Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi della mutagenesi mirata CRISPR/Cas9 nelle mosche della sabbia: raccolta, iniezione, allevamento e identificazione degli insetti, nonché selezione di mutazioni di interesse.
Abstract
Le mosche di sabbia sono i vettori naturali per le specie di Leishmania, i parassiti protozoici che producono un ampio spettro di sintomi che vanno dalle lesioni cutanee alla patologia viscerale. Decifrare la natura delle interazioni vettore/parassita è di primaria importanza per una migliore comprensione della trasmissione della Leishmania ai loro ospiti. Tra i parametri che controllano la competenza del vettore della mosca della sabbia (cioè la loro capacità di trasportare e trasmettere agenti patogeni), i parametri intrinseci a questi insetti hanno dimostrato di svolgere un ruolo chiave. La risposta immunitaria degli insetti, ad esempio, influisce sulla competenza vettoriale della mosca della sabbia in Leishmania. Lo studio di tali parametri è stato limitato dalla mancanza di metodi di modifica dell'espressione genica adattati per l'uso in questi organismi non modello. La downregolazione genica da parte di un piccolo RNA interferente (siRNA) è possibile, ma oltre ad essere tecnicamente impegnativa, il silenziamento porta solo a una perdita parziale della funzione, che non può essere trasmessa di generazione in generazione. La mutagenesi mirata della tecnologia CRISPR/Cas9 è stata recentemente adattata alla mosca di sabbia Phlebotomus papatasi. Questa tecnica porta alla generazione di mutazioni trasmissibili in un luogo appositamente scelto, permettendo di studiare i geni di interesse. Il sistema CRISPR/Cas9 si basa sull'induzione di rotture mirate di DNA a doppio filamento, successivamente riparate da NHEJ (Non-Homologous End Joining) o da Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consiste in una semplice chiusura dell'interruzione e spesso porta a piccoli eventi di inserimento / eliminazione. Al contrario, l'HDR utilizza la presenza di una molecola di DNA donatore che condivide l'omologia con il DNA bersaglio come modello per la riparazione. Qui, presentiamo un metodo di microiniezione embrionale mosca di sabbia per la mutagenesi mirata da PARTE di CRISPR / Cas9 utilizzando NHEJ, che è l'unica tecnica di modifica del genoma adattata ai vettori di mosca della sabbia fino ad oggi.
Introduction
Le malattie trasmesse da vettori sono una delle principali minacce per la salute pubblica in costante evoluzione. Centinaia di specie vettoriali diffuse in famiglie filogeniche molto distinte (ad esempio, zanzare, zecche, pulci) sono responsabili della trasmissione di un numero enorme di agenti patogeni microbici, causando più di 700.000 morti umane all'anno, secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità. Tra gli insetti vettoriali, le mosche di sabbia flebotomina (Diptera, Psychodidae) costituiscono un vasto gruppo, con 80 specie vettoriali comprovate che mostrano tratti fenotipici distinti e capacità vettoriali presenti in diverse regioni geografiche. Sono vettori per i parassiti protozoi del genere Leishmania, causando circa 1,3 milioni di nuovi casi di leishmanie e tra i 20.000 e i 30.000 morti all'anno. Gli esiti clinici delle leishmanie sono diversi, con sintomi che vanno dalle lesioni cutanee autolimitanti alla diffusione viscerale che è fatale in assenza di trattamento.
Le mosche di sabbia sono insetti strettamente terrestri. Il loro ciclo di vita, relativamente lungo rispetto ad altri Ditteri, dura fino a tre mesi, a seconda di diversi parametri come temperatura, umidità e nutrizione. Consiste in uno stadio embrionale (da 6 a 11 giorni), quattro stadi larvali (della durata totale di 23-25 giorni) e uno stadio pupale (da 9 a 10 giorni) seguito da metamorfosi e poi età adulta. Le mosche di sabbia richiedono un ambiente umido e caldo per l'allevamento. Sia i maschi che le femmine si nutrono di zuccheri, ottenuti in natura dai nettari di fiori. Solo le femmine sono emoderivatrici, in quanto richiedono proteine ottenute dalla farina di sangue per la produzione di uova1.
