Summary
이 프로토콜은 태아 수집, 주사, 곤충 사육 및 식별뿐만 아니라 관심있는 돌연변이의 선택 : 모래 파리에 CRISPR / Cas9 표적 돌연변이 발생의 단계를 자세히 설명합니다.
Abstract
모래 파리는 리슈마니아 종, 원생 동물 기생충에 대 한 자연 벡터 피부 병 변에서 내장 병 리 에 이르기까지 증상의 광범위 한 스펙트럼을 생산. 벡터/기생충 상호 작용의 본질을 해독하는 것은 그들의 호스트에 Leishmania 전송의 더 나은 이해를 위한 1차적인 중요성입니다. 모래 플라이 벡터 역량(즉, 병원체를 운반하고 전송하는 능력)을 제어하는 파라미터 중에서도 이러한 곤충에 내재된 파라미터가 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 곤충 면역 반응은 예를 들어, 리슈마니아에모래 플라이 벡터 능력에 영향을 미친다. 이러한 매개 변수의 연구는 이러한 비모델 유기체에서 사용하기 위해 적응된 유전자 발현 변형 방법의 부족에 의해 제한되었다. 작은 간섭 RNA에 의한 유전자 다운 조절은 가능하지만 기술적으로 도전적일 뿐만 아니라 침묵은 세대에서 세대로 전염될 수 없는 기능의 부분적인 손실로 이어집니다. CRISPR/Cas9 기술에 의한 표적 돌연변이 발생은 최근에 Phlebotomus 파파타시 모래 파리에 적응되었습니다. 이 기술은 관심있는 유전자를 공부할 수 있도록, 특별히 선택된 궤적에 있는 전송 가능한 돌연변이의 생성으로 이끌어 냅니다. CRISPR/Cas9 시스템은 대상 이중 가닥 DNA 휴식의 유도에 의존하며, 나중에 비동호모로우스 엔드 인게이션(NHEJ) 또는 호모로지 구동 수리(HDR)에 의해 수리됩니다. NHEJ는 휴식의 간단한 폐쇄로 구성되어 있으며 종종 작은 삽입 / 삭제 이벤트로 이어집니다. 대조적으로, HDR은 기증자 DNA 분자가 표적 DNA와 상동성을 수리가 위한 템플릿으로 사용하는 것을 이용합니다. 여기서, 현재까지 모래파리 벡터에 적응된 유일한 게놈 변형 기술인 NHEJ를 사용하여 CRISPR/Cas9에 의한 표적 돌연변이 발생을 위한 모래플라이 배아 미세주입 방법을 제시한다.
Introduction
벡터 매개 질병은 지속적인 진화의 주요 공중 보건 위협입니다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 수백 종의 벡터 종들이 매우 뚜렷한 물리학 상가(예: 모기, 진드기, 벼룩)의 엄청난 수의 미생물 병원체 의 전염에 책임이 있으며, 이로 인해 연간 70만 명 이상의 인명 사망이 발생한다고 합니다. 벡터 곤충 중, 플레보토민 모래 파리 (Diptera, Psychodidae)는 다른 지리적 지역에서 발견 된 뚜렷한 현상 특성과 벡터 용량을 나타내는 80 입증 된 벡터 종과 함께 광대 한 그룹을 구성합니다. 그(것)들은 사이 20,000그리고 30,000죽음 사이 Leishmanias의 약 130만의 새로운 케이스를 일으키는 원인이 되는 속 Leishmania의원생동물 기생충을 위한 벡터입니다. Leishmaniases 임상 결과는 다양합니다, 치료의 부재에서 치명적인 내장 보급에 자기 제한 적인 경골 병변에서 구역 수색에 이르기까지 현상으로.
모래 파리는 엄격하게 지상파 곤충입니다. 그들의 수명 주기, 다른 Diptera에 비해 상대적으로 긴, 온도 등 다른 매개 변수에 따라 최대 3 개월 지속, 습도, 그리고 영양. 그것은 1개의 배아 단계 (6 11 일), 4개의 애벌레 단계 (총 23 에서 25 일 지속) 및 1개의 pupal 단계 (9 10 일) 그 후에 변질 및 그 후에 성인으로 이루어져 있습니다. 모래 파리는 사육을 위해 습하고 따뜻한 환경이 필요합니다. 남성과 여성 모두 꽃 꿀에서 야생에서 얻은 설탕을 먹습니다. 오직 여성만이 혈액 공급제이며, 계란 생산을 위해 혈액 식사에서 얻은 단백질을 필요로 하기 때문에1.
