Summary
该协议详细介绍了CRISPR/Cas9在沙蝇中靶向诱变的步骤：胚胎采集、注射、昆虫饲养和识别，以及兴趣突变的选择。
Abstract
沙蝇是 莱什马尼亚 物种的自然载体，原生动物寄生虫产生从皮性病变到内脏病理学等多种症状。破译向量/寄生虫相互作用的性质对于更好地了解 莱什马尼亚 传染给宿主至关重要。在控制沙蝇向量能力的参数（即它们携带和传播病原体的能力）中，这些昆虫固有的参数被证明发挥着关键作用。例如，昆虫免疫反应会影响沙蝇向量对 莱什马尼亚的能力。由于缺乏适合用于这些非模型生物体的基因表达修饰方法，对此类参数的研究受到限制。通过小干扰RNA（siRNA）来降低基因调控是可能的，但除了在技术上具有挑战性之外，沉默只导致部分功能丧失，无法代代相传。CRISPR/Cas9技术的靶向突变最近被改编成 木薯沙 蝇。这项技术导致在一个专门选择的轨迹中产生可传播的突变，从而能够研究感兴趣的基因。CRISPR/Cas9 系统依赖于定向双链脱氧核糖核酸断裂的诱导，后来通过非同源端连接 （NHEJ） 或同源驱动修复 （HDR） 进行修复。NHEJ 包括一个简单的休息关闭，并经常导致小插入/删除事件。相比之下，HDR 使用与目标 DNA 共享同源的供体 DNA 分子的存在作为修复模板。在这里，我们提出了一种沙蝇胚胎微注射方法，用于CRISPR/Cas9使用NHEJ靶向突变，这是迄今为止唯一适应沙蝇载体的基因组修饰技术。
Introduction
病媒传播疾病是持续演变过程中的主要公共卫生威胁。据世界卫生组织统计，数以百计的病媒物种分布在非常独特的植物家族（如蚊子、虱子、跳蚤）中，导致大量微生物病原体的传播，每年导致70多万人死亡。在向量昆虫中，植物素沙蝇（滴虫、心理虫）构成一个庞大的群体，80种经过验证的向量物种表现出不同的表型特征和向量能力，在不同地理区域发现。它们是 列什马尼亚属原生寄生虫的载体，每年造成约130万例新的莱什马尼亚病例和2万至3万例死亡。Leishmanias 的临床结果多种多样，症状从自我限制的皮性病变到内脏传播，在缺乏治疗的情况下是致命的。
沙蝇是严格的陆地昆虫。与其他 Diptera 相比，它们的生命周期相对较长，根据温度、湿度和营养等不同参数，寿命长达三个月。它包括一个胚胎阶段（6至11天），四个幼虫阶段（总共持续23至25天）和一个幼虫阶段（9至10天），然后是变质，然后是成年。沙蝇需要潮湿和温暖的环境来饲养。雄性和雌性都以从花蜜在野外获得的糖为食。只有女性是血液喂养者，因为他们需要从血液中获取蛋白质来生产卵子1。
研究的一个重要重点是确定导致可传播感染发展的病媒/寄生虫相互作用的性质。与其他向量昆虫一样，沙蝇固有的参数已被证明会影响它们的病媒能力，即它们携带病原体和将病原体传染给宿主的能力。例如，木瓜沙飞中古特细胞作为识别寄生虫表面成分的受体表达，可以直接影响其对莱什马尼亚主要2、3的载体能力。昆虫免疫反应途径，免疫缺陷（IMD），也是至关重要的木瓜沙蝇向量能力莱什马尼亚主要4。在伊蚊5、6、7、采采蝇格洛西纳摩尔西坦8和阿诺菲莱斯甘比亚蚊子9、10中，对病媒昆虫免疫反应途径在控制传染性病原体传播方面具有重要作用。
沙蝇/莱什马尼亚相互作用的研究因缺乏适应这些昆虫使用的基因表达修饰方法而受限。直到最近，只有通过小干扰RNA（siRNA）进行的基因下调节进行了11，12，13，14。该技术受成年女性微注射相关死亡率的限制，只导致部分功能丧失，无法代代相传。