Un obiettivo importante della ricerca è identificare la natura delle interazioni vettore / parassita che portano allo sviluppo di infezioni trasmissibili. Come per altri insetti vettoriali, i parametri intrinseci alle mosche di sabbia hanno dimostrato di influire sulla loro competenza vettoriale, che è definita come la loro capacità di trasportare e trasmettere agenti patogeni ai loro ospiti. Ad esempio, l'espressione delle galectine da parte delle cellule di phlebotomus papatasi sand fly midgut, agendo come recettori che riconoscono i componenti della superficie parassitaria, può influenzare direttamente la loro competenza vettoriale per la Leishmania major2,3. La via di risposta immunitaria degli insetti, ImmunoDeficiency (IMD), è anche cruciale per la competenza del vettore di mosca della mosca della sabbia Phlebotomus papatasi per Leishmania major4. Un ruolo critico per le vie di risposta immunitaria degli insetti vettoriali nel controllo della loro trasmissione di agenti patogeni infettivi è stato segnalato in modo simile nelle zanzare Aedes aegypti 5,6,7, nella mosca tse-tse Glossina morsitans8e nelle zanzare Gambiae Anopheles 9,10.
Gli studi sulle interazioni mosca di sabbia /Leishmania sono stati limitati dalla mancanza di metodi di modifica dell'espressione genica adattati per l'uso in questi insetti. Solo la downregolazione genica da parte di piccoli RNA interferenti (siRNA) erastata eseguita 11,12,13,14 fino a poco tempo fa. La tecnica, limitata dalla mortalità associata alla microiniezione delle femmine adulte, porta solo a una parziale perdita di funzione, che non può essere trasmessa di generazione in generazione.
La tecnologia CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato la ricerca genomica funzionale in organismi non modello come le mosche della sabbia. Modificato dal sistema immunitario adattivo nei procarioti per la difesa contro i batteriofagi15,16, il sistema CRISPR Cas9 è stato rapidamente adattato come strumento di modifica del genoma per organismi eucarioti superiori, compresi gli insetti. Il principio dell'editing mirato del genoma CRISPR/Cas9 si basa sulla complementarietà di un singolo RNA guida (sgRNA) a uno specifico locus genomico. La nucleasi Cas9 si lega allo sgRNA e crea una rottura del DNA a doppio filamento (dsDNA) nel DNA genomico in cui lo sgRNA si associa alla sua sequenza complementare. Il complesso Cas9-sgRNA è guidato alla sequenza bersaglio da 17 a 20 basi complementari nello sgRNA al locus scelto, la rottura dsDNA può quindi essere riparata da due percorsi indipendenti: giunzione finale non omologa (NHEJ) o riparazione diretta dall'omologia (HDR)17. La riparazione NHEJ comporta una semplice chiusura dell'interruzione, ma spesso porta a piccoli eventi di inserimento / eliminazione. La riparazione del DNA attraverso l'HDR utilizza una molecola di DNA donatore che condivide l'omologia con il DNA bersaglio come modello per la riparazione. Gli insetti possiedono entrambi i macchinari.
La tecnologia CRISPR/Cas9 può generare mutazioni in un luogo scelto, attraverso la via di riparazione NHEJ; o per strategie di editing del genoma più complesse, come knock-in o giornalisti di espressioni, attraverso il percorso HDR con un modello di donatore appropriato. Nelle mosche di sabbia, gli alleli mutanti nulli del fattore di risposta immunitaria Relish sono stati generati attraverso CRISPR mediato da NHEJ in Phlebotomus papatasi4. Gli embrioni di mosca della sabbia sono stati iniettati anche in un altro studio con un mix CRISPR / Cas9 che prende di mira il gene che codifica giallo. Tuttavia, nessun adulto portatore della mutazione è statoprodotto 18. Descriviamo qui un metodo dettagliato di mutagenesi mirata della mosca della sabbia da CRISPR/Cas9 mediata da NHEJ, con particolare attenzione alla microiniezione embrionale, una fase critica del protocollo.
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Protocol
L'uso dei topi come fonte di sangue per l'alimentazione delle chiazza di sabbia è stato effettuato in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti nazionali di salute (NIH). Il protocollo è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del NIAID, NIH (numero di protocollo LPD 68E). Gli invertebrati non sono coperti dalle linee guida NIH.
1. Preparazione dell'ago(figura 1)
- Tirare aghi e smussare come descritto in Meuti e Harrell19. In breve, tirare gli aghi su un estrattore di micropipette di vetro a doppio stadio, utilizzando capillari di vetro borosilicato.
- Affilare gli aghi smussando bagnati sul smussatore di micropipette, utilizzando una pietra extra fine.
