Summary
Denne protokol beskriver trinene i CRISPR/Cas9 målrettet mutagenese i sandfluer: embryonindsamling, injektion, insektopdræt og identifikation samt udvælgelse af mutationer af interesse.
Abstract
Sandfluer er de naturlige vektorer for Leishmania-arter, protozoiske parasitter, der producerer et bredt spektrum af symptomer lige fra kutane læsioner til visceral patologi. Dechifrere karakteren af vektor / parasit interaktioner er af største betydning for en bedre forståelse af Leishmania transmission til deres værter. Blandt de parametre, der styrer sandfluevektorkompetencen (dvs. deres evne til at bære og overføre patogener), viste parametre, der er iboende for disse insekter, at spille en central rolle. Insekt immunrespons, for eksempel, påvirker sand flyve vektor kompetence til Leishmania. Undersøgelsen af sådanne parametre er blevet begrænset af manglen på metoder til modifikation af genekspression, der er tilpasset til brug i disse ikke-modelorganismer. Genregulering ved små forstyrrende RNA (siRNA) er mulig, men ud over at være teknisk udfordrende fører lyddæmpningen kun til et delvist tab af funktion, som ikke kan overføres fra generation til generation. Crispr/Cas9-teknologiens målrettede mutagenese blev for nylig tilpasset Phlebotomus papatasi-sandfluen. Denne teknik fører til gener af overførbare mutationer i et specifikt valgt locus, der gør det muligt at studere de gener af interesse. CRISPR/Cas9-systemet er afhængigt af induktion af målrettede DOBBELTSTRENGEDE DNA-brud, som senere repareres af enten Non-Homologous End Joining (NHEJ) eller Af Homology Driven Repair (HDR). NHEJ består af en simpel lukning af pausen og fører ofte til små indsættelses-/sletningshændelser. I modsætning hertil bruger HDR tilstedeværelsen af et donor-DNA-molekyle, der deler homologi med mål-DNA'et som en skabelon til reparation. Her præsenterer vi en sandflue embryo mikroinjection metode til målrettet mytterigenese af CRISPR/Cas9 ved hjælp af NHEJ, som er den eneste genommodifikationsteknik, der er tilpasset sandfluevektorer til dato.
Introduction
Vektorbårne sygdomme er en stor trussel mod folkesundheden i konstant udvikling. Hundredvis af vektorarter spredt over meget forskellige fylogeniske familier (f.eks. myg, flåter, lopper) er ansvarlige for transmissionen af et stort antal mikrobielle patogener, hvilket resulterer i mere end 700.000 dødsfald om året, ifølge Verdenssundhedsorganisationen. Blandt vektorinsekter udgør phlebotomine sandfluer (Diptera, Psychodidae) en stor gruppe, med 80 dokumenterede vektorarter, der udviser forskellige fænotypiske træk og vektorkapaciteter, der findes i forskellige geografiske regioner. De er vektorer for protozoiske parasitter af slægten Leishmania, der forårsager omkring 1,3 millioner nye tilfælde af Leishmaniases og mellem 20.000 og 30.000 dødsfald om året. Leishmaniases kliniske resultater er forskellige, med symptomer lige fra selvbegrænsende kutane læsioner til visceral spredning, som er dødelig i mangel af behandling.
Sandfluer er strengt jordbaserede insekter. Deres livscyklus, relativt lang sammenlignet med andre Diptera, varer op til tre måneder, afhængigt af forskellige parametre som temperatur, fugtighed og ernæring. Den består af en embryonal fase (6 til 11 dage), fire larvestadier (der varer i alt 23 til 25 dage) og en pupalstadium (9 til 10 dage) efterfulgt af metamorfose og derefter voksenliv. Sandfluer kræver et fugtigt og varmt miljø til opdræt. Både mænd og kvinder fodrer på sukkerarter, opnået i naturen fra blomsternektar. Kun kvinder er blodfodere, da de kræver proteiner opnået fra blodmelet til ægproduktion1.