CRISPR/Cas9技术彻底改变了沙蝇等非模型生物体的功能基因组研究。CRISPR Cas9系统从原核生物的适应性免疫系统中进行了改造，用于防御噬菌体15、16，并迅速被改造为用于包括昆虫在内的高级真核生物的基因组编辑工具。CRISPR/Cas9 目标基因组编辑的原则基于单一指南 RNA （sgRNA） 与特定基因组的互补性。Cas9核酶与sgRNA结合，在基因组DNA中产生双链DNA（dsDNA）断裂，sgRNA与其互补序列关联。Cas9-sgRNA 复合物由 sgRNA 中的 17 到 20 个互补基座引导到目标序列，然后可以通过两个独立的路径修复 dsDNA 中断：非声端连接 （NHEJ） 或同源定向修复 （HDR）17。NHEJ 修复涉及简单的中断关闭，但经常导致小的插入/删除事件。通过 HDR 修复的 DNA 使用与目标 DNA 共享同源的供体 DNA 分子作为修复模板。昆虫拥有两种机器。
CRISPR/Cas9 技术可以通过 NHEJ 修复途径在选定的轨迹中产生突变;或更复杂的基因组编辑策略，如敲击或表达记者，通过HDR通路与适当的捐赠者模板。在沙蝇中，免疫反应因子的 无 突变等位基因通过NHEJ介导的CRISPR在 木薯4中产生。在另一项研究中还注入了沙蝇胚胎，并结合了针对编码黄色的基因的CRISPR/Cas9组合。尽管如此，没有携带突变的成年人产生18。我们在这里描述了由NHEJ调解的CRISPR/Cas9的沙蝇靶向诱变的详细方法，特别侧重于胚胎微注射，这是协议的关键步骤。
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Protocol
严格按照《国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南》的建议，使用小鼠作为沙蝇喂养的血液来源。该议定书得到了国家艾滋病规划署动物护理和使用委员会（协议编号LPD 68E）的批准。无脊椎动物不在国家卫生研究院指南的涵盖范围之内。
1. 针头制备 （图1）
- 拉针和斜面，如在梅蒂和哈雷尔19描述。简言之，使用薄氧酸玻璃毛细管在双级玻璃微皮拉器上拉针。
- 用一块额外的细石，在微尖斜面上用湿斜面切针。
2. 胚胎收集和微操纵 （图2）
- 注射前五天，血液喂养沙蝇雌性，定期进行菌落维护。有关沙蝇群落饲养程序和所需材料的详细信息，请参阅律师等人1 在整个开发过程中，在 70% 湿度和 26 °C 的孵化器中保持昆虫。
- 有一天，在喂血后，用石膏锅和侧端口的100-150组女性捕捉喂血的女性。通过用糖溶液（30%蔗糖-足够的体积浸泡一个小棉球）喂养雌性，这是通常的殖民地维护。
- 在第2-3天献血后，不要滋润石膏锅。将雌性放在干燥的基材上可以防止过早产卵，因为雌性更喜欢在潮湿的环境中产卵。
- 第5天进行血液喂养后，进行胚胎采集、微操纵和微注射。将湿润滤纸引入产卵室。新鲜铺设的胚胎没有完全发育的胆汁，呈白色。在手术过程中使用黑色滤纸，以促进白色胚胎的可视化。
- 使用口腔吸气器将一小群女性从石膏锅转移到产卵室，通过侧端口。湿润基板（滤纸）的存在诱使女性渗出。
- 30-60分钟后，小心地从腔室中取出新铺设的胚胎的滤纸。将滤纸和胚胎放在培养皿中长达3小时。在此期间，定期评估滤纸的水分水平，以确保其保持湿润。在此期间，重复步骤2.4至2.6与新的女性群体，并收集尽可能多的胚胎。
- 准备显微镜幻灯片进行注射：用非常精细的画笔手动收集鸡蛋，并小心地将它们转移到另一张湿润的黑色滤纸上，放在显微镜滑梯上，上面有玻璃盖片。
- 将水加入滤纸中，足以保持胚胎湿润，但不会使胚胎从盖片上浮出或被吸到盖片下。将胚胎与盖片对接。盖片起到后挡作用，防止卵子在注射过程中滚走。
3. 胚胎注射 （图3）
- 鸡蛋收集开始后 2.5 至 3 小时开始注射。在室温和环境实验室湿度下进行注射。