2. Raccolta e micromanipolazione degli embrioni(figura 2)
- Cinque giorni prima del giorno dell'iniezione, il sangue alimenta le femmine di mosca e la mosca come viene eseguita regolarmente per il mantenimento della colonia. Per i dettagli sulle procedure di allevamento delle colonie di mosche di sabbia e sul materiale richiesto, fare riferimento a Avvocato etal.
- Un giorno dopo l'alimentazione del sangue, cattura le femmine nutrite con sangue da gruppi di 100-150 in vasi di gesso con una porta laterale. Mantieni le femmine nutrendole con una soluzione di zucchero (30% di saccarosio - abbastanza volume per immergere un piccolo batuffolo di cotone) che è usuale per il mantenimento della colonia.
- Al giorno 2-3 dopo l'alimentazione del sangue, NON inumidire i vasi di gesso. Mantenere le femmine su un substrato asciutto impedirà la deposizione prematura delle uova, poiché le femmine preferiscono deporre le uova in un ambiente umido.
- Il giorno 5 dopo l'alimentazione del sangue, eseguire la raccolta dell'embrione, la micromanipolazione e la microiniezione. Introdurre una carta filtrante umida nella camera di deposizione delle uova. Gli embrioni appena deposti non hanno un corone completamente sviluppato e appaiono bianchi. Utilizzare carta da filtro nera durante la procedura per facilitare la visualizzazione degli embrioni bianchi.
- Trasferire un piccolo gruppo di femmine dal vaso di gesso alla camera di deposizione delle uova attraverso le porte laterali utilizzando un aspiratore di bocca. La presenza di un substrato umido (la carta filtrante) induce le femmine a ovoposit.
- Dopo 30-60 minuti, recuperare con cura la carta filtrante con embrioni appena posati dalla camera. Conservare la carta filtrante e gli embrioni in una piastra di Petri per un massimo di 3 ore. Durante questo periodo, valutare regolarmente il livello di umidità della carta da filtro per assicurarsi che rimanga umida. Durante questo periodo, ripetere i passaggi da 2.4 a 2.6 con nuovi gruppi di femmine e raccogliere il maggior numero possibile di embrioni.
- Preparare le diapositive al microscopio per l'iniezione: raccogliere manualmente le uova una per una con un pennello molto fine e trasferirle con cura su un altro pezzo di carta filtrante nera umida posta su uno scivolo al microscopio sormontato da un copripazzo di vetro.
- Aggiungere acqua alla carta filtrante, abbastanza da mantenere gli embrioni umidi ma non facendoli galleggiare lontano dal coverslip o essere succhiati sotto il coverslip. Allinea gli embrioni contro il copriscivolo. Il coverslip funge da backstop impedendo alle uova di rotolare via durante l'iniezione.
3. Iniezioni di embrioni (Figura 3)
- Inizia le iniezioni da 2,5 a 3 ore dopo l'inizio della raccolta delle uova. Eseguire iniezioni a temperatura ambiente e umidità ambiente di laboratorio.
- Assicurarsi che gli embrioni allineati abbiano abbastanza acqua in modo che siano mantenuti umidi.
NOTA: È fondamentale che gli embrioni siano mantenuti umidi durante le iniezioni. Se non sono umidi durante il processo di iniezione, le iniezioni diventano difficili perché l'ago ha difficoltà a perforare l'embrione. La corretta quantità di acqua è il punto in cui gli embrioni hanno un menisco d'acqua intorno a loro, ma il coverslip non galleggia sopra l'acqua causando la spinta degli embrioni sotto il coverslip. È fondamentale monitorare la quantità di acqua intorno agli embrioni durante le iniezioni. Aggiungere acqua se necessario per mantenere gli embrioni umidi. - Aggiungere l'acqua con cura bagnando un pennello con acqua e trasferendo l'acqua sul retro della carta filtrante. L'aggiunta di acqua in questo modo consente di aggiungere acqua in modo lento e controllato in modo che venga aggiunto quanto basta per mantenere gli embrioni umidi. Troppa acqua può far galleggiare gli embrioni fuori allineamento, rendendo difficile iniettare gli embrioni.
- Miscela di iniezione di carico posteriore nell'ago di microiniezione. Aggiungere circa 0,5 a 1 μL di miscela di iniezione nell'ago utilizzando un riempitivo ad ago borosilicato disegnato a mano, è anche possibile utilizzare punte di pipetta di caricamento in gel. La miscela di iniezione è composta da uno o più RNA guida (80 ng/μL ciascuno) progettati per colpire uno specifico locus mescolato con la proteina Cas9 ricombinante commerciale (300 ng/μL).