연구의 중요한 초점은 전염성 감염의 발달로 이끌어 내는 벡터/기생충 상호 작용의 본질을 확인하는 것입니다. 다른 벡터 곤충과 마찬가지로, 모래 파리에 본질적인 매개 변수는 그들의 벡터 능력에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다., 그들의 호스트에 병원체를 운반 하 고 전송 하는 그들의 능력으로 정의. 예를 들어, 플레보토무스 파파타시 모래에 의한 갈렉틴의 발현은 기생충 표면 성분을 인식하는 수용체역할을 하는 미드구트 세포를 비행하며, 리슈마니아 전공2,3에대한 벡터 역량에 직접적인 영향을 미칠 수 있다. 곤충 면역 반응 경로, 면역 결핍 (IMD), 또한 Leishmania 주요4에대 한 Phlebotomus 파파타시 모래 플라이 벡터 능력에 대 한 중요 한. 전염하는 병원체의 전염을 조절하는 벡터 곤충 면역 반응 경로에 대한 중요한 역할은 Aedes aegypti 모기5,6,7,체셋 플라이 글로시나 모시탄8,및 아노펠스 감비아 모기9,10에서유사하게 보고되었다.
모래 파리/Leishmania 상호 작용의 연구는 이 곤충에 사용하기 위해 적응된 유전자 발현 수정 방법의 부족에 의해 제한되었습니다. 작은 간섭 RNA(siRNA)에 의한 유전자 다운조절만은 최근까지11,12,13,14를 수행하였다. 이 기술은 성인 여성의 미세 주입과 관련된 사망률에 의해 제한되며, 세대에서 세대로 전염될 수 없는 기능의 부분적인 손실로만 이어집니다.
CRISPR/Cas9 기술은 모래 파리와 같은 비모델 유기체에서 기능성 게놈 연구에 혁명을 일으켰습니다. 세균제에대한 방어를 위한 대핵생물의 적응형 면역 계통으로부터 변형된 CRISPR Cas9 시스템은 곤충을 포함한 우수한 진핵생물을 위한 게놈 편집 도구로 빠르게 적응되고 있다. CRISPR/Cas9 표적 게놈 편집의 원리는 특정 게놈 궤적에 대한 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 상호 보완성을 기반으로 합니다. Cas9 핵은 sgRNA에 결합하고 sgRNA가 그것의 보완적인 순서와 연관되는 게놈 DNA에 있는 이중 가닥 DNA (dsDNA) 중단을 만듭니다. Cas9-sgRNA 복합체는 SgRNA에서 17~20개의 상호 보완염기까지 표적 서열로 유도되며, dsDNA 브레이크는 두 개의 독립적인 경로에 의해 수리될 수 있다: 비homologous 엔드 결합(NHEJ) 또는 호모로지 지향 수리(HDR)17. NHEJ 수리는 휴식의 간단한 폐쇄를 포함하지만 자주 작은 삽입 / 삭제 이벤트로 이어질. HDR을 통한 DNA 복구는 기증자 DNA 분자가 표적 DNA와 상동성을 수리하기 위한 템플릿으로 사용합니다. 곤충은 두 기계를 모두 보유하고 있습니다.
CRISPR/Cas9 기술은 NHEJ 수리 경로를 통해 선택한 궤적에서 돌연변이를 생성할 수 있습니다. 또는 적절한 기증자 템플릿이 있는 HDR 경로를 통해 노크 인 또는 발현 기자와 같은 보다 복잡한 게놈 편집 전략을 위해. 모래 파리에서, 면역 반응 인자의 null 돌연변이 알렐레는 Phlebotomus 파파타시4에서NHEJ 매개 CRISPR을 통해 생성되었다. 모래 플라이 배아는 또한 CRISPR/Cas9 혼합으로 또 다른 연구에서 주입되었다 노란색을 인코딩 하는 유전자를 대상으로. 그럼에도 불구하고 돌연변이를 운반하는 성인은18을생산하지 않았다. 우리는 여기에서 NHEJ 매개 CRISPR/Cas9에 의한 표적 돌연변이 발생의 상세한 방법을 설명하고, 특히 프로토콜의 중요한 단계인 배아 미세 주입에 중점을 둡니다.
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Protocol
모래 파리 먹이 공급에 대 한 혈액의 소스로 마우스의 사용은 건강의 국가 학회 (NIH)의 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 가이드에 있는 권고에 따라 엄격한 수행 되었다. 이 프로토콜은 NIAID, NIH (프로토콜 번호 LPD 68E)의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다. 무척추 동물은 NIH 지침에 따라 적용되지 않습니다.
1. 바늘 준비(그림 1)
- Meuti와 해럴19에설명된 대로 바늘과 벨을 당깁니다. 간단히 말해서, 보로실리케이트 유리 모세혈관을 사용하여 이중 단계 유리 마이크로 피펫 풀러에 바늘을 당깁니다.
- 여분의 미세 한 돌을 사용하여 마이크로 피펫 베벨러에 젖은 베브링하여 바늘을 날카롭게.