- 确保对齐的胚胎有足够的水，使其保持湿润。
注：在注射过程中，胚胎必须保持湿润。如果注射过程中没有湿润，注射变得困难，因为针头难以刺穿胚胎。正确的水量是胚胎周围有半月板水的点，但盖片不会漂浮在水面上，导致胚胎在盖片下推。在注射过程中监测胚胎周围的水量至关重要。根据需要加水以保持胚胎湿润。 - 用水润湿刷子并将水转移到滤纸的后端，小心地加水。以这种方式添加水可以以缓慢和可控的方式添加水，以便添加足够的水来保持胚胎湿润。过多的水会导致胚胎浮出对齐，使胚胎难以注入。
- 背负荷注射混合到微注射针。使用手绘的玻色酸针填充剂在针头中加入约 0.5 至 1μL 的注射混合物，还可用于凝胶加载管道尖端。注射组合由一个或几个导数RNA（每个80 ng/μL）组成，旨在针对与商业重组的Cas9蛋白（300 ng/μL）混合的特定轨迹。
- 从 30 psi 的注射压力开始，按下注射触发器，将空气从针尖排出。这将迫使注射混合到针尖，使注射混合流动。此时，慢慢增加保持/恒定压力，直到注射材料开始流动，然后后退保持/恒定压力，使其略低于从针头流出的注射混合点。门控设置应提供足够的注射材料，以便可以看到少量的材料进入胚胎。
注：在卤烃油下注射沙蝇胚胎，类似于用于 果蝇 和蚊子的其他协议，初步测试，但这些注射的存活率非常低。通过在潮湿的滤纸上切换到注射，如上所述，生存得到了改善。 - 将针头插入胚胎侧面。使用胚胎后面的盖片作为后盾，帮助针刺穿胚胎。在轻轻取出针头之前，将少量注射混合物放入胚胎中。
- 取出针头后，立即按喷油器从针尖上取出任何回填材料。这将有助于防止针头堵塞。
- 进入下一个胚胎。每次注射之间，确保滤纸湿润，针头不堵塞。
- 一旦所有胚胎都被注射，计算注射的胚胎数量，以保持运行计数。
- 通过在滤纸中加入水来去除盖片，使盖片浮动。此时，使用探针（用粘在尖端的昆虫别针粘住的木材施用器）将滤纸固定到位，同时用手指将盖片从注射的胚胎上拉开。
- 一旦盖片被移除，就会从滤纸中清除多余的水。
4. 注射后饲养 （G0） （图 4）
- 将滤纸与胚胎一起转移到放置在培养皿的几层湿润滤纸上，以保持湿度。在注射其他胚胎所需的时间将胚胎保留在这里。胚胎最多可保持3小时。注射后，它们会慢慢变成棕色。
- 一旦所有胚胎都被注射，手动将它们转移到以前滋润的小尺寸石膏盆上。不要把太多的胚胎放在每个锅里，保持它们之间的距离，以避免个体之间可能的真菌污染。用屏幕覆盖锅，并存储它们，通常会做沙蝇殖民地鸡蛋，保持在孵化器在70%的湿度和26°C，在其整个发展。
- 在注射后的第1天，用画笔取出所有受损和死亡的胚胎。在含有注射胚胎的石膏锅中加入 100 μL 的 0.5% 丙酸，一滴一滴，以限制真菌污染。细胞质从注射过程中受损的胚胎中释放，尤其有利于真菌生长。
- 每天检查石膏盆，并去除任何坏或死胚胎。如果存在真菌，取出所有受感染的胚胎，并加入几滴0.5%的丙酸。
- 第8天和第12天注射后，幼虫孵化。每天两次，将新出现的幼虫转移到新的石膏盆中，最多组5-10个。加入少量食物，每周检查食物2-3次。
- 仔细监测幼虫食物的数量，因为过多会大大增加真菌污染的风险。沙蝇幼虫在群体中存活得更好，但是如果没有足够的食物，它们可能是食人族。
- 当幼虫幼崽时，按性别分离它们，以保持雌性为处女。如果有很多幸存者，抛弃雄性，只保留女性。
注：男性和女性都可以携带和传递突变。然而，由于雌性在被穿越之前必须保持处女，因此更容易只使用G0 注射的女性，以避免不得不按性别分离昆虫。G0 男性可以保留作为备份， 如果成年幸存者的数量是低的， 在这种情况下， 将与排序的 wt 处女女性配合。