- A partire dalla pressione di iniezione a 30 psi, premere il grilletto di iniezione per espellere l'aria dalla punta dell'ago. Ciò costringerà la miscela di iniezione alla punta dell'ago permettendo al mix di iniezione di fluire. A questo punto, aumentare lentamente la pressione di tenuta / costante fino a quando il materiale di iniezione inizia a fluire, quindi di nuovo fuori dalla tenuta / pressione costante in modo che sia appena sotto il punto della miscela di iniezione che scorre dall'ago. L'impostazione recintata dovrebbe fornire abbastanza materiale di iniezione in modo che si possa vedere una piccola quantità di materiale per entrare nell'embrione.
NOTA: L'iniezione di embrioni di mosca di sabbia sotto olio di alocarbonio simile ad altri protocolli utilizzati per drosofilia e zanzare è stata inizialmente testata, tuttavia la percentuale di sopravvivenza per queste iniezioni era molto bassa. La sopravvivenza è stata migliorata passando alle iniezioni su carta filtrante umida come descritto sopra. - Inserire l'ago nel lato dell'embrione. Utilizzare il copripasta dietro l'embrione come backstop che aiierà l'ago a perforare l'embrione. Fornire una piccola quantità di miscela di iniezione nell'embrione prima di rimuovere delicatamente l'ago.
- Immediatamente dopo la rimozione dell'ago, premere l'iniettore per rimuovere qualsiasi materiale riempito di nuovo dalla punta dell'ago. Questo aiuterà a prevenire l'intasamento dell'ago.
- Procedi verso l'embrione successivo. Tra ogni iniezione, assicurarsi che la carta filtrante sia umida e che l'ago non sia intasato.
- Una volta che tutti gli embrioni sono stati iniettati, contare il numero di embrioni iniettati per mantenere un conteggio in esecuzione.
- Rimuovere il coverslip aggiungendo acqua alla carta filtrante in modo che il coverslip galleggi. A questo punto, utilizzare una sonda (bastoncino applicatore di legno con perno di insetto incollato alla punta) per tenere la carta filtrante in posizione mentre un dito viene utilizzato per allontanare il coperchio dagli embrioni iniettati.
- Togliere l'acqua in eccesso dalla carta filtrante una volta rimossa la copertina.
4. Allevamento post-iniezione (G0)(figura 4)
- Trasferire la carta filtrante con gli embrioni sopra diversi strati di carta filtrante umida posta in una piastra di Petri per mantenere l'umidità. Tieni qui gli embrioni durante il tempo necessario per iniettare altri embrioni. Gli embrioni possono essere trattenuti per un massimo di 3 ore come questo. Dopo l'iniezione diventano lentamente marroni.
- Una volta che tutti gli embrioni sono stati iniettati, trasferirli manualmente su vasi di gesso di piccole dimensioni precedentemente inumiditi. Non mettere troppi embrioni in ogni vaso e mantenere la distanza tra di loro, per evitare possibili contaminazioni fungine tra gli individui. Coprire i vasi con uno schermo e conservarli come sarebbe in genere fatto per le uova di colonia di mosca di sabbia, mantenute in incubatrici con umidità del 70% e 26 °C, durante il loro intero sviluppo.
- Il primo giorno dopo l'iniezione, rimuovere tutti gli embrioni danneggiati e morti con un pennello. Aggiungere 100 μL di acido propionico allo 0,5%, goccia a goccia, sui vasi di gesso contenenti gli embrioni iniettati per limitare la contaminazione fungina. Il rilascio di citoplasma da embrioni danneggiati durante il processo di iniezione è particolarmente favorevole alla crescita fungina.
- Controllare i vasi di gesso ogni giorno e rimuovere eventuali embrioni cattivi o morti. Se è presente il fungo, rimuovere tutti gli embrioni infetti e aggiungere alcune gocce di acido propionico 0,5%.
- Le larve si schiudono tra il giorno 8 e il 12 dopo l'iniezione. Due volte al giorno, trasferire le larve appena emerse su nuovi vasi di gesso, in gruppi di massimo 5-10. Aggiungi una piccola quantità di cibo e controlla il cibo 2-3 volte a settimana.
- Monitora attentamente la quantità di cibo larvale, poiché aumenta notevolmente il rischio di contaminazione fungina. Le larve di mosca della sabbia sopravvivono meglio in gruppi, tuttavia possono essere cannibali se non c'è abbastanza cibo.
- Quando le larve si impupano, separale per sesso per mantenere le femmine come vergini. Se ci sono molti sopravvissuti, scarta i maschi e mantieni solo le femmine.