2. 배아 수집 및 미세 조작(그림 2)
- 주사일 5일 전에, 혈액 사료 모래는 식민지 유지 보수를 위해 일상적으로 수행된 암컷을 비행합니다. 모래 파리 식민지 사육 절차 및 필수 재료에 대한 자세한 내용은, 변호사 등을 참조하십시오.1 인큐베이터에서 곤충을 유지 70% 습도 및 26°C, 전체 개발 하는 동안.
- 어느 날 혈액 먹이 후, 측면 포트와 석고 냄비에 100-150의 그룹에 의해 혈액 공급 여성을 캡처합니다. 식민지 유지 보수에 보통 설탕 용액 (30 % 자당 - 작은 면공을 담을 수있는 충분한 볼륨)으로 여성을 유지하십시오.
- 2-3 일째에 혈액 을 먹이는 날에석 냄비를 적시지 마십시오. 건조한 기판에 암컷을 유지하는 것은 암컷이 습한 환경에 계란을 낳는 것을 선호하기 때문에, 조기 계란 누워를 방지할 것입니다.
- 5일째에는 혈액 먹이주기 후 배아 수집, 미세 조작 및 미세 주입을 수행합니다. 달걀 누워 챔버에 촉촉한 필터 용지를 소개합니다. 갓 낳은 배아는 완전히 발달된 초리온이 없으며 흰색으로 나타납니다. 절차 중에 검은 색 필터 용지를 사용하여 백색 배아를 시각화합니다.
- 입 흡인기를 사용하여 측면 포트를 통해 계란 누워 챔버에 석고 냄비에서 여성의 작은 그룹을 전송합니다. 습한 기판 (필터 종이)의 존재는 배란을 유도한다.
- 30-60 분 후, 조심스럽게 챔버에서 새로 배치 된 배아와 필터 용지를 검색합니다. 필터 용지와 배아를 페트리 접시에 최대 3시간 동안 보관하십시오. 이 기간 동안 필터 용지의 수분 수준을 정기적으로 평가하여 촉촉하게 유지되도록 합니다. 이 시간 도중, 여성의 새로운 단과 2.4에서 2.6 단계를 반복하고 가능한 한 많은 배아를 수집합니다.
- 주입을 위한 현미경 슬라이드 준비: 매우 미세한 페인트 브러시로 계란을 하나씩 수동으로 수집하고 유리 커버슬립을 얹은 현미경 슬라이드에 놓인 습한 검은 색 필터 용지로 조심스럽게 옮기십시오.
- 필터 용지에 물을 추가하여 배아를 촉촉하게 유지하지만 덮개 슬립에서 벗어나거나 덮개 슬립 아래에 빨려 들어가지 않습니다. 커버슬립에 배아를 정렬합니다. 커버슬립은 주사 중에 계란이 굴러가는 것을 막는 백스톱 역할을 합니다.
3. 배아 주사(그림 3)
- 주사를 시작 2.5 받는 시간 3 계란 수집의 시작 시간 후. 실온 및 주변 실험실 습도에서 주사를 수행합니다.
- 정렬된 배아가 충분한 물을 가지고 있어야 촉촉하게 유지되도록 하십시오.
참고: 배아는 주사 중에 촉촉하게 유지되는 것이 중요합니다. 주사 과정에서 촉촉하지 않으면 바늘이 배아를 관통하는 데 어려움을 겪기 때문에 주사가 어려워집니다. 정확한 양의 물은 배아가 그 주위에 물의 반월상 연골을 가지고 있는 지점이지만, 커버슬립은 배아가 덮개 슬립 아래 를 밀어 일으키는 물 위에 떠 있지 않습니다. 주사 하는 동안 배아 주위 물의 양을 모니터링 하는 것이 중요 하다. 배아를 촉촉하게 유지하기 위해 필요에 따라 물을 추가합니다. - 브러시를 물로 적시고 물을 필터 용지의 뒷쪽 끝으로 옮기면 조심스럽게 물을 추가합니다. 이러한 방식으로 물을 첨가하면 물을 느리고 제어된 방식으로 첨가하여 배아를 촉촉하게 유지하기에 충분합니다. 물이 너무 많으면 배아가 정렬되지 않도록 하여 배아를 주입하기가 어려워질 수 있습니다.
- 백 로드 주입 혼합물을 미세 주입 바늘에 넣습니다. 손으로 그린 보로실리케이트 바늘 필러를 사용하여 바늘에 약 0.5 ~ 1 μL의 주입 믹스를 추가, 젤 로딩 파이펫 팁도 사용할 수 있습니다. 사출 혼합물은 상업용 재조합 Cas9 단백질(300 ng/μL)과 혼합된 특정 궤적을 대상으로 설계된 하나 또는 여러 가이드 RNA(80 ng/μL 각각)로 구성된다.