Et vigtigt fokus for forskningen er at identificere arten af vektor / parasit interaktioner, der fører til udvikling af overførbare infektioner. Som med andre vektorinsekter har parametre, der er iboende for sandfluer, vist sig at påvirke deres vektorkompetence, som defineres som deres evne til at bære og overføre patogener til deres værter. For eksempel kan udtrykket af galectiner af Phlebotomus papatasi sand flyve midgutceller, der fungerer som receptorer, der genkender parasitoverfladekomponenter, direkte påvirke deres vektorkompetence for Leishmania major2,3. Insektet immunrespons vej, Immundefekt (IMD), er også afgørende for Phlebotomus papatasi sand flyve vektor kompetence til Leishmania større4. En kritisk rolle for vektor insekt immunrespons veje i at kontrollere deres overførsel af smitsomme patogener er blevet tilsvarende rapporteret i Aedes aegypti myg5,6,7, i tsetse flyve Glossina morsitans8, og i Anopheles gambiae myg9,10.
Undersøgelser af sandflue/Leishmania-interaktioner er blevet begrænset af manglen på metoder til modifikation af genekspression, der er tilpasset til brug i disse insekter. Kun gen downregulering af små forstyrrende RNA (siRNA) var blevet udført11,12,13,14 indtil for nylig. Teknikken, begrænset af dødeligheden forbundet med mikroinjection af voksne kvinder, fører kun til et delvist tab af funktion, som ikke kan overføres fra generation til generation.
CRISPR/Cas9-teknologien har revolutioneret funktionel genomforskning i ikke-modelorganismer som sandfluer. Crispr Cas9-systemet er modificeret fra det adaptive immunsystem i prokaryoter til forsvar mod bakterioptagere15,16og er hurtigt blevet tilpasset som et genomredigeringsværktøj til overlegne eukaryote organismer, herunder insekter. Princippet om målrettet genomredigering af CRISPR/Cas9 er baseret på komplementariteten mellem et enkelt vejledende RNA (sgRNA) og et specifikt genomisk locus. Cas9-kernen binder sig til sgRNA og skaber et dobbeltstrenget DNA (dsDNA) brud i det genomiske DNA, hvor sgRNA forbinder med sin komplementære sekvens. Cas9-sgRNA-komplekset styres til målsekvensen med 17 til 20 komplementære baser i sgRNA til det valgte locus, dsDNA-pausen kan derefter repareres af to uafhængige veje: nonhomologous end joining (NHEJ) eller homology-directed repair (HDR)17. NHEJ reparation indebærer en simpel lukning af pausen, men ofte fører til små indsættelse / sletning begivenheder. DNA-reparation gennem HDR bruger et donor-DNA-molekyle, der deler homologi med mål-DNA'et som en skabelon til reparation. Insekter besidder begge machineries.
CRISPR/Cas9-teknologi kan generere mutationer i et valgt sted gennem NHEJ-reparationsvejen. eller for mere komplekse genomredigeringsstrategier, såsom knock-ins eller udtryksjournalister, gennem HDR-stien med en passende donorskabelon. I sandfluer blev null mutant alleler af immunresponsfaktoren Relish genereret gennem NHEJ-medieret CRISPR i Phlebotomus papatasi4. Sandfluefostre blev også injiceret i en anden undersøgelse med en CRISPR/Cas9-blanding rettet mod genkodningsgul. Alligevel blev ingen voksne, der bar mutationen, produceret18. Vi beskriver her en detaljeret metode til sandflue målrettet mytterigenese af NHEJ-medieret CRISPR/Cas9, med særligt fokus på embryomikrojection, et kritisk trin i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brugen af mus som en kilde til blod til sandfluefodring blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr fra National Institutes of Health (NIH). Protokollen blev godkendt af Animal Care and Use Committee i NIAID, NIH (protokolnummer LPD 68E). Hvirvelløse dyr er ikke omfattet af NIH's retningslinjer.
1. Nåleforberedelse (figur 1)
- Træk nåle og facet som beskrevet i Meuti og Harrell19. Træk kort nåle på en dual-stage glas micropipette puller, ved hjælp af borosilicate glas kapillærer.
- Skærp nålene ved våd facet på micropipette-facetten ved hjælp af en ekstra fin sten.