NOTA: Sia i maschi che le femmine possono trasportare e trasmettere mutazioni. Tuttavia, poiché le femmine devono essere tenute vergini prima di essere incrociate, è più facile usare solo le femmine iniettate G0 per evitare di dover separare gli insetti wt dal sesso. I maschi G0 possono essere tenuti come riserva se il numero di sopravvissuti adulti è basso e in questo caso saranno accoppiati con femmine vergini wt ordinate.
5. Selezione e screening degli alleli mutanti(figura 5)
- Attraversa di massa le femmine G0 con i maschi wt in una gabbia. Nutrirli del tutto, come sarebbe stato fatto per il normale mantenimento della colonia.
- Un giorno dopo l'alimentazione del sangue, trasferire ogni femmina G0 con 2-3 wt maschi in singoli tubi di gesso usando un aspiratore bocca. Nutrire le mosche con lo zucchero su un piccolo batuffolo di cotone cambiato ogni giorno e utilizzare una siringa d'acqua per garantire che l'umidità dell'intonaco sia adatta per la deposizione delle uova.
- Dopo che le femmine del G0 hanno deposto le uova (corrispondenti al G1),raccolgono i loro corpi in tubi Eppendorf individuali annotati per il genotipizzazione successivo. Mantenere gli embrioni come di solito fatto per le colonie wt.
- Estrarre il DNA dalle femmine G0 con il metodo di scelta.
- Schermare il DNA per la presenza di mutazioni, ad esempio progettando un test PCR utilizzando primer che circondano la regione dei tagli CRISPR previsti.
- Conservare solo gli embrioni G1 deposti dalle femmine G0 mostrando prove di trasformazione. Quando questi embrioni G1 si sviluppano in pupe, separali per sesso e mantieni solo le femmine. Attraversare le femmine G1 dalla stessa femmina G0 ai maschi wt, nutrirle di sangue, quindi trasferirle in piccoli gruppi di 2-3 femmine e 4-5 maschi in contenitori di piccole dimensioni.
NOTA: Tutti gli individui G1 hanno la possibilità di portare una mutazione unica, quindi se il numero di individui sopravvissuti non ètroppo alto, allora è meglio attraversare le femmine G 1 individualmente con i maschi wt. Il caso di diverse femmine che portano una mutazione diversa presente in uno stesso tubo è raro ma può verificarsi. Se tale caso viene osservato dopo il genotipizzazione, le femmine di progenie G2 devono quindi essere accoppiate individualmente ai maschi wt. Questo schema di accoppiamento evita la possibilità di mutazioni multiple nella progenie. - Dopo la deposizione delle uova, raccogli i corpi femminili del G1 e cerca le mutazioni. Conservare solo i tubi in cui almeno una femmina ha mostrato prove di mutazione.
- Per le generazioni successive fare singole coppie in-crosses. Dopo la deposizione delle uova, scherma i genitori per la presenza di mutazione. Ripetere ad ogni generazione fino a quando entrambi i genitori sono omozigoti per la stessa mutazione. Una volta identificati, saranno i fondatori di uno stock mutante omozigote.
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Representative Results
Il protocollo di microiniezione CRISPR/Cas9 qui descritto per generare mutanti di mosca di sabbia è stato stabilito in una precedente pubblicazione4. Questo approccio produsse una mutagenesi altamente efficiente, poiché 11 individui su 540 sopravvissero alla procedura, di cui 9 mutanti. Quando si progettano guide per la mutazione CRISPR/Cas9, un primo passo critico consiste nel sequenziare la regione intorno all'area da prendere di mira. Il modello per il sequenziamento dovrebbe essere dal ceppo che verrà utilizzato come fonte di embrioni per l'iniezione. È rischioso fare affidamento solo su sequenze di genoma pubblicate per progettare guide. Non è insolito avere differenze tra il genoma pubblicato e le sequenze di progettazione pre-guida. In alcuni casi, le guide progettate dalla sequenza genomica pubblicata non sono presenti quando la regione intorno al gene bersaglio viene sequenziata (Harrell, osservazione personale). Inoltre, la sequenza può includere polimorfismi a nucleotide singolo (SNP) che potrebbero essere scambiati come modifiche CRISPR reali durante il genotipizzazione. Pertanto, la conferma della sequenza per l'area di destinazione è fondamentale per il successo del resto del protocollo.