- 30 psi에서 사출 압력으로 시작, 바늘의 끝에서 공기를 배출 하는 주입 트리거를 누릅니다. 이것은 주입 믹스가 흐를 수 있도록 바늘의 끝에 주입 믹스를 강제로. 이 시점에서, 사출 물질이 흐르기 시작할 때까지 홀드/일정한 압력을 천천히 증가시킨 다음, 바늘에서 흐르는 주입 믹스의 지점 바로 아래에 있도록 홀드/일정한 압력을 다시 해제합니다. 문이 닫힌 설정은 소량의 물질이 배아에 들어가는 것을 볼 수 있도록 충분한 주입 물질을 전달해야합니다.
참고: Drosophila와 모기에 사용되는 다른 프로토콜과 유사한 할로탄소 오일 하에서 모래 플라이 배아의 주입은 처음에 테스트되었지만 이러한 주사의 생존 율은 매우 낮았습니다. 생존은 위에서 설명한 바와 같이 축축한 필터 용지에 주사로 전환하여 향상되었다. - 바늘을 배아의 측면에 삽입합니다. 배아 뒤에 있는 커버슬립을 배아를 관통하는 바늘을 돕는 백스톱으로 사용하십시오. 바늘을 부드럽게 제거하기 전에 소량의 주사 믹스를 배아에 전달합니다.
- 바늘을 제거 한 직후 인젝터를 눌러 바늘 끝에서 백필 된 물질을 제거하십시오. 이것은 바늘이 막히는 것을 방지하는 데 도움이 될 것입니다.
- 다음 배아로 진행합니다. 각 주입 사이에 필터 용지가 촉촉하고 바늘이 막히지 않도록하십시오.
- 일단 모든 태아가 주입되면, 실행 집계를 유지하기 위해 주입 된 배아의 수를 계산합니다.
- 커버슬립이 떠 있도록 필터 용지에 물을 추가하여 커버슬립을 제거합니다. 이 시점에서, 프로브(팁에 붙어 있는 곤충 핀이 있는 목재 어플리케이터 스틱)를 사용하여 손가락이 주입된 배아로부터 덮개 슬립을 당기는 데 사용되는 동안 필터 용지를 제자리에 고정시합니다.
- 커버슬립이 제거되면 필터 용지에서 여분의 물을 블롯합니다.
4. 사출 후 양육 (G0)(그림 4)
- 습도를 유지하기 위해 페트리 접시에 놓인 습한 필터 용지의 여러 층 위에 배아를 사용하여 필터 용지를 전달합니다. 다른 배아를 주입하는 데 필요한 시간 동안 여기에 배아를 유지합니다. 배아는 이와 같이 3 시간 동안 최대 3 시간 동안 보유 될 수 있습니다. 주사 후 그들은 천천히 갈색으로 변합니다.
- 일단 모든 배아가 주입되면, 수동으로 이전에 촉촉한 작은 크기의 석고 냄비에 전송. 각 냄비에 너무 많은 배아를 넣고 개인 사이의 가능한 곰팡이 오염을 피하기 위해 그들 사이의 거리를 유지하지 마십시오. 냄비를 화면으로 덮고 일반적으로 모래 파리 식민지 계란을 위해 수행 될 것 같이 저장, 70 % 습도및 26 °C에서 인큐베이터에서 유지, 전체 개발 하는 동안.
- 1일째 주사 후, 페인트 브러시로 손상된 배아와 죽은 배아를 모두 제거하십시오. 곰팡이 오염을 제한하기 위해 주입 된 배아를 포함하는 석고 냄비에 0.5 % 프로피온산의 100 μL을 추가합니다. 주입 과정에서 손상된 배아로부터 세포질 방출은 곰팡이 성장에 특히 유리하다.
- 매일 석고 냄비를 확인하고 나쁜 또는 죽은 배아를 제거하십시오. 곰팡이가 존재하는 경우 감염된 모든 배아를 제거하고 0.5 % 프로피오닉 산을 몇 방울 떨어 뜨립니다.
- 8일과 12일 사이에 유충부 부화. 하루에 두 번, 5-10 최대의 그룹으로, 새로운 석고 냄비에 새로 등장 애벌레를 전송합니다. 소량의 음식을 추가하고 일주일에 2-3 번 음식을 확인하십시오.
- 너무 많이 곰팡이 오염의 위험을 증가으로 조심스럽게 애벌레 음식의 양을 모니터링할 수 있습니다. 모래 파리 유충은 그룹에서 더 잘 살아남을 수 있지만 충분한 음식이 없다면 식인풍이 될 수 있습니다.
- 애벌레가 강아지를 때, 처녀로 여성을 유지하기 위해 섹스로 그들을 분리. 생존자가 많으면 남성을 버리고 여성만 유지하십시오.