5. 突变等位基因的选择和筛选 （图5）
- 大规模穿越G0 女性与wt男性在笼子里。血液喂养他们完全，将做正常的殖民地维护。
- 一天后，用口腔吸气器将每名G0 女性与2-3 wt雄性转移到单独的石膏管中。每天在一个小棉球上用糖喂苍蝇，并使用水注射器，以确保石膏水分适合产卵。
- 在G0 雌性产卵（对应于G1）后，将她们的身体收集在单独的、有注释的埃彭多夫管中，供以后的基因化。保持胚胎，通常做wt殖民地。
- 通过选择的方法从G0 女性中提取DNA。
- 筛选DNA是否存在突变，例如，使用围绕预期CRISPR切割区域的引物设计PCR检测。
- 只保留 G1 女性铺设的 G1 胚胎， 以显示转化的证据。当这些G1 胚胎发育成幼崽时，按性别分离它们，只保留雌性。将 G1 女性从同一个 G0 女叉到 WT 男性，用血喂养它们，然后将 2 - 3 名女性和 4 - 5 名男性分成小尺寸容器。
注意：所有G1 个体都有机会携带一个独特的突变，所以如果幸存个体的数量不是太高，那么最好是单独交叉G1 女性与wt男性。几个女性携带不同的突变存在于同一管子的情况下是罕见的，但可能发生。如果在基因化后观察到这种情况，那么G2 后代雌性应该单独与wt雄性配对。这种交配方案避免了后代发生多重突变的可能性。 - 产卵后，收集G1 女性身体，并筛选它们的突变。只保留至少有一名女性有突变证据的管子。
- 为后代做单对交叉。产卵后，筛选父母存在突变。在每一代人中重复，直到父母双方都是同源的相同突变。一旦确定，它们将成为同源突变种群的创始人。
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Representative Results
CRISPR/Cas9微注射协议在这里描述产生沙蝇突变体是在以前的出版物4中建立的。这种方法产生了高效的诱变，因为540个人中有11人幸存下来，其中9人是突变者。在为CRISPR/Cas9突变设计指南时，关键的第一步是对周围区域进行排序，以便成为目标。测序模板应该来自将用作注射胚胎来源的菌株。仅仅依靠已公布的基因组序列来设计指南是有风险的。在已发布的基因组和指南前设计序列之间存在差异并不罕见。在某些情况下，当目标基因周围的区域被测序时，不存在由已公布的基因组序列设计的指南（Harrell，个人观察）。此外，该序列可能包括单核苷酸多态性 （SNPs），在基因化过程中可能被误认为是真正的 CRISPR 编辑。因此，确认目标区域的顺序对于协议的其余部分取得成功至关重要。
通过微注射对昆虫进行成功的基因改造主要取决于两个关键方面：在发育的适当时间交付材料（蛋白质、质粒或mRNA），对胚胎的损害尽可能小：饲养健壮、健康的昆虫，使这些昆虫在手术中存活下来并产生后代。这个程序的初始阶段，在 图2中描述，从从wt菌落的雌性血液喂养开始，并在五天后进入胚胎采集和微注射。第二阶段包括饲养注射的胚胎直到成年，使适当的交叉，并识别和隔离感兴趣的突变。
用于注射的胚胎收集30-60分钟，以便确定输卵后数小时的相对年龄。然后允许胚胎在注射开始前发育3小时。这个昆虫发育的窗口允许胚胎在注射中存活下来。在此老化期后，胚胎被收集到准备的注射滑梯上，胚胎用细刷在盖片边缘滚动到位。最终配置显示在图 3A 中。重要的是要湿过滤纸足够，使半月板形成在盖滑边缘的胚胎坐。太多的水和胚胎将被推离盖滑边缘。太少会导致胚胎被拉到盖子下。胚胎需要保持湿润，否则胚胎膜变得难以注入。盖片边缘充当后挡，使针头在压在边缘时穿透胚胎。它是锋利的针头和后挡的组合，使针头能够顺利穿透。