Il successo della modificazione genetica degli insetti mediante microiniezione dipende principalmente da due aspetti critici: la consegna di materiali (proteine, plasmidi o mRNA) al momento opportuno dello sviluppo con il meno danno possibile agli embrioni; e allevamento di insetti robusti e sani che sopravviveranno alla procedura e produrranno prole. La fase iniziale di questa procedura, descritta nella figura 2, inizia con l'alimentazione del sangue delle femmine dalla colonia wt e procede alla raccolta e alla microiniezione degli embrioni cinque giorni dopo. La seconda fase consiste nell'allevare gli embrioni iniettati fino all'età adulta, fare le croci appropriate e identificare e isolare le mutazioni di interesse.
Gli embrioni per iniezione vengono raccolti per 30-60 minuti in modo da poter determinare l'età relativa in ore dopo l'ovideposizione. Gli embrioni possono quindi svilupparsi per 3 ore prima dell'inizio delle iniezioni. Questa finestra di tempo di sviluppo degli insetti consente agli embrioni di sopravvivere alle iniezioni. Dopo questo periodo di invecchiamento, gli embrioni vengono raccolti su uno scivolo di iniezione preparato e gli embrioni vengono arrotolati in posizione contro un bordo di coverlip usando un pennello fine. La configurazione finale è illustrata nella figura 3A. È importante bagnare abbastanza la carta filtrante in modo che un menisco si formi sul bordo della copertina dove si trovano gli embrioni. Troppa acqua e gli embrioni saranno allontanati dal bordo del coverslip. Troppo poco farà sì che gli embrioni siano disegnati sotto il coperchio. Gli embrioni devono essere tenuti umidi, altrimenti le membrane embrionale diventano difficili da iniettare. Il bordo del copriscivolo funge da back stop, permettendo all'ago di penetrare negli embrioni quando premuto contro il bordo. È la combinazione di un ago affilato e un backstop che consente all'ago di penetrare senza intoppi.
Come per i protocolli di microiniezione di maggior successo, è importante un buon ago di microiniezione adatto agli embrioni iniettati. Aghi buoni e affilati sono definiti come aghi che penetrano facilmente nell'embrione senza consentire al materiale di sfuggire alla post-iniezione. Una buona penetrazione è evidente quando l'ago scivola nell'embrione, causando poca o nessuna indentazione della membrana embrionale durante la penetrazione e nessuna perdita di materiale dall'embrione dopo il ritiro dell'ago. Buoni aghi affilati vengono prodotti utilizzando impostazioni di tirante dell'ago che producono un ago che arriva a un punto sottile (Figura 1A). L'ago tirato non dovrebbe avere una conio troppo lunga. Altrimenti, il lume dell'ago diventa molto stretto per una parte importante del cono (Figura 1B), e diventa difficile ottenere la pressione di iniezione abbastanza alta da forzare il materiale attraverso l'ago. In questo protocollo sono stati utilizzati aghi smussati. Il processo per tirare e smussare gli aghi è descritto in Meuti e Harrell19. Nel caso di embrioni di mosca di sabbia che si sviluppano per un lungo periodo di tempo, è particolarmente fondamentale avere aghi affilati che riducono al minimo i danni all'embrione, impedendo così al materiale di fuoriuscire nel sito di iniezione. Quando l'embrioplasma fuorieleva da un embrione dopo l'iniezione, questo materiale è un mezzo ricco per la crescita di muffe e funghi. Negli embrioni che si sviluppano per un periodo di tempo più breve l'embrione può svilupparsi e schiudersi prima che lo stampo diventi un problema. Tutti gli embrioni che perdono visibilmente embrioplasma dopo l'iniezione devono essere rimossi.
Durante le iniezioni, è importante aggiungere acqua se necessario bagnando un pennello fine e toccandolo sulla carta filtrante, ripetendosi se necessario fino a quando il menisco d'acqua è solo alla base degli embrioni. L'attenzione all'umidità relativa nel giorno dell'iniezione deve essere notata. Nei giorni di bassa umidità, sarà necessario aggiungere più acqua. Una volta completate le iniezioni, viene aggiunta un po 'd'acqua in più alla carta filtrante in modo che il coverslip galleggi leggermente, rendendolo più facile da rimuovere. Una volta rimosso il coverslip, la carta filtrante con embrioni iniettati può essere macchiata, in modo che la carta filtrante sia appena umida. Gli embrioni possono quindi essere trasferiti in un vaso di gesso umido per la schiusa usando un pennello fine. In questa fase, gli embrioni sono molto fragili, quindi il processo deve essere intrapreso con molta attenzione. È anche importante evitare che gli embrioni si tocchino l'un l'altro per essere in grado di rimuovere embrioni ammuffi e limitare la diffusione della contaminazione fungina.