참고: 남성과 여성 모두 돌연변이를 운반하고 전송할 수 있습니다. 그러나, 암컷이 교차되기 전에 처녀를 유지해야하기 때문에, G0 주입 된 여성만 섹스를 통해 wt 곤충을 분리할 필요가 없도록 사용하는 것이 더 쉽습니다. G0 남성은 성인 생존자의 수가 낮고이 경우 정렬 wt 처녀 여성과 결합 될 경우 백업으로 보관 할 수 있습니다.
5. 돌연변이 진상규약의 선택 및 선별(그림 5)
- 케이지에 wt 수컷을 가진 G0 암컷을 매스 크로스합니다. 정상적인 식민지 유지 보수를 위해 할 것처럼 혈액 공급은 모두 그들을 공급합니다.
- 언젠가 혈액 먹이 후, 입 흡인기를 사용하여 개별 석고 튜브로 2-3 wt 남성으로 각 G0 여성을 전송합니다. 매일 변경된 작은 면공에 설탕으로 파리를 먹이고 석고 수분이 달걀 누워에 적합한지 확인하기 위해 물 주사기를 사용하십시오.
- G0 암컷이 계란을 낳은 후 (G1에해당), 나중에 지노티핑에 대한 개별, 에펜도르프 튜브에 자신의 시체를 수집합니다. wt 식민지를 위해 일반적으로 행해진 것처럼 배아를 유지하십시오.
- 선택 방법에 의해 G0 암컷으로부터 DNA를 추출한다.
- 예를 들어 예상되는 CRISPR 컷 영역을 둘러싼 프라이머를 사용하여 PCR 분석기를 설계하여 돌연변이의 존재를 위한 DNA를 검사합니다.
- G0 암컷이 낳은 G1 배아만 변혁의 증거를 보여 줌으로써 보관하십시오. 이 G1 배아가 강아지로 발전할 때, 성별에 의해 그(것)들을 분리하고 단지 암컷을 유지합니다. 같은 G0 암컷에서암컷을 배회하여 수컷을 낳고, 혈액을 공급한 다음, 2-3 암컷과 4-5명의 수컷을 작은 크기의 용기로 옮긴다.
참고 : 모든 G1 개인은 독특한 돌연변이를 수행 할 수있는 기회가, 그래서 살아남은 개인의 수가 너무 높지 않은 경우 다음 wt 남성과 개별적으로 G1 여성을 교차하는 것이 좋습니다. 동일한 튜브에 존재하는 다른 돌연변이를 운반하는 여러 여성의 경우는 드물지만 발생할 수 있습니다. 이러한 경우 지평 후 관찰 하는 경우, G2 자손 여성 다음 wt 남성에 개별적으로 짝짓기 한다. 이 짝짓기 계획은 자손에서 다중 돌연변이의 가능성을 피합니다. - 계란 누워 후, G1 여성의 시체를 수집하고 돌연변이를 검사합니다. 적어도 한 명의 여성이 돌연변이의 증거를 보인 튜브만 보관하십시오.
- 이후 세대를 위해 하나의 쌍 인 크로스를 합니다. 계란 누워 후, 돌연변이의 존재를 위한 부모를 검사합니다. 두 부모가 동일한 돌연변이에 대한 동종 구균 될 때까지 각 세대에서 반복합니다. 일단 확인되면, 그들은 동종 돌연변이 주식의 창시자가 될 것입니다.
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Representative Results
모래 파리 돌연변이를 생성하기 위해 여기에 설명 된 CRISPR / Cas9 미세 주입 프로토콜은 이전 간행물4에설립되었다. 이 접근법은 540명의 개별 중 11개가 절차에서 살아남았기 때문에, 9는 돌연변이인 이기 때문에 고도로 효율적인 돌연변이 발생을 일으켰습니다. CRISPR/Cas9 돌연변이에 대한 가이드를 설계할 때 중요한 첫 번째 단계는 대상 영역 주변의 영역을 시퀀싱하는 것입니다. 시퀀싱을 위한 템플릿은 주입을 위한 태아의 근원으로 사용될 긴장에서 이어야 합니다. 설계 가이드에 게시된 게놈 서열에만 의존하는 것은 위험합니다. 게시된 게놈과 사전 가이드 설계 서열 간의 차이점이 있는 것은 드문 일이 아닙니다. 어떤 경우에는, 발표된 게놈 서열에서 디자인된 가이드는 표적 유전자 의 주위에 지역이 순서화될 때 존재하지 않습니다 (Harrell, 개인 관측). 또한, 서열에는 지노티핑 중에 실제 CRISPR 편집으로 착각할 수 있는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)이 포함될 수 있다. 따라서 대상 영역에 대한 시퀀스를 확인하는 것은 나머지 프로토콜이 성공하는 데 중요합니다.