2. Indsamling af embryoner og mikromanipulation (figur 2)
- Fem dage før injektionsdagen fodrer blodsandfluehunner som udføres rutinemæssigt til kolonivedligeholdelse. Yderligere oplysninger om sandfluekolonier og påkrævet materiale findes i Advokat et al.1 Vedligehold insekterne i inkubatorer ved 70 % fugtighed og 26 °C under hele deres udvikling.
- En dag efter blodfodring fanger blodfodrede kvinder af grupper på 100-150 i gipspotter med en sideport. Bevar hunnerne ved at fodre dem med sukkeropløsning (30% saccharose – nok volumen til at suge en lille bomuldskugle), hvilket er sædvanligt til kolonivedligeholdelse.
- På dag 2-3 efter blodfodring fugter IKKE gipspotterne. At holde hunnerne på et tørt substrat vil forhindre for tidlig æglægning, da kvinder foretrækker at lægge æg på et fugtigt miljø.
- På dag 5 efter blodfodring skal du udføre embryosamlingen, mikromanipulation og mikroinjection. Indfør et fugtigt filterpapir i æglægningskammeret. Frisklagte embryoner har ikke en fuldt udviklet chorion og vises hvid. Brug sort filterpapir under proceduren for at lette visualiseringen af de hvide embryoner.
- Overfør en lille gruppe hunner fra gipspotten til æglægningskammeret gennem sideportene ved hjælp af en mundspirator. Tilstedeværelsen af et fugtigt substrat (filterpapiret) får kvinder til at oviposit.
- Efter 30-60 minutter skal du forsigtigt hente filterpapiret med nylagte embryoner fra kammeret. Opbevar filterpapiret og embryonerne i en petriskål i op til 3 timer. I løbet af denne tid skal du regelmæssigt vurdere filterpapirets fugtniveau for at sikre, at det forbliver fugtigt. I løbet af denne tid skal du gentage trin 2.4 til 2.6 med nye grupper af kvinder og indsamle så mange embryoner som muligt.
- Forbered mikroskop dias til injektion: manuelt indsamle æg én efter én med en meget fin pensel og forsigtigt overføre dem til et andet stykke fugtig sort filterpapir placeret på et mikroskop dias toppet med et glas coverlip.
- Tilsæt vand til filterpapiret, nok til at holde embryonerne fugtige, men ikke får dem til at flyde væk fra coverlip eller blive suget under coverlip. Stil embryonerne op mod dækslet. Coverlipet fungerer som en bagstopper, der forhindrer æggene i at rulle væk under injektionen.
3. Embryonindsprøjtninger (figur 3)
- Start injektioner 2,5 til 3 timer efter starten af æg indsamling. Udfør injektioner ved stuetemperatur og omgivende laboratoriefugtighed.
- Sørg for, at de justerede embryoner har nok vand, så de holdes fugtige.
BEMÆRK: Det er afgørende, at embryonerne holdes fugtige under injektionerne. Hvis de ikke er fugtige under injektionsprocessen, bliver injektioner vanskelige, fordi nålen har problemer med at gennembore embryoet. Den korrekte mængde vand er det punkt, hvor embryonerne har en menisk af vand omkring dem, men coverslip flyder ikke oven på vandet, hvilket får embryonerne til at skubbe under dækslet. Det er afgørende at overvåge mængden af vand omkring embryonerne under injektioner. Tilsæt vand efter behov for at holde embryonerne fugtige. - Tilsæt vand forsigtigt ved at belægge en børste med vand og overføre vandet til bagenden af filterpapiret. Tilsætning af vand på denne måde gør det muligt at tilsætte vand på en langsom og kontrolleret måde, så lige nok tilsættes for at holde embryonerne fugtige. For meget vand kan få embryonerne til at flyde ud af trit, hvilket gør det vanskeligt at injicere embryonerne.
- Injektion af bagbelastning blandes i mikroinjection-nålen. Der tilsættes ca. 0,5 til 1 μL injektionsblanding i kanylen ved hjælp af et håndtegnet borosilikatnålfyldstof, og der kan også anvendes gelindlæsningspipetspidser. Injektionsblandingen består af et eller flere vejledende RNA (80 ng/μL hver), der er beregnet til at målrette en bestemt locus blandet med kommercielt rekombinant Cas9-protein (300 ng/μL).
