثيل التخطيطي لإعداد الميكرويكشن. B. عن قرب من الجنين المنحازة للميكروبيكشن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تربية وتحديد الفسيفساء G0 الأفراد البالغين. A. الجدول الزمني المتوقع من الجنين microinjection إلى G0 مرحلة البلوغ. ب. أمثلة على الأجنة الجيدة والسيئة المظهر بعد الحقن. C. PCR genotyping من واحد تحولت G0 الفسيفساء الفردية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحديد وعزل الطفرات ذات الأهمية. أ. التمثيل التخطيطي للاستراتيجية التجريبية لعزل الأليل المتحولة وإنشاء مخزونات متحولة متجانسة (الشكل من 4). اللون يمثل وجود خلايا تحمل الأليل متحولة، في heterozygous (الوردي) أو homozygous (الأحمر) الدولة. ب. مثال على استراتيجية فحص PCR ل genotyping الصلبان القضم الفردية من الذباب الرملي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن نقدم هنا طريقة التلقيح الدقيق الجنين التي تم تطويرها مؤخرا لتولد الطفرات المستهدفة من قبل CRISPR / Cas9 في ذباب الرمال Phlebotomus papatasi. تم تطوير الميكرونجيكشن الجنيني للتعديل الوراثي للحشرات في دروسوفيلا في منتصف الثمانينيات21 ويستخدم الآن بشكل روتيني في مجموعة واسعة من الحشرات. تم تطوير طرق أخرى لتوصيل مواد التعديل الوراثي لاستخدامها في الحشرات ، مثل ReMOT20و21و22و23 و electroporation23. ومع ذلك، فإن الميكروبيكشن الجنيني هو في الوقت الحاضر الطريقة الأكثر تنوعا وكفاءة لتسليم هذه المواد. يعد ReMOT واعدا للغاية كطريقة توصيل وينبغي استكشافه لاستخدامه في ذباب الرمل ، نظرا للسهولة النسبية لحقن البالغين مقارنة بالحواس الدقيقة للجنين. ومع ذلك ، حتى الآن لم يتم استخدام ReMot بنجاح ل CRISPR / Cas9 HDR أو transposon transgenesis. على الرغم من أن تقنية التنقية الدقيقة للأجنة في الحشرات هي في الأساس نفس التقنية التي تم تطويرها في البداية ، فقد تكون هناك حاجة إلى تحسينات جديدة لكل نوع جديد من التقنيات. وتشمل هذه الاختلافات بين الأنواع نمط ومدة نمو الجنين، وبنية الجنين، والبيئة التي يتطور فيها الجنين عادة. الأجنة ذبابة الرمل صغيرة بشكل خاص (0.3-0.5 مم طويلة و 0.1- 0.15 ملم واسعة، تمثل ما يقرب من 1/3 من حجم البويضة Drosophila 1). هذا الحجم المنخفض يزيد من صعوبة التعامل مع البيض دون الإضرار بها. يجب مراقبة مستوى الرطوبة في كل خطوة من البروتوكول بعناية فائقة ، حيث أن أجنة ذبابة الرمل حساسة بشكل خاص للكف. ومع ذلك، فهي ليست مائية وسوف تموت إذا غمرت تماما في الماء لفترة طويلة. يتطلب الحقن المجهري للجنين Drosophila الحقن في النهاية الخلفية للجنين. بسبب الشكل شبه المتماثل للأجنة ذبابة الرمل، وتحديد قطبية الجنين من الصعب. وأخيرا ، في حين أن تطور جنين ذبابة الرمل يسير على غرار Drosophila، فإنه يفعل ذلك بمعدل أبطأ بكثير. يستمر تكوين الأجنة وحده بين 6 إلى 11 يوما ، اعتمادا على أنواع ذبابة الرمل ، في حين يفقس بيض دروسوفيلا يوما واحدا فقط بعد وضع البيض. Drosophila الخلايا البيض يحدث حوالي 2 ساعة بعد oviposition، في حين أن الأجنة ذبابة الرمل تصل إلى هذه المرحلة في أقرب وقت 9 ساعات بعد oviposition. وبالنظر إلى هذا الاختلاف في توقيت النمو، تستهدف الحقن مركز جنين ذبابة الرمل النامي على افتراض أن تطوير نواة في الجنين المتزامن يقع بالقرب من مركز الجنين النامي في هذه المرحلة المبكرة من التطور، وبالتالي تجنب الحاجة إلى التمييز بين قطبية الجنين.