미세 주입에 의한 곤충의 성공적인 유전자 변형은 주로 두 가지 중요한 측면에 달려 있습니다: 가능한 한 배아에 대한 손상이 거의 없는 적절한 시기에 물질 (단백질, 플라스미드 또는 mRNA)의 전달; 그리고 절차에서 살아남고 자손을 생산하는 강력하고 건강한 곤충의 양육. 도 2에기술된 이 절차의 초기 단계는 wt 식민지에서 암컷의 혈액 공급으로 시작하고 5일 후에 배아 수집 및 미세 주입으로 진행됩니다. 두 번째 단계는 성년까지 주입 된 배아를 양육하여 적절한 십자가를 만들고 관심있는 돌연변이를 식별하고 격리하는 것으로 구성됩니다.
주사를 위한 배아는 30 - 60 분 동안 수집되므로 시간 후 oviposition의 상대적 연령을 결정할 수 있습니다. 배아는 주사의 시작 전에 3 시간 동안 발전할 수 있습니다. 곤충 발달의 이 시간 창은 배아가 주사를 살아남을 수 있게 합니다. 이 노화 기간 후에, 배아는 준비된 주입 슬라이드에 집합되고 태아는 미세한 브러시를 사용하여 커버슬립 가장자리에 대하여 제자리에 압연됩니다. 최종 구성은 그림 3A에표시됩니다. 반월 상 연골이 배아가 앉아 있는 커버 슬립 가장자리에 형성되도록 필터 용지를 충분히 적시는 것이 중요합니다. 너무 많은 물과 배아는 커버 슬립 가장자리에서 밀려나게 됩니다. 너무 적으면 배아가 표지 슬립 아래에 그려집니다. 배아는 습기를 유지해야하며, 그렇지 않으면 배아 막은 주입하기가 어려워집니다. 커버슬립 엣지는 백 스톱역할을 하므로 바늘이 가장자리에 대고 누르면 배아에 침투할 수 있습니다. 바늘이 매끄럽게 침투할 수 있도록 날카로운 바늘과 백스톱의 조합입니다.
가장 성공적인 미세 주입 프로토콜과 마찬가지로 주입되는 배아에 적합한 좋은 미세 주입 바늘이 중요합니다. 좋은, 날카로운 바늘은 쉽게 주사 후 탈출 하는 물질을 허용 하지 않고 배아를 관통 하는 바늘으로 정의 됩니다. 바늘이 배아로 미끄러질 때 좋은 침투가 분명하며, 침투 중에 배아 멤브레인을 거의 또는 전혀 들여지지 않으며 바늘이 철회 된 후 배아에서 물질이 누출되지 않습니다. 좋은 날카로운 바늘은 미세 한 점에 오는 바늘을 생산하는 바늘 풀러 설정을 사용하여 생산된다(도 1A). 당겨지는 바늘에는 너무 긴 테이퍼가 없어야 합니다. 그렇지 않으면, 바늘의 루멘은 테이퍼의 주요 부분에 대해 매우 좁아지고(도1B)를통해 물질을 강제로 주입 압력을 가하기 어려워진다. 이 프로토콜에서, beveled 바늘이 사용되었다. 바늘을 당기고 베벨링하는 과정은 Meuti와 해럴19에설명되어 있습니다. 장시간 발달하는 모래플라이 배아의 경우, 배아의 손상을 최소화하는 날카로운 바늘을 가지는 것이 특히 중요하므로 주사 부위에 물질이 누출되는 것을 방지한다. 배아 플라스엠이 주입 후 배아에서 누출될 때, 이 물질은 곰팡이와 곰팡이 성장을 위한 풍부한 매체입니다. 짧은 기간 동안 발생하는 배아에서 배아는 곰팡이가 문제가되기 전에 형성되고 부화 할 수 있습니다. 주사 후 눈에 띄게 누출되는 배아를 제거해야합니다.
주사 하는 동안, 미세 한 페인트 브러시를 적시 고 필터 종이에 터치 하 여 필요에 따라 물을 추가 하는 것이 중요 하다, 물의 반월 상 연골이 단지 배아의 기지에 때까지 필요에 따라 반복. 주사일에 상대 습도에 주의해야 합니다. 습도가 낮은 날에는 더 많은 물을 추가해야합니다. 주사가 완료되면 필터 용지에 약간의 여분의 물이 추가되어 덮개 슬립이 약간 떠 있어 쉽게 제거할 수 있습니다. 커버슬립이 제거되면 주입된 배아가 있는 필터 용지가 만만드므로 필터 용지가 거의 축축해질 수 있습니다. 배아는 좋은 페인트 브러시를 사용하여 부화하기 위해 습한 석고 냄비로 옮길 수 있습니다. 이 단계에서 배아는 매우 취약하므로 프로세스를 매우 신중하게 수행해야합니다. 또한 배아가 서로 만지는 것을 방지하여 곰팡이 배아를 제거하고 곰팡이 오염의 확산을 제한할 수 있습니다.