- Start med injektionstrykket ved 30 psi, tryk på indsprøjtningsudløseren for at udvise luft ud af nålespidsen. Dette vil tvinge injektionsblandingen til nålespidsen, så injektionsblandingen kan flyde. På dette tidspunkt skal du langsomt øge hold/konstant tryk, indtil injektionsmaterialet begynder at strømme, og derefter trække det hold/konstante tryk tilbage, så det er lige under det punkt, hvor injektionsblandingen strømmer fra nålen. Den indhegnede indstilling skal levere lige nok injektionsmateriale, så en lille mængde materiale kan ses at komme ind i embryoet.
BEMÆRK: Injektion af sandfluembryoner under halocarbonolie svarende til andre protokoller, der anvendes til Drosophila, og myg blev oprindeligt testet, men overlevelsesprocenten for disse injektioner var meget lav. Overlevelsen blev forbedret ved at skifte til injektioner på fugtigt filterpapir som beskrevet ovenfor. - Sæt nålen ind i siden af embryoet. Brug coverlip bag embryoet som en bagstopper, som vil hjælpe nålen til at gennembore embryoet. Der skal leveres en lille mængde injektionsblanding i embryoet, før du forsigtigt fjerner nålen.
- Umiddelbart efter at kanylen er fjernet, skal du trykke på injektoren for at fjerne alt genopfyldt materiale fra nålespidsen. Dette vil bidrage til at forhindre nålen i at tilstoppe.
- Fortsæt til det næste foster. Sørg for, at filterpapiret er fugtigt mellem hver injektion, og at nålen ikke er tilstoppet.
- Når alle embryoner er blevet injiceret, tælle antallet af injicerede embryoner til at holde en løbende stemmer.
- Fjern coverlip ved at tilføje vand til filterpapiret, så coverlip flyder. På dette tidspunkt skal du bruge en sonde (træapplikatorpind med insektstift limet til spidsen) for at holde filterpapiret på plads, mens en finger bruges til at trække coverlipet væk fra de injicerede embryoner.
- Blot væk overskydende vand fra filterpapiret, når coverlip er blevet fjernet.
4. Opdræt efter injektion (G0) (figur 4)
- Overfør filterpapiret med embryonerne oven på flere lag fugtigt filterpapir placeret i en petriskål for at opretholde fugtigheden. Hold embryonerne her i den tid, der er nødvendig for at injicere andre embryoner. Embryoner kan opbevares i højst 3 timer som dette. Efter injektionen bliver de langsomt brune.
- Når alle embryoner er blevet injiceret, manuelt overføre dem på tidligere fugtet lille størrelse gips potter. Læg ikke for mange embryoner i hver gryde og hold afstand mellem dem for at undgå mulig svampeforurening mellem individer. Dæk potterne med en skærm og opbevar dem, som det typisk ville ske for sandfluekoloniæg, der holdes i inkubatorer ved 70% fugtighed og 26 °C under hele deres udvikling.
- På dag 1 efter injektion skal du fjerne alle de beskadigede og døde embryoner med en pensel. Der tilsættes 100 μL på 0,5% propionsyre, dråbe for dråbe, på gipspotterne, der indeholder de injicerede embryoner, for at begrænse svampeforureningen. Frigivelsen af cytoplasma fra embryoner, der er beskadiget under injektionsprocessen, er særlig gunstig for svampevækst.
- Kontroller gipspotterne hver dag og fjern eventuelle dårlige eller døde embryoner. Hvis svampen er til stede, skal du fjerne alle inficerede embryoner og tilsæt et par dråber 0,5% propionsyre.
- Larver lukker mellem dag 8 og 12 efter injektion. To gange om dagen overføres de nyligt fremkomne larver på nye gipspotter i grupper på højst 5-10. Tilsæt en lille mængde mad og tjek maden 2-3 gange om ugen.
- Overvåg omhyggeligt mængden af larvefødevarer, da for meget øger risikoen for svampeforurening. Sandflue larver overlever bedre i grupper, men de kan være kannibalistiske, hvis der ikke er nok mad.
- Når larverne popper, adskilles dem efter køn for at opretholde hunnerne som jomfruer. Hvis der er mange overlevende, kassér mændene og hold kun hunnerne.