Dopo l'iniezione, gli embrioniiniettati G 0 vengono conservati su vasi di gesso secondo le normali procedure di allevamento. Fino a quando non si schiudono, i vasi di embrioni iniettati devono essere controllati una volta al giorno per rimuovere embrioni malsani. La figura 4A presenta la tempistica prevista dell'allevamento individuale G0 dal giorno della deposizione e dell'iniezione delle uova all'età adulta. La figura 4B mostra esempi di embrioni G0 che sono sani e dovrebbero essere conservati; o danneggiati, contaminati da funghi, essiccati o deformati e devono essere scartati. Gli individuiiniettati g 0 sono presumibilmente mosaici per alleli mutanti. Dovrebbe essere progettato un metodo per identificare potenziali alleli mutanti, come un saggio PCR della regione che circonda i siti di taglio previsti. La figura 4C presenta un esempio di saggio PCR che mostra un individuo G 0 amosaico, che espone un prodotto PCR aggiuntivo al prodotto wt previsto, che rappresenta un allele mutante.
Una volta che gli adulti emergono, le femmine G0 che si sviluppano da embrioni iniettati G0 vengono incrociate con maschi wt, autorizzate a deporre le uova e vengono genotipate in seguito. Vengono conservati solo i tubi contenenti una mosca G0 che dimostri la mutazione del metodo di genotipizzazione di scelta. Le mosche delle generazioni successive (femmine G1) sono incrociate con maschi wt o individualmente tra fratelli (da G2). Queste croci sono autorizzate a deporre le uova e poi genotipate con il metodo di scelta. L'ultimo passo viene ripetuto fino a quando non si ottengono maschi e femmine mutanti omozigoti, stabilendo una linea mutante omozigota. Una rappresentazione schematica della successione appropriata di croci per stabilire una linea mutante è fornita nella figura 5A. La figura 5B mostra un esempio di PCR genotipico che consente l'identificazione di una croce di fratello mutante omozigota.
Figura 1: Aghi a microiniezione. A. Buon ago. B. Ago con cono estremo non buono per le iniezioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica della raccolta e della microgestione degli embrioni (questa cifra era stata adattata apartire da 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Configurazione della microiniezione. A. Rappresentazione schematica dell'insieme della microiniezione. B. Primo piano dell'embrione allineato per la microiniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Allevamento e identificazione di individui adulti del mosaico G0. A. Calendario previsto dalla microiniezione dell'embrione all'etàadulta G 0. B. Esempi di embrioni buoni e di cattivo aspetto dopo l'iniezione. C. Genotipizzazione PCR di un individuo mosaico G0 trasformato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Identificazione e isolamento delle mutazioni di interesse. A. Rappresentazione schematica della strategia sperimentale per isolare gli alleli mutanti e stabilire scorte mutanti omozigoti (figura da 4). Il colore rappresenta la presenza di cellule che trasportano alleli mutanti, allo stato eterozigote (rosa) o omozigoto (rosso). B. Esempio di strategia di screening PCR per genotipizzazione di singole croci di sibbling di mosche di sabbia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Presentiamo qui un metodo di microiniezione embrionale recentemente sviluppato per la mutagenesi mirata di CRISPR/Cas9 in mosche di sabbia Phlebotomus papatasi. La microiniezione embrionale per la modificazione genetica degli insetti è stata sviluppata in Drosophila a metà degli anni'80 21 ed è ora regolarmente utilizzata in un'ampia varietà di insetti. Altri metodi per la consegna di materiali di modificazione genetica sono stati sviluppati per l'uso negli insetti, come ReMOT20,21,22,23 ed elettroporazione23. Tuttavia, la microiniezione embrionale è attualmente il metodo più versatile ed efficiente per la consegna di questi materiali. ReMOT è estremamente promettente come metodo di consegna e dovrebbe essere esplorato per l'uso nelle mosche di sabbia, a causa della relativa facilità delle iniezioni adulte rispetto alle microiniezioni embrionale. Tuttavia, finora ReMot non è stato utilizzato con successo per CRISPR / Cas9 HDR o transgenesi transposon. Sebbene la tecnica per le microiniezioni embrionale negli insetti sia fondamentalmente la stessa inizialmente sviluppata, per ogni nuova specie possono essere necessari perfezionamenti delle tecniche. Queste differenze di specie