주입 후, G0 주입된 배아는 일반적인 양육 절차에 따라 석고 냄비에 보관됩니다. 부화할 때까지, 주입된 태아 냄비는 건강에 해로운 태아를 제거하기 위하여 하루에 한 번 검사되어야 합니다. 도 4A는 계란 누워 및 주입의 날부터 성인기에 G0 개별 양육의 예상 타임 라인을 제시한다. 도 4B는 건강하고 유지되어야 하는 G0 배아의 예를 보여줍니다; 또는 곰팡이에 의해 오염되거나 건조되거나 변형되어 폐기해야 합니다. G0 주입 된 개인은 아마도 돌연변이 진상제에 대한 모자이크입니다. 잠재적인 돌연변이 진상규어를 식별하는 방법은 예상되는 절단 부위를 둘러싼 영역의 PCR 분석과 같이 설계되어야 합니다. 도 4C는 모자이크 G0 개별을 보여주는 PCR 분석법의 예를 제시하며, PCR 제품을 예상 wt 제품에 추가하여 돌연변이 적 장어를 나타낸다.
성인이 나타나면 G0 주입 된 배아에서 개발되는 G0 암컷은 wt 수컷과 교차하여 알을 낳을 수 있으며 나중에 유전자 형형이됩니다. G0 플라이를 함유한 튜브만이 지노피방식으로부터의 돌연변이의 증거를 나타내는 것으로 유지된다. 다음 세대 (G1 여성)에서 파리는 wt 남성 또는 형제 (G2에서)형제 사이에 개별적으로 교차한다. 이러한 십자가는 계란을 낳은 다음 선택의 방법에 의해 유전자 형이 허용됩니다. 마지막 단계는 동종 가우스 돌연변이 남성과 암컷이 얻어질 때까지 반복되어 동종 수돌연변이 선을 확립합니다. 돌연변이 선을 설정하기 위해 십자가의 적절한 계승의 회로도 표현은 도 5A에 주어진다. 도 5B는 동종자 돌연변이 형제 의 십자가의 식별을 허용하는 지노티핑 PCR의 예를 나타낸다.
그림 1: 미세 주입 바늘. A. 좋은 바늘. B. 극단적 인 테이퍼가있는 바늘은 주사에 좋지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 배아 수집 및 미세 조작개요(이 수치는4에서적응하였다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미세 주입 설정. A. 미세 주입 설정의 회로도 표현. B. 미세 주입을 위한 정렬된 태아의 클로즈업. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 모자이크 G0 성인 개인의 양육 및 식별. A. 배아 미세 주입에서 G0 성년까지 예상되는 시간 일정. B. 주사 후 좋은 찾고 배아의 예. C. 하나의 변형 G0 모자이크 개인의 PCR genotyping. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 관심 있는 돌연변이의 식별 및 격리. A. 돌연변이 항제를 분리하고 동질 돌연변이 주식을 확립하기 위한 실험 전략의 회로도 표현(그림 4). 색상은 이종수(분홍색) 또는 동형구(red) 상태에서 돌연변이 항제를 운반하는 세포의 존재를 나타낸다. B. 모래 파리의 교차를 시블링하는 개별을 지피하기위한 PCR 스크리닝 전략의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 여기에 Phlebotomus 파파타시 모래 파리에서 CRISPR / Cas9에 의해 표적 돌연변이 발생을위한 최근에 개발 된 배아 미세 주입 방법을 제시한다. 곤충 유전자 변형을 위한 배아 미세주입은 1980년대 중반에 드로소필라에서 개발되었으며 현재 다양한 곤충에서 일상적으로 사용되고 있다. 유전자 변형 물질의 전달을 위한 다른 방법은 ReMOT20,21,22,23 및 전기기와 같은 곤충에 사용하기 위해 개발되었다. 그러나, 배아 미세분사액은 현재 이들 물질의 전달을 위한 가장 다재다능하고 효율적인 방법입니다. ReMOT는 전달 방법으로 매우 유망하며 배아 미세 주입에 비해 성인 주사의 상대적 용이성 으로 인해 모래 파리에 사용하기 위해 탐구해야합니다. 그러나, 지금까지 ReMot는 CRISPR/Cas9 HDR 또는 트랜스포슨 트랜스게네시스에 성공적으로 사용되지 않았습니다. 곤충에서 배아 미세 주입을 위한 기술은 기본적으로 처음 개발된 것과 동일하더라도, 기술의 각각의 새로운 종 정제에 대한 필요가 있을 지도 모릅니다. 