BEMÆRK: Både hanner og hunner kan bære og overføre mutationer. Men da kvinder skal holdes jomfruer, før de skal krydses, er det lettere at bruge kun G0 injicerede kvinder for at undgå at skulle adskille wt insekter efter køn. G0-hannerne kan opbevares som backup, hvis antallet af voksne overlevende er lavt og i dette tilfælde vil blive parret med sorterede wt jomfruhunner.
5. Udvælgelse og screening af mutant alleler (figur 5)
- Mass-cross G0 hunnerne med wt mænd i et bur. Blod-feed dem helt, som det ville ske for normal koloni vedligeholdelse.
- En dag efter blod-fodring, overføre hver G0 kvinde med 2-3 wt mænd i de enkelte gipsrør ved hjælp af en mund aspirator. Foder fluerne med sukker på en lille bomuldskugle, der skiftes hver dag, og brug en sprøjte vand for at sikre, at gipsfugtigheden er egnet til æglægning.
- Efter G0 hunnerne har lagt æg (svarende til G1), indsamle deres kroppe i individuelle, kommenteret Eppendorf rør til senere genotyping. Vedligehold embryoner som normalt gjort for wt kolonier.
- Udtræk DNA fra G0 hunnerne ved hjælp af den valgte metode.
- Screen DNA'et for tilstedeværelsen af mutationer, for eksempel ved at designe en PCR-analyse ved hjælp af primere, der omgiver regionen af forventede CRISPR-udskæringer.
- Hold kun G1 embryoner lagt af G0 hunner viser tegn på transformation. Når disse G1 embryoner udvikler sig til pupper, adskille dem efter køn og holde kun hunnerne. Kryds G1 hunnerne fra samme G0 kvinde til wt mænd, blodfodr dem, og overfør derefter i små grupper på 2-3 kvinder og 4-5 mænd i små størrelse beholdere.
BEMÆRK: Alle G1 individer har en chance for at bære en unik mutation, så hvis antallet af overlevende individer ikke er for højt, er det bedre at krydse G1 hunner individuelt med wt mænd. Sagen om flere kvinder, der bærer en anden mutation til stede i et samme rør, er sjælden, men kan forekomme. Hvis et sådant tilfælde observeres efter genotypning, skal G 2-afkomhunnerne derefter parres individuelt med wt mænd. Denne parringsordning undgår muligheden for flere mutationer i afkommet. - Efter æglægning skal du samle G 1-hunkroppene og screene dem for mutationer. Hold kun rørene, hvor mindst en kvinde viste tegn på mutation.
- For senere generationer gøre enkelt par in-crosses. Efter æglægning skal du screene forældre for tilstedeværelse af mutation. Gentag ved hver generation, indtil begge forældre er homozygobåde for den samme mutation. Når de er identificeret, vil de være grundlæggerne af en homozygous mutant bestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Crispr/Cas9-mikroinjektionsprotokollen, der er beskrevet her for at generere sandfluemutanter, blev etableret i en tidligere publikation4. Denne tilgang produceret meget effektiv mutagenesis, som 11 ud af 540 personer overlevede proceduren, hvoraf 9 var mutant. Når du designer vejledninger til CRISPR/Cas9-mutation, er et vigtigt første skridt at sekvensere regionen omkring det område, der skal målrettes mod. Skabelonen til sekventering skal være fra den stamme, der skal bruges som en kilde til embryoner til injektion. Det er risikabelt kun at stole på offentliggjorte genomsekvenser til designvejledninger. Det er ikke usædvanligt at have forskelle mellem offentliggjorte genom- og præ-guide designsekvenser. I nogle tilfælde er guider designet ud fra offentliggjort genomsekvens ikke til stede, når regionen omkring målgenet er sekventeret (Harrell, personlig observation). Derudover kan sekvensen omfatte enkeltkleotidpolymorfier (SNP'er), der kan forveksles med ægte CRISPR-redigeringer under genotyping. Derfor er det vigtigt at bekræfte rækkefølgen for målområdet, for at resten af protokollen kan lykkes.