includono il modello e la durata dello sviluppo dell'embrione, la struttura dell'embrione e l'ambiente in cui l'embrione si sviluppa normalmente. Gli embrioni di mosca della sabbia sono particolarmente piccoli (0,3-0,5 mm di lunghezza e 0,1- 0,15 mm di larghezza, che rappresentano circa 1/3 delle dimensioni dell'uovo di Drosophila 1). Questa dimensione ridotta aumenta la difficoltà di maneggiare le uova senza danneggiarle. Il livello di umidità in ogni fase del protocollo deve essere monitorato con molta attenzione, poiché gli embrioni di mosca della sabbia sono particolarmente sensibili all'essiccazione. Tuttavia, non sono acquatici e moriranno se completamente immersi nell'acqua per un lungo periodo. La microiniezione dell'embrione Drosophila richiede l'iniezione all'estremità posteriore dell'embrione. A causa della forma quasi simmetrica degli embrioni di mosca di sabbia, determinare la polarità embrionale è difficile. Infine, mentre lo sviluppo dell'embrione della mosca della sabbia procede in modo simile alla Drosophila, lo fa a un ritmo molto più lento. L'embriogenesi da sola dura tra 6 e 11 giorni, a seconda delle specie di mosca della sabbia, mentre le uova di Drosophila si schiudono solo un giorno dopo la deposizione delle uova. La cellularizzazione dell'uovo di Drosophila avviene circa 2 ore dopo l'ovideposizione, mentre gli embrioni di mosca della sabbia raggiungono questa fase a circa 9 ore dopo l'ovideposizione. Data questa differenza nei tempi di sviluppo, le iniezioni sono mirate al centro dell'embrione di mosca sabbia in via di sviluppo supponendo che i nuclei in via di sviluppo nell'embrione si trovino vicino al centro dell'embrione in via di sviluppo in questa fase iniziale dello sviluppo, evitando così la necessità di distinguere la polarità embrionale.
CRISPR/Cas9 crea rotture dsDNA in un luogo genomico scelto. Queste rotture a doppio filamento vengono riparate nella cella da NHEJ o HDR. Il metodo che presentiamo qui è stato precedentemente utilizzato solo per la mutagenesi basata su NHEJ, che ha generato piccoli eventi di inserimento / cancellazione, indeli, portando a un frameshift nelle sequenze geniche, con conseguente arresto prematuro dei codoni e una proteina priva di tutti i domini funzionali4. Gli insetti possiedono anche i macchinari cellulari per la riparazione della dsDNA attraverso l'HDR, che potrebbe quindi essere reindirizzato per progettare strategie di editing del genoma più complesse. L'editing del genoma CRISPR/Cas9 basato su HDR deve ancora essere impostato per l'uso nelle mosche della sabbia e dovrebbe consentire lo sviluppo di giornalisti di mutanti di espressione e espressione condizionale, tra le altre costruzioni.
Lo sviluppo di questo protocollo di microiniezione apre ora la porta all'utilizzo di altri metodi di modifica del genoma, come CRISPR/Cas9 HDR, transgenesi transposon, sistemi di espressione binaria come UAS /Gal4 e ricombinazione site-specific di phiC31 o Cre/lox. Lo sviluppo di questi altri metodi amplierà ulteriormente la cassetta degli attrezzi per la modifica dell'espressione genica della mosca della sabbia consentendo una manipolazione genomica più complessa. Tuttavia, prima che questi altri metodi possano essere utilizzati, saranno necessari lavori di identificazione e isolamento degli elementi regolatori per guidare l'espressione dei geni inseriti nelle mosche di sabbia, così come marcatori di inserimento e altri componenti di questi metodi, come i promotori per guidare l'espressione di trasposasi e ricombinasi.
Infine, l'editing del genoma negli insetti non modello è ormai diventato una possibilità, grazie in particolare alla rivoluzione della scoperta e dell'adattamento CRISPR/Cas915,16. Negli insetti, la maggior parte delle tecniche di editing del genoma, con la notevole eccezione della nuova tecnica ReMOT, richiedono la microiniezione embrionale, un passo cruciale e tecnicamente impegnativo. Speriamo che questa pubblicazione contribuisca ad ampliare la gamma di tecniche di modifica dell'espressione genica adattate alle mosche della sabbia e porti a nuove scoperte sulla loro biologia e sulla competenza vettoriale ai parassiti della Leishmania.
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Disclosures
nessuno
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Vanessa Meldener-Harrell per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
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