이 종 다름은 배아 발달의 패턴 그리고 기간, 태아 구조물 및 태아가 일반적으로 발전하는 환경을 포함합니다. 모래 파리 배아는 특히 작습니다 (0.3-0.5 mm 길이와 0.1- 0.15 mm 폭, 드로소필라 계란1의크기의 약 1/3을 나타냅니다). 이 감소 된 크기는 그들을 손상시키지 않고 계란을 취급하는 어려움을 증가시킵니다. 모래 파리 배아가 특히 건조에 민감하기 때문에 프로토콜의 각 단계에서 수분 수준은 매우 신중하게 모니터링되어야합니다. 그러나, 그들은 수생되지 않으며 장기간 물에 완전히 물에 잠긴 경우 죽을 것입니다. Drosophila 태아 미세 주입은 태아의 후방 끝에 주사를 필요로 합니다. 모래 플라이 배아의 거의 대칭 모양 때문에 배아 극성을 결정하는 것은 어렵습니다. 마지막으로, 모래 플라이 배아 발달이 Drosophila와유사한 진행되는 동안, 그것은 훨씬 느린 속도로 이렇게 합니다. 배아 발생은 모래 파리 종에 따라 6 일에서 11 일 사이에 지속되는 반면 드로소필라 계란은 계란 누워 후 하루만 부화합니다. Drosophila 계란 세포화는 약 2 시간 후 oviposition, 모래 비행 배아가 대략 9 시간 포스트 oviposition에서 이 단계에 도달하는 동안 생깁니다. 발달 타이밍에 있는 이 다름을 감안할 때, 주사는 syncytial 태아에 있는 핵개발이 개발의 초기 단계에서 발전 태아의 중심 근처에 위치한다는 가정하에 발전하는 모래 플라이 태아의 중심에 표적으로 하고, 따라서 배아 극성을 구별할 필요가 없습니다.
CRISPR/Cas9는 선택한 게놈 궤적에서 dsDNA 휴식을 만듭니다. 이러한 이중 가닥 나누기는 NHEJ 또는 HDR에 의해 셀에서 수리됩니다. 여기서 제시하는 방법은 이전에 는 NHEJ 계 돌연변이 발생에만 사용되었는데, 이는 작은 삽입/삭제 이벤트, 인델을 생성하여 유전자 서열의 프레임 시퀀스로 이어지며, 조기 정지 코돈과 모든 기능성도메인4가결여된 단백질을 초래하였다. 곤충은 또한 HDR을 통해 dsDNA 브레이크 수리를 위한 세포 기계를 가지고, 그 때 더 복잡한 게놈 편집 전략을 디자인하기 위하여 경로를 변경할 수 있었습니다. HDR 기반 CRISPR/Cas9 게놈 편집은 여전히 모래 파리에 사용하기 위해 설정해야 하며, 다른 구조물 들 중에서도 발현 및 조건부 발현 돌연변이의 리포터개발을 허용해야 합니다.
이 미세 주입 프로토콜의 개발은 이제 CRISPR / Cas9 HDR, 트랜스포슨 트랜스 게인, UAS / Gal4와 같은 이진 발현 시스템 및 phiC31 또는 Cre / lox에 의한 사이트 별 재조합과 같은 다른 게놈 수정 방법을 사용하는 문을엽니다. 이러한 다른 방법의 개발은 더 복잡한 게놈 조작을 허용함으로써 모래 플라이 유전자 발현 수정을위한 도구 상자를 더욱 확장 할 것이다. 그러나, 이러한 다른 방법이 채택되기 전에, 모래 파리에 삽입된 유전자의 발현을 유도하기 위해 레귤레이터 요소를 식별하고 격리하는 작업뿐만 아니라, 트랜스포지아제 및 재조합의 발현을 구동하는 프로모터와 같은 이러한 방법의 삽입 및 기타 구성 요소의 마커가 필요할 것이다.
마지막으로, 비모델 곤충의 게놈 편집은 CRISPR/Cas9 발견 및 적응15,16의혁명 덕분에 이제 가능성이 되었다. 곤충에서, 대부분의 게놈 편집 기술, 새로 개발 된 ReMOT 기술의 주목할만한 예외에, 배아 미세 주입을 필요로, 중요하고 기술적으로 까다로운 단계. 우리는 이 간행물이 모래 파리에 적응한 유전자 발현 수정 기술의 범위를 확장하는 것을 돕고, 그들의 생물학에 새로운 발견으로 이끌어 내고, Leishmania 기생충에 벡터 능력으로 이끌어 낼 수 있기를 바랍니다.
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Disclosures
없음
Acknowledgments
저자들은 원고의 비판적 독서에 대한 바네사 멜데너 - 해럴에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
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