Vellykket genetisk modifikation af insekter ved mikroinjektion afhænger hovedsageligt af to kritiske aspekter: levering af materialer (protein, plasmid eller mRNA) på et passende tidspunkt i udviklingen med så lidt skade på embryonerne som muligt; og opdræt af robuste, sunde insekter, der vil overleve proceduren og producere afkom. Den indledende fase af denne procedure, der er beskrevet i figur 2, starter med blodfodring af hunnerne fra wtkolonien og fortsætter til embryoindsamling og mikroinjection fem dage senere. Den anden fase består i at opdrætte de injicerede embryoner indtil voksenalderen, foretage passende kryds og identificere og isolere mutationer af interesse.
Embryoner til injektion indsamles i 30 – 60 minutter, så den relative alder i timer efter oviposition kan bestemmes. Embryoner får derefter lov til at udvikle sig i 3 timer før injektionernes start. Denne tidsvindue for insektudvikling gør det muligt for embryonerne at overleve injektionerne. Efter denne aldringsperiode opsamles embryonerne på et forberedt injektionsdias, og embryonerne rulles på plads mod en coverlip kant ved hjælp af en fin børste. Den endelige konfiguration er vist i figur 3A. Det er vigtigt at vådt filterpapiret nok, så der dannes en menisk ved dækkanten, hvor embryonerne sidder. For meget vand og embryoner vil blive skubbet væk fra coverlip kant. For lidt vil medføre, at embryonerne trækkes under dækslet. Embryonerne skal holdes fugtige, ellers bliver embryomembranerne vanskelige at injicere. Dækkanten fungerer som et backstop, så nålen kan trænge ind i embryonerne, når den presses mod kanten. Det er kombinationen af en skarp nål og en bagstopper, der gør det muligt for nålen at trænge glat ind.
Som med de fleste succesfulde mikroinjection protokoller, en god mikroinjection nål egnet til embryoner, der injiceres er vigtig. Gode, skarpe nåle defineres som nåle, der let trænger ind i embryoet uden at lade materialet undslippe efter injektionen. God indtrængning er tydelig, når nålen glider ind i embryoet, hvilket forårsager lidt eller ingen fordybning af embryomembranen under penetration og ingen materialelækager fra embryoet, efter at nålen er trukket tilbage. Gode skarpe nåle produceres ved hjælp af nåletrækkerindstillinger, der giver en nål, der kommer til et fint punkt(Figur 1A). Den trukket nål bør ikke have en tilspidsning, der er for lang. Ellers bliver nålens lumen meget smal for en stor del af konus (Figur 1B), og det bliver svært at få injektionstrykket højt nok til at tvinge materialet gennem nålen. I denne protokol blev der brugt facetterede nåle. Processen for at trække og skråne nåle er beskrevet i Meuti og Harrell19. I tilfælde af sandfluembryoner, der udvikler sig over en lang periode, er det særligt kritisk at have skarpe nåle, der minimerer skader på embryoet og dermed forhindrer materiale i at lække på injektionsstedet. Når embryoplasme lækker fra et foster efter injektion, er dette materiale et rigt medium til skimmel- og svampevækst. I embryoner, der udvikler sig over en kortere periode embryoet kan udvikle sig og luge, før formen bliver et problem. Embryoner, der lækker embryoplasme synligt efter injektionen, bør fjernes.
Under injektioner er det vigtigt at tilføje vand efter behov ved at betisse en fin pensel og røre ved den til filterpapiret og gentage efter behov, indtil vandets menisk er lige ved bunden af embryonerne. Opmærksomhed på relativ luftfugtighed på injektionsdagen skal bemærkes. På dage med lav luftfugtighed skal der tilsættes mere vand. Når injektionerne er afsluttet, tilsættes lidt ekstra vand til filterpapiret, så coverlipet flyder lidt, hvilket gør det lettere at fjerne. Når coverlipet er fjernet, kan filterpapiret med injicerede embryoner renses, så filterpapiret knap nok er fugtigt. Embryoner kan derefter overføres til en fugtig gipspotte til udklækning ved hjælp af en fin pensel. På nuværende tidspunkt er embryoner meget skrøbelige, så processen skal udføres meget omhyggeligt. Det er også vigtigt at forhindre embryonerne i at røre hinanden for at kunne fjerne mugne embryoner og begrænse spredningen af svampeforurening.