与大多数成功的微注射方案一样，适合注射胚胎的良好微注射针也很重要。好的，锋利的针头被定义为容易穿透胚胎的针头，而不允许材料在注射后逸出。当针头滑入胚胎时，良好的渗透是显而易见的，在渗透过程中很少或根本没有凹痕胚胎膜，针头取出后胚胎也没有物质泄漏。良好的锋利的针头是使用针拉器设置，产生一个针，来到一个细点（图1A）。拉针不应有太长的锥度。否则，针头的流明在锥度的大部分（图1B）中变得非常狭窄，并且很难获得足够高的注射压力，迫使材料穿过针头。在此协议中，使用了斜线针头。拉针和斜线的过程在梅蒂和哈雷尔19中描述。在沙蝇胚胎长期发育的情况下，有锋利的针头，尽量减少对胚胎的损害，从而防止材料在注射部位泄漏尤为重要。当胚胎质在注射后从胚胎中泄漏时，这种材料是霉菌和真菌生长的丰富媒介。在较短时间内发育的胚胎中，胚胎可以在模具成为问题之前发育和孵化。注射后明显泄漏胚胎的胚胎应切除。
在注射过程中，必须根据需要加入水，将细画笔润湿并触摸到滤纸中，必要时重复，直到水的半月板刚刚在胚胎底部。需要注意注射当天的相对湿度。在低湿度的日子里，需要更多的水。注射完成后，在滤纸上加入少量额外的水，使盖片稍微浮动，从而更容易去除。一旦盖片被移除，注入胚胎的滤纸就会被弄脏，使滤纸几乎不潮湿。然后，胚胎可以转移到湿润的石膏锅中，用精美的画笔孵化。在现阶段，胚胎非常脆弱，因此必须非常小心地进行这一过程。防止胚胎相互接触也很重要，以便能够去除发霉的胚胎并限制真菌污染的传播。
注射后，G0 注射的胚胎按正常饲养程序保存在石膏盆上。在他们孵化之前，注射的胚胎盆应该每天检查一次，以去除不健康的胚胎。 图4A 介绍了从产卵和注射到成年的G0 个体饲养的预期时间表。 图4B 显示了G0 胚胎健康且应保留的例子：或损坏、被真菌污染、干燥或变形，应丢弃。G0 注射的个体被认为是突变等位基因的马赛克。应设计一种识别潜在突变等位基因的方法，例如对预期切割地点周围的区域进行 PCR 分析。 图 4C 展示了一个 PCR-分析示例，显示马赛克 G0 个体，显示与预期 wt 产品额外的 PCR 产品，表示突变等位基因。
一旦成人出现，从 G0 注射胚胎发育的 G0 雌性与 wt 雄叉，允许产卵，并在以后被基因化。只保留含有 G0 苍蝇的管子，显示选择的基因型方法突变的证据。下一代（ G1 雌性）的苍蝇要么与雄叉，要么在兄弟姐妹之间单独交叉（来自G2 ）。这些十字架被允许产卵，然后通过选择的方法基因。最后一步重复，直到获得同源突变的男性和女性，建立一个同源突变线。 图5A中给出了适当继承十字架以建立突变线的示意图表示。 图 5B 显示了一个基因型 PCR 允许识别同源突变兄弟姐妹十字架的示例。
图1：微注射针。好的针头。B. 针与极端锥度不适合注射。 请单击此处查看此图的更大版本。
图2：胚胎采集和微操纵概述（此图改编自4）。请单击此处查看此图的更大版本。
图3：微投影设置。A. 微注入设置的示意图表示。B. 微注射对齐胚胎的特写。 请单击此处查看此图的更大版本。
图4：马赛克G0 成年个体的饲养和鉴定。A. 从胚胎微注射到 G0 成年的预期时间安排。B. 注射后好看和不好看的胚胎的例子。C. 一个经过改造的 G0 马赛克个体的 PCR 基因化。 请单击此处查看此图的更大版本。
图5：识别和隔离感兴趣的突变。A. 分离突变等位基因和建立同源突变种群的实验策略的原理图表示（ 图4）。颜色表示携带突变等位基因的细胞在异质（粉红色）或同源（红色）状态下的存在。B. 用于基因化单个沙蝇交叉的 PCR 筛选策略示例。 请单击此处查看此图的更大版本。
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Discussion