CRISPR/Cas9 يخلق فواصل dsDNA في مكان الجينوم المختار. يتم إصلاح هذه فواصل مزدوجة حبلا في الخلية من قبل NHEJ أو تقرير التنمية البشرية. الطريقة التي نقدمها هنا كانت تستخدم سابقا فقط لnHEJ القائم على mutagenesis ، والتي ولدت صغيرة الإدراج / حذف الأحداث ، indels ، مما أدى إلى frameshift في تسلسل الجينات ، مما أدى إلى توقف الكودونات المبكرة وبروتين تفتقر إلى جميع المجالات الوظيفية4. تمتلك الحشرات أيضا الآلات الخلوية لإصلاح كسر dsDNA من خلال HDR ، والتي يمكن بعد ذلك إعادة توجيهها لتصميم استراتيجيات تحرير الجينوم الأكثر تعقيدا. لا يزال تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 القائم على HDR بحاجة إلى إعداد للاستخدام في ذباب الرمل ، وينبغي أن يسمح بتطوير مراسلي التعبير ومسوخ التعبير المشروط ، من بين الإنشاءات الأخرى.
تطوير هذا البروتوكول microinjection يفتح الباب الآن لاستخدام أساليب تعديل الجينوم الأخرى ، مثل CRISPR / Cas9 HDR ، transposon transgenesis ، وأنظمة التعبير الثنائي مثل UAS / Gal4 ، وإعادة التركيب الخاصة بالموقع عن طريق phiC31 أو Cre /lox. وسيؤدي تطوير هذه الأساليب الأخرى إلى زيادة توسيع صندوق أدوات تعديل التعبير الجيني لذبابة الرمل من خلال السماح بمعالجة جينومية أكثر تعقيدا. ومع ذلك ، قبل استخدام هذه الأساليب الأخرى ، ستكون هناك حاجة إلى العمل على تحديد وعزل العناصر التنظيمية لدفع التعبير عن الجينات المدرجة في ذباب الرمل ، وكذلك علامات الإدراج والمكونات الأخرى لهذه الأساليب ، مثل المروجين لدفع التعبير عن المنقولات وإعادة دمجها.
وأخيرا ، أصبح تحرير الجينوم في الحشرات غير النموذجية الآن احتمالا ، ويرجع الفضل في ذلك بشكل خاص إلى ثورة اكتشاف CRISPR /Cas9 والتكيف15و16. في الحشرات ، تتطلب معظم تقنيات تحرير الجينوم ، باستثناء ملحوظ لتقنية ReMOT المطورة حديثا ، إجراء زراعة دقيقة للجنين ، وهي خطوة حاسمة وصعبة تقنيا. نأمل أن يساعد هذا المنشور في توسيع نطاق تقنيات تعديل التعبير الجيني المتكيفة مع ذباب الرمل ، ويؤدي إلى اكتشافات جديدة على بيولوجيتها وكذلك كفاءة ناقلات لطفيليات الليشمانيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي
Acknowledgments
يشكر المؤلفون فانيسا ميلدينر هاريل على القراءة النقدية للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42 (2017).
- Pelletier, I., et al. Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells. Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).
- Kamhawi, S., et al. A role for insect galectins in parasite survival. Cell. 119 (3), 329-341 (2004).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major. MBio. 10 (4), (2019).
- Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).
- Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes. Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Hu, C., Aksoy, S. Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans. Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).
- Meister, S., et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).
- Meister, S., et al. Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).
- Telleria, E. L., et al. Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis. Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).
- Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).
- Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania. Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).
- Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality. PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
- Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).
- Meuti, M., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9. JoVE. (163), e61651 (2020).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Macias, V. M., et al. Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control. Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).