Efter injektionen opbevares de G0-injicerede embryoner på gipspotter i henhold til normale opdrætsprocedurer. Indtil de klækkes, skal injicerede embryopotter kontrolleres en gang om dagen for at fjerne usunde embryoner. Figur 4A viser den forventede tidslinje for den individuelle opdræt af G0 fra æglægnings- og injektionsdagen til voksenalderen. Figur 4B viser eksempler på G0-embryoner, der er sunde og bør bevares; eller beskadiget, forurenet af svamp, udtørret eller deformeret og bør kasseres. G0 injiceres individer er angiveligt mosaik for mutant alleler. Der bør udformes en metode til identifikation af potentielle mutant alleler, f.eks. Figur 4C præsenterer et eksempel på en PCR-analyse, der viser en mosaik G0-person, der udviser et PCR-produkt ud over det forventede wt-produkt, der repræsenterer en mutant allel.
Når de voksne opstår, krydses G0-hunnerne, der udvikler sig fra G0 injicerede embryoner, med wt-hanner, får lov til at lægge æg og genotyped senere. Kun de rør, der indeholder en G 0-flue, der viser tegn på mutation fra den valgte genotypingmetode, bevares. Fluerne fra de næste generationer (G1 hunner) krydses enten med wt hanner eller individuelt mellem søskende (fra G2). Disse kryds får lov til at lægge æg og derefter genotyped ved den valgte metode. Det sidste trin gentages, indtil homozygogous mutant hanner og hunner er opnået, oprettelse af en homozygous mutant linje. Figur 5Aindeholder en skematisk repræsentation af den relevante række kryds for at etablere en mutantlinje . Figur 5B viser et eksempel på en genotyping PCR, der gør det muligt at identificere et homozygotiske mutant søskendekors.
Figur 1: Mikroinjektionsnåle. A. God nål. B. Nål med ekstrem tilspidsning er ikke god til injektioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oversigt over embryonindsamling og mikromanipulation (Dette tal var blevet tilpasset fra4). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Opsætning af mikroinjektion. A. Skematisk repræsentation af mikroinjektionsopsætningen. B. Nærbillede af justeret embryon til mikroinjektion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Opdræt og identifikation af mosaik G0 voksne individer. A. Forventet tidsplan fra embryo mikroinjection til G0 voksenalderen. B. Eksempler på flotte og flotte embryoner efter injektionen. C. PCR genotyping af en forvandlet G0 mosaik individuelle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Identifikation og isolering af mutationer af interesse. A. Skematisk repræsentation af forsøgsstrategien til at isolere mutant alleler og etablere homozygotiske mutantlagre (figur fra 4). Farven repræsenterer tilstedeværelsen af celler, der bærer mutant alleler, på heterozygous (pink) eller homozygous (rød) tilstand. B. Eksempel på en PCR screening strategi for genotyping individuelle sibbling kors af sand fluer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer her en nyligt udviklet embryo mikroinjection metode til målrettet mytterigenese af CRISPR/Cas9 i Phlebotomus papatasi sand fluer. Embryo mikroinjection for insekt genetisk modifikation blev udviklet i Drosophila i midten af 1980'erne21 og bruges nu rutinemæssigt i en bred vifte af insekter. Andre metoder til levering af genetiske modifikationsmaterialer er udviklet til brug i insekter, såsom ReMOT20,21,22,23 og elektroporation23. Men, embryo mikroinjection er i øjeblikket den mest alsidige og effektive metode til levering af disse materialer. ReMOT er yderst lovende som leveringsmetode og bør undersøges til brug i sandfluer på grund af den relative lethed af voksne injektioner sammenlignet med embryomikroinjections. Indtil videre er ReMot imidlertid ikke blevet anvendt med succes til CRISPR/Cas9 HDR eller transposon transgenese. Selv om teknikken til embryomikroinjections i insekter stort set er den samme som oprindeligt udviklet, kan der for hver ny art være behov for finjusteringer af teknikkerne. Disse artsforskelle omfatter mønsteret og varigheden af embryoudvikling, embryostruktur og det miljø, hvor embryoet normalt udvikler sig. Sandflueembryoner er særligt små (0,3-0,5 mm lange og 0,1- 0,15 mm brede, hvilket svarer til ca. 1/3 af Drosophila-æggets størrelse1). Denne reducerede størrelse øger vanskeligheden ved at håndtere æggene uden at beskadige dem. Fugtniveauet på hvert trin i protokollen skal overvåges meget nøje, da sandfluefostre er særligt følsomme over for udtørring. De er dog ikke akvatiske og vil dø, hvis de er helt nedsænket i vand i en længere periode. Drosophila embryo mikroinjection kræver injektion i den bageste ende af embryoet. På grund af den næsten symmetriske