我们在这里介绍了最近开发的胚胎微注射方法，用于在木薯沙蝇的CRISPR/Cas9靶向诱变。昆虫基因改造的胚胎微注射是在20世纪80年代中期在德罗索菲拉开发的，现在经常用于各种昆虫。其他基因改造材料的交付方法已经开发用于昆虫，如REMOT 20，21，22，23和电波23。然而，胚胎微注射是目前最通用和最有效的交付这些材料的方法。ReMOT作为一种分娩方法非常有前途，应探索用于沙蝇，因为与胚胎微注射相比，成人注射相对容易。然而，到目前为止，ReMot尚未成功用于CRISPR/Cas9 HDR或转子转基因。虽然昆虫胚胎微注射技术与最初开发的技术基本相同，但可能需要对每一个新物种进行技术改进。这些物种差异包括胚胎发育的模式和持续时间、胚胎结构以及胚胎正常发育的环境。沙蝇胚胎特别小（长0.3-0.5毫米，宽0.1-0.15毫米，大约相当于德罗索菲拉卵1的1/3大小）。这种缩小的大小增加了处理鸡蛋而不损坏鸡蛋的难度。由于沙蝇胚胎对干燥特别敏感，因此必须非常仔细地监测协议每一步的水分水平。然而，它们不是水生生物，如果长时间完全淹没在水中，它们就会死亡。嗜血性胚胎微注射需要在胚胎的后端注射。由于沙蝇胚胎的近对称形状，很难确定胚胎的极性。最后，虽然沙蝇胚胎发育过程与果蝇相似，但速度要慢得多。仅胚胎生成就持续6至11天，取决于沙蝇物种，而果蝇卵在产卵后仅孵化一天。嗜血性卵细胞化在卵子沉降后约2小时发生，而沙蝇胚胎在卵子移植后约9小时达到这一阶段。鉴于发育时间的差异，注射针对的是发育中的沙蝇胚胎的中心，假设在发育的早期阶段，同步胚胎中的发育核位于发育胚胎中心附近，从而避免了区分胚胎极性的必要性。
CRISPR/Cas9 在选定的基因组轨迹上创建 dsDNA 中断。这些双链断裂由 NHEJ 或 HDR 在单元格中修复。我们目前采用的方法以前只用于基于NHEJ的突变，它产生小的插入/删除事件，因德尔，导致基因序列的帧移位，导致过早停止结肠和缺乏所有功能域4的蛋白质。昆虫还拥有通过HDR进行dna突破修复的细胞机制，然后可以改道设计更复杂的基因组编辑策略。基于HDR的CRISPR/Cas9基因组编辑仍然需要建立用于沙蝇，并应允许记者的表达和有条件表达突变体的发展，以及其他结构。
这种微注入协议的开发现在打开了使用其他基因组修饰方法的大门，如CRISPR/Cas9 HDR，转子转基因，二元表达系统，如UAS/Gal4，以及phiC31或Cre/lox的现场特定重组。这些其他方法的开发将进一步扩大沙蝇基因表达修饰的工具箱，允许更复杂的基因组操作。然而，在采用这些其他方法之前，需要确定和隔离调节元件，以驱动沙蝇中插入的基因表达，以及插入标记和这些方法的其他组件，如推动转位酶和重组酶表达的促进剂。
最后，非模型昆虫的基因组编辑现在已成为一种可能性，特别是由于CRISPR/Cas9的革命发现和适应15，16。在昆虫中，大多数基因组编辑技术，除了新开发的REMOT技术的显著例外，都需要胚胎微注射，这一步骤既关键又技术要求高。我们希望，本出版物将有助于扩大适应沙蝇的基因表达修饰技术的范围，并导致其生物学的新发现以及莱什马尼亚寄生虫的病媒能力。
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Disclosures
没有
Acknowledgments
作者感谢瓦妮莎·梅尔德纳-哈雷尔对手稿的批判性解读。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
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