form af sandfluembryoner er det vanskeligt at bestemme embryopolariteten. Endelig, mens sand flyve embryo udvikling fortsætter ligner Drosophila, det gør det i et meget langsommere tempo. Embryogenese alene varer mellem 6 og 11 dage, afhængigt af sandfluearterne, mens Drosophila-æg kun klækkes en dag efter æglægning. Drosophila æg cellularization sker omkring 2 timer efter oviposition, mens sand flyve embryoner nå dette stadium på nær 9 timer efter oviposition. I betragtning af denne forskel i udviklingsmæssige timing, injektioner er rettet mod centrum af den udviklende sand flyve embryo på den antagelse, at udvikle kerner i syncytial embryo er placeret i nærheden af centrum af udviklingslandene embryo på dette tidlige udviklingsstadium, hvilket undgår behovet for at skelne embryo polaritet.
CRISPR/Cas9 skaber dsDNA pauser på et valgt genomisk locus. Disse dobbeltstrengsbrud repareres i cellen enten af NHEJ eller af HDR. Den metode, vi præsenterer her, blev tidligere kun brugt til NHEJ-baseret mutagenesis, som genererede små indsættelses- / sletningshændelser, indels, hvilket førte til en frameshift i gensekvenser, hvilket resulterede i for tidlige stopkodoner og et protein, der manglede alle funktionelle domæner4. Insekter har også de cellulære maskiner til dsDNA bryde reparation gennem HDR, som derefter kunne omdirigeres til at designe mere komplekse genom redigering strategier. HDR-baseret CRISPR/Cas9 genomredigering skal stadig sættes op til brug i sandfluer og bør gøre det muligt at udvikle blandt andet udtryks- og betingede udtryksmutanter.
Udviklingen af denne mikroinjektionsprotokol åbner nu døren for at bruge andre genommodifikationsmetoder, såsom CRISPR/Cas9 HDR, transposon transgenese, binære ekspressionssystemer som UAS/Gal4 og stedspecifik rekombination af phiC31 eller Cre /lox. Udviklingen af disse andre metoder vil yderligere udvide værktøjskassen til sandflue genekspression modifikation ved at give mulighed for mere kompleks genomisk manipulation. Men før disse andre metoder kan anvendes, vil der være behov for arbejde med at identificere og isolere regulatorelementer for at drive ekspression af indsatte gener i sandfluer samt markører for indsættelse og andre komponenter i disse metoder, såsom initiativtagere til at drive udtryk for transponering og rekombinationer.
Endelig er genomredigering i ikke-modelinsekter nu blevet en mulighed, især takket være revolutionen af CRISPR/Cas9 opdagelse og tilpasning15,16. I insekter kræver de fleste genomredigeringsteknikker, til den bemærkelsesværdige undtagelse af den nyudviklede ReMOT-teknik, embryomikroinjection, et skridt både afgørende og teknisk krævende. Vi håber, at denne publikation vil hjælpe med at udvide udvalget af genekspressionsmodifikationsteknikker tilpasset sandfluer og føre til nye opdagelser på deres biologi samt vektorkompetence til Leishmania parasitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ingen
Acknowledgments
Forfatterne takker Vanessa Meldener-Harrell for kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42 (2017).
- Pelletier, I., et al. Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells. Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).
- Kamhawi, S., et al. A role for insect galectins in parasite survival. Cell. 119 (3), 329-341 (2004).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major. MBio. 10 (4), (2019).
- Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).
- Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes. Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Hu, C., Aksoy, S. Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans. Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).
- Meister, S., et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).
- Meister, S., et al. Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).
- Telleria, E. L., et al. Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis. Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).
- Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).
- Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania. Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).
- Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality. PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
- Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).
- Meuti, M., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9. JoVE. (163), e61651 (2020).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Macias, V. M., et al. Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control. Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).
